Tarrthálann Tubuloside B Ó Salsa Cistanche Na Cealla Néarónacha PC12 Ó 1-Meitile-4-Apoptóis Ion-Ion-spreagtha agus Strus Ocsaídeach

Réamhrá

Go paiteolaíoch, is gnách go mbíonn galar treallach Parkinson (PD) tréithrithe ag caillteanas néaróin catecholaminergic, go háirithe néaróin dopaminergacha den substantia nigra pars compacta (SNc), agus láithreacht intraneurona tréith|cuimsiú ar a dtugtar comhlachtaí Lewy i réigiúin inchinne lena mbaineann. In ainneoin go bhfuil fachtóirí éagsúla bainteach le pataigineas PD, tá na meicníochtaí a bhaineann le tionscnamh agus dul chun cinn PD fós éiginnte, Cé go bhfuil freagra fós ar an gcúis PD, tugann roinnt línte fianaise le fios go láidir go bhfuil baint ag strus ocsaídiúcháin, rud a thugann le fios ar deireadh. le bás néarónach nó apoptosis ag giniúint iomarcach fréamhacha saor in aisce. Tacaíonn an fhíric gur féidir leis an gcóras dopaminergic nigiúil leibhéil arda fréamhacha saor in aisce a tháirgeadh agus go bhfuil leibhéil réasúnta íseal de chóras cosanta ocsaídiúcháin aige leis an hipitéis seo. Léirigh staidéir in vivo agus in vitro araon néarthocsaineacht ocsaídeach strus-idirghabhála de MPP ＋, meitibilít gníomhach de l-meitil-4-phenyl-l,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) ar néaróin dopaminergic. Tugann rannpháirtíocht na bhfréamhacha saor in aisce ró-tháirgthe ag strus ocsaídiúcháin mar chúis gar do neamhoird neurodegenerative ar nós PD le fios go bhfuil ról lárnach ag frithocsaídeoirí. Bhí Tubuloside B (Fíor l) ar cheann de na comhdhúile feaniletha noid atá scoite amach ó na gais Cistanche salsa. Fuarthas amach i staidéir roimhe seo go raibh go leor feinileatánóidigh lena n-áirítear tubuloside B, léirigh siad gníomhaíocht láidir scavening radacach saor in aisce.

Ag cur na dtorthaí seo san áireamh, rinneamar imscrúdú sa staidéar seo ar éifeacht tubu]nside B ar néarthocsaineacht spreagtha MPP+-in vitro, ag baint úsáide as an líne chill-pheochromocytoma nerve báúil PC12 a úsáideadh go rathúil thar na blianta chun staidéar a dhéanamh ar fheidhm néaránach.

TUBULOSA CISTANCHE NÁDÚRTHA CHUN GALAR PARKINSON A CHOSAINT PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Abhair agus modhanna

Ábhair

Ba é an Dr Li Lei (An Roinn Táirgí Nádúrtha, Scoil na nEolaíochtaí Cógaisíochta, Ollscoil Peking, Beijing, an tSín) a sholáthair Tubuloside B ó Cistanche Salsa. Bhí íonacht an chomhdhúil níos mó ná 98% de réir anailís HPLC. Ceannaíodh meán modhnaithe Eagle (DMEM) Dulbecco, séiream capall agus séiream lao féatais ó GIBCO BRL, 1-ian oinniam meitile~-phenylpyridi (MPP+ ), polai-L-lísín, 3-(4,{ {8}}thiazole démheitil-2 -il)-2,5- bróimíd défheiniltetrasóiliam (MTT), iaidíd próipidiam (PI), RNase A, próitéináis K, agus 2; Ceannaíodh dé-aicéatáit 7'-déchlórafluorescein (DCFH-DA) ó Sigma.

