Déanann Bithábhar Frithocsaídeach Nádúrtha Nua Ó Cinnamomum Osmophloeum Kanehira Duilleoga Represses Melanogenesis Agus Cosnaíonn in aghaidh Damáiste DNA

Teagmháil: ali.ma@wecistanche.com

Yung-Shu Ho 1, Jane-Yii Wu 1,* agus Chi-Yue Chang 2

Coimriú:Is speiceas crann dúchasach é Cinnamomoum ​​osmophloeum Kanehira (COK) i gcomhdhéanamh Taiwan.frithocsaídeachgníomhaíocht, muisiriúntyrosinaseScrúdaíodh cosc, sintéisiú melanin, agus cosaint i gcoinne damáiste DNA hidreasol ó na duilleoga COK trí dhriogadh gaile. Rinneamar 1, 1-défheinil-2- scavening radacach picrylhydrazil, chelating ian miotail, laghdú cumhachta, agus cumas frithocsaídeach coibhéiseach Trolox (TEAC) agus shocraigh muid na comhghaolta idir ábhar feanólach iomlán agus gníomhaíochtaí frithocsaídeacha. Léiríodh sna torthaí go bhfuil dlúthbhaint idir airíonna frith-ocsaídiúcháin COK hidrosol agus a n-ábhar feanólacha. Ina theannta sin, bhí éifeachtaí frith-tyrosinase ag brath ar dháileog ar phríomh-chomhábhair hidrosol, ie, cinnamaldehyde agus beinsaldehyde, i gcoinne gníomhaíochtaí monophenolase agus diphenolase. Nocht anailís GC-MS gurb iad na comhpháirteanna bithghníomhacha móra de hidreaól ná tras-cinnamaldehyde (87.7 faoin gcéad), beinsaildéad (7.0 faoin gcéad ), agus aicéatáit cinnamile (5.3 faoin gcéad ). Ina theannta sin, fuaireamar amach go bhfuil an hidreasol le láithreacht beinsaldéad níos láidre ná cinnamaldehyde íon, agus cuireann sé feabhas ar an méid.tyrosinasegníomhaíocht choisctheach hidreasol. In anailísí cinéiteach, thaispeáin ceapacha agus replots Lineweaver-Burk gur coscaire de chineál measctha é COK hydrosol. Ina theannta sin, fuaireamar amach go bhfuil dáileoga an-íseal de COK hidrosol athbhrú - melanocyte-spreagtha sintéis hormone-spreagtha den fachtóir trascríobh a bhaineann le micreaphthalmia, as a dtagann laghdú ar shintéis melanin i B16-F10melanoma cealla. Léirigh na torthaí seo go bhféadfadh táirgeadh hidrea-soil ó dhuilleoga COK trí úsáid a bhaint as driogadh gaile foinse shábháilte agus éifeachtach a sholátharcraiceann-ag fiuchadhgníomhairí le haghaidh feidhmeanna cosmaidíand cógaisíochta, lefrithocsaídeach, gníomhaíochtaí frith-tyrosinase, frith-melanogenesis, agus DNAprotective.

Eochairfhocail: frithocsaídeachgníomhaíocht; Osmophloeum Cinnamomoum; hidreasol;tyrosinasegníomhaíocht choisctheach;ag fiuchadh; Éifeachtaí cosanta damáiste DNA

Cliceáil chunCistanchegas agus táirge do chraiceann whitening

1. Réamhrá

Tá neamhoird chraiceann an duine mar lentigo, spotaí aoise, melasma, agus melanomas urchóideacha nasctha le foirmiú agus carnadh melanin [1]. Cosc ar tyrosinases agus melanogenesiscan neamhoird dermatological a fheabhsú agus siondróm hyperpigmentation. Ina theannta sin, tá méadú tagtha le déanaí ar an margadh domhanda le haghaidh oibreáin bhánaithe an chraicinn agus táirgí cosmeceutical mar is fearr le go leor daoine a bhfuil craiceann níos dorcha orthu dath an chraiceann éadrom [2]. Dá bhrí sin, éifeachtach agus sábháiltetyrosinaseagus meastar go bhfuil coscóirí sintéise melanin tábhachtach chun tinneas pigmentation a chosc agus saincheisteanna sláinte daonna eile a bhaineann le melanin [3,4]. Ina theannta sin, cuireann tocsainí comhshaoil ​​strusanna éagsúla ocsaídiúcháin ar an duine, agus féadann siad speicis nítrigine imoibríocha nó speicis imoibríocha ocsaigine (ROS) a tháirgeadh [5]. Tá baint ag fréamhacha saor in aisce iomarcacha agus ROS le bealaí comharthaíochta athlastacha, rud a fhágann damáiste cheallacha, dul in aois, neamhoird néaracha, diaibéiteas, atherosclerosis, athlastach, galar cardashoithíoch, ailse, agus melanogenesis [6,7]. Tugann roinnt staidéir le fios go bhfuilfrithocsaídeoiríis féidir cosc ​​a chur ar dhamáistí brú ocsaídiúcháin trí ghníomhú mar scavengers radacach saor in aisce nó ROSscavengers [7,8]. Thairis sin, féadfaidh an dá inhibitors giniúna ROS agus scavengers ROS táirgeadh melaninpigments a laghdú [9]. Go sonrach,tyrosinaseIs eochair-einsím í a chatalaíonn stepat teorannaithe ráta an chéad dá chéim le linn na bpróiseas sintéise melanin [10], agus síos-rialáil tyrosinaseis sprioc ríthábhachtach chun tinneas craicinn a chosc agus a tháirgeadhcraiceann-bhánúgníomhairí [11]. Dá bhrí sin, tá sé ríthábhachtach frithocsaídeoirí nádúrtha a fhorbairt a chuireann bac ar tyrosinases go héifeachtach chun hipearpigmentation craiceann neamh-inmhianaithe a chosc agus cosaint i gcoinne damáiste DNA.

