Sa Lá atá inniu ann, Breathnaítear ar Seanchas Ceallach mar Fhrithghníomh Coiteann ar Beagnach Gach Cineál Ceall Iomadaithe

Déan teagmháil le do thoiloscar.xiao@wecistanche.comle haghaidh tuilleadh eolais

TeibíTá díothú spriocdhírithe cealla senescent, anailís, ar cheann de na treochtaí lárnacha i teiripe frith-aosaithe. Cruthaíodh le déanaí go raibh gliocóisídí cairdiacha ina senolytics leathan-speictrim. Anseo rinneamar tástáil ar airíonna senolytic de gliocóisídí cairdiacha i dtreo gaschealla meiseinchymal daonna (hMSCanna). Ní raibh aon chumas senolytic ag gliocóisídí cairdiacha i dtreo hMSCanna senescent de bhunús éagsúla. Ag baint úsáide as cur chuige bitheolaíoch agus bithfhaisnéiseach déanaimid comparáid idir forbairt seanaoise i 'gliocóisídí cairdiacha-íogair'A549 agus '-neamhíogair'hMSCs. Fuarthas amach go raibh an easpa anailíse á idirghabháil ag allmhairiú éifeachtach potaisiam agus friotaíocht méadaithe apoptóis i HMSCanna séanacha. Mar gheall ar lagú “cosaint antiapoptotic” ní féidir HMSCanna a anailísiú. Nochtamar nach bhfuil frithsheasmhacht apoptosis, a aithníodh roimhe seo mar shaintréith choitianta de sheansúlacht, i ndáiríre, ina ghné ghinearálta de chealla senescent. Ina theannta sin, níl ach cealla senescent apoptosis-proline íogair d'anailís spreagtha glycosíde cairdiach. Mar sin, is féidir linn tuairimíocht a dhéanamh go bhféadfadh éifeachtacht na hanailíse a bheith ag brath ar cé acu an n-éiríonn cealla seanaoise-resistant apoptosis i gcomparáid lena gcomhghleacaithe iomadaithe.

EochairfhocailGaschealla. Seinealú·Senescence·Apoptosis· Friotaíocht struis

KSL27

Cliceáil anseo le do thoil chun tuilleadh eolais a fháil

Réamhrá

Sa lá atá inniu ann, meastar gur imoibriú coitianta de bheagnach gach cineál cealla iomadúcháin é seangacht cheallacha, lena n-áirítear cealla ailse agus gas, chomh maith le roinnt cealla iar-mhiotótach ar éagsúlacht spreagthaigh struis [1-3]. Is féidir na cineálacha senescence cealla seo a leanas a idirdhealú dá réir sin le bunús an fhachtóra ionduchtaithe: macasamhail (mar gheall ar an damáiste DNA ag na foircinn telomere giorraithe), spreagtha oncogene (mar fhreagra ar ghníomhachtú neamhbhuan comharthaí oncogenic), strus-spreagtha ( arna idirghabháil ag an damáiste DNA de bharr an strus ocsaídiúcháin, turraing teasa, radaíocht UV agus y, etc.) agus ceimiteiripe-spreagtha (gníomhachtaithe i gcealla ailse mar fhreagra ar dhrugaí ceimiteiripeacha)[4-7]. Tá ilchineálacht sna marcóirí arna léiriú ag cealla senescent ag brath ar an gcineál cille agus maslaí a úsáidtear chun seanchas a chothú. Mar sin féin, tá roinnt gnéithe coitianta tipiciúil don chuid is mó de na cineálacha cealla senescent. Is é an tréith riachtanach a bhaineann le seangacht d'aon chineál cille roinnte ná an caillteanas iomadú dochúlaithe [8].sliocht cistanche tubulosaTá do-aisiompaitheacht na gabhála timthriall cille á rialú ag na coscóirí cyclin-spleách kinase (CDK) pl6 agus p21 agus is minic a rialaítear é ag an próitéin suppressor meall p53 [8,9]. Is iad na gnéithe tábhachtacha eile de chealla senescent gníomhachtú freagra damáiste DNA leanúnach; hypertrophy cille, a eascraíonn go minic mar thoradh ar bithgenesis ribosomal lagaithe agus sintéis próitéin; suaitheadh ar dhíghrádú lysosomal agus mífheidhmiú na gcóras díghrádaithe scíthe; gníomhaíocht mhéadaithe na heinsíme líseasómach ar leith a bhaineann- -galactosidase; athruithe mitochondrial éagsúla; éadáil feinitíopa rúnaithe seandálaíochta (SASP), comhdhéanta d’fhachtóirí pro-athlastacha, einsímí díghrádaithe maitrís, speicis ocsaigin imoibríocha, etc.; athruithe tírdhreacha epigenetic agus crómatin, lena n-áirítear foirmiú fócais heitreacrómataigh a bhaineann le seandacht agus distension satailítí a bhaineann le senescence [8-10]. na cealla tionscnaimh.