Cultúr cille

Coinníodh cealla PCI2 i DMEM agus forlíonadh le 10% séiream capall, 5% séiream lao féatais, peinicillin 100U/ml agus streiptimícin 100ug/ml. Saothraíodh na cealla i gorlann humidified aeraithe le 95% aeir agus 5% CO2 ag 37 céim . Rinneadh na turgnaimh go léir 24-48 h tar éis na cealla a shíolrú. Baineadh na cealla go rialta le trypsinúchán 0.25 % nuair a tháinig na cealla i dtreo na céime fochomhlíonta agus plátáilte i bhfleascáin saothraithe 25 cm roinnte ag 1: 8.

Anailís ar inmharthanacht cille

Cinneadh inmharthanacht na gcealla trí úsáid a bhaint as measúnacht MTT modhnaithe mar a thuairiscítear roimhe seo [10], Go hachomair, síolaíodh cealla PC12 i 96-plátaí tobair ag dlús I × 104 cealla in aghaidh an tobair. Fásadh na cultúir ar feadh 48 h, agus ansin athraíodh an meán go dtí sin ina raibh tiúchain éagsúla de dhó B nó MPP＋. Tar éis gor suas le 48h agus 72 h, cuireadh tuaslagán MTr (5 mg/ml i DMEM) leis na 96-plátaí tobair, agus ceadaíodh na cealla a ghoradh ar feadh 4h ag 37 céim . Tar éis an mheán a bhaint, rinneadh na criostail cille agus ruaime beatha intuaslagtha trí 200μL de DMSO a chur leis, agus tomhaiseadh an ionsú ag 570nm (540 nm mar thagairt) le múnla 550 léitheoir microplate (Bio-Rad). Rinneadh anailís freisin ar inmharthanacht na gceall ag baint úsáide as an modh eisiamh gorm trypan. Bailíodh na cealla, iad a mhilleadh go réidh, agus a dhaite le tuaslagán 0.6% de trypan gorm le haghaidh 3 bháisteach. Rinneadh measúnú ar chéatadán na gceall neamhdhaite ina dhiaidh sin i ndeich réimse micreascóp a roghnaíodh go randamach. Mar dhruga dearfach, úsáideadh fachtóir fáis eipideirm 100 ng／ml (EGF).

TUBULOSA CISTANCHE NÁDÚRTHA DO GHNÍOMHAÍOCHT SCAVENING RADACH SAOR IN AISCE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Apoptosis a bhrath trí chitoiméadracht sreafa

Braitheadh ​​cealla apoptotic ag cítoiméadracht sreafa ag baint úsáide as iaidíd propidium (PI) [11 ]. Go hachomair, lománaíodh thart ar 1 × 106 chill a bhí gortha le substaintí tástála trí lártheifneoiriú agus nite uair amháin iad le PBS. Socraíodh cealla le 70 % eatánól ar feadh 24 h ag - 20 céim agus nite uair amháin le PBS. Ansin athchuireadh cealla i 300μL de PBS ina raibh 0.5 mg/ml RNAseA agus 0.5 mg/ml PI. Tar éis gor breise ar feadh 30 nóiméad sa dorchadas, rinneadh cítoiméadracht sreafa le FACScan (Becton Dickinson, Heidelberg, an Ghearmáin).

