Scáileán Úrscéal le hAghaidh Rialtóirí Slonn na Próitéine Telomeric TRF2 Mhóilíní Beaga Aitheanta a Dhochairíonn TRF2 Cothú Imdhíonachta Cleithiúnach agus Fás Meall

Déan teagmháil le do thoiloscar.xiao@wecistanche.comle haghaidh tuilleadh eolais

Achoimre Shimplí:Déantar an phróitéin telomeric TRF2 (fachtóir athcheangailteach Telomeric 2) a uasrialáil in ailsí daonna agus baint aige le prognóis lag. Bíonn airíonna oncogenic TRF2 ag brath ar a ról cosanta intreach telomere, ach freisin ar éifeachtaí cille-eistreacha trí ghníomhaíochtaí imdhíon-bhrú agus angóigineacha. Dá bhrí sin, is cosúil gur straitéis fhrith-ailse theiripeach a bhfuiltear ag súil léi é díriú ar TRF2. Sa staidéar seo, d'fhorbraíomar modh cille-bhunaithe chun scagadh le haghaidh coscairí TRF2 a ligeann dúinn dhá chomhdhúil a aithint a mhaolaíonn airíonna pro-oncogenic TRF2 in vivo.

Coimriú: Fo-aonad den choimpléasc próitéine foscadh is ea fachtóir athcheangailteach teiliméire 2 (TRIF2), a cheanglaíonn agus a chosnaíonn telomeres ó ghníomhú freagairt damáiste DNA (DDR) nach dteastaíonn. Tá ról lárnach ag léiriú TRF2 in aosú agus ailse, á íosrialú le linn seanaoise cille agus ró-bhrú le linn oncogenesis. Is minic a bhíonn droch-prognóis ag ailsí a dhéanann róléiriú TRF2. I gcealla ailse, imríonn TRF2 feidhmeanna iomadúla, lena n-áirítear cosaint telomere agus róil uathrialaitheacha neamh-chealla, neo-angiogenesis agus imdhíonacht a chur chun cinn.puritans vitimín cCuirimid i láthair anseo straitéis scagtha bhunaidh, a chuireann ar chumas móilíní beaga a aithint a laghdaíonn nó a mhéadaíonn léiriú TRF2. Trí leabharlann bheag de dhrugaí arna gceadú ag an nGníomhaireacht Bia agus Drugaí (FDA) a scagadh, d’aithníomar dhá mhóilín (AR-A014418 agus alexidine-2HCl) a chuir isteach ar fhás siadaí, neo-angiogenesis agus imdhíon-shochtadh trí léiriú TRF2 a íosrialáil i luch. samhail xenograft. Tacaíonn na torthaí seo leis an straitéis cheimiteiripeach chun léiriú TRF2 a íosrialáil chun siadaí daonna ionsaitheach a chóireáil agus chun measúnú a dhéanamh ar an gcill seo atá in ann scagadh a dhéanamh do mhóilíní féideartha frith-ailse agus frith-aosaithe trí leibhéil léirithe TRF2 a mhodhnú.

Eochairfhocail:TRF2; ailse ; ag dul in aois ; measúnacht scagtha cille-bhunaithe; neo-angiogenesis; faoi ​​chois imdhíonachta

Cliceáil anseo le do thoil chun tuilleadh eolais a fháil

1. Réamhrá

Is struchtúir speisialaithe nucleoprotein iad Telomeres a fhaightear ag foircinn crómasóim líneacha atá á rialú ag fachtóirí a bhaineann le telomere cosúil le telomerase, coimpléisc próitéin foscadh agus RNA athrá telomeric neamhchódaithe [1]. Nuair a rialaítear i gceart iad, cosnaíonn telomeres crómasóim i gcoinne éagobhsaíocht agus seangacht. Tarlaíonn giorrú DNA Telomeric mar chuid d'fhorbairt fiseolaíoch cláraithe agus d'aosú [2]. Mar sin féin, thiomáineann giorrú iomarcach telomere DNA siondróim progeroid annamh, mar dyskeratosis congenita [3]. Ina theannta sin, tá baint ag stáit telomere dírialaithe le galair iomadúla atá coitianta ar fud an phobail i gcoitinne, lena n-áirítear beagnach gach cineál ailse agus roinnt galair degenerative [4]. Dá bhrí sin, táthar ag súil le cóireálacha cógaseolaíochta a fhorbairt chun díriú ar chomhpháirteanna sonracha telomere chun galair den sórt sin a chosc agus a chóireáil.

Chomh fada agus a bhaineann le telomere agus ailse, teipeann uaireanta ar sheicphointí ríthábhachtacha freagairt damáiste DNA (DDR); is féidir go n-eascródh giorrú DNA telomeric iomarcach agus athshocruithe crómasóim neamhbhríoch as seo, rud a d'fhéadfadh cur leis an oncogenesis. Ina theannta sin, is príomhimeacht é an t-uasrialú telomerase i bhforbairt thart ar 90 faoin gcéad de na hailse go léir, toisc go bhféadfadh sé seo fás gan teorainn a thabhairt do chealla ailse [5]. Ar an gcúis seo, tá cosc ​​​​telomerase mar sprioc ag roinnt staidéar a lorg cóireálacha ailse a fhorbairt [6]. In ainneoin dul chun cinn le déanaí, tá roinnt teorainneacha le húsáid chliniciúil drugaí frith-telomerase. Mar shampla, chun stop a chur le iomadú cille ailse, ní mór fad DNA telomeric gearr go criticiúil a bhaint amach, agus cailltear éifeachtaí frith-oncogenic telomeres giorraithe in éagmais géine sup-pressor meall p53 [7,8]. Laghdaíonn an tréimhse moille seo éifeachtúlacht theiripeach agus méadaítear fo-iarmhairtí pro-aosaithe trí athnuachan cille a theorannú agus trí mheicníochtaí fadaithe telomere malartacha atá bunaithe ar athmheascadh a chur i bhfeidhm [9,10].sistéalDá bhrí sin, d'fhéadfadh straitéisí frith-telomerase a bheith níos oiriúnaí chun díriú ar chealla ailse a bhfuil telomeres gearr ríthábhachtach acu cheana féin [11].