KSL28

Is féidir le Cistanche frith-aging

Tá sé soiléir anois gur féidir le cealla senescent an microenvironment máguaird a mhodhnú a dhéanann difear do chealla comharsanacha agus nideoga ceallacha, rud a d'fhéadfadh mífheidhmiú fíocháin a bheith mar thoradh air agus dá bhrí sin d'fhéadfadh go mbeadh baint acu le dul chun cinn ag dul in aois agus galair a bhaineann le haois [11,12]. Agus é sin á chur san áireamh, dírítear níos mó airde inniu ar na straitéisí chun “marú” spriocdhírithe cealla seanaoise[13-15]. Chuige sin, tá aicme nua drugaí ar a dtugtar senolytics ag forbairt go gníomhach. Díríonn Senolytics ar bhealaí comharthaíochta a chuireann le friotaíocht na gceall sinseach i dtreo apoptosis, rud a fhágann go n-eascraíonn apoptosis go fabhrach i gcealla senescent[16]. Tá liosta na senolytics ag athlánú i gcónaí le gníomhairí nua. Is iad na comhdhúile is eol leis an ngníomhaíocht senolytic luaite ná navitoclax (Bcl-2 inhibitor teaghlaigh), meascán de dasatinib (coisctheoir de kinases tyrosine iolrach) agus quercetin (flavonol nádúrtha), coscairí Hsp90, coscairí MDM2, FOXO{ {8}}peiptíd trasnaíochta p53, díghrádóir próitéine teaghlaigh BET, CAR-T a bhaineann go sonrach le uPAR, navitoclax galacto-chomhchuingeach agus comhdhúile nádúrtha seanalytic éagsúla[16-24]. Le déanaí, d'aithin dhá ghrúpa taighde neamhspleácha trí úsáid a bhaint as scagthástáil drugaí ard-thréchur, gliocóisídí cairdiacha, go háirithe ouabain, digoxin, agus búfalin, mar shinolytics leathan-speictrim [25,26].athbhreithnithe cistanche tubulosaIs fiú a lua go bhfuil teorainneacha ag beagnach gach ceann de na senolytics dearbhaithe, mar shampla fo-iarsmaí neamh-inmhianaithe nó neamhéifeachtúlacht i dtreo roinnt cineálacha cille. Is sainairíonna iad gaschealla mesenchymal (MSCanna), a fhaightear beagnach i ngach orgán / fíocháin iarbhreithe, go bhfuil an cumas féin-athnuachan (rannáin siméadracha) agus idirdhealú a dhéanamh orthu, rud a chuireann le cothabháil agus athghiniúint an fhíocháin chónaithe [27]. Mar gheall ar na hairíonna uathúla seo, chomh maith leis na feidhmeanna cumhachtacha frith-athlastacha agus imdhíonachta, cuirtear MSCanna i bhfeidhm go forleathan i dteiripe athsholáthair cille chun galair éagsúla a chóireáil, lena n-áirítear diaibéiteas Mellitus, scléaróis iolrach, infarction miócairdiach, agus mar sin de [28]. Mar sin féin, cosúil lena sliocht difreáilte agus cealla unipotent eile, tá MSCs in ann senesce ceachtar macasamhail nó ró-luath mar fhreagra ar ghníomhachtú oncogenes agus spreagthaí struis [29, 30]. den chomhthiomsú gascheall, cothabháil agus athghiniúint fíocháin laghdaithe, cumas difreála lagaithe, scaipeadh seangachta trí mheán SASP, airíonna angaigineacha laghdaithe, nideoige gascheall a mhodhnú [29,31-33]. Agus an tábhacht bhitheolaíoch a bhaineann le feidhmiú cuí na MSCanna á gcur san áireamh, d'fhéadfaí breathnú ar MSCanna seanaoise mar an sprioc ríthábhachtach le haghaidh anailíse. Ag teacht leis an moladh seo, foilsíodh roinnt athbhreithnithe le bliain anuas inar leagadh béim ar thorthaí buntáisteacha a d’fhéadfadh a bheith ann ó bhaint MSCanna seanaoise [29, 31,34,35]. Mar sin féin, níl ach cúpla sonraí turgnamhacha maidir leis an tsaincheist seo [36-40].

Laistigh den staidéar reatha, léirímid den chéad uair go dteipeann ar gliocóisídí cairdiacha, eadhon ouabain agus bufalin, gníomhaíocht hemolytic a thaispeáint i dtreo MSCanna daonna (hMSCanna) a dhíorthaítear ón endometrium (END-MSCs), fíochán adipose (AD-MSCs), an laíon fiaclóireachta (DP-MSCs) agus glóthach Warton (WJ-MSCs). Chomh maith leis sin, dearbhaímid go bhfuil an dá gliocóisídí cairdiacha in ann apoptosis a aslú go fabhrach i senes-cent A549 agus SK-HEP-1, mar a cuireadh síos cheana sna staidéir phíolótacha [25,26]. Trí athruithe ar hoiméastáis ianach a mheas de bharr blocáil Nat/K plus -ATPase agus leibhéil slonn na ngéinte gaolmhar, léirímid go bhféadfadh easpa anailíse a tharlódh le ouabain a bheith idirghabhála ag éifeachtacht fheabhsaithe an chúitimh K móide allmhairiú i síneasach END- MSCanna i gcomparáid le senescent A549. Ina theannta sin, ag baint úsáide as ard-bhithfhaisnéisíocht léirímid go bhfuil éadáil feinitíopa atá frithsheasmhach in aghaidh apoptóis ag gabháil le seanaoise END-MSCanna, atá frithsheasmhach in aghaidh anailíse spreagtha ó uaabain, cé nach bhfuil seanúlacht A549 íogair ó thaobh ouabain. Is é an rud is tábhachtaí ná gur tharla anailís ar END-MSCanna senescent senescent-resistant apoptosis. Dá bhrí sin, soláthraímid fianaise shoiléir nach gné ghinearálta de chealla senescent é apoptosis-resist-ance. Bunaithe ar na sonraí a fuarthas déanaimid ar an tátal go bhféadfadh éifeachtacht na gcur chuige anailíse a bheith ag brath ar cé acu an raibh nó nach raibh cealla in ann apoptosis-resistant le linn fhorbairt seantachta.

