Cuireann Netrin Úrscéal-1-Peiptíde Díorthaithe le Cosaint ar Bhás Néarónach agus Maolaítear Hemorrhage Incerebral i Lucha Cuid 2

Ina theannta sin, fuaireamar amach gur ghníomhaigh peptide E1 go sonrach na cosáin comharthaíochta FAK agus SFK. Mar sin, d'fhéadfadh éifeachtaí an-sonracha a bheith ag peptide E1 agus a bheith éifeachtach sa phróiseas aisghabhála tar éis ICH.

Tá gaol idir sainiúlacht ard agus cuimhne. Tagraíonn sainiúlacht ard don ghníomhaíocht níos láidre i réimsí sonracha den inchinn nuair a bhíonn daoine ag déanamh taisc. Tagraíonn cuimhne do chumas daoine eolas a fhoghlaim agus a mheabhrú. Nuair a fhoghlaimímid úsáid a bhaint as sainiúlacht ard chun tasc a dhéanamh, méadóidh ár gcuimhne freisin.

Léiríonn taighde, nuair a bhíonn sainscileanna agus taithí againn ar thasc, go dtógfaidh an inchinn ciorcaid néaracha speisialaithe agus patrúin cuimhne de réir a chéile. Beidh éifeacht shonrach ag na ciorcaid agus na patrúin seo ar an bhfreagra ar an tasc, agus ar an gcaoi sin feabhsófar éifeachtúlacht an taisc. Ag an am céanna, agus iad ag comhlíonadh tascanna den chineál céanna sa todhchaí, cuirfear na ciorcaid agus na patrúin seo i ngníomh freisin chun cabhrú linn an tasc a mheabhrú agus a chomhlíonadh níos fearr.

I measc na dtascanna a bhfuil ardshainiúlacht acu tá ceol, teanga, spóirt, etc., agus féadann foghlaim na scileanna seo cur lenár gcuimhne. Mar shampla, nuair a chleachtann pianódóir ag imirt, foghlaimfidh an inchinn scileanna sonracha an phianó agus leanfaidh sé de na ciorcaid seo a neartú le linn an phróisis chleachtais. Feabhsóidh bunú agus neartú na gciorcaid seo tuiscint agus cuimhne an phianó ar an gceol freisin.

Mar sin, tá caidreamh dearfach idir sainiúlacht ard agus cuimhne. Ní hamháin go bhfeabhsóidh foghlaim scileanna agus eispéiris shonracha ár n-éifeachtúlacht forghníomhaithe ach freisin ár gcuimhne a neartú, ag cabhrú linn eolas níos fearr a fhoghlaim agus a mheabhrú. Is féidir a fheiceáil go gcaithfimid cuimhne a fheabhsú, agus is féidir le Cistanche cuimhne a fheabhsú go suntasach toisc go bhfuil éifeachtaí frithocsaídeacha, frith-athlastacha agus frith-aosaithe aige, a d'fhéadfadh cabhrú le ocsaídiú agus imoibrithe athlastacha san inchinn a laghdú, rud a chosnaíonn sláinte an néarchóras. Ina theannta sin, is féidir le Cistanche fás agus deisiú na gcealla néaróige a chur chun cinn, rud a fheabhsaíonn nascacht agus feidhm líonraí néaracha. Is féidir leis na héifeachtaí seo cabhrú le cuimhne, cumas foghlama, agus luas smaointeoireachta a fheabhsú, agus féadann siad cosc ​​a chur ar mhífheidhm chognaíoch agus galair neurodegenerative freisin.

Cliceáil fios forlíontaí chun cuimhne a threisiú

Murab ionann agus peptide E1, is féidir le peptide E2 comharthaíocht ERK a ghníomhachtú, rud a chuireann bás néarónach chun cinn. D’fhéadfadh móitífín Cx(1–2)Cx(3–4)Tx(0 –1)G E2 a bheith mar chúis leis seo ar féidir leis conair chomharthaíochta ERK a ghníomhachtú [28].

Tugann sé seo le fios go ndéanann peiptídí éagsúla a dhíorthaigh Netrin feidhmeanna éagsúla. Is iad príomhghabhdóirí Netrin-1 CCDnG agus baill de theaghlach UNC5 [50]. Tá ról DCC agus UNC5H2 in ICH fós conspóideach [51,52].

Tá seicheamh Netrin-1a d’aithin muid ríthábhachtach d’idirghníomhú Netrin-1 le DCC [19]. Tugann na torthaí seo le tuiscint go bhféadfadh DCC páirt a ghlacadh in téarnamh feidhme spreagtha Netrin tar éis ICH.