Chomh maith le telomerase, tá baint ag athruithe ar shloinneadh agus ar ghníomhaíochtaí fo-aonaid chasta foscadh (TRF1, TRF2, RAP1, TIN2, TPP1 agus POT1) le tumorigenesis, agus i gcásanna áirithe neamhspleách ar fhad telomere [12-16]. Mar sin, d’fhéadfadh díriú ar foscadh le haghaidh cóireála ailse a bheith ina rogha suimiúil eile seachas idirghabhálacha frith-telomerase. Is iarrthóir suimiúil é an fo-aonad seilfré TRF2; Tá TRF2 róbhrúite i roinnt urchóideacht daonna, i gcealla ailse agus soithíoch araon agus is gnách go mbíonn baint aige seo le prognóis lag [17-20]. Go háirithe, is féidir le ró-expression TRF2 tumorigenesis neamhchealla a chur chun cinn go huathrialach, rud a fhágann go n-eascraíonn imdhíonacht agus neo-angiogenesis[13,18-20]Go háirithe, cruthaíonn upregulation TRF2 micri-thimpeallacht imdhíon-bhrú cumhachtach. Trí léiriú próiteagáin sulfáit heparan a athrú, earcaíonn agus gníomhaíonn TRF2 cealla forlíontacha díorthaithe myeloid (MDSCanna) go díreach trí chonair TLR2 [21]. Cé go gcuireann ró-eisiúint TRF2 i gcealla ailse bac láidir ar earcaíocht cille NK i micri-thimpeallacht an meall trí shintéis HSPG a rialáil[13], mar thoradh ar ghníomhachtú TLR2 MDSC a tharlódh de bharr ró-eisiúint TRF2 tá cosc ​​cumhachtach ar imdhíon-fhaireachas cille NK le laghdú láidir. de degranulation cealla NK, táirgeadh agus marú IFNgamma [21].cad é cisteánMar sin, cuireann ró-eisiúint TRF2 isteach go mór ar an luathchéim d’fhaireachas imdhíonachta frith-meall trí chosc a chur go díreach ar earcaíocht cealla NK agus go hindíreach ar fheidhmiúlacht cealla NK trí mhicrea-thimpeallacht imdhíon-imdhíonachta atá ag brath ar MDSC a mhúnlú. Dá bhrí sin, d’fhéadfadh díriú ar TRF2 in ailsí a bheith ina straitéis luachmhar il-bhuail trí phróisis uathrialacha cille agus neamh-chill-uathrialach trí sheanchas a chur chun cinn chomh maith le lagú ar neo-angiogenesis agus éalú imdhíonachta.

is féidir cistanche frith-aging

Go dtí seo, déanann na comhdhúile beaga sainaitheanta go léir a dhíríonn ar TRF2 dochar dá chumas foircinn crómasóim a chosaint ó DDR agus mar sin tá fo-iarmhairtí ionchasacha pro-aosaithe [22]. Léirigh ár gcuid oibre roimhe seo gur féidir le laghdú páirteach ar léiriú TRF2 siadaí a aisiompú i múnlaí luiche trí éifeachtaí neamh-chealla uathrialacha, gan DDR a aslú[13]. Rinneamar réasúnú mar sin go bhféadfadh díriú ar bhreis TRF2 a laghdú in ailsí mar thoradh ar a ró-eisiúint a bheith ina straitéis spéisiúil chun ailse a chóireáil gan fo-iarmhairtí ar son dul in aois. Sa staidéar seo, cuirimid ardán scagtha bunaidh i láthair chun comhphunta beaga a aithint a dhíríonn ar chobhsaíocht TRF2. Léirímid gur chuir dhá amas is fearr bac ar ghníomhaíocht siadaíigineach ró-eisbhrú TRF2. Léirigh an staidéar seo gur féidir slonn TRF2 a mhodhnú go cógaseolaíoch agus gur modh iontaofa é ár measúnú scagthástála chun drugaí a roghnú atá in ann leibhéil slonn TRF2 a mhodhnú, le hairíonna féideartha frith-ailse agus frith-aosaithe.

2. Ábhair agus Modhanna 2.1.Cealla

Fásadh duán suthach daonna (HEK)293-Cealla T (ATCC CRL-1573) agus cealla BJ-HELTRas[13] i Meán-Iolar Athraithe Dulbecco (DMEM) (Lonza, Levallois Perret, An Fhrainc) arna fhorlíonadh le 10 faoin gcéad de shéiream lao féatais (FCS), 100 IU/mL peinicillin agus streiptimícin 100ug/ml (Invitrogen, Cergy Pontoise, an Fhrainc).

