Tionchar an Ochratocsain Nephrotoxin A Ar Chealla Duánach Daonna a bhfuil Staidéar Samhail Chomhchultúr Úrscéal faoi Bhfuil Tionchar ag Láithreacht Fibroblasts
Mar 01, 2022
Coimriú:Tá anduánatá faoi bhagairt ag go leor substaintí a d’fhéadfadh a bheith tocsaineach. Chun staidéar a dhéanamh ar thionchar an nephrotoxin ochratoxin A (OTA) bhunaíomar samhail comhchultúr cille comhdhéanta de daonnaduánach cealla tubule proximal agus fibroblasts. Rinneamar staidéar ar éifeacht OTA ar mharthanas cille, léiriú géinte agus/nó próitéiní a bhaineann le bás cille, maitrís eischeallach agus hoiméastáis fuinnimh. Feabhsaíodh neacróis spreagtha OTA sa dá chineál cille i láthair an chineáil cille eile faoi seach, ach bhí apoptosis arna spreagadh ag OTA neamhspleách air. I fibroblasts, ach ní i gcealla feadáin, bhí éifeacht chomhchultúr le feiceáil maidir le léiriú na próitéine p21 a bhaineann le timthriall cille. Bhí an léiriú ar an vimentin próitéin trasdultach epithelial-go mesenchymal-léiriú neamhspleách ar an gcultúr-riocht. Feabhsaíodh léiriú an lncRNA WISP1-AS1 arna spreagadh ag OTA sa chomhchultúr. Mar thoradh ar nochtadh OTA tháinig athruithe ar léiriú géinte a bhaineann le meitibileacht fuinnimh le héifeacht slógtha glúcóis agus léiriú laghdaithe ar phróitéiní miteachondrial. Léirímid le chéile gur féidir le imoibriú na gceall a bheith difriúil i láthair na gcealla atá in aice láimhe go nádúrtha, rud a chumasaíonn traschaint cheallacha. Dá bhrí sin, chun tocsaineacht substainte a mheas, bheadh sé ina bhuntáiste breithniú a dhéanamh ar úsáid comhchultúr in ionad mona-chultúr.
Eochairfhocail:ócratocsain A; cultúr cille; meitibileacht fuinnimh; cothromaíocht apoptosis-neacróis; mitochondria; duán ; duánach
Feabhsaíonn CISTANCHE TEIP Duán/Duánach
Réamhrá
Mar gheall ar a fheidhm eisfheartha, tá anduánatá faoi bhagairt ag substaintí díobhálacha éagsúla cosúil le drugaí nó ábhar salaithe bia, cosúil le míceatocsainí as a dtagann géara nó – níos measa fós – ainsealaígalair duáinle leitheadúlacht thart ar 10 faoin gcéad [1,2]. Chun meicníochtaí na gníomhaíochta nephratocsaineacha a thuiscint is cuidiú é straitéisí a aimsiú chun na cásanna díobhálacha seo a mhaolú agus rinneadh go leor staidéar chun an cheist a réiteach maidir le cén fáth agus cén chaoi.duáinatá i mbaol [3–5]. Chun staidéar a dhéanamh ar thionchair substainte ar orgánach, is minic a bhíonn sé deacair ainmhithe iomlána a úsáid mar gheall ar imní eiticiúil agus réamhriachtanais eagraíochtúla, chostasacha agus ilchasta. Ina theannta sin, baineann neamhchinnteachtaí le haistriú eolais chuig staid an duine. Dá bhrí sin, tá samhlacha saothraithe cille bunaithe agus úsáidtear iad go forleathan, agus tá an buntáiste acu gur féidir staidéar a dhéanamh ar chineál sonrach cille agus ar a fhreagra ar shubstaint nó ar chóireáil faoi choinníollacha rialaithe. Cé go bhfuil go leor torthaí tábhachtacha déanta ag baint úsáide as an gcur chuige seo, tá roinnt míbhuntáistí ag baint leo: is minic a bhíonn cealla líne cille neamhbhásaithe ag mutagenesis nó modhanna eile - uaireanta drastic [6]. Ligeann sé seo láimhseáil éasca agus úsáid fhada ach leis an nguais a fhaightear i gcóras múnla sonrach d’fhéadfadh sé nach mbeadh sé inaistrithe chuig staid an orgánaigh nó an orgánaigh ar fad. Chun an míbhuntáiste seo a shárú, in ionad línte cille neamhbhásaithe, is féidir cealla príomhúla a úsáid, ach is minic a bhíonn giniúint cealla príomhúla an-deacair agus éilíonn sé ardscileanna teicniúla. Ina