Is speiceas cainéil dhúchasach na Téaváine é Cinnamomum osmophloeum Kanehira (COK) a bhfuil go leor úsáidí aige mar leigheas luibhe Síneach. Léiríonn comhdhúile gníomhacha blátholaí COK cumas sármhaith mar antibacterials cógaseolaíochta [12]. Cé gur léirigh staidéir roimhe seo ar eastóscáin alcóil duilleoga COK gníomhaíochtaí frith-tyrosinase, dhírigh beagnach gach ceann de na staidéir seo ar eastóscáin eatánól nó blátholaí ó COK. Ina theannta sin, níor tuairiscíodh aon staidéir chainníochtúla agus chórasachafrithocsaídeachmaoine,tyrosinasegníomhaíochtaí coisctheacha agus faoi chois sintéise melanin ag waterextracts (hydrosol) de COK duilleoga. Mar sin, rinneadh an staidéar seo chun imscrúdú a dhéanamh ar éifeachtaí COK hydrosol ar strus ocsaídiúcháin agus melanógenesis i gcealla melanoma B16F10 agus chun cosaint a dhéanamh i gcoinne damáiste DNA. Is é an staidéar seo an chéad tuarascáil mhionsonraithe ar an gcomhdhéanamh ceimiceach agusfrithocsaídeach,cosc tyrosinase, melanogenesis faoi chois, agus gníomhaíochtaí cosanta damáiste DNA de hydrosoló duilleoga COK.

2. Ábhair agus Modhanna

2.1. Ceimiceáin agus Antasubstaintí

Muisiriúntyrosinase, hiodrocsatailéin bhúitileach (BHT), -tócaifearól, 6-hiodrocsa-2,5,7,8-teitrimeitilcróman-2-aigéad carbocsaileach (Trolox), aigéad tríchlóraaicéiteach (TCA), galach aigéad, potaisiamfheiricíníd, clóiríd fheiriúil, clóiríd neamhfheiriúil, ferrozine, 1,1-défheinile-2-picrylhydrazil (DPPH),2,20-azino-bis-3-ethylbenzthiazoline{{14} } aigéad sulfónach (ABTS), imoibrí Folin-Ciocalteu, L-tyrosine, agus L-3,4-déhidrocsafheiniolalainín (L-DOPA) ó Merck Co. (Darmstadt, an Ghearmáin). agus tuaslagóirí a úsáideadh sa staidéar a bhí de ghrád anailíseach nó de chrómatagrafaíocht leacht ardfheidhmíochta. Fuarthas antasubstaintí i gcoinne fachtóir trascríobh a bhaineann le micreaphthalmia (MITF) agus -actin ó Cell Signaling Technology (Danvers, MA, SAM) agus Sigma Chemical Co. (St. Louis, USA), faoi seach.

2.2. Ullmhú Hidreasóil: Sliocht as Duilleoga COK Ag Úsáid Driogadh Gaile

Aerthriomaíodh duilleoga ó chrann COK 13-bliain d'aois sa Téaváin (Uimh. 186, Bóthar Yongping, Zhongliao Township, Nantou County, Taiwan). Ag baint úsáide as grinder cruach dhosmálta, cuireadh na duilleoga isteach i bpúdar mín (níos lú ná < 10="" mogall)="" agus="" ansin="" stóráiltear="" iad="" ag="" teocht="" an="" tseomra.="" ansin,="" baineadh="" 3.5="" kg="" de="" phúdar="" duille="" cok="" triomaithe="" ag="" baint="" úsáide="" as="" driogadh="" gaile="" ar="" feadh="" 4="" h.="" rinneadh="" an="" próiseas="" seo="" arís="" agus="" arís="" eile="" ceithre="" huaire.="" ag="" baint="" úsáide="" as="" bhfolús,="" rinneadh="" an="" sliocht="" a="" scagadh="" agus="" ansin,="" ag="" baint="" úsáide="" as="" evaporator="" rothlach,="" fuarthas="" an="" sliocht="" tirim="" (fíor="" 1).="" rinneadh="" an="" sliocht="" a="" ghalú="" ar="" deireadh="" chun="" meáchan="" deiridh="" a="">

2.3. Crómatagrafaíocht Gháis/Mais-Speictriméadracht (GC/MS) Anailís ar Hidreasol

Ionstraim Thermo-GC/MS ag a bhfuil THERMO WaxMS tras-nasctha 5 faoin gcéad feinil- 95 faoin gcéad colún ribeach meitiolpolasiloxane (60 m × 0.25 mm id, tiús scannáin {{1 Baineadh úsáid as 0}}.25 µm) le héiliam mar ghás iompróra ag ráta sreafa tairiseach 1.0 mL/nóiméad. Coinníodh an colún ag 200 ◦C ar feadh5 nóiméad tar éis an insteallta agus ansin téadh é ag 5 ◦C/min go 260 ◦C. Instealladh ola riachtanach íon (1.0 mL) le cóimheas scoilte de 1:100. Ba é teocht an injector, an líne aistrithe agus an fhoinse ian ná 250 ◦C, 250 ◦C, agus 200 ◦C, faoi seach. Rinneadh braite MS sa mhodh imbhuailte leictreoin ag 70 fuinneamh eVionisation agus 60 µA sruth ianúcháin; oibríodh an ionstraim i mód fála lánscála sa raon 50–350 amu. Aithníodh comhdhúile trí amanna coinneála agus innéacsanna buaiceanna crómatagrafaíochta a chur i gcomparáid leo siúd de chaighdeáin thagartha bharántúla, arna instealladh faoi na coinníollacha céanna. Cuireadh patrúin ilroinnte MS i gcomparáid leo siúd de chomhdhúile íon, agus rinneadh cuardach ar an mbunachar sonraí massspectrum ag baint úsáide as bunachar sonraí MSspectral na hInstitiúide Náisiúnta um Chaighdeáin agus Teicneolaíocht (NIST) [13].

2.4.Ábhar Feanólach Iomlán

Cinneadh ábhar feanólach iomlán (TPC) na sleachta ag baint úsáide as an assayas Folin-Ciocalteu cur síos orthu roimhe seo [14]. Go hachomair, meascadh samplaí hidreasóil (100 µL) le aliquots 100 µL d’imoibrí Folin–Ciocalteu (10-caolú fillte) agus slánscríbhinní 10 µL de charbónáit sóidiam (10 faoin gcéad , w/v).Tar éis stórála ar feadh 30 nóiméad, déanfar an tomhaiseadh ionsúiteacht ag 735 nm. Cuirtear TPCanna in iúl mar choibhéis aigéid ghalla (GAE) i mg in aghaidh 100 g d'ábhar úr.