2.2.SDS-PAGE agus Blotting an Iarthair

Ullmhaíodh lysates cille iomlán, scartha le leictreafóiréis agus blotted mar a thuairiscítear roimhe seo [14]. Go hachomair, baineadh cealla agus cuireadh iad i maolán lysis (8.76 g/L NaCl 10 mM Tris-HCL pH7.2,0.1 faoin gcéad SDS,0.1 faoin gcéad Triton X -100, 10 g/L déocsacolaáit sóidiam, aigéad eitiléinedé-aimínteitrea-aicéiteach 5 mM (EDTA), 1{{50}} ug/mL leiipitín, 1 mM AEBSF agus 19 ug/mL aprotinin). Ansin rinneadh samplaí a thoirtmheascadh ag baint úsáide as trealamh measúnaithe próitéin BCA (Interchim, Monlucon, an Fhrainc). Téiteodh samplaí (60 ug/lána) ag 95 céim ar feadh 5 nóiméad i maolán luchtaithe (500 mM Tris-HCl, 100 mM DTI, 2 faoin gcéad SDS, bromaphenol gorm 0.1 faoin gcéad, gliocról pH 10 faoin gcéad 6.8). Ansin luchtaíodh samplaí ar glóthacha polyacrylamide 10 faoin gcéad agus reáchtáiltear iad ar feadh 45 nóiméad ag 160 V. Aistríodh próitéiní ansin chuig seicní Immobilon-FL (Millipore, Upstate New York, USA) ag baint úsáide as Trans-Blot SD Semi-Triomaigh Aistrithe Leictreafóireolaíochta Cell (Bith- Rad, Hercules, CA, USA).Blocáladh membrane ar feadh 1 h i maolán blocála Idircheapa (LI COR, Lincoln, NE, USA) roimh gor thar oíche ag 4 chéim le meascán d'antasubstaintí príomhúla (mouselgGl anti-TRF2 caolaithe ag1: 250;agus coinín IgGanti-Beta-actin caolaithe ag 1:10,000) i maolán blocála Idircheapa ina bhfuil 0.5 faoin gcéad Tween20. Tar éis a bheith nite i PBS 0.1 faoin gcéad Tween20, goradh membrane ar feadh 1 h ag teocht an tseomra i Maolán blocála Idircheapa ina raibh 0.25 faoin gcéad Tween20 le meascán d’antasubstaintí tánaisteacha: gabhar frith-luch IRDye 680 le haghaidh antashubstaint frith-TRF2 agus gabhar frith-coinín IRDye 800CW le haghaidh antashubstaint frith-Beta-actin (1:15,000 caolú).Ciste frith-aosaitheTá antashubstaintí tánaisteacha príomhúla agus IRDye a úsáideadh liostaithe thíos sa tábla antasubstainte (Tábla 1). Ar deireadh, léiríodh bannaí próitéine ag baint úsáide as córas íomháithe LiCor Odyssey 9120 (LI-COR). Tomhaiseadh léiriú TRF2 trí dhéine banna TRF2 a normalú go dtí déine an bhanna actin agus an chúlra.

2.3.Straitéis Clónála

Clónáladh seicheamh cDNA TRF2 daonna idir na suíomhanna srianta BamHI/BclI de plasmid lentiviral SFFV-GPR atá ina dhíorthach VEID-SFFV-GFP-WPRE [23]. Tá tionscnóir víreas foirmithe fócas spleen (SFV) sa plasmid SFFV-GPR a rialaíonn géine polycistronic GPR a chuimsíonn seichimh cDNA le haghaidh próitéin fluaraiseachta glas (GFP), próitéin friotaíochta puromycin agus próitéin fluaraiseachta Tag-dearg (RFP)-T (S158T Mutated Tag -RFP), gach ceann acu scartha le seichimh E2 agus T2 Picoraviridae. Cuireadh hTRF2 cDNA isteach ag an réigiún C-críochfort de RFP-T, chun léiriú próitéin comhleá RFP-TRF2 a chumasú.

2.4.Táirgeadh Lentivirus

Le haghaidh táirgeadh lentivirus, 5 × 10* HEK 293-Aistríodh cealla T le 8.6 ug de SFFV-GPR nó RFP-TRF folamh2-ag cur in iúl veicteoir SFFV-GPR,8.6 ug an Charghais -Delta 8.91 agus 2.8 ug de VSV-g trí aistriú fosfáit-idirghabhála cailciam. Saothraíodh cealla tras-aistrithe i DMEM agus forlíonta le 10 faoin gcéad FCS ag 37 céim le 5 faoin gcéad CO2 i 10-miasa cm. Bailíodh súiteáin a raibh na víris nuathógtha iontu tar éis 48 h, ansin cuireadh trí scagaire Millipore 0.45-μm. Tar éis toirtmheascadh víreas, úsáideadh cóimheas 1∶1 (víreas∶cill) chun an líne cille BJ-HELTRas a ionfhabhtú, a roghnaíodh le haghaidh a fhriotaíochta in aghaidh lochtanna TRF2[13].sochair cisteancheRinneadh clón a léirigh GFP agus an próitéin RFP-TRF2 comhleáite go leibhéil mheasartha a leithlisiú ansin ag sórtáil cille fluaraiseachta-gníomhachtaithe (FACS).

2.5.Scrúdú Citeiméadrachta Sreafa

Saothraíodh cealla líne clónacha BJ-HELTR ina raibh an veicteoir SFFV-GPR agus a léirigh an próitéin chomhleá RFP-TRF2 i 96-plátaí tobair i meán DMEM arna fhorlíonadh le 10 faoin gcéad FCS agus 1 faoin gcéad peinicillin/streiptimícin. Tar éis 24 h de chóireáil drugaí, rinneadh na cealla a trypsinized ansin agus nite i saline maolánach fosfáit (PBS) ina raibh 0.5 mM EDTA agus 2 faoin gcéad FCS sular socraíodh iad le 0.5 faoin gcéad formaildéad (FA). Cuireadh cealla seasta faoi réir ansin chun citeiméadracht a shreabhadh ag baint úsáide as samplóir ard-thréchur FacsCalibur (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA).