abhair agus modhanna

Cealla

Fuarthas END-MSCs, WJ-MSCs, DP-MSCs, AD-MSCs, A549, agus SK-Help ó Bhailiúchán Cultúir Cille na Rúise (Institiúid na Cíteolaíochta, Saint-Petersburg, an Rúis). Fíordheimhníodh línte A549 agus SK-Help le tástálacha karyology, tumorigenicity, isoenzyme (LDH agus G6PD), agus anailís STR. Saothraíodh cealla i meán iomlán DMEM F12 (Gibco BRL) arna fhorlíonadh le 10 faoin gcéad FBS (HyClone), 1 faoin gcéad peinicillin-streiptimícin (Gibco BRL) agus 1 faoin gcéad glútamach (Gibco BRL). Rinneadh tástáil rialta ar gach cill le haghaidh éillithe mycoplasma.

Coinníollacha Senescence agus strus-spreagtha

Le haghaidh seanaoise ocsaídiúcháin de bharr strus, déileáladh le END-MSCs/WJ-MSCs le 200 uM/100 uM HO (Sigma) ar feadh 1 h. Le haghaidh seanaoise de bharr doxorubicin, déileáladh le DP-MSCs/A549 le 1 μM de doxorubicin (Veropharm) ar feadh 3 lá. I ngach cás, measadh go raibh cealla senescent tráth nach luaithe ná 14 lá tar éis cóireála. Le haghaidh seanaoise macasamhail aithníodh AD-MSCanna níos luaithe ná an 4ú sliocht mar chealla rialaithe agus níos déanaí ná an 10ú mar chealla seanaoise. Le haghaidh seanaoise arna spreagadh ag etoposide cuireadh cóireáil ar A549/END-MSCs/SK-Help le 2 uM/5 uM/3 uM etoposide(Veropharm) ar feadh 3 lá agus rinneadh anailís orthu tráth nach luaithe ná 7 lá tar éis ionduchtú seanaoise. Sa chás seo, bhí dearadh an chóireála go hiomlán ag an am céanna leis na cinn a thuairiscítear sa staidéar as ar tháinig sonraí RNA-seq (Wang et al., 2017). Chuireamar dhá ghlocóisídí cairdiacha i bhfeidhm mar chomhdhúile seantalytic——Ouabain (Sigma) agus Bufalin(Calbiochem).

Chun comparáid a dhéanamh idir an fhriotaíocht struis idir rialú agus END-MSCanna seanaoise nó A549, déileáladh le cealla le 400/800 uM H O2(Sigma) ar feadh 1 h nó le staurosporine 0.3/1 uM (Sigma). Rinneadh anailís ar inmharthanacht cille 48 h tar éis ionduchtú struis.

Chun gníomhaíocht MCL{0}} a chosc, rinneadh réamhchóireáil ar END-MSCanna le 10 uM de A-1210477(Sigma) ar feadh 3 lá.

KSL29

Anailís cítiméadracht sreafa

Rinneadh tomhais ar inmharthanacht cille, iomadú, méid cille, auto-fluaraiseacht, rátaí apoptosis, scoilteachta caspase 3/7, acmhainneacht membrane mitochondrial, agus dípolarization membrane ag cítoiméadracht sreafa. Baineadh úsáid as cíteaiméadracht sreafa ag baint úsáide as an CytoFLEX (Beckman Coulter) agus rinneadh anailís ar na sonraí a fuarthas trí úsáid a bhaint as leagan bogearraí CytExpert 2.0. Rinseodh cealla greamaitheacha faoi dhó le PBS agus baineadh iad le trypsinization. Comhthiomsaíodh cealla scoite agus cuireadh ar fionraí arís iad i meán úr agus ansin rinneadh iad a chomhaireamh agus a anailísiú le haghaidh uathfhluaraiseacht. D'fhonn rochtain a fháil ar inmharthanacht cille, cuireadh 50ug/ml iaidíd próipidiam (Teicneolaíochtaí Beatha) le gach sampla díreach roimh anailís. Rinneadh measúnú ar mhéid na gcealla trí scaipeadh solais chitiméadrach ar aghaidh ar chealla PI-diúltacha. Fíoraíodh ionduchtú apoptosis trí úsáid a bhaint as comhstaining Annexin-V-APC (Invitrogen) agus DAPI (Sigma) de réir threoracha an déantóra. Rinneadh measúnú ar ghníomhaíocht Caspase trí úsáid a bhaint as CellEventTM Caspase-3/7 Green Sreabhadh Cytometry Assay Assay (Invitrogen) tar éis prótacal monaraíochta. Rinneadh measúnú ar chailliúint poitéinseal scannáin miteachondrial ag baint úsáide as an dath cóimheasmhéadrach JC-1 (Invitrogen). Rinneadh an nós imeachta staining i gcomhréir le prótacal an mhonaróra. Le haghaidh dípolarú membrane, d'úsáideamar taiscéalaí fluaraiseacha DiBAC4(3) (Invitrogen).

