Dab Homozygous1−// Is Úrscéal Féideartha é d'Aimhrialtachtaí ó bhroinn Uathsomalacha Cúlaitheacha Duán na Muice agus Conaire Fuail
Feb 28, 2022
Réamhrá
Léiríonn lucha mutant Yotari, a fhaightear trí shóchán a fháil go spontáineach sa ghéine Dab1, mínormáltachtaí histeolaíocha sa lárchóras néaróg [1,2], atá an-chosúil leo siúd a bhaineann le lucha reeler (reelin//), rud a thugann le tuiscint go mbaineann reelin agus DAB1 leo. an cosán comharthaíochta céanna [1–4]. Tuairiscíodh go bhfuil baint ag na bearrthaí sa chonair reelin/DAB1 le neamhoird shíciatracha éagsúla [5-7]. Suimiúil go leor, sa bhreis ar an néarchóras lárnach, tá láithreacht DAB1 agus próitéiní reelin deimhnithe freisin sa néarchóras imeallach agus roinnt fíocháin seachtracha. Tá láithreacht DAB1 le fáil i podocytes luch [8] agus féatais dhaonnaduáin[9] cé go bhfuil léiriú reelin tuairiscithe le linn luchóg agus forbairt féatais daonna, chomh maith le i roinnt cealla endothelial feadh soithigh fola sa luch fásta [9-11]. D’fhéadfadh go spreagfadh an cosán rílein chanónach/DAB1 próitéiní iartheachtacha ar leith, lena n-áirítear gabhdóirí NOTCH2, a imríonn róil ríthábhachtacha i gcinntí agus difreáil cinniúint cille le linnduánforbairt [12–14]. Tá gá le gabhdóirí NOTCH2 chun feadáin agus podocytes proximal a fhoirmiú [13], ach a luaithe a dhéantar aibiú nephron a bhaint amach, tá an cosán seo ina thost den chuid is mó [15]. I gcoinníollacha géarmhíochainegalair duáin,d’fhéadfadh go gcuirfeadh léiriú méadaithe NOTCH2 le hathghiniúint, cé go bhfuil baint cúiseach ag léiriú marthanach le fifibrosis interstitial agus glomerulosclerosis [15]. Is féidir le laghdú ar chomharthaíocht NOTCH an t-autophagy a laghdú go mór agus lagú difreála podocyte a chur faoi deara le linn forbartha [16].
Dá bhrí sin, tá ról ríthábhachtach ag podocytes mífheidhmiúla i ngalar glomerular, go háirithe i siondróm nephrotic idiopathic daonna [17,18] agus i siondróm nephrotic athraithe íosta (MCNS) [19]. Mar sin, coinníonn autophagy hoiméastáis cheallacha faoi ghnáthchoinníollacha fiseolaíocha, ach i gcoinníollacha paiteolaíocha, féadann sé dul ar aghaidh go bás uathphagóideach [20]. Is bithmharcóir autophagy a úsáidtear go forleathan LC3B, próitéin struchtúrach de seicní autophagosomal [21]. Cuidíonn crosstalk casta idir autophagy agus apoptosis freisin le cothabháil cothromaíocht homeostatic mar fhreagra ar mhicrea-thimpeallacht na cille. Tá sé ar eolas go maith go dtiocfaidh méadú ar líon na n-imeachtaí apoptotic le linnduánforbairt [22] agus a laghdú go mór nuair a bheidh an aibiú thart, ach amháin i gcoinníollachadíobháil duánach[23]. Gan amhras, is meicníocht chasta é apoptosis a rialaítear trí idirghníomhú roinnt bealaí ach críochnaíonn sé den chuid is mó le gníomhachtú caspase3 (CASP3), a bhfuil a ghníomhachtú ar cheann de na marcóirí is minice a úsáidtear chun apoptosis a bhrath [23].
Sa tuarascáil seo, bhí sé mar aidhm againn anailís a dhéanamh ar an tionchar a bhíonn ag tost feidhme géine Dab1duánmoirfeolaíocht agus léiriú agus logánú ríleanna, NOTCH2, LC3B, agus próitéiní CASP3 scoilte i lucha iarbhreitheduáin. Glacaimid leis go gcuirtear na próitéiní seo in iúl sa luch iarbhreitheduán,agus cuireann a n-idirghníomhú feidhmiúil le cothabháil a struchtúir agus a bhfeidhme. Ina theannta sin, toisc go bhfuil láithreacht DAB1 deimhnithe le linn daonna féataisduán[9], d’fhéadfaí a thoimhdiú go bhféadfadh a díghníomhú a bheith ina chúis le neamhord i speictream leathan aimhrialtachtaí ó bhroinn anduánagus conradh urinary (CAKUT).