theannta sin, ní minic a mhaireann cealla bunscoile ar feadh tréimhse fada ama agus is gá coinníollacha cultúir aonair speisialta. Ach tá cealla príomhúla céim níos gaire do choinníollacha nádúrtha agus ar a laghad uaireanta d'éirigh sé amach go bhfuil siad níos íogaire do, m.sh., spreagthaí tocsaineach mar go bhfuil línte cille [7], rud a chiallaíonn go bhféadfadh línte cille a bheith níos láidre. Míbhuntáiste eile is ea an fhíric go gcoimeádtar cealla go minic i monashaothrú, ie, gan tionchair chineálacha eile cille, atá gar dá n-orgán baile de ghnáth. Mar sin, d’fhéadfadh sé a bheith ina chéim i dtreo staid níos réadúla staidéar a dhéanamh ar fhreagairt cineál cille do shubstaint nó do chóireáil i láthair na gcealla sin, atá san orgán dúchais i ngar dó.
Saduán, tá cealla feadánacha cóngaracha timpeallaithe ag fifibroblasts agus is féidir glacadh leis go mbeidh tionchar acu—is dócha go mbeidh tionchar acu orthu. Tá sé seo amhlaidh freisin idamáiste duáincásanna a mbíonn athlasadh tubulo-interstitial agus fiobróis mar thoradh orthu i bhformhór na gcásanna [8,9], agus atá cinntitheach maidir le meath naduánfeidhm. Mar gheall ar a gcumas iompair agus einsímeach,duánachtá cealla tubulacha cóngaracha i mbaol ag éagsúlacht substaintí tocsaineacha a d’fhéadfadh a bheith ann, mar shampla, drugaí nó a n-iarsmaí nó míceatocsainí. Is é ról amháin atá ag na fibroblasts máguaird ná an maitrís extracellular a sholáthar trí collagens agus comhpháirteanna maitrís eile a scaoileadh agus mar sin páirt a ghlacadh i sláine an fhíocháin [10]. Ach tá baint acu freisin - mar aon le cealla epithelial - le próisis athlastacha nó le fibroticgalair duáin[11] leis an riosca a fhorbairtcliseadh duánach.
Míceatocsain a ndéantar dianstaidéar air agus atá ábhartha do shláinte an duine is ea ochratocsain A (OTA) [12,13]. Is féidir é a fháil in éagsúlacht earraí bia [12,14] agus tá sé beagnach dodhéanta a nochtadh agus a ghlacadh a sheachaint [9,15]. Mar thoradh air seo breathnaítear go n-aimsítear OTA go minic san fhuil dhaonna i dtiúchan íseal nanomolar [16]. In ainmhithe nochta, mar thoradh ar OTAteip duánachaagus athruithe fifibrotic [17,18]. Glactar leis go bhfuil baint ag nochtadh OTA leis an duinegalair duáin[19]. I gcealla tubule proximal bunscoile daonna, tá éifeacht tocsaineach OTA léirithe, atá infheicthe freisin i fifibroblasts bunscoile daonna, cé nach bhfuil sé chomh feiceálach agus atá i gcealla tubule proximal [7]. Ní thuigtear go hiomlán fós na meicníochtaí atá taobh thiar de ghníomhaíocht thocsaineach OTA agus tá siad faoi réir go leor staidéar leanúnach. Ní fios cé chomh fada agus a chuireann cealla comharsanacha a bhfuil feidhmeanna éagsúla isteach orthu agus ar an gcaoi sin feidhm na gceall a mhodhnú ach ní fios go bhfuiltear ag súil leis. I staidéar roimhe seo ag baint úsáide as samhail comhchultúr comhdhéanta de francachduántubule proximal agus cealla fifibroblast, d'éirigh sé amach go dtarlaíonn cineál crosstalk idir an dá chineál cille, rud a fhágann gur tugadh faoi deara gur tharla éifeachtaí OTA mar aistriú epithelial-go-mesenchymal (EMT) ach amháin faoi choinníollacha comhchultúr [20]. Tátal eile is féidir a tharraingt ón staidéar sin agus cinn eile ná go bhfuil cealla francacha níos láidre maidir leis an lamháltas do OTA i gcomparáid le cealla feadánacha cóngaracha [7,20] agus mar sin tá gá le córas múnla bunaithe ar chealla daonna chun staid an duine a mheas níos dlúithe agus an riosca a bhaineann le nochtadh OTA.