2.5. Measúnachtaí Snámha Radacacha Saor in Aisce DPPH

Mar a thuairiscítear roimhe seo, ag baint úsáide as measúnacht DPPH, socraíodh gníomhaíochtaí scavenging radacach hidreasol [15], le modhnuithe. Go hachomair, cuireadh caoluithe éagsúla de shamplaí hidreasóil (75 µL trí chóip) le 150 µL slánchuid de DPPH (0.02 g/100 mL) agus tomhaiseadh ionsúiteacht ag 517 nm tar éis 30 nóiméad. Baineadh úsáid as BHT mar rialú dearfach (0.5 mg / mL eatánól). Léiríodh gníomhaíochtaí scavenging radacach mar chóimheasa coiscthe ( faoin gcéad ) ag baint úsáide as an gcothromóid seo a leanas:

An cóimheas coiscthe( faoin gcéad )=[1 − (A/B)] × 100 faoin gcéad

áit arb é A ionsúntacht an tsampla hidreasóil agus gurb é B ionsúchán an bháin.

2.6. Comhchruinnithe Coiscthe Codánacha

Rinneadh measúnachtaí ar thiúchan coisctheacha codánacha (FIC) mar a thuairiscítear roimhe seo [16], le modhnuithe. Go hachomair, meascadh FeSO4 (20 µL; 2 mM) le caoluithe difriúla hidrea-shamplaí (200 µL). Tar éis ferrozine a chur leis (40 µL; 5 mM), ceadaíodh imoibrithe dul ar aghaidh ar feadh 10 nóiméad agus ansin tomhaiseadh ionsúiteacht ag 562 nm. Ina theannta sin, baineadh úsáid as 0.5 mg/mL eitiléine diamine aigéad tetraaicéiteach (EDTA) mar rialú dearfach. Ríomhadh céatadán an choisc ar ferrozine-Fe2 móide foirmiú coimpléisc ag baint úsáide as an bhfoirmle seo a leanas:

Iarmhairt chealaithe miotail ( faoin gcéad )=[1 − (A/B)] × 100 faoin gcéad

áit arb é A ionsúntacht an tsampla hidreasóil agus gurb é B ionsúchán an bháin.

2.7. Measúnachtaí Cumhachta a Laghdú

Socraíodh cumhacht laghdaithe COK hydrosol trí mhonatóireacht a dhéanamh ar laghdú Fe3 móide toFe2 móide mar a thuairiscítear roimhe seo [17], le modhnuithe. Go hachomair, go dtí 50 µL caolaithe hidreasóil, bhí 50-µLaliquots de mhaolán fosfáite (pH 6.6, 200 mM) agus 50-µL aithisc de fheiricíaníd photaisiam (1 faoin gcéad , w/v) curtha leis. Tar éis gor ag 50 ◦C ar feadh 20 nóiméad, cuireadh 50 µL den ACCán (10 faoin gcéad , w/v); agus lártheifneoiríodh an meascán ag 9,000 rpm ar feadh 3 nóiméad. Ar deireadh, meascadh comhshnáthán 50 µL le huisce driogtha 50 µL agus clóiríd ferric 50 µL in uisce (0.1 faoin gcéad , w/v), agus tomhaiseadh ionsúiteacht ag 700 nm in aghaidh folamh tar éis 10 nóiméad den am imoibrithe. Ba iad na rialuithe dearfacha a úsáideadh ná hiodrocsaitolúéin bhúitileach (BHT) agus -tócaifearól.

2.8. Measúnacht ar Acmhainn Frithocsaídeach Coibhéiseach Trolox (TEAC).

Frithocsaídeachrinneadh gníomhaíochtaí COK hydrosol a mheasúnú de réir modh a thuairiscítear roimhe seo [15,18], le modhnuithe. Go hachomair, caolaíodh tuaslagán tiubhaithe cataithe radacach ABTS (ABTS• móide ) i saline maolánach fosfáite (pH 7.4) go dtí ionsúchán deiridh de 0.80 ± 0.05 ag 734 nm. Tar éis sampla (0.02 mL) a mheascadh le tuaslagán 1 mL ABTS móide, bhí laghduithe ar ionsúchán ag 734 nm tar éis 5 min.Trolox a úsáid mar chaighdeán, agus cuireadh gníomhaíochtaí hydrosol in iúl mar TEAC trí chuair chalabrú Trolox a bhreacadh. Ríomhadh luachanna coibhéiseacha molar TEAC de shamplaí hidreasóil de réir laghduithe ar ionsú tuaslagán Trolox. Baineadh úsáid as BHT agus -tócaifearóil mar rialuithe dearfacha.

2.9. Éifeachtaí Hidreasol ar Chosc ar Muisiriún Tyrosinase

MuisiriúntyrosinaseRinneadh gníomhaíocht a thomhas ag baint úsáide as anailís speictrophotiméadrach mar a thuairiscítear roimhe seo, le modhnuithe [19]. Go hachomair, cuireadh 20 µL L-tyrosine nó 20 µL L-DOPA i PBS (pH 6.8; 80 µL) agus 80 µL PBS le hidreasól tástála nó gan é isteach i 96-mhicrphlátaí tobair, agus ansin cuireadh 20 µL mushroomtyrosinase (100 U/ mL) curtha leis. Tar éis meascadh agus goir ag 37 ◦C ar feadh 20 min, socraíodh dopachromeproduction (nó tomhaltas) sa mheascán imoibrithe ag ionsúchán 475 nm. Baineadh úsáid as aigéad Kojic, a chuireann bac ar tyrosinase, mar rialú dearfach. Rinneadh an céatadán coiscthe tyrosinase a ríomh mar seo a leanas:

Cosc ( faoin gcéad ) ≡ ​​{[(A − B) − (C − D)]/(A − B)} × 100 faoin gcéad

nuair a léiríonn A ionsúiteacht le heinsím in éagmais sampla hidreasóil, léiríonn B ionsúchán gan sampla einsím nó hidreasol, léiríonn C ionsúiteacht le heinsím, agus hidreasol agus ionsúiteacht gan an einsím ach le hidreasol. Rinneamar 50 faoin gcéad a ríomh freisintyrosinasetiúchan coisctheach (IC50) samplaí mar iad siúd a chuireann bac ar ghníomhaíocht tyrosinase faoi 50 faoin gcéad .