Eochairfhocail:yotari; feidhm duáin; forbairt duáin iarbhreithe; staining inmunofluorescence; micreascópacht leictreon tarchurtha
Feabhsaíonn CISTANCHE FEIDHM Duán/Duánach
Abhair agus modhanna
Bailiúchán SamplachMar Dab1 null mutants traidisiúnta, úsáid againn yotari (Dab1 / ) lucha cur síos roimhe seo ag Howell et al. [24]. Ba iad na primers PCR a úsáideadh le haghaidh géinitíopáil na lucha ná yotari: GCC CTTCAGCATCACCATGCT agus CAGTGAGTACATATTGTGTGAGTTCC, fiáin de chineál Dab1 lócas: GCCCTTCAGCATCACCATGCT agus CCTTGTTTCTTTGTTTAA-GGCTGT [5]. Ardaíodh lucha C57BL/6 N agus cuireadh i ngrúpaí iad i gcaighin chaighdeánacha polacarbónáit (lena n-áirítear ceann amháin ar a laghad de gach géinitíopa) le rochtain ad libitum ar bhia agus ar uisce i seomra rialaithe teochta (23 ± 2 ◦C) le solas 12 h/ timthriall dorcha. Ar laethanta iarbhreithe 4, 11 agus 14 (P4, P11, agus P14), rinneadh lucha ainéistéiseach go domhain le pentobarbital agus perfused transcardially ar feadh 10 min le saline maolánach fosfáit (PBS, pH 7.2) agus 4 faoin gcéad paraformaldehyde (PFA ) i 0.1 M PBS.Duáinbaineadh iad agus socraíodh iad le 4 faoin gcéad PFA in 0.1 M PBS thar oíche le haghaidh gnáth-anailísí histeolaíochta (hematoxylin-eosin (H&E), staining imdhíon-histochemical agus imdhíonfhluaraiseacht) agus i meascán PFA 2 faoin gcéad móide 2.5 faoin gcéad de ghlútaraildéad (GA) le haghaidh scrúdú micreascóp leictreon. Tar éis a shocrú, ullmhaíodh fíocháin le haghaidh tuilleadh scrúdaithe histolaíochta, mar a thuairiscíomar roimhe seo [25,26].
Immunoflfluorescence agus Immunoperoxidase stainingTar éis dípharaifínithe agus athhiodráitithe, téadh na hailt ar feadh 20 nóiméid sa mhaolán citrate 0.01 M (pH 6.0) i galtán uisce agus, ina dhiaidh sin, fuaraíodh iad go teocht an tseomra. Cuireadh maolán blocála (ab 64226, Abcam, Cambridge, UK) i bhfeidhm ar feadh 30 nóiméad chun staining neamhshonraithe a eisiamh. Ansin goradh codanna i seomra taise thar oíche le príomhantasubstaintí (Tábla 1). Tar éis níocháin i PBS, cuireadh antasubstaintí tánaisteacha (Tábla 1) i bhfeidhm ar feadh uair an chloig agus nite i PBS arís. Ansin, rinneadh núicléis a dhathú le 4060 -diamidino-2-phenylindole(DAPI) ar feadh 2 nóiméad, nite i PBS, agus clúdaíodh iad. Rinneamar an tástáil réamh-asaithe ionas gur úsáideadh gach antashubstaint phríomhúil leis an peptide comhfhreagrach agus cuirimid a gcomhcheangal leis na hailt. Níor léirigh na torthaí aon staining antashubstainte. Ina theannta sin, rinneadh rialuithe inar fágadh an príomh-antasubstaint ar lár chun leibhéil de cheangal neamhshonrach antasubstaintí tánaisteacha a chinneadh.
Le haghaidh staining immunoperoxidase, cuireadh coinín frith-CASP3 polyclonal frith-CASP3 (1: 1{{-0 caoluithe, ab13847, Abcam, Cambridge, RA) i bhfeidhm mar antashubstaint príomhúil ar feadh uair an chloig i seomra taise tar éis cóireáil an t-alt le 0.1 faoin gcéad H2O2. Tar éis níocháin i PBS, rinneadh braite tánaisteach ag baint úsáide as an nasc agus streptavidin peroxidase, gach ceann acu ar feadh cúig nóiméad déag (DakoCytomation, CA 93013 USA, LOT 03477) agus diaminobenzidine (Dako, CA 93013 USA, LOT 10051369), rialaithe go cúramach chun róshárú cúlra a sheachaint. Rinneadh núicléis a dhaite le hematocsailín, rinsíodh iad in uisce sconna ar feadh 10 nóiméad, díhiodráitíodh iad go hachomair i sraith ardaitheach de thuaslagáin eatánóil, agus rinneadh iad a shleamhnú faoi chlúdach.
Ullmhúchán Fíocháin do Mhicreascóip Tarchurtha Leictreon (TEM)Tar éis é a shocrú le meascán de 2 faoin gcéad PFA agus 2.5 faoin gcéad GA i 0.1 M PBS ar feadh 2 h, nitear na samplaí le PBS agus postfixed i dtuaslagán uiscí de 2 faoin gcéad osmium tetroxide ar feadh 2 h. Rinneadh na samplaí go léir a ní faoi dhó i PBS, díhiodráitíodh iad i ngráid ardaitheacha eatánóil agus leabaíodh iad in Epon 812 (TAAB Laboratories Equipment, Reading, UK). Gearradh rannóga sraitheach (70 nm i dtiús) ar ultramicrotome Ultracut UCT (Leica Microsystems, Wetzlar, an Ghearmáin) agus dhaite le 1 faoin gcéad aicéatáit úráinil agus chiotráite luaidhe.