Dá bhrí sin, sa staidéar seo, bunaímid samhail chun cinn comhchultúr cille comhdhéanta de chealla tubule proximal daonna (HK2) agus fifibroblasts daonna (CCD{2}} cealla SK) chun staidéar a dhéanamh ar éifeachtaí OTA ar mharthanas cille (apoptosis). , neacróis) agus léiriú ar roinnt géinte a roghnaíodh go heiseamláireach a bhaineann le timthriall cille, bás cille, maitrís eischeallach, agus meitibileacht. Cosúil le staidéir roimhe seo ag baint úsáide as cealla francach [20], cuireadh na cealla tubule proximal daonna ar fheistí scagaire agus cuireadh na scagairí os cionn sraith de fibroblasts a shíolraíodh ar bhun mhias petri ionas go mbeidh taobh basolateral na gcealla epithelial os comhair i dtreo. na fibroblasts, rud a chumasaíonn cineál comhrá idir an dá chineál cille.
Torthaí
Gníomhaíocht Próitéin, Dí-hidrigine Lachtáit agus Caspase-3Chun an chéad tuiscint a fháil ar éifeachtaí féideartha na gcoinníollacha cultúir féin chomh maith le hiarmhairtí ar athruithe a tharchuirtear le OTA, rinneamar gníomhaíocht caspase a chur i gcomparáid mar thomhas ar apoptosis cealla a fhástar i monashaothrú le gníomhaíocht na gceall a fhástar i gcomhar. -cultúr gortha le nó gan 100 nM OTA ar feadh dhá phointe ama, 24 agus 48 h. Ina theannta sin, socraíodh scaoileadh lactate dehydrogenase (LDH) mar bheart le haghaidh necróis chomh maith le hábhar próitéine chun tuiscint iomlán a thabhairt ar stádas cille. Dá bhrí sin, cuireadh méideanna comhionanna cealla i mbun an tobair (fifibroblasts) nó ar scagaire (cealla tubule cóngarach). Tar éis an cumar a bhaint amach, cuireadh scagairí isteach sna toibreacha ina raibh na fifibroblasts suite (féach coimriú grafach). Mar a léirítear i bhFíor 1A, níorbh fhéidir beagnach aon éifeachtaí a bhraitheann ar choinníoll cultúir ar ábhar próitéine a thabhairt faoi deara sa dá chineál cille tar éis 24 nó 48 h (féach freisin Comhad Forlíontach S1). I fifibroblasts, tháinig méadú beag ar an méid próitéine de bharr nochtadh OTA ach i gcealla feadáin tháinig laghdú beag ar an gcion próitéine a léirigh go bhféadfadh tionchar diúltach a bheith ag OTA ar chealla feadáin. Bhí na héifeachtaí seo beagnach neamhspleách ar choinníoll an chultúir sa dá chineál cille
Fíor 1. Éifeachtaí ochratocsain A (OTA) agus/nó coinníollacha saothraithe ar chion próitéine (A), gníomhaíocht caspase-3 (B), agus scaoileadh lachtáit dehydrogensase (LDH) (C). Saothraíodh cealla i monai- nó i gcomhchultúr agus nochtar do 100 nM OTA ar feadh 24 nó 48 h. N=3–6, n=14–18 (próitéin, LDH) nó 8–9 (caspase-3). * léiríonn ap < 0.05="" do="" chealla="" neamh-ota="" (comparáid="" a="" dhéanamh="" idir="" na="" héifeachtaí="" ota,="" resp.="" taobh="" clé)="" nó="" le="" cealla="" i="" mona-chultúr="" (i="" gcomparáid="" éifeachtaí="" cultúir,="" resp.