2.6.Imoibriú Slabhra Polaiméaráis Cainníochtúil Fíor-Ama (RT-qPCR)

Rinneadh RNA iomlán a leithlisiú ag baint úsáide as RNeasy Mini Kit (Qiagen, Venlo, an Ísiltír). Rinneadh tras-scríobh droim ar ais ag baint úsáide as trascríobh droim ar ais Superscript II (Invitrogen) le 1 ug den RNA iomlán. Rinneadh normalú ar shloinneadh gach géine go dtí sin GAPDH. Baineadh úsáid as na primers seo a leanas: hTRF2 Fw 5'-GCTGCCTGACTIGAACAGT-3';hTRF2 Rv 5'-CCGTTCTCAACCAACCCCTC-3';hGAPDHFw5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3'hGAPDH Rv 5'-CCGTTCACCAACCCCTC{8}';hGAPDHFw5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3'hGAPDH Rv 5''-GCTCCAVA{8}'; 14}}. 2.7.Alamar Gorm

I 96-pláta bun cothrom, síolaíodh 5 × 103 cill in aghaidh an tobair i 200 ul DMEM-forlíonadh le 10 faoin gcéad FCS. Ag 24h tar éis cóireála drugaí, cuireadh 10 uL de AlamarBlue (Bith-Rad) leis agus tomhaiseadh ionsúiteacht ag 570 nm agus 600 nm ar feadh 36 h i léitheoir pláta Nano Spectrostar (BMGLabtech, Ortenberg, an Ghearmáin). Cinneadh an céatadán ocsaídiúcháin-laghdaithe de AlamarBlue mar a thuairiscigh an monaróir.

2.8.Ainmhithe

Rinneadh turgnaimh ar 8- go dtí 12-lucha baineann nude seachtaine ó Janvier Labs (An Fhrainc). Rinneadh na turgnaimh luiche go léir de réir threoirlínte institiúideacha áitiúla agus idirnáisiúnta agus d'fhormheas Coiste Cúraim Ainmhithe an IRCAN agus an réigiúnach (CIEPAL Cote d'Azur #187 agus #188) agus náisiúnta (Aireacht Taighde na Fraince #03482.01/02482.2) iad. agus #02973.01/02973.2)údaráis.

2.9.Turgnaimh Fháis Tumor

Rinneadh gach luch nude NMRI a instealladh go subcutaneously sa chúl le cealla 1 x 106 BJ-HELTRas ar fionraí i 100 μL de lucha PBS (n{4}} in aghaidh an ghrúpa). Cóireáladh na lucha ar laethanta 16, 18, 20 agus 22 le instealltaí intraperitoneal de 100 ul de DMSO (45 faoin gcéad ), alexidine-2HCl (1 mg/kg) nó AR-A014418(5 mg/kg), ansin lean sé suas go dtí an lá 26. Rinneadh measúnú ar chuma an meall le palpation gach lá. Rinneadh méid meall a thomhas gach 2-3 lá ag baint úsáide as caliper. Rinneadh toirt meall a chinneadh ansin ag baint úsáide as an bhfoirmle hemi-ellipsoid: π × (L × 1 × h) / 6, áit a gcomhfhreagraíonn L don fhad, I go dtí an leithead agus h go airde an meall, faoi seach.

2.10.Matrigel Breiseán Measúnachtaí

Cóireáladh cealla BJ-HELTRas le DMSO (1 faoin gcéad ), alexidine-2HCl (1 uM) nó AR-A014418 (10 μM) ar feadh 2 lá. Ansin, rinneadh 100 μL de chealla cóireáilte 1 × 10 céim ar fionraí i PBS mar aon le 400 ul de Matrigel laghdaithe fachtóir fáis (Corning, Nua-Eabhrac, SAM) a ionaclú go subcutaneously isteach i gcúl lucha nude NMRI faoi ainéistéise isoflurane. Ag an lá 5 iar-ionaclaithe, baineadh na plocóidí Matrigel, agus bailíodh cealla insíothlaithe trí dissociation einsímeach trí dispase (Corning), collagenase A (Roche, Bale, an Eilvéis) agus díleá DNAseI (Roche) ar feadh 30 nóiméad ag 37 céim [13 ]. Sáithíodh cealla ar feadh 15 nóiméad ar oighear le antasubstaintí frith-CD16/CD32 Fe-Block (clón 2.4G2) sular staining iad le antasubstaintí cúpláilte ar feadh 30 nóiméad ag 4 céim . Tá na hantasubstaintí comhchuingeacha a úsáidtear liostaithe sa tábla antasubstainte. Nite cealla i PBS le 0.5 mM EDTA, 2 faoin gcéad FCS agus seasta le 0.5 faoin gcéad FA. Rinneadh anailís ar chealla dhaite ag baint úsáide as cíteaiméadar ARIA III le bogearraí DIVA6 (BD Biosciences) agus FlowJo 10(LLC).