Staining Senescence-galactosidase

Rinneadh staining Senescence-Galactosidase (SA- -Gal) ag baint úsáide as trealamh staining senescence -galactosidase (Teicneolaíocht Comharthaíochta Cealla) de réir threoracha an déantóra. Táirgeadh anailís chainníochtúil ar íomhánna le cur i bhfeidhm an phacáiste MatLab, de réir an algartam ar a ndearnadh cur síos roimhe seo[41]. I gcás gach pointe turgnamhach, rinneadh anailís ar nach lú ná 50 ceall a roghnaíodh go randamach.

Blotting an Iarthair

Rinneadh blotáil an Iarthair mar a thuairiscítear roimhe seo [41]. Rinneadh leictreafóiréis SDS-PAGE, aistriú go membrane nitrocellulose, agus imdhíonadh le brath ECL (Thermo Scientific) de réir prótacail chaighdeánacha an mhonaróra (Saotharlanna Bith-Rad). Baineadh úsáid as antasubstaintí in aghaidh na bpróitéiní seo a leanas: glyceraldehyde-3-fosfáit díhidriginease (GAPDH)(clón 14C10), fosfa-p53(Ser15), p21(clón 12D1), fosfa-Rb (Ser807/811) , HMGB1 (clón D3E5), chomh maith le horseradish sárocsaíd-chomhchuingeach gabhar antirabbit IgG. Ba iad na rátaí caolaithe ná 1:1000 do gach antasubstaintí príomhúla agus 1:7000 do na cinn thánaisteacha. Ceannaíodh gach antasubstaint ó Chomharthaíocht na gCeall. Baineadh úsáid as an Scion Image 4.0(Scion Corporation) chun dlús na mbanda cúlra-dealaithe sna glóthacha agus sna blotaí go léir a roghnú agus a chinneadh.

Anailís trascriptomic

Úsáideadh samplaí ó na trí thacar sonraí Omnibus Slonn Géinte (GEO)RNA-seq seo a leanas san anailís: GSE102639(GSM2742113-GSM2742114 agus GSM2742121-GSM2742122do rialú agus cealla senescentA549, dá réir); GSE122081(GSM3454482-GSM3454484 agus GSM3454500-GSM3454502 le haghaidh cealla IMR-90 rialaithe agus séanbhreithe, dá réir); agus ár dtacar sonraí GSE160702 (GSM4877895-GSM4877898 agus GSM4877907-GSM4877910 le haghaidh END-MSCanna rialaithe agus séanacha, faoi seach). Próiseáladh na sonraí do na tacair sonraí go léir ar an mbealach céanna.

Léann Raw sonraí a ndearnadh scagadh cáilíochta agus bearradh cuibheoirí trí scripteanna FilterByTile agus BBDuk ón bpacáiste BBtools (leagan 38.75) ag baint úsáide as na roghanna réamhshocraithe. Rinneadh na léamha eile a scagadh agus a bhearradh freisin le húsáid scripte trimester ón bpacáiste FastqPuri (leagan 1.0.7).cistanche RACuireadh an oibríocht bearrtha i bhfeidhm ar dhá cheann an léite má bhí N iontu nó má bhí a gcáilíocht faoi bhun na tairsí cáilíochta a socraíodh go 27, gach léamh níos giorra ná 25 bonn curtha i leataobh. Tionóladh rialú cáilíochta an scamhadh leis na bogearraí FastQC (leagan 0.11.7) agus scripteanna FastqPuri. Ní lú ná 90 faoin gcéad de na sonraí tosaigh sna léann, tar éis dóibh gach oibríocht a rith.

Measadh flúirse tras-scríbhinní ag baint úsáide as an léarscáiliú éadrom Bradán (leagan 1.1.0) a ritheadh sa mhodh ailínithe roghnach. Gineadh an liosta maolán bunaithe ar ghéanóm tagartha daonna Gencode GRCh38.p13 (scaoileadh 33) agus úsáideadh é a thuilleadh chun an t-innéacs ar chomhaid thagartha tras-aimsithe comhcheangailte agus genome Gencode a thógáil (scaoileadh 33) ag baint úsáide as méid kmer de 21. Reáchtáladh oibríochtaí mapála le bratacha breise ——numBootstraps 30——sequins——gcBias—— mapálacha a bhailíochtú. Bhí na rátaí mapála mar thoradh air sin thart ar 70 faoin gcéad.

KSL30

Rinneadh tuilleadh próiseála sonraí trí úsáid a bhaint as leagan R 3.6.3 le bailiúchán pacáistí Tidyverse (leagan 1.3.0). Lódaíodh comhaireamh géine measta, meiteashonraí, agus raonta tras-scríbhinní isteach i R agus rinneadh achoimre orthu go leibhéal géine ag baint úsáide as tximeta (leagan 1.4.5). Rinneadh an mhaitrís chomhairimh a tháinig as a scagadh chun sraitheanna a raibh ar a laghad 5 chomhaireamh measta iontu thar na samplaí go léir a chuimsiú, agus chuimsigh an mhaitrís a bhí mar thoradh air sin 20,400 géin.