Fáil agus Anailís SonraíRinneadh an anailís le micreascóp epiflfluorescence (Olympus BX51, Tóiceo, an tSeapáin) atá feistithe le ceamara digiteach DP71 (Olympus), micreascóp leictreon tarchurtha JEM 1400 (JEOL, Tóiceo, an tSeapáin) a oibríodh ag 80 kV agus grianghraf le muirear JEOL- gléas cúpláilte (CCD) córas ceamara (Ardteicnící Micreascópachta, Danvers, MA, SAM) agus ar deireadh, micreascóp geal-fifield (BX40, Olympus, Tóiceo, an tSeapáin). Próiseáladh gach íomhá anailísithe le bogearraí ImageJ agus Adobe Photoshop (Adobe, San Jose, CA, USA). In aghaidh an ghrúpa scrúdaithe, d'úsáideamar trí nó ceithre ainmhí. Gach bailitheduáingearrtha ag 5 µm codanna tiubh, agus uastaduán length determined by using these samples was reported. Mean proximal convoluted tubules (PCT), distal convoluted tubules (DCT) and glomeruli diameters were determined by averaging 100 structure diameters per analyzed sample. As nephron segments have irregular shapes, we took the largest diameter of every examined segment as representative. The staining intensity was semiquantitatively evaluated at four degrees: the absence of any reactivity (( ), mild reactivity (+), moderate reactivity (++), and strong reactivity (+++) (Table 2). The number of DAB1, reelin, NOTCH2, LC3B, and cleaved CASP3 immunoreactive cells was counted and expressed as a percentage of total cells. For each sample, we analyzed twenty PCT, DCT, and G at ×40 objective magnifification. We averaged the number of positive cells per group. Any level of nuclear, cytoplasmic, or membrane staining was regarded as positive. Three investigators analyzed the images independently. Interrater agreement was tested with interclass correlation analysis, which yielded a coeffificient >0.75, rud a léiríonn comhaontú sármhaith [27].
Anailís staitistiúilRinneadh t-tástáil dhá eireaball chun anailís a dhéanamh ar na difríochtaí sa mheántrastomhas idir PCT, DCT agus G ainmhithe de chineál fiáin agus yotari. Cuireadh an trastomhas i láthair mar mheán ± diall caighdeánach (SD). Socraíodh an leibhéal suntasachta ag p < 0.05.="" baineadh="" úsáid="" as="" tástáil="" anova="" débhealaigh="" agus="" triail="" chomparáid="" iolrach="" tukey="" ina="" dhiaidh="" sin="" chun="" scrúdú="" a="" dhéanamh="" ar="" na="" difríochtaí="" i="" gcéatadán="" na="" gcealla="" dearfacha="" idir="" pct,="" dct,="" agus="" glomeruli="" ag="" pointí="" uile-ama.="" cuireadh="" céatadán="" na="" gcealla="" dearfacha="" in="" iúl="" mar="" mheán-earráid="" chaighdeánach="" an="" mheáin="" (sem).="" socraíodh="" an="" leibhéal="" suntasachta="" ag="" p="">< 0.05.="" rinneadh="" an="" anailís="" i="" mbogearraí="" graphpad="" (graphpad="" software,="" la="" jolla,="" ca,="">
Torthaí
Staining Hematoxylin-Eosin (H&E) agus Trastomhas Duán a Thomhassmálú H&E de chodanna meánachar anduáincuireann pointí ama scrúdaithe béim ar an méid beagduánfeinitíopa lucha yotari i gcomparáid le cineál fiáin (Fíor 1a). Ag meán 4Pduánbhí trastomhas ainmhithe yotari timpeall 55 µm ná timpeall 75 µm. Ina theannta sin, bhí an difríocht seo faoi deara ag pointí ama níos déanaí mar gheall ar an bhfás níos moille ar anduáinin yotari i gcomparáid le fás forásach anduáinin ainmhithe de chineál fiáin. Chun a chinneadh an bhfuil an laghdú ar an iomlánduánBa é ba chúis leis an méid ná laghdú ar mhéid deighleog nephron, rinneamar meán trastomhas PCT, DCT agus G in aghaidh an ghrúpa. Go deimhin, bhí laghdú ar mheántrastomhas G, PCT agus DCT sa ghrúpa yotari i gcomparáid le cineál fiáin (Fíor 1b, p < 0.05).="" ina="" theannta="" sin,="" nocht="" staining="" h&e="" cortex="" níos="" tanaí="">duánachsíneadh pelvis in ainmhithe yotari agus DCT beagán idirleata ag 14P. Tá bunstruchtúr agus patrún an aibithe glomerular mar an gcéanna sa dá ghrúpa ainmhithe scrúdaithe.