2. 10. Anailís Chinéiteach ar Chosc ar Muisiriún Tyrosinase

I meascáin imoibrithe bhí 20 µL de L-tyrosine nó L-DOPA (0.25 mg/mL) mar fhoshraitheanna, 100 µLof tyrosinase muisiriún (20 aonad/mL) i maolán fosfáite sóidiam 0.2 M ( pH 6.8) agus 80 µL de gach sampla hidreasol i dtoirt iomlán 200 µL. Rinneadh an mheasúnacht ag 25 ◦C, agus cinéitic coisctheach gach sampla hidreasóil letyrosinaseRinneadh anailís ar cheapacha Lineweaver-Burk. Baineadh úsáid as an chothromóid chómhalartach le haghaidh cothromaíochta tapa ón gcosc neamhiomaíoch de chineál measctha, mar a chuirtear in iúl i gcothromóid (1) [20]. Measadh luachanna Ki do shamplaí hidrea-soil ó athchló fána (Cothromóid (2)).Ríomhadh na luachanna Ki do hidreasól ón aisléamh idircheapa ais 1/v (Cothromóid (3)),

áit a bhfuil Vmax an treoluas uasta antyrosinasegníomhaíocht, Ksis tairiseach díthiomsaithe an tsubstráit (S) ón gcoimpléasc einsím-tubstráit (ES), Kiis tairiseach díthiomsaithe an choisceora[I] ón gcoimpléasc einsím-choiscthe agus Kiis tairiseach díthiomsaithe an choisceora ón tsubstráit theeinsíme -coimpléasc inhibitor (ESI).

2. 11. Measúnachtaí ar Chultúr na gCeall agus ar Inmharthanacht na gCeall

Fuarthas cealla meileanoma B16-F10 (BCRC60031) ón mBailiúchán Bith-acmhainní agus ón Ionad Taighde (BCRC), Taiwan. Saothraíodh na cealla B16-F10 i meán modhnaithe Eagle Dulbecco (Gibco, California, SAM) ina raibh 10 faoin gcéad FBS ag 37 ◦C i 5 faoin gcéad CO2. Trí trypsinization, baineadh cealla. Rinneadh inmharthanacht na gceall a thomhas ag baint úsáide as measúnacht 3-(4,5-démheitiol-thiazol-2-il)-2,5-défheiniltetrasoliumbromide (MTT) mar a chuir Lee síos air [15 ].

2.12. Clár Melanin Cellular

Tomhaiseadh an t-ábhar meileanin ag baint úsáide as an modh a ndearna Lee cur síos air. [15]. Go hachomair, saothraíodh cealla B16-F1{0 i 6-phlátaí toibreacha ag dlús 0.8 × 105cill in aghaidh an tobair agus goraíodh iad ar feadh 24 h. Ansin rinneadh cealla cóireáilte le hormón a spreagann {{8}nM -melanocyte-spreagthach (-MSH), aigéad kojic (rialú dearfach) agus hidreasol ag tiúchana éagsúla ar feadh 24 h. Tar éis níocháin faoi dhó le PBS, rinneadh maolán a dhéanamh ar chealla ina raibh fosfáit sóidiam 100 mM (pH 6.8), 1 faoin gcéad Triton X-100 agus fluairíd feinilmethanesulphonyl 0.1 mM agus a stóráil ag −80 ◦C ar feadh 30 nóiméad. Tar éis na cealla a bhailiú, díscaoileadh an millíní cille 1N NaOH ina bhfuil 10 faoin gcéad DMSO ag 65 ◦C ar feadh 1 h. Ina dhiaidh sin, tomhaiseadh ionsúiteacht ag 405 nm.

2.13. Blot an Iarthair

Rinneadh liostáil ar chealla mar a thuairiscítear i Roinn 2.11 agus cuireadh faoi deara iad a snothú san Iarthar le haghaidh próitéine MITF a úsáideann antashubstaint Frith-MITF.

2.14. Measúnachtaí Cosanta DNA

Cinneadh damáiste DNA ocsaídiúcháin de réir tiontú DNA ciorclach supercoiledpCI neo plasmid isteach i bhfoirmeacha ciorclach nicked nó díghrádaithe breise ag baint úsáide as modh a thuairiscítear roimhe seo [21,22] le modhnuithe beaga. I meascáin imoibrithe de 20 µL bhí 2.5 µL de shárchoiledpCI neo (150 ng/µL), 10 µL de thuaslagán imoibriúcháin Fenton ina raibh sárocsaíd hidrigine 30 mM, 100-µMferric clóiríd agus 100 Aigéad ascorbic µM i maolán Tris-HCl 20 mM (pH 7.6), agus 5µL de hidreasol (0.3325–5.32 mg/mL) nó quercetin (rialú dearfach; 250 µg/mL). Goradh meascáin imoibrithe ag 37 ◦C ar feadh 30 nóiméad agus scartha foirmeacha DNA plasmid ar glóthacha agarose 0.7 faoin gcéad agus dathaíodh iad ag baint úsáide asSafeView™ (Ábhair Bhitheolaíocha Fheidhmeacha (ABM) Inc., Richmond, Ceanada).