Maidir leis an léiriú PCA agus léarscáil teasa, normalaíodh na háirimh léite ag baint úsáide as claochlú loga ón bpacáiste DESeq2 (leagan 1.26.0).cisteanche wirkungTógadh léarscáileanna teasa le húsáid scagaire géine (leagan 1.38.0) agus pacáistí heatmap (leagan 1.0.12)R. Rinneadh bailíochtú ar shamplaí rannáin de réir athróige seanaoise trí chomhairimh léite normalaithe de réir géinte a bhaineann leis an téarma Géin-Ointeolaíocht "Cellular senescence" (GO 0090398) a fho-chur. Ríomhadh anailís difreálach ar chaint agus meastachán ar athruithe fillte loga trí úsáid a bhaint as DESeq2 don athróg dheireanach sa rialú foirmle deartha do stádas seanaoise cealla, imoibriú cóireála ouabain, agus idirghníomhú na bhfachtóirí léirithe. Chun tástáil slonn difreálach a neartú, cuireadh ceartú athraithe fillte loga ag baint úsáide as meastóir crapadh oiriúnaitheach ón bpacáiste pailme (leagan 1.8.0) agus ag sonrú tairseach athraithe fillte logála breise cothrom le 0.667. Baineadh úsáid bhreise as na meastacháin laghdaithe a d'eascair as seo chun géine a rangú agus Anailís Saibhrithe Set Géin a rith ag baint úsáide as próifíl bhraisle (leagan 3.14.3) agus fiús (leagan 1.12.0)R le luachanna p arna choigeartú le haghaidh comparáidí iolracha de réir mhodh Benjamin-Hochberg. Fuarthas samplaí Affymetrix microarray le haghaidh rialaithe agus Senes-cent AD-MSC ó bhunachar sonraí GEO (GSE66236) agus próiseáladh iad le feidhmchlár gréasáin Phantasus le normalú log2 agus comhaireamh cainníochtúil. Rinneadh Anailís Saibhrithe Géine Géinte le húsáid pacáiste fiús (leagan 1.12.0)R.

eastóscadh RNA, trascríobh droim ar ais, agus PCR fíor-ama

Rinneadh eastóscadh RNA, trascríobh droim ar ais, agus PCR fíor-ama mar a thuairiscítear inár staidéar roimhe seo [32]. Fuarthas imoibrithe le haghaidh eastóscadh RNA (imoibrí ExtractRNA), trascríobh droim ar ais (trealamh MMLV RT), agus PCR fíor-ama (feisteán HS SYBR) ó Evrogen. Rinneadh measúnú ar leibhéil slonn géine ag baint úsáide as an aimplitheoir fíor-ama PCR BioRad CFX-96 (BioRad) leis an gclár reatha seo a leanas do gach géin imscrúdaithe: 40 timthriall leá ar feadh 10 s ag 95 céim, annealing ar feadh 15 s ag 57.5 céim , agus sintéis ar feadh 15 s ag 72 céim. Cuireadh anailís cuair leá i bhfeidhm chun sainiúlacht na n-imoibrithe a rialú. Rinneadh an anailís seo a leanas ar na sonraí a fuarthas trí úsáid a bhaint as bogearraí Bio-Rad CFX Manager (BioRad) leis an modh caighdeánach cainníochtaithe 2deltaCt le húsáid slonn GAPDH mar thagairt. Tá seichimh primer liostaithe i dTábla 1.

Anailís staitistiúil

Chun suntas a fháil sa difríocht idir an dá ghrúpa cuireadh t-tástáil an mhic léinn nó t-thástáil Welch i bhfeidhm. Le haghaidh comparáidí iolracha idir grúpaí, baineadh úsáid as ANOVA le HSD Tukey. Mura gcuirtear a mhalairt in iúl, taispeántar na sonraí cainníochtúla go léir mar mheán±SD agus léiríonn na réiltíní difríochtaí suntasacha mar seo a leanas: ns, ní suntasach, *p<0.05,><><0.001. statistical="" analysis="" was="" performed="" using="" r="">

Torthaí

Cuireann H2O2-END-MSCanna cóireáilte isteach sa seanaois roimh am

Laistigh den staidéar reatha, d'úsáideamar gaschealla mesenchymal daonna scoite ó endometrium díscéimeach (END-MSCs), a shásaíonn na critéir íosta a mhol an ISCT chun hMSCanna a shainiú [41]. Roimhe seo, tá múnla turgnamhach iontaofa forbartha againn chun staidéar a dhéanamh ar ghnéithe éagsúla de sheansúlacht roimh am END-MSCs [30]. Is é sin, tá sé léirithe againn go bhfuair END-MSCanna a bhí faoi strus ocsaídiúcháin sublethal na gnéithe tipiciúla de chealla seanaoise de réir a chéile, lena n-áirítear fócais damba marthanacha DNA agus freagairt damáiste DNA gníomhach, gabháil do thimthriall cille do-aisiompaithe arna idirghabháil ag an clasaiceach p53/p21/Rb. cosán, caillteanas iomadúcháin, hipertróf cille, cuma SA- -Staining gal agus forbairt feinitíopa rúnaíochta a bhaineann le seangacht [30, 32, 42]. Anseo chuireamar an tsamhail deartha i bhfeidhm chun staidéar a dhéanamh ar éifeacht senolytic an ouabain chomh maith leis na bunathruithe intracellular i hoiméastáis ian a nochtadh. Ar dtús, trí na paraiméadair is coitianta a mheas, dheimhnigh muid gur leor cóireáil aon-dáileog （1 h, 200 μM） HO chun seantúlacht a chothú i END-MSCs. Is é an rud is tábhachtaí ná gur measadh go raibh END-MSCs faoi strus senescent dhá sheachtain tar éis an strus ocsaídiúcháin; dá bhrí sin, rinneadh measúnú ar na marcóirí seanaoise tráth nach luaithe ná 14 lá tar éis cóireáil H-Oz. Go deimhin, mar thoradh ar chóireáil H-Oz ar END-MSCanna bhí bloc iomadú, hipertróf cille mar a léirigh an méadú ar mhéid na gceall, carnadh an lipofuscin a braitheadh de bharr ingearchló na n-uathfhluaraiseacht, cuma an SA- -Gal, gníomhachtú an conair p21/Rb agus cailliúint HMGB1 le chéile ag tacú le bunú seanaoise faoi na coinníollacha turgnamhacha roghnaithe (Fíor ac,e,f).