2.11.Staidreamh

Táirgeadh gach graif agus anailís staitistiúil ag baint úsáide as bogearraí GraphPad Prism (San Diego, CA, SAM). Léirítear na torthaí go léir mar an meán ± diall caighdeánach (sd) nó meán ± earráid chaighdeánach an mheáin (SEM). Cinneadh difríochtaí suntasacha idir na hacmhainní trí úsáid a bhaint as tástáil dhá eireaball Mann-Whitney. Baineadh úsáid as an tástáil log-rang (Mantel-Cox) chun tógáil siadaí a chinneadh. I gcás gach tástála, lch<0.05 was="" considered="" statistically="">

3.Results

3.1.Móilíní Coscacha TRF2 a shainaithint

Chun scagadh a dhéanamh ar dhrugaí atá in ann leibhéil phróitéin TRF2 a mhodhnú, d’úsáideamar córas lentiviral chun an ghéin GFP agus an RFP a chomhthroiseadh chuig an gcríochfort N TRF2 a chomh-tras-scríobh. Tar éis straitéis ghinearálta a thuairiscítear in áit eile [23], thógamar lentivirus GRT, inar rialaigh tionscnóir SFFV léiriú géine ionchódaithe il-cistronic GFP, próitéin friotaíochta puromycin agus RFP-TRF2 nó RFP amháin mar rialú (Fíor 1A). Dá bhrí sin, léirigh gach ceall trasduchtáilte GFP agus RFP-TRF2 araon. Dearadh an córas seo chun drugaí a mhodhnaíonn slonn TRF2 a shainaithint, trí dhéine RFP a thomhas ag baint úsáide as cíteiméadracht sreafa, agus feidhmíonn déine GFP mar rialú inmheánach chun tógáil an tuairisceora a thrascríobh.

D'aistrigh muid na lentiviruses GRT isteach i fibroblasts daonna BJ-HELTR a bhí neamhbhásaithe ag SV40 agus hTERT agus a rinneadh oncogenic ag Ras v12[13]. Chun tomhais suas agus síos-rialáil TRF2 a éascú, rinneadh clón frithsheasmhach in aghaidh puromycin a léirigh próitéiní GFP agus RFP-TRF2 go measartha a leithlisiú ag baint úsáide as sórtáil FACS agus ainmnithe GRI-BJ-HELTRas (Fíor 1A). Mar rialú dearfach, dhéileálamar le cealla GRT-BJ-HELTRas le 10 uM gemcitabine, modulator a thuairiscítear roimhe seo ar chobhsaíocht TRF2 [24], le haghaidh24h. Cé nár aimsíodh aon mhodhnú RFP i gcealla a aistríodh le veicteoir folamh, breathnaíodh laghdú suntasach ar an gcóimheas meándéine fluaraiseachta RFP/GFP (MFI) i gcealla GRT-BJ-HELTRas cóireáilte le gemcitabine i gcomparáid leis an rialú cóireáilte DMSO (82 faoin gcéad). an rialaithe;p<0.0001)(figure 1b).moreover,="" gemcitabine="" specifically="" diminished="" rfp-trf2="" protein="" levels="" without="" affecting="" gfp="" levels="" (figure="" s1a).="" of="" note,="" we="" observed="" here="" that="" gemcitabine="" is="" reducing="" trf2="" level="" in="" contrast="" to="" the="" published="" work[24],="" a="" difference="" that="" may="" be="" explained="" by="" cell="" type="" differences="" in="" the="" dna="" damage="" response="" induced="" by="" gemcitabine="" since="" trf2="" stability="" can="" be="" altered="" in="" a="" p53-dependent="" manner="" [25].="" this="" effect="" was="" further="" confirmed="" by="" western="" blotting="" analyses="" where="" we="" observed="" that="" endogenous="" trf2="" levels="" were="" affected="" by="" gemcitabine="" treatment="" on="" untrans-duced="" bj-heltras="" cells="" (figure="" s1b).therefore,="" grt-bj-heltras="" cells="" enabled="" detection="" of="" specific="" variations="" in="" trf2="" protein="" levels="" induced="" by="" drug="" treatment.="" or="" gemcitabine="" (right="" panel)(n=""><0.001;two-tailed student'st="" test).="" (c)representative="" rfp/gfp="" flow="" cytometry="" plots="" of="" trf2="" vector-transduced="" bj-heltras="" cells="" treated="" with="" 10="" um="" of="" alexidine-2hcl,="" ar-a014418="" or="" dmso="" (left="" panel).="" box-plot="" quantification="" of="" rfp-trf2="" fusion="" (trf2="" vector)="" proftein="" levels="" following="" treatment="" with="" dmso,="" alexidine-2hcl="" or="" ar-a014418(right="" panel)(n=""><0.05;mann-whitney test).(d)representative="" western="" blotting="" showing="" reduced="" trf2="" protein="" levels="" following="" treatment="" with="" 10="" um="" alexidine2hcl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="" treatment="" in="" untransduced="" bj-heltras="" cells="" (left="" panel;="" full="" western="" lolotting="" image="" is="" presented="" in="" figure="" s2a).="" quantification="" of="" trf2="" protein="" levels="" after="" treatment="" with="" 10="" μm="" alexidine-2hccl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="" treatment="" （right="" panel)(n="2;mean" +="" standard="" error="" of="" the="" mean).(e)quarntification="" of="" trf2="" mrna="" levels="" analyzed="" by="" rt-qpcr="" after="" treatment="" with="" 10="" um="" alexidine-2hcl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="">