Chun leath-chainníochtúfrithocsaídeachrinneadh gníomhaíochtaí na n-sleachta, cainníochtaí foirmeacha supercoiled agus leasaithe de PCI neo ag baint úsáide as ionstraim AlphaImager Mini (próitéinsimple), agus cainníochtaíodh glóthacha intensitieson banna agarose ag baint úsáide as bogearraí Gelpro. Mar rialuithe diúltacha agus dearfacha, goraíodh neoplasmid pCI ina n-aonar agus le meascán imoibrí Fenton, faoi seach. Cuirtear sonraí in iúl mar chainníochtaí DNA supercoiled i gcoibhneas leis sin (100 faoin gcéad ) i rialuithe diúltacha. Ríomhadh gníomhaíochtaí cosanta sliocht ó chainníochtaí DNA plasmid supercoiled agus nick ag baint úsáide as na cothromóidí seo a leanas [23]:

Cosaint ar plasmid( faoin gcéad ) sárchoiled =foirm shárchoiled déinepCI neodéine banda DNA × 100

Cosaint ar phlasmid ( faoin gcéad ) nite ) =foirm nite déinepCI neodéine banda DNA × 100

2.15. Anailís staitistiúil

Sloinntear na sonraí go léir mar mhodh ± diall caighdeánach (SD). Aithníodh difríochtaí idir cóireálacha trí úsáid a bhaint as t-thástáil an Mhic Léinn nó ANOVA agus tástáil Scheffe ina dhiaidh sin. Measadh go raibh difríochtaí suntasacha nuair a bhí p <>

3. Torthaí agus Plé

3.1. Comhdhúile So-ghalaithe i Hidreasol a Aithint

Rinneadh anailís ar inneachar na hidrea-sól ag baint úsáide as GC/MS. Aithníodh comhpháirteanna de réir amanna coinneála na gcaighdeán agus socraíodh cainníochtaí ó bhuaic-réimsí na n-eilimintí (Fíor 2). Mar atá leagtha amach i bhFíor 2A–D, ba chomhdhúile téamacha iad tras-cinnamaldehyde, beinsaildéad, agus aicéatáit cinnamile i COK hidreasol agus bhí siad i láthair ag 87.7 faoin gcéad , 7.0 faoin gcéad , agus 5.3 faoin gcéad , faoi seach. Fuarthas Eugenol roimhe seo i blátholaí ó C. verum ag 7.29 faoin gcéad [24] ach níor aimsíodh é sa hidrosol presentCOK (Fíor 2). D’fhéadfadh difríochtaí i bpróisis eastósctha agus i modhanna measúnaithe cur leis na difríochtaí in inneachar cinnamaildéad na blátholaí C. cassia [25].

3.2. Airíonna Frithocsaídeacha Hidreasóil ó Dhuilleoga COK

3.2.1. Gníomhaíocht Scavening Radacach DPPH

I bhFíor 3A, bhí gníomhaíochtaí scavening radacach DPPH de hidrea-sól ó 1.06×10 -2 go 5.32×10−1 mg/mL idir 5.04. faoin gcéad ± 0.96 faoin gcéad agus 41.76 faoin gcéad ± 2.50 faoin gcéad, faoi seach. Léiríonn na sonraí seo scavening radacach dáileog-spleách ag hidreasol COK. I gcomparáid leis sin, na rialuithe dearfacha BHT agus -tócaifearóil scavenged 94.32 faoin gcéad ± 0.08 faoin gcéad agus 93.82 faoin gcéad ± 0.13 faoin gcéad de radacach imoibríoch DPPH, faoi seach, ag 0.5 mg/mL.Is dócha go bhfuil gníomhaíocht scavenging radacach COK hidrosol mar gheall ar cinnamuredhyde (F) ） Léiríonn staidéir go leor go feanólics agus flavonoids cosc ​​ar fhoirmiú na fréamhacha DPPH trí bhronnadh adaimh hidrigine. Mar sin, d’fhéadfadh gníomhaíochtaí mar dheontóir hidrigine a léiriú freisin i ngníomhaíochtaí scavenála radacacha DPPH speiceas Cinnamomum [26,27].

3.2.2. Miotal ian Chelation

Rinneamar measúnú ar chumas ceangailteach Fe2 móide hidrea-sól ag 1.06 × 10-3 agus 5.32 × 10 - 1 mg / ml, mar a thaispeántar i bhFíor 3A. Mhéadaigh chelation miotail ag comhpháirteanna hidreasol beagán le tiúchan, ach ag 6 mg/mL, ní raibh ach 37.3 faoin gcéad de ghníomhaíocht chelating EDTA (Fíor 3A).

3.2.3. Cumhacht a Laghdú

Mar a léirítear i bhFíor 3A, bhí cumhacht laghdaithe na gcomhpháirteanna hidreasóil ag brath ar thiúchan agus bhí sé níos airde ná iad siúd BHT agus -tócaifearóil (0.22 ± 0.01 agus {{9 }}.33 ± 0.15, faoi seach) ag 0.5 mg/mL. I staidéir roimhe seo, bhí cumhacht laghdaithe na n-amhábhar as craobhóga C. osmophloeum codáin inBuOH an ceann ab airde i measc na gcodán go léir agus mhéadaigh sé go líneach le tiúchan [28].frithocsaídeachdifríocht idir poitéinseal comhdhúile i eastóscáin, gníomhaíochtaí frithocsaídeacha foriomlán na n-sleachta ag brath go mór ar an tuaslagóir eastóscadh. Mar sin féin, bhí an chumhacht laghdaitheora (luach OD {{0}}.7) d'eastóscáin uisce as craobhóga C. osmophloeum cosúil (luach OD=0.66 ± 0.01) leis an láthairC. hidreasholas osmophloeum (Fíor 3A), a táirgeadh trí úsáid a bhaint as driogadh gaile. Poweris a laghdú a bhaineann go ginearálta le láithreacht gníomhairí laghdaithe agus gníomhaíocht frithocsaídeach, rud a léiríonn scor d'imoibrithe slabhra radacach saor in aisce trí sholáthar adaimh hidrigine a laghdú. Is dócha gur mar gheall ar láithreacht na ngrúpaí hiodrocsaile i gcomhdhúile feanólacha (Fíor 2), a d'fhéadfadh feidhmiú mar dheontóirí leictreon, is cúis le cumhacht laghdaitheach C. osmophloeum.