Creidtear gurb iad na hiarmhairtí is díobhálaí a bhaineann le cealla senescent ag leibhéil fíocháin agus orgánacha mar thoradh ar a mbeogacht fhada. Ag teacht leis an bpointe seo, choinnigh END-MSCanna cóireáilte HO?-inmharthanacht ard fiú ag na céimeanna déanacha d'fhorbairt seantachta (measúnaíodh inmharthanacht END-MSCanna seanaoise 17 lá (14 lá ＋3 lá) tar éis an strus ocsaídiúcháin tosaigh)(Fig.1d ). Go hachomair, is é cóireáil subleiteach HO{2-ar END-MSCanna an tsamhail chuí den seanchas roimh am agus tá sé ábhartha chun imscrúdú a dhéanamh ar éifeachtaí na gcomhdhúile seantalachacha ar END-MSCanna.

Níl aon ghníomhaíocht senolytic ag ouabain glycosíde cairdiach i dtreo END-MSCanna senescent i raon tiúchan leathan

Tugann fianaise le déanaí le fios go léiríonn glycosídí cairdiacha, lena n-áirítear ouabain, digoxin, agus bufalin, teaghlach comhdhúile le gníomhaíocht hemolytic [25,26]. Cé go mbreathnaítear ar gliocóisídí cairdiacha sa lá atá inniu ann mar sheanalytics leathan-speictrim, tá easnamh ar na sonraí maidir lena n-éifeachtaí ar hMSCanna senescent. Dá bhrí sin, rinneamar tástáil anseo an bhfuil an cumas ag ouabain bás a spreagadh go roghnach i END-MSCanna seanaoise. Chun é sin a dhéanamh, rinneamar measúnú ar inmharthanacht rialaithe agus Senes-cent END-MSCs tar éis cóireála le ouabain ag an raon tiúchana leathan (ó 10-' go 10~ M). Is díol spéise é nár tháinig laghdú suntasach ar inmharthanacht na gceall rialaithe agus na gceall senescent ar an gcéad lá tar éis iarratas ouabain (Fíor 2 agus Fíor Forlíontach. S1).

Mar sin féin, ar an tríú lá tar éis cóireáil ouabain, nocht muid laghdú suntasach ar dháileog-spleách ar inmharthanacht rialaithe END-MSCs (Fíor 2a agus Fíor Forlíontach. S1). Gan choinne, d'éirigh le cealla seanaoise a bheith níos frithsheasmhach in aghaidh ouabain ag gach tiúchan a tástáladh. Ag teacht leis an toradh seo,10-bíodh níos mó seans ann go bhfuair M ouabain bás apoptotic i gcealla rialaithe (20.75 faoin gcéad Móide /PI-agus 36.47 faoin gcéad Móide /PI móide ) i gcomparáid le cinn seanaoise (15.01 faoin gcéad An＋/PI -agus 12.15 faoin gcéad Móide /PI móide (Fíor 2b). Léiríonn na torthaí a fuarthas go soiléir, i gcomhthéacs END-MSC seanaoise, nach bhfuil aon ghníomhaíocht seiniolaíoch ag ouabain.

Chun éifeachtaí féideartha a bhaineann le héagsúlacht spreagthaigh a chothaíonn seangacht ar ghníomhaíocht senolytic an ouabain a eisiamh, rinneamar sraith turgnamh breise. Is é sin, thugamar cóireáil le END-MSCanna le héitíopaíd in ionad strus ocsaídiúcháin chun seanchas roimh am a chothú.bioflavonoids citrisThaispeáin END-MSCanna cóireáilte Etoposide na gnéithe go léir atá tipiciúil le haghaidh cealla senescent (Fig.3a-e).

Rud atá tábhachtach, ní raibh aon ghníomh hemolytic ag ouabain i dtreo END-MSCanna senescent cóireáilte etoposide (Fíor 3f agus Forlíontach Fig. S2). Soláthraíonn na sonraí seo deimhniú breise do na torthaí thuas agus fianaise nach toradh é an easpa anailíse a tharchuirtear le ouabain ar an truicear seangachta nithiúil a úsáideadh chun seanchas a chothú.