Anailís Histeolaíochta Tuairisciúil Bunaithe ar Mhicreasfógraif TEMAr mhicreafgraif a fuarthas le TEM, léirigh glomeruli lucha de chineál fiáin cuma tipiciúil gach cuid den bhacainn scagacháin, a forbraíodh de ghnáth agus inaitheanta (Fíor 2a). Bhí podocytes, próisis coise podocyte agus pedicles, slits scagtha, seicní íoslaigh glomerular, agus an lumen ribeach leis an endothelium fenestraithe inaitheanta go héasca (Fíor 2a). Ar an láimh eile, i glomeruli lucha yotari, d'fhéadfaí damáiste podocyte forásach mar thoradh ar eiseadh próisis coise agus easpa slits scagacháin a thabhairt faoi deara (Fíor 2b–d). Breathnaíodh na hathruithe ultrastruchtúracha seo ar fadduáinscrúdaíodh agus bhain an chuid is mó de na glomeruli a scrúdaíodh. Níor tugadh faoi deara aon neamhghnáchaíochtaí i PCT nó DCT lucha yotari ná ainmhithe de chineál fiáin (Fíor 2e-h). Sa PCT, rinneadh droch-shainiú ar chomhéadain chill mar gheall ar neamhrialtacht na seicní cille agus idirdigitiú cille lena gcomharsana. Bhí an cíteaplasma flúirseach, ina raibh núicléis dea-cháiliúil, mitochondria fadaithe, infoldings basal, agus go leor claiseanna feadánacha idir microvilli, a bhí mar teorainn scuab ag an membrane apical. Léirigh formhéadú níos airde dromchla apical na gcealla epithelial PCT ina bhfuil microvilli fada chun teorainn an scuab agus acomhail dhaingne a chruthú idir teorainneacha cealla lonrúla na gcealla epithelial feadánacha comharsanacha (Fíor 2e, f). Ar an láimh eile, bhí cúpla microvilli gearr agus veicilíní iomadúla ar dhromchla apical na gceall epithelial DCT (Fíor 2g,h).
Fíor 2. Micrfhótagraif tarchurtha leictreon-mhicreascóp (TEM) de chineál fiáin agus yotariduáin.Glomeruli ainmhithe de chineál fiáin (a) léirigh bacainn scagacháin gnáthfhorbartha le endothelium feinneestraithe (E) den ribeach (C), membrane íoslach (BM), podocytes (P) le pedicles (PE), agus slits scagacháin (FS). ). SaduáinI measc na n-ainmhithe yotari, d’fhéadfaí éadain na pedicíní agus easpa slits scagacháin a thabhairt faoi deara (réiltíní, b–d). Níor tugadh faoi deara aon neamhghnáchaíochtaí sna feadáin convoluted proximal (PCT) nó tubules convoluted distal (DCT) de lucha yotari i gcomparáid leis na hainmhithe fiáine (e-h). Sa PCT, bhí an cíteaplasma flúirseach, ina raibh núicléis dea-cháiliúil (N), mitochondria fadaithe (M), infoldings basal (BI), agus go leor claiseanna tubular (TP) idir microvilli, a bhí mar teorainn scuab (BB) ag an. membrane apical (e, f). Léirigh formhéadú níos airde dromchla apical cealla epithelial PCT ina bhfuil microvilli fada chun an teorainn scuab agus acomhail daingean (TJ) a fhoirmiú idir teorainneacha cealla luminal cealla epithelial feadánacha comharsanacha (e, f). Ar an láimh eile, dromchla apical na gcealla epithelial DCT ina bhfuil beagán microvilli gearr agus go leor vesicles (g, h). Is é 1 µm barra an scála in íomhánna (a–d) agus insets (e–h); is é 2 µm barra an scála in íomhánna (e–h).
Logánú agus Comhlonnú Reelin agus DAB1Cuireadh in iúl go lag Reelin le himoibríocht éadrom go measartha (Tábla 2) i glomeruli agus DCT na n-ainmhithe scrúdaithe go léir ag gach pointe ama breathnaithe (p < 0.05,="" fíor="" 3a).="" i="" pct="" lucha="" yotari="" amháin="" a="" bhí="" céatadán="" na="" gceall="" dearfach="" i="" bhfad="" níos="" airde="" ná="" ainmhithe="" de="" chineál="" fiáin="" (p="">< 0.05,="" fíor="" 3a).="" sna="" cealla="" glomerular,="" bhí="" logánú="" an="" staining="" perinuclear,="" agus="" sa="" pct="" agus="" dct,="" bhí="" sé="" scaipthe="" ar="" fud="" an="" cíteaplasma="" (fíor="" a,="">
igure 4. Staining immunofluorescence of yotari iarbhreitheduáinle marcóir ríilín (a) agus staining imdhíonfhluaraiseachta dúbailte den chineál iarbhreithe fiáinduáinle DAB1 agus marcóirí ríilín (b). (a,b) ruaimniú DNA DAPI núicléach a chumasc le DAB1, agus taispeántar imdhíonfhluaraiseacht an ríilín i gcomhthreo (cumasc). Ba iad na pointí ama breathnaithe ná P4, P11, P14. Tá léiriú na marcóirí scrúdaithe sna glomeruli (G), feadáin convoluted proximal (PCT) agus feadáin convoluted distal (DCT) marcáilte leis na saigheada, cé go bhfuil réiltíní ag léiriú léiriú ar an ríilín sa mhaitrís extracellular (a). Léiríonn ionsáigh an abairt is suntasaí san íomhá. Léirigh staining núicléach DAPI droch-chomhlonnú DAB1 agus spól, go príomha sa DCT (ceann saighde). Is é 20 µm an barra scála agus tagraíonn sé do gach íomhá.