3.2.4. Measúnachtaí TEAC

Méadaíodh luachanna TEAC an hidreasóil reatha ag tiúchain níos airde ná 5.32 × 10−3 mg/mLand a bhí níos airde ná iad siúd de na comhdhúile tagartha -tócaifearóil agus BHT, mar a thaispeántar i bhFíor 3A. príomhchritéar gníomhaíochta i dtástálacha TEAC.Dá réir sin, is lú an bac a bhíonn ar ghrúpaí feinile na gcomhábhar hidreasóil atá ann faoi láthair ná mar atá ag Trolox.

3.2.5. Comhghaolta idir TPCanna agus Gníomhaíochtaí Frithocsaídeacha

Mar a léirítear i bhFíor 3B, bhí comhghaol an-suntasach idir TPCanna agus gníomhaíocht scabhála saorradacach DPPH ag GAE ó 1.75 ± 0.438 go 100.41 ± 1.581 mg/g . Ba iad comhéifeachtaí comhghaoil ​​TPC le gníomhaíocht scavening radacach saor in aisce DPPH, gníomhaíocht FIC, laghdú cumhachta agus TEAC0.980, 0.925, 0.967 agus 0.902, faoi seach (Fíor 3B). Le chéile, léiríonn na sonraí seo go bhfuil anfrithocsaídeachdéantar gníomhaíochtaí hidreasholais COK a chomhghaolú go dlúth le hinneachar feanóil.

3.3. Éifeacht Tiúchan Hidreasóil COK ar Ghníomhaíocht Tyrosinase

Chinneamar éifeachtaí tiúchan COK hydrosol ar ocsaídiú L-tyrosine agusL-DOPA ag muisiriúntyrosinaseagus rinne sé comparáidí le gníomhaíocht aigéid kojic, ar a dtugtar coscaire tyrosinase (Fíor 3C,D). Chuir an hidrosol reatha bac ar ghníomhaíochtaí L-tyrosine agus L-DOPA oxidase de muisiriún tyrosinase (Fíor 3C) go potently agus dáileog-spleách ach bhí gníomhaíocht coisctheach níos airdetyrosinase i láthair substráit L-tyrosine (gníomhaíocht monophenolase) náL-DOPA (gníomhaíocht diphenolase). Ba iad na luachanna IC5{{10}} aigéid kojic i gcoinne monaifheinóláis agus gníomhaíochtaí défheinóláis ná 4.0 × 10−5 agus 7.8 × 10−3 mg/mL (Fíor 3C), faoi ​​seach, i bhfad níos mó ná iad siúd den hidreasol reatha (7.96 × 10−4 mg/mL agus 0.35 mg/mL, faoi seach; Fíor 3D). Mar sin, chun gníomhaíocht coisctheach tyrosinase 90 faoin gcéad (gníomhaíocht monophenolase) a bhaint amach, bhí gá le hidrosol agus aigéad kojic ag 0.52 mg / mL agus 4.0 × 10−3 mg / mL, faoi seach, nuair a úsáideadh L-tyrosine mar an tsubstráit (Fíor 3C, D. ). Cé go n-éilíonn éifeachtaí coisctheacha tyrosinase tiúchain níos airde d'aigéad COK hidrosolthan kojic, bhí gníomhaíocht coisctheach tyrosinase potent le feiceáil sna turgnaimh seo.

Éagsúlatyrosinased'fhéadfadh ullmhóidí, modhanna measúnaithe gníomhaíochta, agus íonachtaí agus comhpháirteanna coisctheacha cur leis na difríochtaí i gcinéiticí coisctheacha einsímeacha [29]. Mar sin féin, cuireann a gcomhpháirteanna bithghníomhacha le gníomhaíochtaí bitheolaíocha na n-eastóscán plandaí, a bhféadfadh tionchar a bheith acu ar speicis phlandaí, am buainte, séasúr, tionscnamh geografach, cleachtais agranamaíocha, agus modhanna eastósctha. Aithníodh agus sainaithníodh coscóirí ó fhoinsí nádúrtha i go leor staidéar le déanaí, agus tá caidreamh idir gníomhaíochtaí coisctheacha agus comhábhair nádúrtha bunaithe go maith (Tábla 1). Go háirithe, tá go leor aildéid agus comhdhúile eile leithlisithe agus tréithrithe mar choscóirí tyrosinasein. Ina measc seo tá cinnamaldehyde, 2-hiodrocsa-4-meatocsaí beansaildéad, ainsaldehyde, cuminaildéad, aigéad cumic, flavóil, flavones, agus isaflaibháin [4,19,30–37]. Is éard atá sa hidreasholas atá ann faoi láthair ná 87.7 faoin gcéad cinnamaldehyde agus 7.0 faoin gcéad beinsaldehyde, rud a thugann le tuiscint gurb é cinnamaldehyde, agus beinsaildéad ina dhiaidh sin, an phríomhshubstaint atá freagrach as gníomhaíocht coisctheach tyrosinase hidrosol. thanpure cinnamaldehyde, agus a fheabhsaíonn antyrosinasegníomhaíocht choisctheach hidreasol. Deimhníodh freisin go gcuireann benzaldehydes bac ar ghníomhaíocht diphenolase agus ar ghníomhaíocht monophenolase mushroomtyrosinase [38]. Is dócha go dtagann an mheicníocht coisctheach tyrosinase de choscóirí de chineál benzaldehyde as a gcumas bonn Schiff a fhoirmiú le príomhghrúpa aimín san einsím [33,39]. Má chuirtear grúpa deonaithe leictreon ag suíomh para benzaldehyde, méadaítear gníomhaíocht choisctheach tyrosinasein, bonn Schiff a chobhsú is dócha.