="" taobh="" deas).="" chun="" an="" éifeacht="" ar="" ábhar="" próitéine="" a="" mhíniú="" tuilleadh,="" rinneamar="" staidéar="" ar="" apoptosis="" agus="" necróis.="" i="" gcomparáid="" le="" fifibroblasts,="" bhí="" tionchar="" soiléir="" ag="" ota="" ar="" apoptosis="" i="" gcealla="" feadáin="" tar="" éis="" nochtadh="" 24="" h="" le="" thart="" ar="" 2.5-méadú="" ar="" ghníomhaíocht="" faoi="" dhó="" (fíor="" 1b).="" tar="" éis="" nochtadh="" 48="" h="" bhí="" an="" méadú="" fós="" inbhraite="" ach="" ní="" raibh="" sé="" chomh="" sainiúil="" agus="" a="" bhí="" tar="" éis="" 24="" h.="" mar="" sin="" féin,="" bhí="" na="" méaduithe="" seo="" beagnach="" neamhspleách="" ar="" choinníollacha="" cultúir="" ach="" amháin="" tar="" éis="" 48="" h="" i="" láthair="" fifibroblasts="" laghdaíodh="" gníomhaíocht="" caspase="" sna="" cealla="" tubule="" beagán,="" rud="" a="" léiríonn="" éifeacht="" chosanta="" measartha="" ar="" an="" gcomhchultúr.="" mar="" sin="" féin,="" bhí="" éifeacht="" chosanta="" comhchultúr="" le="" feiceáil="" do="" na="" fifibroblasts,="" go="" háirithe="" i="" láthair="" ota.="" i="" gcomhchultúr,="" feabhsaíodh="" scaoileadh="" ldh="" go="" soiléir="" i="" fifibroblasts="" agus="" cealla="" tubule="" i="" gcomparáid="" le="" coinníollacha="" monashaothraithe="" neamhspleách="" ar="" láithreacht="" ota="" (fíor="" 1c).="" i="" gcealla="" tubule,="" d'eascair="" méadú="" ar="" ldh="" a="" scaoiltear="" isteach="" sna="" meáin="" mar="" thoradh="" ar="" ota="" go="" háirithe="" tar="" éis="" nochtadh="" 48="" h,="" nach="" raibh="" chomh="" soiléir="" i="" fibroblasts.="" nuair="" a="" chuirtear="" le="" chéile="" iad,="" d'eascair="" necróis="" feabhsaithe="" de="" bharr="" láithreacht="" an="" chineáil="" cille="" eile="" faoi="" seach="" ach="" tháinig="" laghdú="" níos="" lú="" ar="" apoptosis="" ionas="" nár="" athraíodh="" an="" cion="" próitéine="" iomlán="" go="" suntasach.="" bhí="" éifeachtaí="" ota="" ar="" apoptosis="" agus="" neacróis="" neamhspleách="" den="" chuid="" is="" mó="" freisin="" ó="" láithreacht="" nó="" as="" láthair="" an="" chineáil="" cille="">
Western Blot agus Slonn mRNA
CDKN1A/lch21Taispeánadh go raibh tionchar ag OTA ar thimthriall cille agus d'fhéadfaí a thaispeáint go raibh an próitéin p21 atá páirteach sa timthriall cille uasrialaithe ag OTA i gcealla feadáin [21]. Chun imscrúdú a dhéanamh ar cé chomh fada agus a bhíonn tionchar ag láithreacht fibroblasts ar phróitéin, chomh maith le léiriú códú mRNA do p21, rinneamar blotaí an Iarthair agus RT-PCR. Mar a léirítear i bhFíoracha 2A, B agus 3, tháinig méadú ar mhéid próitéine p21 i monai mar thoradh ar