Ní raibh beagnach aon imoibríocht imdhíonachta DAB1 i glomeruli agus PCT na n-ainmhithe fiáine ag P4, agus tháinig méadú suntasach ar chéatadán na gcealla dearfacha le himoibríocht éadrom (Tábla 2) ag P11 agus P14 (p < 0.05,="" fíor="" 3b).="" sa="" dct,="" léiríodh="" dab1="" den="" chuid="" is="" mó="" ag="" na="" codanna="" apical="" agus="" cliathánach="" de="" na="" seicní="" cille="" (fíor="" 4b)="" le="" imoibríocht="" láidir="" (tábla="" 2).="" bhí="" céatadán="" na="" gcealla="" dearfacha="" i="" bhfad="" níos="" airde="" ná="" i="" struchtúir="" roimhe="" seo,="" thart="" ar="" 60="" faoin="" gcéad="" (fíor="" 3b),="" go="" háirithe="" sa="" macula="" densa="" (fíor="" 4b).="" ní="" raibh="" beagnach="" aon="" chomhlonnú="" ar="" an="" dab1="" agus="" ar="" an="" rílín="" ach="" amháin="" i="" dct="" ainmhithe="" fiáine="" ag="" p14="" (ceann="" saighde,="" fíor="" 4b).="" bithmhóilíní="" 2021,="" 11,="" 609="" 8="" de="" 14="" fíor="" 4.="" smáil="" imdhíonfhluaraiseachta="" ar="" yotari="">duáinle marcóir ríilín (a) agus staining inmunofluorescence dúbailte den chineál iarbhreithe fiáinduáinle DAB1 agus marcóirí ríilín (b). (a,b) smálú DNA DAPI núicléach chumasc le DAB1, agus taispeántar fluaraiseacht imdhíon-imdhíonachta i gcomhthreo (cumasc). Ba iad na pointí ama breathnaithe ná P4, P11, P14. Tá léiriú na marcóirí scrúdaithe sna glomeruli (G), feadáin convoluted proximal (PCT) agus feadáin convoluted distal (DCT) marcáilte leis na saigheada, cé go bhfuil réiltíní ag léiriú léiriú ar an ríilín sa mhaitrís extracellular (a). Léiríonn ionsáigh an abairt is suntasaí san íomhá. Léirigh staining núicléach DAPI droch-chomhlonnú DAB1 agus spól, go príomha sa DCT (ceann saighde). Is é 20 µm an barra scála agus tagraíonn sé do gach íomhá. Ní raibh beagnach aon imoibríocht imdhíonachta DAB1 i glomeruli agus PCT na n-ainmhithe fiáine ag P4, agus tháinig méadú suntasach ar chéatadán na gcealla dearfacha le himoibríocht éadrom (Tábla 2) ag P11 agus P14 (p <0.05, fíor="" 3b).="" sa="" dct,="" léiríodh="" dab1="" den="" chuid="" is="" mó="" ag="" na="" codanna="" apical="" agus="" cliathánach="" de="" na="" seicní="" cille="" (fíor="" 4b)="" le="" imoibríocht="" láidir="" (tábla="" 2).="" bhí="" céatadán="" na="" gcealla="" dearfacha="" i="" bhfad="" níos="" airde="" ná="" mar="" a="" bhí="" i="" struchtúir="" roimhe="" seo,="" thart="" ar="" 60="" faoin="" gcéad="" (fíor="" 3b),="" go="" háirithe="" sa="" macula="" densa="" (fíor="" 4b).="" ní="" raibh="" beagnach="" aon="" chomhlonnú="" ar="" an="" dab1="" agus="" ar="" an="" rílín="" ach="" amháin="" i="" dct="" ainmhithe="" den="" chineál="" fiáin="" ag="" p14="" (ceann="" saighde,="" fíor="">
Patrúin Slonn Spásúlachta agus Ama de NOTCH2 agus LC3BBhí an céatadán de chealla dearfacha NOTCH níos lú ná 20 faoin gcéad i glomeruli an dá ghéinitíopa ainmhí ag gach pointe ama a breathnaíodh. Ní raibh ach céatadán P14 de chealla dearfacha i bhfad níos airde i glomeruli ainmhithe yotari ná ainmhithe de chineál fiáin (p < 0.05,="" fíor="" 3c).="" bhí="" an="" déine="" staining="" éadrom="" go="" measartha="" (tábla="" 2),="" lonnaithe="" go="" peinuclearly="" den="" chuid="" is="" mó="" (fíor="" 5a-f).="" i="" pct="" agus="" dct="" an="" dá="" ghéinitíopa="" ainmhí="" mhéadaigh="" céatadán="" na="" gceall="" dearfach="" le="" himeacht="" ama.="" ag="" p14,="" bhí="" an="" céatadán="" de="" chealla="" dearfacha="" i="" bhfad="" níos="" airde="" i="" pct="" agus="" dct="" na="" n-ainmhithe="" yotari="" ná="" pct="" agus="" dct="" ainmhithe="" de="" chineál="" fiáin="" (p="">< 0.05,="" fíor="" 3c).="" bhí="" déine="" na="" gcomharthaí="" ag="" gach="" pointe="" ama="" breathnaithe="" éadrom="" go="" measartha="" (tábla="" 2)="" agus="" scaipthe="" ar="" fud="" an="" chíteaplasma="" (fíor="" 5a-f).="" fíor="" 5.