3.4. Modhanna Cinéiteach de Chosc ar Muisiriún Tyrosinase ag COK Hydrosol

Rinneadh staidéar ar iompraíochtaí cinéiteach hidrosol, ar an monophenolase agus ar ghníomhaíocht diphenolase tyrosinaseusing L-tyrosine agus L-DOPA mar an tsubstráit, faoi seach. Tá antyrosinaseRinneadh anailís ar chinéitic coisctheach hidreasóil trí úsáid a bhaint as ceapacha cómhalartacha dúbailte Lineweaver–Burk, mar a thaispeántar i bhFíor 4. I bhFíor 4A, B, léiríonn na ceithre líne einsím neamhchoiscthe (Líne 1) agus cosc ​​ar thiúchan trí thrí (Líne 2 – Líne 4) de hidreasol, agus trasnaíonn na línte seo ar chlé na haise 1/v os cionn na haise 1/S. Faoi na coinníollacha turgnamhacha gan bhac, ba é an t-uastreoluas (Vmax) den imoibriú ocsaídiúcháin L-tyrosine agus L-DOPA a chatalaíoch ag an tyrosinase ná {{10}}.055 ∆OD475/minand 0.096 ∆OD475/min gan a bheith ann. hidreasol (Líne 1 i bhFíor 4A, B), faoi seach. Na paraiméadair cinéiteach Km (Michaelis constant) le haghaidh muisiriúntyrosinasea fhaightear ó Fhíodóir Líne-Burk a úsáideann L-tyrosine agus L-DOPA mar fhoshraitheanna, faoi seach, go raibh Km 0.534 mg/mL agus0.511 mg/mL gan hidreasol ann (Líne 1 i bhFíor 4A, B).

Trasnaíonn na ceithre líne, a fhaightear ón einsím neamhchoiscthe agus ó thrí thiúchan éagsúla de hidreasol, ar thaobh na láimhe clé den ais 1/v os cionn na haise 1/S. Tháinig laghdú ar Vmax agus Km méadaithe mar thoradh ar thiúchan méadaithe hidreasholais. Go sonrach, nuair a úsáideadh L-tyrosine mar an tsubstráit, bhí línte iolracha le fánaí agus idircheapanna éagsúla mar thoradh ar thiúchan méadaithe hidreasóil, ach trasnaigh siad seo a chéile sa dara ceathrú (Líne 1–4 i bhFíor 4A). Fuarthas torthaí cosúla nuair a úsáideadh L-DOPA mar an tsubstráit (Líne 1–4 i bhFíor 4B), ag tacú leis an dearbhú go n-iompraíonn hidreasol coscairí de chineál measctha tyrosinase. I gcomhréir le cosc ​​de chineál measctha, is dócha go gceanglaíonn comhpháirteanna hidreaóil einsím saor in aisce agus an coimpléasc einsím-substráit. Is féidir leis na coscanna cineálacha measctha teacht chun cinn ar go leor bealaí: d'fhéadfadh cosc ​​ar hidreasol teacht chun cinn toisc go n-idirghníomhaíonn siad le hidirmheánach ina dhiaidh sin sa phatrún imoibriúcháin ach ní le coimpléasc tosaigh einsím-substráit [40]. Mar sin, chinneamar tairisigh díthiomsaithe (Ki agus Ki, faoi ​​seach) don choscóir atá ceangailteach leis an einsím saor (E) agus an coimpléasc einsím-fhoshraith ag baint úsáide as ceapacha cómhalartacha dúbailte agus ceapacha fána agus idircheap ingearach i gcoinne na tiúchana hidreasóil i láthair L-tyrosine (Fíor 4C, D) nó L- DOPA mar fhoshraitheanna (Fíor 4E, F). Mar a léirítear i bhFíor 4A, B, bhí luach Ki nuair a úsáideadh L-tyrosine mar an tsubstráit thart ar 1.28 uair níos ísle ná mar a bhí i láthair L-DOPA, rud a léiríonn go bhfuil ceangal einsímeach coisctheach níos éifeachtaí le L-tyrosine ná le L-DOPA. Ina theannta sin, bhí luach Ki 1.71 uair níos mó ná luach Ki le haghaidh ocsaídiúcháin L-DOPA, rud a thugann le fios go bhfuil cleamhnas na gcomhpháirteanna hidrosol le haghaidh einsím saor in aisce níos láidre ná an coimpléasc einsím-foshraith. an einsím le haghaidh L-DOPA ach ní cheanglaíonn sí an suíomh gníomhach. Thairis sin, bhí luach Ki beagnach mar an gcéanna le ocsaídiú L-tyrosine Kifor, rud a thugann le fios gurb iad na coscairí measctha na coscóirí neamhiomaíoch, a cheanglaíonn le heinsím saor in aisce agus coimpléasc einsím-substráit leis an tairiseach cothromaíochta céanna ag baint úsáide as L-. tyrosine mar an tsubstráit (Fíor 4A). Mar sin féin, tá na tairisigh cheangailteach cothromaíochta don einsím saor in aisce agus an einsím-substratecomplex, faoi seach, difriúil ag baint úsáide as L-DOPA mar an tsubstráit (Fíor 4B), rud a léiríonn gur féidir le cineál measctha (measctha iomaíoch agus neamhiomaíoch) inhibitor ceangailteach ní hamháin le einsím saor in aisce freisin leis an gcoimpléasc einsím-foshraith ag baint úsáide as L-DOPA mar an tsubstráit. Léirigh staidéir roimhe seo freisin gur coscairí de chineál measctha iad ola riachtanach C. cassia agus cinnamaldehyde [19]. I gcodarsnacht leis sin, léirigh tras-cinnamaldehyde scoite amach ó choirt C. cassia cosc ​​iomaíoch ar ocsaídiú L-DOPA ag muisiriúntyrosinase[32], cé go bhfuil cainéildéad leithlis ó fhréamhP. cosc ​​neamhiomaíoch a bhí i cernua [35].