Anailís ar ilroinnt DNA trí leictreafóiréis

Chuireamar prótacal Moore i bhfeidhm [12] nach raibh ach DNA ilroinnte scoite amach agus rinneadh turgnaimh a normalú trí úsáid a bhaint as líon comhionann cultúir ó gach grúpa tástála. Go hachomair, nitear 3 × 106 néaróin ó gach ceann de na samplaí cóireáilte i dtuaslagán salainn cothromaithe Hank (1000g ar feadh 10 nóiméad), agus rinneadh na millíní a foirmíodh ag bun an fheadáin a aonchineálú le maolán lysis 1 ml (10 mM Tris ag pH 7.4. EDTA 5 mM, 1% Triton X-100) ar feadh 20 nóiméad ar oighear. Tar éis lártheifneoraithe ag 11,000 g le haghaidh 20 báisteach ag 4 céim , baineadh súiteáin ina raibh DNA ilroinnte agus díleáíodh iad le 20 mg/ml RNase A ag 37 céim ar feadh 1 h, agus 0.1 mg/ml de phróitéineas K ag 56 céim. ar feadh 1 h breise. Baineadh úsáid as feanól agus clóraform as an DNA ilroinnte, agus rinneadh é a lártheifneoiriú ag 1O,000g le haghaidh 1 bháisteach ag 4 C. Aistríodh an chéim uiscí isteach i bhfeadán nua Eppendorf, measctha le 2 thoirt d’eatánól oighearfhuar agus ansin curtha ag 20 céim ar feadh 1 h ar a laghad chun DNA a deascadh. Tar éis lártheifneoiriú ag 15,000g ar feadh 20 nóiméad ag 4 céim , baineadh súiteáin as, agus nite millíní DNA le 80 % eatánól uair amháin (15,000 g ar feadh 15 nóiméad ag 4 céim), aer-triomaithe, agus tuaslagtha i 20μL Maolán TE ag pH 7.6. Ansin rinneadh an sampla iomlán a leictreafóiriú ar fhoirmiú agarose 1.5% ar feadh 1 uair ag 85 V. Scrúdaíodh an glóthach agus rinne Córas Doiciméadaithe Glóthach Táirgí Ultra Violet (GELDOC-2000, Bio-Rad, USA) an glóthach a scrúdú agus a ghrianghrafadh.

Foirmiú ROS incheallach a thomhas

Braitheadh ​​foirmiú sárocsaídí intracellular le micreascóp léasair scanadh comhfhócasach ag baint úsáide as cumaisc neamh-fluaraiseacha, 2" 7 "-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) [13], atá dí-eistearaithe laistigh de chealla ag eistearas indéine go dtí an saor ianaithe. aigéad, 2; 7"-déchlórafluorescein. 2",7-Is féidir déchlórafluaraiseacht a ocsaídiú go fluaraiseacha 2" 7"-déchlórafluaraiseach (DCF) ag hidrea-ocsaídeoirí. Goradh cealla le 10 μM DCFH-DA ar feadh 30 nóiméad ag 37 céim . Nitear cultúir faoi dhó le tuaslagán salainn cothromaithe Hank agus íomháíodh iad sa mheán céanna. Rinneadh an íomháú ag baint úsáide as micreascóp léasair scanadh confocal, bhí DCF ar bís ag 488 nm agus bhí an scagaire astaíochtaí scagaire bacainn 510nm, Chun comparáid bhailí a sholáthar, baineadh úsáid as na paraiméadair fála céanna le haghaidh gach breathnóireachta. Socraíodh an suíomh ingearach is fearr is féidir i lár na gcealla, agus ansin scanadh an réimse go tapa. Toisc gur tháinig méadú ar fhluaraiseacht de bharr soilsiú ag an tonnfhad excitation de 488 nm mar gheall ar ocsaídiú an ruaim seo, bhí gach réimse faoi lé Iight ag an am céanna. Baineadh úsáid as luachanna bonnlíne ó chealla neamhspreagtha mar luachanna rialaithe chun comparáid a dhéanamh le cealla cóireáilte MPP＋ i láthair nó in easnamhtubuloside B. Tar éis an scanadh, rinneadh an meán-déine fhluaraiseachta choibhneasta i 15-20 chomhlachtaí cille néarónach in aghaidh an réimse micreascóp a chainníochtú i gceithre chultúr ar leith in aghaidh an choinníll cóireála.

Anailís staitistiúil

Cuireadh na luachanna go léir a fuarthas in iúl mar mhodh ±SD. Ba é tástáil t an Mhic Léinn a chinntigh tábhacht staitistiúil na ndifríochtaí idir grúpaí; Measadh go raibh luachanna p ríofa níos lú ná 0.05 suntasach go staitistiúil.