nochtadh 48 h do 100 nM OTA ach freisin i gcoinníollacha comhchultúr i gcealla feadáin. I fibsoblasts faoi choinníoll comhchultúrtha s, ní raibh aon éifeacht ag OTA ar léiriú próitéine cé gur mhéadaigh OTA an slonn mRNA a bhí neamhspleách ó láithreacht an chineáil cille eile. Suimiúil go leor, faoi choinníollacha comhchultúr, níor tháinig méadú breise ar nochtadh OTA ar léiriú próitéin p21. I gcealla feadáin, níor athraíodh slonn iadRNA ag láithreacht fibroblasts ach i fibroblasts i gcomhchultúr cuireadh feabhas ar an léiriú pZlmRNA ní hamháin in OTA-nochta ach freisin i gcealla nach bhfuil faoi lé OTA cheana féin (féach freisin Comhad Forlíontach S1). Léiríonn sé seo go bhfuil tionchar ag an p resenee den chineál cille eile ar léiriú próitéin p21, go háirithe i fibroblasts.
Ciocsaigineas 2 (COX2)Tá sé léirithe go n-ardaítear próitéin cyclooxygenase 2 (COX2) chomh maith le leibhéil mRNA le linnteip duánacha[22]. Mar a léirítear i bhFíoracha 2C, D agus 3, i bhfifibroblasts amháin, méadaíodh slonn na próitéine le nochtadh OTA. Ina theannta sin, i láthair na gcealla tubule, feabhsaíodh léiriú próitéin COX2 i gcealla neamhchóireáilte agus i gcealla OTA-nochta, rud a léirigh tionchar soiléir ar chealla tubule. Ní raibh tionchar ag OTA ar an slonn mRNA, áfach, agus tharla tionchar an-bheag ar chomhchultúr mar gheall ar nochtadh OTA. I gcodarsnacht leis sin, i gcealla tubule, bhí an mRNA agus léiriú próitéine COX2 go hiomlán neamhspleách ó OTA nó láithreacht fifibroblasts. Léiríonn sé sin gur féidir le cealla feadáin COX2 tionchar a imirt ar fhifibroblasts ach níl aon tionchar ag fifibroblasts ar chealla feadáin.
FibronectinTeip duáinIs minic a bhíonn fiobróis ag gabháil leis. Le linn fiobróis, tarlaíonn carnadh maitrís extracellular agus breathnóireacht amháin seachas an ceann eile méadú ar mhéid próitéin fifibronectin [23]. Mar sin, socraíodh an t-athrú spleách ar OTA ar fibronectincoding mRNA agus léiriú próitéine i gcoinníollacha monai nó comhchultúir. Mar a léirítear i bhFíoracha 3 agus 4A,B, tháinig laghdú ar fifibronectin intracellular i monai-agus i gcomhchultúr mar gheall ar nochtadh 48 h de chealla tubule go 100 nM OTA. Bhí an éifeacht OTA níos ísle sa chomhchultúr. Thairis sin, laghdaíodh an méid códaithe mRNA le haghaidh fifibronectin trí nochtadh OTA go neamhspleách ó na coinníollacha cultúir agus mar thoradh ar láithreacht fifibroblasts tháinig léiriú mRNA níos ísle i rialú agus cealla OTA-nochta. I gcodarsnacht leis sin, i fifibroblasts níor athraíodh an slonn fifibronectin beagnach ag OTA ná ag coinníollacha cultúir mar gheall ar éagsúlacht mhór, go háirithe i blots an Iarthair. D’fhéadfadh go mbeadh claonadh i dtreo slonn OTAinduced le feiceáil i mona-chultúr.