3.5. Tiúchan-Cleithiúnaí Éifeachtaí Tiúchan Hidreasóil ar Melanogenesis

Chun éifeachtaí hidrea-soil ar inmharthanacht cille agus melanógenesis ag tiúchana éagsúla a mheas ({{{{0}}.0035–10.64 mg/mL), d’ionsuchamar melanógenesis i gcealla melanóma B16-F10 ag baint úsáide as -MSH agus i gcomparáid na héifeachtaí ag baint úsáide as aigéad kojic mar rialú dearfach (Fíor 5). Thug toradh an mheasúnaithe inmharthanachta cille seo le fios nach raibh aon chiteatocsaineacht ag hidreasol ag tiúchan 0.0035-1.064 mg/mL i gcealla meileanóma B16F10 (Fíor 5a). De réir mar a bhíonn coscairí melanogenesis á bhforbairt, ba cheart go mbeadh sábháilteacht agus éifeachtacht an chomaoin is tábhachtaí maidir le go leor feidhmeanna. Mar sin féin, tháinig laghdú suntasach ar inmharthanacht na gceall ag tiúchan 5.32–10.64 mg/mL mar thoradh ar chóireáil cealla meileanoma B16F10 le hidreasol. De réir thorthaí na staidéar a rinneadh scagadh ar shábháilteacht agus ar éifeachtúlacht ancraiceann-bhánútáirgí i gcultúir B16F10, is tiúchan tairsí é 1.064 mg/mL le haghaidh scagadh príomhúil cille. Mar sin, baineadh úsáid as tiúchain 0.1064-1.064 mg/mL chun meicníochtaí frith-tyrosinase i gcealla melanoma B16F10 a scrúdú trí hidreaól.

Cinneadh faoi chois melanogenesis trí chóireálacha hidrosol ag tiúchain éagsúla aspercentages na n-ábhar melanin i gcealla (Fíor 5b). Rinneamar anailís freisin ar leibhéil slonn MITF ag baint úsáide as blotáil an Iarthair (Fíor 5c). Sna turgnaimh seo, cuireadh an t-ábhar melanin agus leibhéil slonn MITF faoi chois dáileog-spleách ag COK hydrosol, rud a thugann le tuiscint go laghdaíonn COK hydrosol melanincontent i gcealla trí shintéis MITF a chur faoi chois.

3.6. Measúnachtaí Cosanta DNA

Is eol go maith go ndéanann speicis ocsaigin imoibríoch damáiste do DNA agus go mbíonn siad ina gcúis le haosú cille agus ailse. Tairgeann measúnachtaí DNAnicing córas múnla áisiúil saor ó chill chun táirgeadh fréamhacha damáiste DNA a chinneadh go híogair [41]. Sna turgnaimh seo, tháirg imoibrithe Fenton fréamhacha hiodrocsaile a ghlanann DNA plasmid supercoiled agus a thiontú go foirm nicked DNA, rud a laghdaigh soghluaisteacht leictreafóiréis. [42,43]. Mar sin, chun meastóireacht a dhéanamh ar ghníomhaíochtaí cosanta DNA hidreasol, chothaigh muid neo DNA leis na himoibreoirí Fenton [44]. Mar a léirítear i bhFíor 6, tá foirmeacha plasmid supercoiled agus nicked idirdhealú go soiléir ag a rátaí soghluaisteachta leictreafóiréis coibhneasta ar fhoirmiú agarose; supercoiledDNA ar athraíodh a ionad an tapúla, agus nicked DNA bhog an ceann is moille, faoi seach. Tar éis cóireálacha le hidreasol, laghdaíodh damáiste DNA beagán ag tiúchan hidreasol de 1.33-5.32 mg / ml, le cosaint 28-58 faoin gcéad ar an bhfoirm supercoiled, faoi seach (lánaí 6-8). Ag tiúchan hydrosol de 0.3325-0.665 mg/mL, níor breathnaíodh aon chosaint i gcoibhneas leis an rialú diúltach (lánaí 4 agus 5). I gcodarsnacht leis sin, chosnaigh quercetin DNA plasmid go héifeachtach ó radacach hiodrocsaile- ilroinnt idirghabhála, mar a léiríodh roimhe seo [45]. Is iad seo na chéad sonraí a thaispeánann éifeachtaí cosantacha eastóscáin hidreasóil óC. osmophloeum Fágann Kanehira ar dhamáiste DNA de bharr imoibrithe Fenton. Is dócha go bhfuil na héifeachtaí seo ann mar gheall ar láithreacht comhdhúile polyphenol.

4. Conclúidí

Tá COK in úsáid le fada mar ghléasra míochaine sa Téaváin. Mar sin féin, go bhfios dúinn, is é seo an chéad tuarascáil a thaispeánann go bhfuil gníomhaíochtaí frithocsaídeacha ag hidrea-sóil a ullmhaítear trí dhriogadh gaile ó dhuilleoga COK, mar a breathnaíodh i dtástálacha arfrithocsaídeachgníomhaíocht agus damáiste DNA. Léirigh muid freisin go represses an hidreaol melanogenesis. In anailísí GC/MS, fuarthas gurb iad na príomh-chomhdhúile inCOK hydrosol ná cinnamaldehyde agus benzaldehyde, agus bhí na hoibreáin seo ina gcosc potently in aghaidh ghníomhaíochtaí monaifheinóláis agus défheinóláis tyrosinase. Inár measúnuithe ar chinéitic coiscthe tyrosinase, thaispeáin COK hydrosol cosc ​​de chineál measctha-spleách ar dháileog ar ghníomhaíochtaí L-tyrosine agus L-DOPA oxidase de.tyrosinase. Chuir na comhdhúile hidreasol reatha slonn próitéine MITF faoi chois freisin, rud a fhágann sintéis melanin laghdaithe -MSH-spreagtha.

Ar deireadh, tá sábháilteacht ina mór-bhreithniú maidir le coscairí tyrosinase, go háirithe i gcás táirgí neamhchosmaideacha agus bia a úsáidtear, ar féidir iad a úsáid i gcainníochtaí rialaithe. Is breiseán nádúrtha inite é COK cheana féin agus a úsáidtear go forleathan le haghaidh bia agus cosmaidí. Ina theannta sin, aithnítear go ginearálta go bhfuil cinnamaldehyde sábháilte mar bhia don duine. Is bithábhar nádúrtha den scoth é COK hydrosol, atá éifeachtach agus sábháiltetyrosinaseagus gníomhaíocht choisctheach sintéise melanin agus an poitéinseal cosaint a thabhairt i gcoinne damáiste DNA. Dá bhrí sin, creidimid go bhféadfaí COK hydrosol a úsáid mar ghníomhaire díphacáil shábháilte agus éifeachtach le haghaidh go leor iarratas.