Ag baint úsáide as cíteiméadracht sreafa, rinneamar scagadh ansin ar 396 comhdhúil cógaseolaíochta ceadaithe ag an Riarachán Bia agus Drugaí (FDA) a bhí in ann díriú ar shé phríomhchatagóir de phróisis bhitheolaíocha: cainéil ian, fosfatas, kinases, fachtóirí epigenetic, ligands gabhdóirí núicléacha agus an cosán Wnt (Fíor S1C). ).Cóireáladh cealla GRT-BJ-HELTRas ar dtús le 10 uM de gach ceann de na 396 comhdhúil nó DMSO ar feadh 24 uair an chloig roimh anailís chiteiméadrachta sreafa (Fíor S1D). Sa chás seo, fuarthas amach go raibh 84 comhdhúile chun leibhéil próitéin TRF2 a mhodhnú (Fíor S1D, painéal ar dheis; Tábla S1), agus úsáideadh iad le haghaidh scáileán tánaisteach (Fíor S1E; ​​Tábla S1). Sa scáileán tánaisteach seo, chomh maith le cealla GRT-BJ-HELTRas a chóireáil le 10 uM de na comhdhúile roghnaithe, caitheadh ​​ar an gcaoi chéanna le cealla BJ-HELTRas neamh-aistrithe nó cealla BJ-HELTR a aistrítear le veicteoir folamh chun dearfacha bréagacha a scriosadh as astaíonn dearg. nó uathfhluaraiseacht glas nó a dhéanann difear do phróitéiní RFP nó GFP. Roghnaíodh na 18 com-punt is fearr ansin chun a gcumas a chinneadh an léiriú ar endoge nous TRF2 a mhodhnú i gcealla BJ-HELTRas neamh-aistrithe, bunaithe ar blotting an Iarthair (Fíor S2A, Tábla B S1). Sainmhíníomar amas mar chomhdhúile a mhodhnaíonn 20 faoin gcéad ar a laghad den dáileog TRF2 (suas nó síos). Agus na critéir seo á n-úsáid, as na 18 ndruga a ndearna blotting an Iarthair measúnú orthu, laghdaigh 9 acu agus mhéadaigh ceann amháin leibhéil phróitéin TRF2 inghineacha (Fíor S2A, Tábla S1) Chinneamar ansin dhá chomhdhúil a roghnú i measc na ndrugaí seo le haghaidh turgnaimh in vivo chun a chinneadh an bhféadfadh siad gníomhú in aghaidh na n-éifeachtaí pro-oncogenic de ró-eisiúint TRF2. Chun gníomhachtú DDR agus fo-iarmhairtí a sheachaint i gcealla neamh-tumorigenic, roghnaigh muid comhdhúile nár laghdaigh go dtí an dáileog TRF2 is airde ná na leibhéil is ísle. Ina measc, bhí AR agus AD ag freagairt do na critéir sin. Rinne an dá chomhdhúil íosrialáil RFP-TRF2 i gcealla GRT-BJ-HELTRas mar a anailísíodh ag cíteiméadracht sreafa (Fíor 1C), leibhéil phróitéin TRF2 endogenous mar a léirítear ag anailís blotting an Iarthair (Fíor 1D; Fíor S2A, B) agus leibhéil TERF2 mRNA mar a chinntear trí RT -qPCR (Fíor 1E). Ina theannta sin, laghdaigh cóireáil leis na tiúchain LD50 faoi leith de AR agus AD slonn mRNA TERF2 i gcealla BJ-HELTR agus i gcealla TRF 2-ró-léirsithe BJ-HELTRas (Fíor S3A-C).

3.2.AR-A014418 agus Alexidine-2D'aisiompaigh HCl an Tumoriginicity Bronnta ag Leibhéil Slonn Ard-TRF2

An chéad uair eile rinneamar measúnú ar thionchar AR agus AD ar fhás siadaí. Chun rialú a dhéanamh ar a gcumas díriú ar ailsí ró-léirsithe TRF, rinneamar anailís ar na héifeachtaí frith-tumorigenacha a d’fhéadfadh a bheith ag AR agus AD ar chealla caighdeánacha BJ-HELTRas agus TRF2-for-léiriú ar chealla BJ-HELTRas. Aistríodh cealla BJ-HELTRas le veicteoir TRF2lentiviral nó veicteoir folamh, ansin iad a instealladh go subcutaneously isteach i lucha nude. Cuireadh cóireáil ar na lucha ansin le DMSO, 1 mg / kg AD nó 5 mg / kg AR ag laethanta 16,18,20 agus 22 iar-instealladh [26,27] (Fíor 2A). Mar a tuairiscíodh roimhe seo [13,21], chuir overexpression TRF2 meall ini chun cinn. ceangal agus fás in vivo (Fíor 2B-D; lch<0.05). treatment="" with="" neither="" ar="" nor="" ad="" impacted="" tumor="" volume="" in="" bj-heltras="" cells="" transduced="" with="" the="" empty="" vector="" (figure="" 2e,="" upper="" panels)="" neither="" tumor="" growth="" rate(figure="" 2f-h).="" by="" contrast,="" both="" drugs="" induced="" a="" significant="" decrease="" in="" the="" tumor="" volume="" of="" trf2-overexpressing="" xenografted="" tumors,="" leading="" to="" significantly="" smaller="" tumor="" sizes="" at="" day="" 26="" (figure="" 2e,middle=""><001)but also="" of="" the="" tumor="" growth="" rate="" (figure="" 2f-h)="" at="" each="" time-point.="" furthermore,="" the="" vol-ume="" and="" growth="" rates="" of="" trf2-overexpressing="" tumors="" treated="" by="" the="" two="" drugs="" returned="" to="" levels="" similar="" to="" those="" of="" the="" control="" tumors,="" thus="" demonstrating="" the="" trf2-specific="" selectivity="" of="" ar="" and="" ad="" (figure="" 2e,lower="" panels).these="" results="" show="" that="" ar="" and="" ad="" treatment="" reversed="" specifically="" the="" tumorigenicity="" conferred="" by="" trf2="" overexpression.="" or）="" were="" injected="" subcutaneously（1×10°cells/100μl）into="" nmri="" nude="" mice.="" the="" mice="" were="" then="" treated="" with="" dmso,alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg)="" or="" ar-a014418(5="" mg/kg)="" at="" days16,18,20="" and="" 22="" post-injection,="" then="" followed="" up="" until="" day="" 26="" (n="8" mice="" per="" group).(b-d)="" the="" percentage="" of="" tumor-free="" mice="" (b)="" and="" tumor="" volumes(c)="" were="" determined="" at="" the="" indicated="" time="" points="" in="" mice="" injected="" with="" bj-heltras="" cells="" overexpressing="" trf2(trf2="" vector)="" or="" empty="" vector.="" tumor="" take="" based="" on="" palpability="" was="" determined="" at="" the="" indicated="" time="" points="" and="" is="" represented="" as="" a="" percentage="" of="" tumor-free="" mice.p="" values="" were="" determined="" using="" the="" log-rank="" mantel-cox="" test(*=""><0.05). tumor="" volumes="" were="" assessed="" at="" different="" time-points="" (mean="" ±="" standard="" deviation);="" tumor="" volume="" at="" d.ay="" 15="" is="" represented="" in="" (d).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><><><0.001). (e)="" tumor="" volumes="" were="" followed="" as="" in="" (c)="" after="" repetitive="" treatments="" with="" dmso,="" alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg),="" or="" ar-a014418(5mg/kg).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><0.0001;ns: not="" significant).(f-h)="" tumor="" growth="" rate="" of="" ar-a014418(5mg/kg)treated="" mice(f,h)="" or="" alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg)(g,h)="" treated="" mice="" were="" determined="" by="" considering="" the="" last="" day="" before="" treatment="" for="" empty="" vector="" or="" trf2="" vector="" as="" 100%.="" variations="" of="" the="" growth="" rate="" in="" both="" treatments="" over="" the="" time="" are="" represented="" in="" (f,g)="" and="" for="" each="" time-point="" (h).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><><><>