Fíor.1 Bailíochtú samhail seanaoise roimh am END-MSCs ocsaídiúcháin de bharr strus. END-MSC Senescent iomadú scaoilte, b dul faoi hipertróf, c fháil uathfhluaraiseacht ardaithe, ard-inmharthanacht cille a choinneáil d agus e taispeáint SA{4}}Galghníomhaíocht i gcomparáid leis na cinn rialaithe. f Leibhéil fosfarylation de p53 agus Rb agus leibhéil slonn de phróitéiní p21 agus HMGBI i rialú agus senescent END-Ouabain aon ghníomhaíocht haemolytic i dtreo gaschealla mesenchymal daonna de bhunús éagsúla Ár tuairimí a leathnú maidir le heaspa anailíse ouabain-spreagtha i END-MSCs , rinneamar anailís ar éifeachtaí ouabain ar HMSCanna atá scoite ó fhoinsí eile lena n-áirítear fíochán saille, laíon fiaclóireachta, agus glóthach Wharton. Chun ár sonraí a neartú chomh maith, chuireamar i bhfeidhm múnlaí éagsúla seangachta ——seansacht mhacasamhail le haghaidh AD-MSCs, seandacht de bharr doxorubicin do DP-MSCs, agus seandacht ocsaídiúcháin de bharr strus do WJ-MSCs (Fig.4a-f).

Mar a léirítear i bhFíor.4g, bhí éagsúlachtaí ag cineálacha éagsúla hMSCanna san inmharthanacht ar chóireáil ouabain, mar shampla, bhí DP-MSCanna rialaithe agus síneasach i bhfad níos frithsheasmhaí in aghaidh gníomh ouabain ná WJ-MSCs (Fig.4g agus Fíor Forlíontach. S3b, c). Mar sin féin, ní raibh an t-Úabain in ann seinolú a chothú i gceachtar den dá chineál hMSCanna séiseacha (Fíor 4g agus Fíor Forlíontach S3). Le chéile, léiríonn na sonraí a fuarthas gur gné choitianta do chineálacha éagsúla HMSC é an easpa anailíse a tharlódh le ouabain. MSCanna. Is ionann na luachanna a chuirtear i láthair agus meán±SD. Le haghaidh comparáidí grúpa iolracha ag a agus d, cuireadh ANOVA aontreo i bhfeidhm, n=3, ns gan a bheith suntasach,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c="" and="" e="" welch's="" t-test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="">

Baineadh úsáid as GAPDH mar rialú luchtaithe

Ní mharaíonn búfalin glycosíde cairdiach END-MSCS senescent

Chun a fhíorú an easpa gníomhaíochta senolytic de gliocóisídí cairdiach i dtreo hMSCs, chuireamar búfalin i bhfeidhm, cumaisc eile leis an ngníomhaíocht senolytic luaite a bhaineann leis an teaghlach glycosídí cairdiach [25]. Ní raibh tionchar beagnach ar bith ag Bufalin ar inmharthanacht an rialaithe agus chóireáil H2O Senes-cent END-MSCs i raon comhchruinnithe leathan (ó 10-7 go 10-5 M) (Fíor 5a agus Forlíontach Fíor. S4a).

Cosúil leis an méid a thugamar faoi deara le haghaidh cóireála ouabain, bhí an easpa anailíse ar bhúfalin neamhspleách ar spreagthaigh a chothaíonn seanaoise, ós rud é nach raibh aon tionchar ar inmharthanacht ESCanna a chonaic mar fhreagra ar strus ocsaídiúcháin nó ar éiteasposide (Fíor 5a, b, Fíor Forlíontach. .S4a, b). Deimhníonn na torthaí a bhfuil cur síos déanta orthu thuas gur tharla gliocóisídí cairdiacha a bheith neamhéifeachtach maidir le hionduchtú bás spriocdhírithe i END-MSCanna seanaoise. MSCanna. Is ionann na luachanna a chuirtear i láthair agus meán±SD. Le haghaidh comparáidí grúpa iolracha ag a agus d, cuireadh ANOVA aontreo i bhfeidhm, n=3, ns gan a bheith suntasach, ***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c="" and="" e="" welch's="" t-test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="" um.="" gapdh="" was="" used="" as="" a="" loading="">

Ní mharaíonn búfalin glycosíde cairdiach END-MSCS senescent

Fig.2 Níl aon ghníomhaíocht haemalaíoch ag Ouabain i dtreo END-MSC Senes-cent cóireáilte i raon comhchruinnithe leathan. Inmharthanacht choibhneasta cille ( faoin gcéad ) de rialú agus END-MSC seanaoise i 3 lá tar éis cóireála le 1077,10~6,10-5 M ouabain. b Ionduchtú apoptóis i END-MSCs ar 10-6 M ouabain arna measúnú ag Iarscríbhinn V/DAPI staining dúbailte. n=3 turgnaimh neamhspleácha. Freagraíonn na sonraí go léir don mheán±SD. Rinneadh measúnú ar thábhacht staitistiúil ag t-tástáil na Welch: ní suntasach,** p<>

Tá an dá gliocóisídí cairdiacha ouabain agus búfalin in ann bás cille a spreagadh go roghnach i gcealla seanaoise A549 agus SK-Hep1

Ag cur san áireamh nach gcomhfhreagraíonn ár dtorthaí leis an bhfianaise a foilsíodh le déanaí maidir le gníomh senolytic leathan-speictrim na gliocóisídí cairdiacha, shocraigh muid an éifeacht seo a atáirgeadh ag baint úsáide as an tsamhail cheallacha a thuairiscítear sna staidéir ábhartha [25,26]. Mar sin, rinneamar sraith turgnaimh ag baint úsáide as cealla carcanóma scamhóg A549 rialaithe agus senescent. Ba chúis le híogaireacht i gcealla an A549 mar gheall ar chóireáil éiceapóisíde. Múnla seanaoise de bharr teiripe-spreagtha [4] is ea seanaoise cealla A549 arna spreagadh ag Etoposide [4]. Chomh maith leis sin, léiríodh go maraíodh ouabain cealla A549 seanchóireáilte etoposide[25]. den chonair p53/p21/Rb, agus leibhéal slonn HMGB1 (Fíor 6a-e).