Torthaí

Mar a léirítear i bhFíor 2, tháirg MPP+ laghdú dáileog-spleách ar inmharthanacht na gceall PCI2. I gcodarsnacht leis sin, thug EGF, fachtóir néartrófach aitheanta, cosaint shuntasach d’inmharthanacht na gceall ag 100ng/mL MPP – maolaíodh éifeachtaí citotocsaineacha spreagtha freisin i láthair tubuloside B (5, 10, 50 nó 100 ug-ml{{12} }), cé go bhfuil níos lú potency ná an tagairt

druga (Fig. 3). Thaispeáin Tubuloside B ag na tiúchain seo éifeachtaí cíteachosanta ar bhealach a bhí ag brath ar dháileog agus níorbh é an comhdhúil amháin ba chúis le haon cíteatocsaineacht dealraitheach (níor léirítear sonraí). Léirigh leictreafóiréis glóthach den sliocht DNA ó chealla PCI 2 cóireáilte le 200 µM MPP+ ar feadh 48 h dréimire DNA. sainmharc clasaiceach de apoptosis,tubuloside B, ag dáileoga de 10 agus 100 μ g·ml-1fhoirmiú oideachasúil ar an dréimire DNA(Fíor. 4) . Taispeánann Fig.5 histeagraim tipiciúla den sreabhadh anailís chithiméadrach ar bhás cille apoptotic de bharr MPP＋ i gcealla PC12 i láthair nó in éagmais tubuloside B. Nocht cainníochtú phróifíl timthriall na gceall le PI líon na gcealla le tréithe fodhioplóideach (réigiún M1). táscach ar ilroinnt DNA apoptotic. I gcealla neamhchóireáilte, bhí an codán apoptotic fo-dhioplóideach íosta suas go dtí 5 94 ％ de na 10000 cill iomlán (Fíor 5 A). Tar éis nochtadh 48 h do MPP＋, mhéadaigh céatadán an apoptóis go 43．02;j;(Fíor.5 B)． Nuair a chuirtear leis an gcultúr cille, tubuloside Bapoptosis coiscthe MPP+-spreagthaar bhealach dáileog-spleách. Ag tiúchan 10 ug·ml-1ní raibh an chosaint le tubuloside B suntasach go staitistiúil, ach ag 50 agus 1 00ug·ml-1, laghdú 45 ％ agus 63％ faoi seach, chonacthas. méadú ar chéatadán na gceall marthanais (Fíor. 5D, E).

Is féidir carnadh ROS infhéitheach a bhrath trí úsáid a bhaint as DCFH-DA (Cealla PC12 atá cóireáilte le 200 uM MPP) ar feadh 48 h ar taispeáint fluaraiseacht dhian taobh istigh den chill tar éis é a dhathú le dath DCFH-DA (Fíor 6)． Chuir cóireáil chomhuaineach le tubuloside B (ag dáileoga 10 agus 100ug·ml.) bac ar tháirgeadh ROS spreagtha MPP＋一 (ba é céatadán laghdaithe 24．52％ agus 55．63％, faoi seach).

TUBULOSA CISTANCHE NÁDÚRTHA CHUN GALAR PARKINSON A CHÓIREÁIL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Plé

Is éard atá i gceist le pathogenesis PD ná strus láidir ocsaídiúcháin, leibhéil laghdaithe frithocsaídeacha, agus lochtanna mitochondrial. go léir a chothaíonn apoptosis i roinnt córais cheallacha. Go háirithe, tá sé léirithe go spreagann fréamhacha saor in aisce bás cille gníomhach i néaróin[14]. Táirgeann MPTP siondróm do-aisiompaithe agus dian cosúil le Parkinsonian a fhágann díghiniúint roghnaíoch na néaróin dopaminergacha nigrostriatal i ndaoine. Baineadh úsáid as an neurotoxin seo chun a chruthú. ith samhlacha ainmhithe de PD[15] ．Déantar MPTP a thiontú ag monoamine oxidase B go Mpp＋, atá carntha i miteachondria. sa chás go gcuireann sé bac ar choimpléasc miteachondrial I agus na díslí miteachondrialacha sin. is cúis le feidhm apoptosis[16]. Dá bhrí sin, tá néartocsaineacht spreagtha MPP+一 i néaróin dopaminergacha úsáidte go forleathan mar shamhail etiologic PD chun gníomhairí néarchosanta a scagadh.