3.3.AR-A014418 agus Alexidine-2HCI in aghaidh TRF2-Sochtadh Imdhíonachta Cleithiúnach agus Neo-Angiogenesis

Chun a chinneadh an bhféadfadh éifeachtaí antitumor AR agus AD díriú ar airíonna uathrialaitheacha neamh-chealla TRF2, rinneamar scrúdú ar insíothlú cille imdhíonachta agus gníomhachtú chomh maith le angiogenesis i siadaí cóireáilte. Chuireamar cóireáil ar chealla BJ-HELTRas caighdeánach agus TRF (Fíor S3A) le 1 uM AD, 10 uM de AR nó DMSO ar feadh 48 h roimh a n-instealladh subcutaneous le Matrigel i lucha nude. Bailíodh plocóidí matrigel ansin ag 5 lá tar éis an insteallta chun anailís a dhéanamh ar mhicrea-thimpeallacht an meall de réir cítoiméadracht sreafa (Fíor 3A). De réir mar a bhíothas ag súil leis [13,21], níor athraigh ró-expression TRF2 insíothlú cille imdhíonachta domhanda (CD45 móide cill) (Fíor 3B; Fíor S4A), ach chuir sé bac ar earcaíocht cille marú nádúrtha (NK) (Fíor 3C; Fíor S4B) agus feidhm NK -ality (Fíor 3C-E; Fíor S4C), agus méadú ar insíothlú MDSC (Fíor 3F). I TRF2-ró-eisbhrú cealla BJ-HELTRas go sonrach, mhéadaigh cóireáil le ceachtar den dá dhruga insíothlú imdhíonachta domhanda (Fíor 3B; Fíor S4A), chomh maith le cainníocht agus feidhmiúlacht na gceall NK laistigh den meall (Fíor 3C-E; Fíor S4B,C). Go háirithe, tharrtháil an dá dhruga go hiomlán an cosc ​​ar fhaireachas imdhíonachta NK-idirghabhálaithe cille (CD107a móide agus CD69 móide cill NK) a tharlódh de bharr ró-abairt TRF2 (Fíor 3C). Bhain sé seo le laghdú suntasach ar earcaíocht MDSC (Fíor 3F; Fíor S4D) agus le hearcú méadaithe monaicítí agus macraphages (Fíor 3G).

Mar a tuairiscíodh roimhe seo [14,20], bhí angiogenesis siadaí níos airde i siadaí ró-léirsithe TRF i gcomparáid le siadaí rialaithe. Cé gur mhéadaigh ró-eisiúint TRF2 an chainníocht CD31 móide cealla endothelial CD45- laistigh den leaba siadaí (Fíor 3H; Fíor S4E), níor aimsíodh aon difríocht idir veicteoir folamh nó TRF2-siadaí ró-abairt tar éis cóireála le ceachtar den dá dhruga. ing TRF2 (veicteoir TRF2) nó veicteoir folamh cóireáilte le 1uM de alexidine-2HCl nó 10 μM de AR-A014418 nó DMSO ag 2 lá roimh instealladh subcutaneous le Matrigel (1 × cealla céime 10) i lucha nude NMRI ( n=8). Rinneadh measúnú ansin ar insíothlú cille imdhíonachta agus endothelial ag 5 lá tar éis an insteallta trí chiteiméadracht sreafa. (BH). Anailís citoiméadrachta sreafa ar insíothlú imdhíonachta an breiseán Matrigel. Taispeántar líon na gceall imdhíonachta a dhéanann insíothlú ar na plocóidí Matrigel i measc na gcealla beo. Taispeántar insíothlú cille imdhíonachta iomlán (CD45 móide cealla) i (B); taispeántar insíothlú cille marú nádúrtha (NK) (NKp46 móide cealla) in (C); taispeántar insíothlú cille NK gníomhachtaithe (CD107a móide agus CD69 móide cealla NK) in (D,E); Taispeántar insíothlú cille súiche díorthaithe myeloid (MDSC; CD11b móide GR1 móide ) in (F); taispeántar insíothlú monaicítí-macrophage in (G) agus taispeántar insíothlú cille endothelial i (H).p Cinneadh luachanna ag baint úsáide as an Mann- Tástáil Whitney(*p<><><0.001;n =="" 8="" mice="" per="">