Tá gá le staidéir bhreise chun meicníochtaí bunúsacha na bpróiseas seo agus na conairí comharthaíochta gaolmhara a fhiosrú. I dturgnaimh amach anseo, déanfaimid measúnú ar airíonna bitheolaíocha peptide E1 chun a thocsaineacht agus a leathré a iniúchadh lena gcur i bhfeidhm go cliniciúil.

4. Ábhair agus Modhanna

4.1. Ainmhithe

Saotharlann sonrach saor ó phataiginí (SPF) a bhí sa tsaotharlann. Cuireadh gach lucha faoi chuimsiú 12-h timthriall éadrom-dorcha le soilse ar siúl ó 6 am go 6 pm agus sholáthair siad rochtain ar bhia ad libitum. Gineadh DCC+/- lucha mar a thuairiscítear roimhe seo [53].

Baineadh úsáid as suthanna de DCC +/ - lucha le haghaidh cultúr cortical néaránach. Rinneadh géinitíopáil trí imoibriú slabhra polaiméaráise (PCR) mar a thuairiscítear roimhe seo [53]. Ceannaíodh lucha C57BL/6J ó Beijing Huafukang Bioscience Co., Ltd. (Beijing, an tSín).

4.2. Tógann

Gineadh tógálacha slonn a ionchódaíonn DCC daonna (HGNC: 2701), Netrin daonna-1 (HGNC:8029), agus UNC5A daonna (HGNC: 12567) inár saotharlann [14,32,45].

pcDNA 3.1-hNetrin-1 (∆407–443)-myc-Cruthaíodh a chuid le Trealamh Clónála Comhthionól Gan uaim (Clone Smarter, C5891, SAM). Chonacthas seicheamh cDNA de hNetrin-1 (∆407–443) i dTábla Forlíontach S2.

Tógadh seichimh cDNA a chomhfhreagraíonn d’fhearann ​​FN5 deDCC agus aimínaigéid 407–443 de Netrin-1 trí ligation isteach sa veicteoir pGEX-5x{-1 chun próitéiní comhleá GST a tháirgeadh.

4.3. Bailiúchán Netrin-1 Meán Coinníollach

Bailíodh agus bailíochtaíodh an meán coinníollaithe netrin mar a mhínítear inár dtuarascáil roimhe seo [13,14]. Go hachomair, cuireadh Myc-His-clibáilte Netrin-1 daonna in HEK293Tcells.

Tar éis 24 h, nite na cealla 3 huaire le Opti-MEM (Invitrogen, 31985070, Carlsbad, CA, SAM) agus ansin goradh ar feadh trí lá in Opti-MEM gan serum.

Saibhríodh na meáin trí scagachán lártheifeacha (Millipore, UFC903096, Billerica, MA, SAM) agus a stóráil ag −80 ◦C. Saibhríodh Netrin-1 le frith-A agus rinneadh é a chainníochtú trí chomparáid a dhéanamh le BSA mar rialú lódála.

Rinneadh measúnú ansin ar éifeacht Netrin{{0}} trí fhosfarylation FAK. Go hiondúil, ba é 0.1 mg/mL de Netrin-1 a chothaíonn fosfarylation FAK go héifeachtach, agus úsáideadh an tiúchan seo inár gcuid staidéir. Ba é an ré spreagtha Netrin 20 nóiméad i ngach turgnamh mura gcuirtear a mhalairt in iúl.

4.4. Anailís Blot an Iarthair

Rinneadh blotáil an Iarthair mar a thuairiscítear roimhe seo [54]. Rinneadh na samplaí a anailísiú i maolán lysis (1% Nonidet P-40, 0.5% deocsacolaáit sóidiam, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 150 mM NaCl, 10% gliocról, 1% Triton X-100, 100 mM NaF, vanadate 1 mM, agus coscairí protease) chun cealla lyse agus fíochán inchinn úr.