="" smáil="" imdhíonfhluaraiseachta="" de="" chineál="" fiáin="" iarbhreithe="" agus="">duáinle marcóirí NOTCH2 agus LC3B agus staining immunoperoxidase le marcóir caspase3 scoilte (CSP3). (a–f) Déantar staining DNA DAPI núicléach a chumasc le NOTCH2 agus LC3B. Ba iad na pointí ama breathnaithe ná P4, P11, P14. Tá léiriú na marcóirí NOTCH2 agus LC3B sna glomeruli (G), feadáin convoluted proximal (PCT) agus feadáin convoluted distal (DCT) marcáilte leis na saigheada. Is féidir imoibríocht LC3B go háirithe láidir a thabhairt faoi deara i capsule Bowman de glomeruli ag lobhadh (réiltín, e). Léiríonn ionsáigh an abairt is suntasaí san íomhá. Léiríodh go dona CASP3 i ngach pointe ama a breathnaíodh. Ba é an t-aon léiriú suntasach ná glomeruli lucha yotari ar P14 (saigheada). Is é 20 µm an barra scála agus tagraíonn sé do gach íomhá. Bithmhóilíní 2021, 11, 609 9 de 14 3.4. Patrúin Slonn Spásúlachta agus Ama NOTCH2 agus LC3B Bhí céatadán na gcealla dearfacha NOTCH níos lú ná 20 faoin gcéad i glomeruli an dá ghéinitíopa ainmhí ag gach pointe ama breathnaithe. Ní raibh ach céatadán P14 de chealla dearfacha i bhfad níos airde i glomeruli ainmhithe yotari ná ainmhithe de chineál fiáin (p < 0.05,="" fíor="" 3c).="" bhí="" an="" déine="" staining="" éadrom="" go="" measartha="" (tábla="" 2),="" lonnaithe="" go="" peinuclearly="" den="" chuid="" is="" mó="" (fíor="" 5a-f).="" i="" pct="" agus="" dct="" an="" dá="" ghéinitíopa="" ainmhí="" mhéadaigh="" céatadán="" na="" gceall="" dearfach="" le="" himeacht="" ama.="" ag="" p14,="" bhí="" an="" céatadán="" de="" chealla="" dearfacha="" i="" bhfad="" níos="" airde="" i="" pct="" agus="" dct="" ainmhithe="" yotari="" ná="" pct="" agus="" dct="" ainmhithe="" de="" chineál="" fiáin="" (p="">< 0.05,="" fíor="" 3c).="" bhí="" déine="" na="" gcomharthaí="" ag="" gach="" pointe="" ama="" breathnaithe="" éadrom="" go="" measartha="" (tábla="" 2)="" agus="" scaipthe="" ar="" fud="" an="" chíteaplasma="" (fíor="">
Figiúr 5. Imdhíonfluaraiseacht staining de chineál iarbhreithe fiáin agus yotariduáinle marcóirí NOTCH2 agus LC3B agus staining immunoperoxidase le marcóir caspase3 scoilte (CSP3). (a–f) Déantar staining DNA DAPI núicléach a chumasc le NOTCH2 agus LC3B. Ba iad na pointí ama breathnaithe ná P4, P11, P14. Tá léiriú na marcóirí NOTCH2 agus LC3B sna glomeruli (G), feadáin convoluted proximal (PCT) agus feadáin convoluted distal (DCT) marcáilte leis na saigheada. Is féidir imoibríocht LC3B go háirithe láidir a thabhairt faoi deara i capsule Bowman de glomeruli ag lobhadh (réiltín, e). Léiríonn ionsáigh an abairt is suntasaí san íomhá. Léiríodh go dona CASP3 i ngach pointe ama a breathnaíodh. Ba é an t-aon léiriú suntasach i glomeruli lucha yotari ar P14 (saigheada). Is é 20 µm an barra scála agus tagraíonn sé do gach íomhá.
I glomeruli agus DCT an dá ghéinitíopa ainmhí, mhéadaigh céatadán na gcealla LC3B-dearfach le himeacht ama (p < 0.05,="" fíor="" 3d).="" ag="" p11="" agus="" p14,="" bhí="" céatadán="" na="" gceall="" dearfacha="" i="" bhfad="" níos="" airde="" i="" glomeruli="" ainmhithe="" yotari="" ná="" i="" glomeruli="" ainmhithe="" de="" chineál="" fiáin="" (p="">< 0.05,="" fíor="" 3d).="" i="" glomeruli="" ainmhithe="" yotari="" bhí="" déine="" staining="" ainmhithe="" measartha="" go="" láidir="" den="" chuid="" is="" mó="" (tábla="" 2)="" suite="" sa="" spás="" perinuclear="" agus="" núicléach="" (fíor="" 5a–f),="" ag="" gach="" pointe="" ama="" a="" breathnaíodh,="" agus="" i="" glomeruli="" lucha="" de="" chineál="" fiáin,="" bhí="" an="" déine.="" measartha="" den="" chuid="" is="" mó="" (tábla="" 2).="" bhí="" timpeall="" 20="" faoin="" gcéad="" de="" chealla="" dearfacha="" ag="" pct="" de="" yotari="" agus="" ainmhithe="" de="" chineál="" fiáin="" ag="" gach="" pointe="" ama="" breathnaithe="" (p="">< 0.05,="" fíor="">
Slonn CASP{0}} glantaNí raibh beagnach aon léiriú ar an CASP{0}} gníomhachtaithe saduáinainmhithe de chineál fiáin ag gach pointe ama breathnaithe. I PCT agus DCT lucha yotari, bhí roinnt ceall aonair dearfach CASP (Fíor 3e). Ach amháin i glomeruli duáin yotari ag P14 (Fíor 5e), tháinig méadú suntasach ar chéatadán na gcealla dearfacha i gcomparáid leduáinde lucha fiáine (p < 0.05, Fíor 3e).