4. Plé

Anseo, tuairiscímid forbairt measúnachta cille-bhunaithe chun scagadh a dhéanamh ar chomhdhúile a mhodhnaíonn léiriú na próitéine telomeric TRF2. Trí leabharlann bheag de mhóilíní atá ceadaithe ag FDA a scagadh, d’aithin muid comhdhúile a d’fhéadfadh leibhéil slonn TRF2 a mhéadú nó a laghdú. Fuaireamar amach go ndearna AD agus AR íosrialáil ar TRF2 agus gur léirigh siad gníomhaíocht fhrith-tumorigenic a bhí sonrach do chealla meall a chuireann ró-léiriú ar TRF2. Ag léiriú tuilleadh a ngníomhaíocht ar leith TRF2-, tarrtháil cóireáil AR agus AD an imdhíon-shochtadh agus neo-angiogenesis arna mbronnadh ag ró-eisbhrú TRF2. Is díol suntais é, toisc go bhfuil méadú ar an insíothlú imdhíonachta domhanda le haghaidh siadaí ró-léirithe TRF2 tar éis cóireála AR nó AD, le tuiscint go bhfuil na drugaí sin níos cumhachtaí chun freagairt imdhíonachta a fheabhsú nuair a bhíonn TRF2 ró-léirithe. Cuireann na drugaí sin bac ar éifeacht imdhíon-bhrú ar ró-eisiúint TRF2 trí fheidhmiúlacht cille NK (CD107a agus CD69 móide cealla NK) a athbhunú agus laghdaítear insíothlú MDSC go láidir. Tugann sé seo le tuiscint go ndéanann na drugaí sin maolú ar an gclár sainiúil cleithiúnach TRF a spreagann éalú imdhíonachta agus imdhíon-shochtadh agus d’fhéadfadh go bhfeabhsaítear scaoileadh Móilíní Danger Associated (DAMP) a fheabhsaíonn freagairt imdhíonachta go sonrach nuair a bhíonn TRF2 róbhrúite. Is fiú a thabhairt faoi deara, tugaimid faoi deara gur sháraigh AR agus AD na feidhmeanna imdhíon-bhrú agus pro-angaigineacha de ró-eisiúint TRF2, dhá shaintréith de ró-eisiúint TRF2 a léirigh muid roimhe seo mar neamhspleách DDR. Mar sin, rinneamar hipitéisiú go bhfuil na héifeachtaí AR agus AD ar fhás siadaí neamhspleách ar DDR, meicníocht nach bhfuil cur síos iomlán fós uirthi i staidéir bhreise. Soláthraíonn an staidéar cruthúnas coincheapa seo fianaise go bhféadfadh laghdú cógaseolaíoch ar léiriú TRF2 a bheith ina straitéis luachmhar frith-ailse.

Cé gur mheas an modh scagtha leibhéil phróitéin TRF2 go neamhspleách ar leibhéil tras-scríofa, laghdaigh an dá dhruga leibhéil TERF2 mRNA ingenous, rud a thugann le tuiscint go bhfuil AR agus AD ag díriú ar leibhéil iolracha de rialáil TRF2. Ag tacú leis seo, tá AR ina choscóir ar chomharthaíocht Wnt [28], atá ina ghníomhaí ar thrascríobh TERF2 [29]. Níos ginearálta, saibhríodh na drugaí a dhíríonn ar chonair chomharthaíochta Wnt le linn na gcéimeanna scagtha (Fíor S1B-D). Tá sé fós le cinneadh conas a théann AD, gníomhaire spriocdhírithe mitochondria, i bhfeidhm ar léiriú TRF2. Ós rud é go bhfuil droch-prognóis ag ailsí a thaispeánann leibhéil TRF2 arda agus go léiríonn siad friotaíocht méadaithe i gcoinne ceimiteiripe [21], is gníomhairí spéise teiripeacha iad AR agus AD le haghaidh siadaí den sórt sin. Mar gheall ar an bhféidearthacht gníomhaíochtaí telomeric agus pro-oncogenic TRF2 a dhíchúpláil[13], tá an fhéidearthacht ann TRF2 a íosrialú go cógaseolaíoch, rud a thugann buntáistí frith-ailse il-bhuaile gan fo-iarmhairtí díobhálacha ar son dul in aois. Dá bhrí sin, tá gá le staidéir sa todhchaí chun éifeachtaí sineirgisteacha na ndrugaí seo ar leibhéil léirithe TRF2 i staidéir chliniciúla a chinneadh.

Cé go bhfuil TRF2 uasrialaithe in ailsí éagsúla daonna [13,21], tá a léiriú íslithe le linn aosú gnáth agus paiteolaíoch go leor fíocháin [30,31] Thairis sin, cuireann roinnt tuarascálacha a bhaineann le samhlacha lucha de dhírialú TRF2 béim ar an tábhacht a bhaineann le TRF2 ag an. crosbhóthar idir aosú agus ailse [31-35]. Dá bhrí sin, is iarrthóirí suimiúla drugaí iad na móilíní a shainaithnítear leis an nós imeachta scagthástála a thuairiscítear anseo, mar ghníomhairí frith-ailse le haghaidh íosrialú TRF2 mar a dheimhnítear sa staidéar seo, agus d'fhéadfadh siad a bheith mar ghníomhairí frith-aosaithe trí TRF2 a rialáil.

Baintear an t-alt seo as Cancers 2021, 13, 2998. https://doi.org/10.3390/cancers13122998 https://www.mdpi.com/journal/cancers