Ba iad seo a leanas na príomh-antasubstaintí a úsáideadh: luch frith-DCC (1:500, #554223, BD, San Jose, CA, SAM ), frith-luiche (1:1000, TA-02, ZSGB-BIO, Beijing, an tSín ), luch frith-myc (1:1000, 22E8, Sungene Biotech, Tianjin, an tSín), luch frith-Netrin-1 (1:1000, ALX804838, Enzo Life Sciences, Farmingdale, Nua-Eabhrac, SAM ), luch frith-bhratach (1:1000, F3165, Sigma Aldrich, St Louis, MO, SAM), coinín frith-phospho-FAK(pTyr861) (1:1000, F9176, Sigma Aldrich, St Louis, MO, SAM), coinín frith-FAK (1:200, sc-557, Santa Cruz, Santa Cruz, CA, SAM), coinín frith-phosphoSRC (Tyr418)(1:1000, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) , coinín frith-SRC Teaghlaigh (1:1000, #2123, CST, Danvers, MA, SAM), luch frith-GAPDH (1:5000, TransGene Biotech, Beijing, an tSín), luch frith-beta actin (1:3000, A5441, Sigma Aldrich, St Louis, MO, SAM), coinín frith-phospho-ERK(Thr202/Tyr204) (1: 1000, #9101, CST, Danvers, MA, SAM), rabbitanti-ERK (1:1000, # 4695, CST, Danvers, MA, SAM), ceannaíodh antasubstaint thánaisteach HRP-chomhchuingeach in aghaidh lucha, gabhar nó coinín ó Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, SAM).

4.5. Ceangal Dromchla Cill

Aistríodh cealla HEK293 atá plátáilte ar chlúdaigh chlúdaigh le plasmids Flag-DCC ag baint úsáide as modh fosfáit chailciam mar a thuairiscítear roimhe seo [55]. Timpeall 40 h tar éis aistrithe, goradh na cealla le 100 µg/mL myc-Netrin-1 nó myc-Netrin-1 (∆407–443) le haghaidh30 min sula nitear é ar feadh 5 nóiméad le HBHA (20 mM HEPES, pH 7.0, agus 0.5 mg/mLBSA i HBSS), rinsithe le 1 × PBS, agus socraithe go seicheamhach le paraformaildéad 4% iPBS ar feadh 10 nóiméad. Ba iad na príomh-antasubstaintí a úsáideadh ná antasubstaintí frith-myc coinín (1:200, Abcam,ab9106, Cambridge, MA, SAM) agus frith-bhratach luiche (1:100, Sigma Aldrich, F3165).

Ba iad na hantasubstaintí tánaisteacha a úsáideadh ná antasubstaintí asail-fhrith-choinín comhchuingeach Alexa Fluor (1:1000; Invitrogen, A21206) agus Alexa Fluor 546-frith-luch gabhair(1:1000; Invitrogen, A10036); . Bhí na núicléis dhaite le 40,6-dé-aimín{-2-feinilindól (DAPI) (Thermo Fisher, Waltham, MA, SAM). Fuarthas na híomhánna go léir le micreascóp comhfhócasach Zeiss LSM 880.

4.6. GST Tarraingt-Síos

Rinneadh próitéin chomhleá GST-DCC a íonú le coirníní glutathione-SepharoseTM 4B (GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, RA) ag prótacal an mhonaróra.

Goradh thart ar 500 µg de lysate cille ó chealla HEK293T a aistríodh leis na plasmids léirithe le 2-5 µg de mhaolán próitéine inRIPA comhleá GST-DCC-FN5 ag 4 ◦C thar oíche. Baineadh úsáid as coirníní Glutathi-one-SepharoseTM 4B chun próitéin comhleá GST-DCC-FN5 agus a próitéiní idirghníomhaithe a ghabháil. Scaoileadh na próitéiní ceangailte isteach sa mhaolán luchtaithe próitéine trí dhínádúrú teasa.

4.7. Cultúr Néaróin Cortical Bunscoile

Rinneadh néaróin cortical bunscoile a chothú mar a thuairiscítear roimhe seo [56]. Go hachomair, baineadh suthanna (E17) ó lucha ainéistéiseach a bhí ag iompar clainne. Bhí na cortices cerebral scartha agus mionghearrtha i bpíosaí beaga.

Tar éis gortha in {{0}.125% Trypsin Plus le 0.05%DNase i HBSS ag 37 ◦C ar feadh 20 nóiméad, trituraíodh na cealla le pípéid Pasteur gloine tine-snasta agus scagtha le scagaire 40 µm.

Cuireadh cealla dissociated ar fionraí i DMEM le 10% FBS agus plátáilte ar miasa polai-D-lísín-brataithe nó clúdaigh clúdaigh gloine ag 37 ◦C in atmaisféar 5% CO2. Tar éis 4 h, cuireadh meán neurobasal arna fhorlíonadh le B27 agus GlutaMAX in ionad an mheáin.