Plé
DuánIs próisis chasta iad morphogenesis agus forbairt a chomhordaítear go beacht trí idirghníomhú líon mór géinte. aimhrialtachtaí ó bhroinn anduánagus conradh urinary (CAKUT) an locht breithe is coitianta arb ionann é agus 23 faoin gcéad de na lochtanna sin ar fad agus is ionann é agus an phríomhchúis leis an gcéim deiridhgalar duánachi leanaí [28,29]. D’fhéadfadh neamhoird géine aonair a bheith mar phríomhfhoinse CAKUT, agus go dtí seo, aithníodh sóchán i níos mó ná 20 géinte mar chúis CAKUT [30]. Mar a léirigh ár gcuid oibre roimhe seo léiriú iontach ar DAB1 le linn gnáthfhéatas daonnaduánforbartha [9], ghlacamar leis go bhféadfadh ról suntasach a bheith ag DAB1 le linn mamaighduánForbairt. Chun ár hipitéis a chruthú, rinneamar imscrúdú ar anduándeilbhíocht agus patrúin slonn rílíní, NOTCH2, LC3B, agus próitéiní CASP3 gníomhachtaithe i lucha cnagála Dab1.
Feabhsaíonn CISTANCHE Péine Duán/Duánach
Ag dul tríd na lucha yotariduáinnocht cortex níos tanaí agus meán i bhfad níos lúduánagus trastomhais PCT, DCT agus G i gcomparáid le hainmhithe fiáine. An laghdú arduántugtar méid de bharr dearlaice nephron neamhleorduánachhypoplasia, ar cheann de na neamhoird CAKUT is coitianta, a réamhshuíomh Hipirtheannas a thosaíonn do dhaoine fásta agus galar duáin ainsealach [31]. Ina theannta sin, léirigh na micreaghrianghraif a gabhadh leis an TEM go raibh damáiste feiceálach podocyte léirithe ag lucha yotari mar gheall ar eiseadh próisis coise agus easpa slits scagacháin. Tar éis an díobhála, téann podocytes faoi phróiseas éifeachta ina gcailleann siad a struchtúr, rud a fhágann go laghdaítear a bhfeidhm bhacainn scagacháin [32]. Tá gach cineál siondróm nephrotic, chomh maith le glomerulosclerosis deighleogach fócasach (FSGS), tréithrithe ag lochtanna i struchtúr nó feidhm podocyte [33].
Léirigh ár staidéar reatha an léiriú is airde de DAB1 ag na codanna apical agus cliathánach de seicní cille an DCT, agus bhí REELIN scaipthe den chuid is mó ar fud cíteaplasma an PCT. Ag na pointí ama imscrúdaithe, níor breathnaíodh aon athruithe moirfeolaíocha i tubuli de lucha yotari, ach tá gá le himscrúdú breise chun ról DAB1 in urranna tubulointerstitial a shoiléiriú. Tharla comhlocalú ó am go chéile ar phróitéiní DAB1 agus REELIN, sa DCT den chuid is mó. Tá na torthaí seo ag leanúint lenár gcuid oibre roimhe seo maidir le léiriú an dá phróitéin seo le linn daonna féataisduánforbairt [9]. D’fhéadfadh sé seo a thabhairt le tuiscint go bhfuil róil chomhchosúla ag DAB1 agus reelin sa duine agus sa luchduáintrí chuid de na cosáin le sruth a ghníomhachtú, mar shampla cascáidí comharthaíochta Crk, MAPK agus PI3K/Akt/mTOR [34–36]. Nocht ár gcuid sonraí freisin go bhfuil méadú ar an slonn reelin i glomeruli na lucha yotari. Go suimiúil, léirigh staidéar roimhe seo go bhfuil Hipirtheannas, proteinuria, agus gortú podocyte sna francaigh insileadh Ang II ag gabháil le fosfarú DAB1 agus léiriú méadaithe reelin sa glomeruli [10].