Sa staidéar seo, tá sé léirithe againn gur laghdaigh tubuloside B bás cille spreagtha MPP+-trí strus ocsaídiúcháin i gcealla PC12. Ina theannta sin, léirigh muid go ndearna tubuloside B cosaint freisin ar bhealach dáileog-spleách ar an MPP{{ 3}}dréimire DNA spreagtha agus apoptosis, arna dtomhas ag baint úsáide as leictreafóiréis glóthach DNA agus anailís chithiméadrach sreafa. Ina theannta sin, chuir cóireáil chomhuaineach le tiúchan níos airde de tubuloside B bac ar tháirgeadh ROS arna spreagadh ag MPP. Mar sin, léirigh tubuloside B éifeachtaí néarchosanta ilfheidhmeach. D'fhéadfadh go mbeadh baint ag roinnt meicníochtaí, ar leithligh nó i gcomhar, le gníomhartha tubuloside B. Is meicníocht fhéideartha é an éifeacht frithocsaídeach le haghaidh neuroprotection B-idirghabhála tubuloside. Fuair ​​Xiong Q amach gur léirigh tubuloside B gníomhaíocht láidir scavening radacach saor in aisce ar an radacach 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl agus xanthine]xanthine oxidase a ghin superoxide anion radacach.

Tuairiscíodh le déanaí go bhfuil airíonna scavening radacacha saor in aisce ag roinnt feinileatánóid agus go gcosnaíonn siad gortuithe tocsaineacha ocsaídeacha de bharr strus. Déanann ROS arna dtáirgeadh ag MPP+ cosúil le sárocsaíd hidrigine, superoxide anion, agus radacach hiodrocsaile damáiste go héasca do mhóilíní bitheolaíocha, rud a d'fhéadfadh bás cille apoptotic nó necrotic a bheith mar thoradh ar deireadh thiar. Mar sin, d’fhéadfadh éifeachtaí díreacha scavening a bheith ag tubuloside B i gcoinne ROS. Cé nach socraíonn ár gcuid sonraí an suíomh cruinn ag a ngníomhaíonn tubuloside B chun carnadh ROS a chosc, tugann siad le tuiscint go bhfuil spreagadh bealaí frithocsaídeacha i gceist leis an meicníocht néarchosanta. Léiríonn staidéar ar struchtúr móilíneach tubuloside B freisin go bhfuil cumas láidir aige le haghaidhscavening fréamhacha saor in aisce(cumarsáid phearsanta).

D’fhéadfadh meicníochtaí eile a bheith ábhartha freisin. Mar shampla, d’fhéadfadh go mbeadh sé d’acmhainn ag tubuloside B tocsaineacht MPP＋ a chomhrac trí oscailt phiocháin trasdula tréscaoilteachta miteachondrial agus mífheidhm a chosc. Ina theannta sin, ba cheart a mheas freisin an bhfuil éifeacht dhíreach ag tubuloside B chun fás a chur chun cinn ar chealla néarónacha. Tá meicníocht chruinn na gníomhaíochta neuroprotective de tubuloside B soiléir fós. Tá gá le staidéir bhreise chun an pictiúr iomlán dá éifeacht neuroprotective a shoiléiriú.

Go críochnaitheach, tubuloside B óSliocht salsa cistanchetá éifeachtaí cosanta soiléire aige ar apoptosis spreagtha MPP agus ar strus ocsaídiúcháin. D’fhéadfadh a éifeachtaí neuroprotective i gcoinne MPP ＋ tocsaineacht a bheith tábhachtach agus a thabharfadh le tuiscint go bhféadfadh go mbeadh acmhainneacht theiripeach aige chun PD a chosc agus a chóireáil.

TUBULOSA CISTANCHE NÁDÚRTHA CHUN GALAR PARKINSON A CHÓIREÁIL PHGS75% ECH 30% ACT 12%