4.8. Prótacail Cultúir agus Cóireála Cealla NLT

Rinne ár saotharlann cothabháil ar chealla néaránacha Luiche GnRH-léirithe (NLT). Fásadh NLTcells i DMEM (Sigma Aldrich, St Louis, MO, SAM) ina raibh 10% FBS (Tionscail Bhitheolaíocha, Kibbutz Beit Haemek, Iosrael) agus 1% peinicillin/streiptimícin (Thermo FisherScientific, Waltham, MA, SAM) ag 37 ◦C faoi. atmaisféar tais de 95% aeir agus 5% CO2.

Chun néarthocsaineacht hemin a chinneadh, cuireadh tiúchain éagsúla (0, 10, 30, 60, 90, agus 120 µM) de hemin (Sigma-Aldrich) le cealla NLT agus cuireadh cóireáil orthu ar feadh 6 h. Roghnaíodh 60 µM (LD50) de na tiúchain seo agus úsáideadh iad sna turgnaimh ina dhiaidh sin.

Níor caitheadh ​​ach le grúpaí rialaithe le feithicil (DMSO). Rinneadh inmharthanacht cille agus Beo/ Marbh-shainiú 6 h tar éis cóireála. Baineadh úsáid as trí thobar do gach grúpa. Rinneadh na turgnaimh 3 huaire ar a laghad.

4.9. Múnla In Vitro de Bhás Cille de bharr Hemin

Spreagadh bás cille i néaróin cortical príomhúla agus cealla NLT trí chóireáil le 50µM agus 60 µM hemin, faoi seach, mar a thuairiscítear roimhe seo [57,58]. Díscaoileadh Hemin 0.1 M NaOH chun tuaslagán stoic a ghiniúint. Maidir leis na staidéir neuroprotection, déileáladh le cealla le hemin 6h i láthair gníomhairí ainmnithe nó uisce driogtha dodhúbailte tuaslagtha seiléinít sóidiam.

4.10. CCK-8 Measúnú

Rinneadh inmharthanacht cille a thomhas leis an measúnacht CCK-8 (CK04, Dojindo, Kumamoto, an tSeapáin) mar a thuairiscítear roimhe seo [59]. Go hachomair, síolaíodh Neuronal i 96-plátaí tobair ag dlús 6000 cill/tobar i meán saothraithe 100 µL agus cuireadh sa ghorlann iad thar oíche.

Cóireáladh cealla le Hemin ar feadh 6 h. Nitear na cealla néarónacha in imoibrí réamhthéite PBS (37 ◦C) agus CCK-8 (10 µL in aghaidh 100 µL meán) i ngach tobar.

Tar éis sin, ghoradh muid na plátaí ar feadh 2 h in atmaisféar 5% CO2, agus tomhaiseadh an t-ionsúcht ag 450 nm ag baint úsáide as léitheoir amicroplate. Léiríodh inmharthanacht cille mar faoin gcéad den rialú (cealla neamhchóireáilte).

4.11. Dathú Beo/Marbh

Fíoraíodh cumas an mheasúnaithe CCK-8 chun inmharthanacht a thomhas trí smálú le calceinAM/PI i PBS (Live/Marbh Assay, KeyGEN BioTECH, Nanjing, An tSín) de réir threoracha an déantóra.

Is éard a bhí sa tuaslagán ruaimnithe ná imoibrí 2 µM calcein AM agus imoibrí 8 µM PI measctha i PBS. Goradh samplaí ar feadh 30 nóiméad agus rinneadh iad a íomháú ag baint úsáide as lionsa 20xobjective de mhicreascóp fluaraiseachta (Olympus FSX100, Tóiceo, an tSeapáin). Baineadh úsáid as íosmhéid de 3 chultúr cille neamhspleácha don mhúnla in vitro de bhás cille de bharr heimín.

4.12. Sintéis Peptide agus Riarachán

An Pep Ctrl (NH2-TPCCGKTDVGI-CONH2), Pep E1 (NH2- HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2), Pep E2 (NH2- CPCKDGVTGIT-CONH2), Tat (NH{{11} }YGRKKRRQRRR-CONH2), TE1 (NH2- YGRK-KRRQRRR-HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2), FITC lipéadaithe TE1 (NH{2-YGRK-KRRQRRR-HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2), FITC lipéadaithe (Pe{P)CONH2), FITC ! TTGQ-CONH2) agus Brat lipéadaithe Cheannaigh cuideachta Shanghai GL Biochem (Shanghai, China) agus cuideachta Wuhan Bioyeargene Biosciences (Wuhan, an tSín) peiptídí Pep E2 (NH{2- DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK-GGGGSCPCKDGVTGIT-CONH2) peiptídí le 99% íonachta.

For more information:1950477648nn@gmail.com