Ina theannta sin, léirigh staining inmunofluorescence léiriú méadaithe ar ghabhdóirí NOTCH2 i glomeruli lucha yotari P14. Is eol go maith go ndéantar slonn NOTCH2 a íosrialáil nuair a dhéantar aibiú nephron a bhaint amach, ach amháin i gcoinníollachagortuithe duánach,mar nephropathy diaibéitis agus FSGS [15,37]. Léirigh lucha leis an siondróm nephrotic spreagtha Adriamycin freisin léiriú méadaithe ar NOTCH2 gníomhachtaithe, a mhaolaíonn fiobróis [38]. Ag na pointí ama imscrúdaithe, níor thugamar faoi deara fiobróis mhéadaithe, ach tá sé fós le ról beacht an NOTCH2 sainráite san yotari iarbhreithe a shoiléiriú.duáin.Ba ghá breathnú níos mó féachaint an dtarlaíonn athruithe fifibrotic sna céimeanna níos déanaí. Mar sin féin, tá roinnt torthaí ann cheana féin a thugann le tuiscint go bhfuil baint ag éifeacht gearrthéarmach gníomhachtú NOTCH2 méadaithe le sochar marthanais láidir do podocytes gortaithe, a chailltear i múnlaí fadtéarmacha, mar shampla nephropathy diaibéitis [39].
Is dócha gur léirigh slonn LC3B níos airde i glomeruli lucha yotari P11 agus P14 carnadh na n-uathphagosomes sna podocytes. Chun a thaispeáint go soiléir go raibh luasghéarú ar autophagy. Is gá anailís a dhéanamh ar chóimheas slonn próitéine LC3-II agus LC3-I. Faoi ghnáthchoinníollacha, tá gá le autophagy le haghaidh gnáthfeidhm duáin[40], go háirithe i podocytes. Mar gheall ar a gcumas teoranta maidir le roinnt agus athsholáthar cille, léiríonn siad leibhéal basal ard autophagy [41]. In ainneoin na dtorthaí seo, tuairiscíodh ardú i léiriú LC3B i roinnt galair glomerular [42-44], go príomha i gcomhar le héifeacht próiseas coise agus forbairt siondróm nephrotic, mar a fheictear i lucha cnagaireachta coinníollach receptor prorenin [45,46]. Tugann na staidéir seo go léir le fios go bhfuil ról cosanta ag autophagy feabhsaithe i gcoinníollacha paiteolaíocha, a fhaigheann tacaíocht bhreise ó thorthaí nephropathy spreagtha Adriamycin, áit a gcuirtear autophagy i ngníomh chun cosaint a dhéanamh i gcoinne díobhála podocyte [43], chomh maith le galar glomerular aois-spleách nuair a chuireann sé moill. meath forásach feidhmiúil anfeidhm duáin[40]. Anailís ar an duineduánLéirigh bithóipsí fianaise freisin ar autophagy méadaithe i gcomhar le héifeacht próiseas coise i roinnt galair glomerular, lena n-áirítear siondróm nephrotic athraithe íosta (MCNS), atá ar cheann de na cúiseanna is coitianta le siondróm nephrotic idiopathic [19]. I gcoinníollacha nephropathy diaibéitis agus géarmhíochaine lipopolysaccharide-spreagthagortú duáin,feabhsaítear autophagy le roinnt teiripeoirí trí chosc ar an gcosán PI3K/AKT/mTOR chun feidhm na duáin a fheabhsú [47,48]. Tugann na torthaí seo go léir le tuiscint go bhfuil ról fíor-riachtanach cíteachosanta ag an uathphagaíocht maidir le hoiriúnú struis.gortú duáin, agus d'fhéadfadh a modhnú a bheith ina straitéis teiripeach tuar dóchais inti, cé, i gcásanna áirithe, is féidir leis an uathphagaíocht a bheith díobhálach freisin agus dul ar aghaidh go bás cille.
Feabhsaíonn CISTANCHE TEIP Duán/Duánach
Ach amháin an t-ingearchló in autophagy, d’fhéadfaí leibhéal méadaithe apoptosis a thabhairt faoi deara freisin i glomeruli lucha yotari P14. De ghnáth cuireann autophagy cosc ar apoptosis, ach faoi imthosca paiteolaíocha sonracha, is féidir go mbeadh éifeacht contrártha aige freisin ar mharthanas cille trí apoptosis a fheabhsú agus a chur chun cinn [42]. Tar éis breithe, apoptosis saduáinlaghdaithe go mór, ach amháin i gcoinníollacha nagortú duáin,mar siondróm nephrotic idiopathic áit a chuireann le forbairt an ghalair [23]. cúis núíosach féideartha aimhrialtachtaí ó bhroinn autosomal cúlaitheach anduánagus conradh urinary. Mar sin féin, príomhról DAB1 le linnduánníl an fhorbairt soiléir fós. Ina theannta sin, léirigh na lucha seo neamhghnáchaíochtaí próisis coise agus leibhéal méadaithe de spól, NOTCH2, LC3B agus próitéiní CASP3 scoilte sa glomeruli a d'fhéadfadh gortuithe glomerular a bheith mar thoradh orthu, cosúil le siondróm nephrotic, a d'fhéadfadh a bheith ina chúis bháis i gcomhghaolú le hipoplasia. de na hainmhithe seo le linn na tréimhse scoite. Chun an hipitéis seo a dhearbhú, is gá faisnéis bhreise a sholáthar maidir le brú fola agus paraiméadair eile sa chlinic-saotharlann, amhail leibhéil creatiníne serum, albaimin agus próitéiní.