Chun gníomhaíocht hemolytic ouabain i dtreo cealla ailse senescent a fhíorú, rinneamar meastachán ar inmharthanacht cille dáileog-spleách ar dtús. De réir ár dtorthaí a thuairiscítear thuas, níorbh fhéidir linn aon laghdú suntasach ar líon na gcealla rialaithe inmharthana nó cealla A549 a bhrath laistigh de 24 h tar éis iarratas ouabain (Fíor Forlíontach S5a). Mar sin féin, i 3 lá tar éis cóireála laghdaigh ouabain go suntasach inmharthanacht na gcealla senescent A549 ar bhealach dáileog-spleách, agus laghdaigh líon na gcealla rialaithe A549 go pointe i bhfad níos lú (Fig.7a agus Fíor Forlíontach S5a). Is é sin le rá, chaomhnaigh thart ar 90 faoin gcéad de chealla rialaithe inmharthanacht ag 10- M ouabain i gcomparáid le 50 faoin gcéad de chealla sínescent A549 cóireáilte leis an dáileog chéanna (Fíor 7a). Ina theannta sin, bhí níos mó seans ann go bhfaigheadh cealla bíosúnach A549 bás cille de bharr bíosún ná a gcomhghleacaithe rialaithe (Fig.7b)(Fíor.5b agus Fíor Forlíontach Fig.S5b).

De réir na sonraí a foilsíodh, spreag ouabain caspase-3-apoptosis cleithiúnach i gcealla senescent A549 [26]. Go deimhin, thugamar le fios go raibh méadú suntasach ar an gcodán deimhneach dúbailte agus/nó ar an gcodán PI i gcealla ailse senescent cóireáilte le 10-6M ouabain (Fig.7c). Ina theannta sin, ag baint úsáide as measúnacht fhluaraiseachta thugamar faoi deara gníomhachtú caspase-3 i gcealla síneacha A549 cóireáilte le ouabain (Fig.7d). Le chéile, tá na torthaí seo comhsheasmhach go hiomlán leis na sonraí a thuairiscíonn údair eile agus deimhníonn siad gníomhaíocht hemolytic ouabain i dtreo A549.

Chomh maith leis sin, d'úsáideamar doxorubicin in ionad etoposide chun seanchas a chruthú san A549 (Fig.8a-e). De réir mar a bhíothas ag súil leis, léirigh séiseach A549 cóireáilte doxorubicin, chomh maith le cóireáil le héitposide-íogair íogaireacht níos airde maidir le hÚabain agus bíosún i gcomparáid lena gcomhghleacaithe rialaithe (Fíor 8g agus Fíor Forlíontach S6). Deimhníonn an dara ceann go bhfuil éifeachtaí senolytic na gliocóisídí cairdiacha neamhspleách ar spreagthaigh astaithe seanaoise. Dá bhrí sin, tá gliocóisídí cairdiacha go deimhin senolytic

Fig.3 Ní féidir le hOuabain seinolú a chothú i END-MSCanna senescent cóireáilte etoposide. Bailíochtú na samhla seanaoise de bharr eipeasóid le haghaidh END-MSCs: cumas iomadaithe, méid cille b, leibhéil uathfhluaraiseachta agus d SA{5}}Gníomhaíocht gal, leibhéal efhosfarylation Rb agus leibhéil slonn próitéiní p21 agus HMGBI. f Inmharthanacht choibhneasta cille ( faoin gcéad ) de chealla rialaithe agus séineachais tar éis cóireála le 10-6 ouabain. Is ionann luachanna agus meán±SD. I gcás grúpaí iolracha cuireadh comparáidí ag ANOVA aontreo i bhfeidhm,n=3, ns gan a bheith suntasach, ***p<0.001.for pair="" comparisons="" at="" b,c,d,f="" welch's="" t-test="" was="" used,="" n="3" for="" b,="" c,f="" n="50" for="" d,="" ns="" not="" significant,=""><0.05,><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="" μm.="" gapdh="" was="" used="" as="" loading="" control="" activity="" towards="" a549,="" but="" these="" compounds="" turned="" out="" to="" be="" ineffective="" for="" targeted="" death="" induction="" in="" senescent="">

Ar deireadh, shocraigh muid turgnaimh anailíse a atáirgeadh ar chealla ailse ae cóireáilte le etoposide SK-Help, samhail cille eile le héifeachtaí senolytic cruthaithe de gliocóisídí cairdiacha de réir Guerrero et al. staidéar [25] (Fig.9a-e). Léirigh SK-Help senescent cóireáilte le Etoposide íogaireacht níos airde don dá ghníomhairí i gcomparáid lena gcomhghleacaithe rialaithe, rud a chruthaigh gníomh hemolytic gliocóisídí cairdiacha i dtreo an chineáil cille seo (Fig.9f agus Fig. Forlíontach S7).

Tugann na sonraí seo le chéile fianaise go mbraitheann roghnaíocht haemalú a tharlódh de bharr gliocóisídí cairdiacha níos mó ar nádúr na gceall ná ar an truicear seanaoise nithiúla.

Baintear an t-alt seo as Eolaíochtaí Beatha Ceallacha agus Móilíneacha (2021) 78:7757–7776 https://doi.org/10.1007/s00018-021-03980-x