VimentinIs próitéin é Vimentin a mhéadaíonn a flúirse nuair a tharlaíonn trasdul epithelial-go-mesenchymal (EMT) agus is féidir forbairt EMT a bheith mar thoradh air.teip duánacha[23]. Mar sin, socraíodh an t-athrú OTA-spleách ar vimentin mRNA agus léiriú próitéine i gcoinníollacha monai agus comhchultúr. Mar a léirítear i bhFíoracha 3 agus 4C,D, d'eascair raidhse níos ísle de phróitéin vimentin faoi choinníollacha monai agus comhchultúir de bharr nochtadh 48 h de chealla feadáin go 100 nM OTA. Mar sin féin, i láthair fifibroblasts bhí an abairt próitéine vimentin neamhspleách ó choinníollacha cultúir. Níor athraíodh an léiriú ar chódú mRNA do vimentin beagnach ag OTA ná ag coinníollacha cultúir cé is moite de gur léirigh nochtadh OTA sa chomhchultúr méadú beag. I fifibroblasts, bhí an abairt próitéine vimentin go hiomlán neamhspleách ó nochtadh OTA chomh maith le láithreacht na gcealla tubule. Ina theannta sin, níor athraíodh slonn mRNA códaithe vimentin beagnach
Léiriú Roinnt Géinte RoghnaitheChun tástáil bhreise a dhéanamh ar cé chomh fada agus a d'fhéadfadh na coinníollacha cultúir difear a dhéanamh freisin ar léiriú RNAanna eile, roghnaigh muid roinnt géinte, a bhfuil ról acu in apoptosis-neacróis, forbairt ailse, nó meitibileacht fuinnimh (féach freisin Comhad Forlíontach S1).
WISP1-AS1Is RNA fada neamhchódaithe (lncRNA) é a tharlódh ó OTA a dhéanann difear do rialáil thras-scríofa agus a bhfuil ról aige sa chothromaíocht apoptosis-neacróis agus is dócha i bhforbairt ailse [24]. Mar atá le feiceáil i bhFíor 5A, tháinig méadú suntasach ar léiriú an lncRNA sin mar thoradh ar nochtadh 48 h do 100 nM OTA sa dá chineál cille. Gan OTA, ní raibh tionchar beagnach ar bith ag láithreacht an chineáil cille eile faoi seach ar an slonn. Mar sin féin, i láthair OTA, bhí a léiriú níos airde sa chomhchultúr i gcomparáid le mona-chultúr.
GDF 15Is ball é fachtóir difreála fáis 15 (GDF15) den fhortheaghlach fachtóir fáis claochlaitheach a fhreagraíonn do strus. Déantar é a phlé mar bhithmharcóir freisin le haghaidhgalair duáinnó mar thuar chun maireachtáilduánothair trasphlandúcháin [25,26]. Feabhsaíodh léiriú códaithe mRNA do GDF15 sa dá chineál cille tar éis nochtadh OTA mar a thaispeántar i bhFíor 5B. B'fhearr leis an éifeacht OTA-spreagtha seo i fifibroblasts nuair a bhí cealla tubule sa chomharsanacht. I gcealla tubule, áfach, bhí an abairt neamhspleách ar láithreacht fifibroblasts (Fíor 5B).CDK2Aithníodh kinase 2 (CDK2) Cyclin-spleách trí anailís líonra comhghaol ualaithe mar rialtóir mór ar dhírialú timthriall cille spreagtha ag OTA [21]. I fifibroblasts i monashaothrú níor athraíodh an slonn ar an gcódú mRNA do CDK2 le OTA. Ina theannta sin, níor chuir láithreacht na gcealla tubule isteach ar an slonn mRNA. Mar sin féin, i gcealla tubule, tháinig léiriú beagán feabhsaithe ar OTA ach amháin i láthair fifibroblasts (Fíor 5C).
Glicogen agus Próitéiní a Bhaineann le Glúcóis: PYGM, GYS1 agus GLUT1 (SLC2A1)Tá anduánTá baint aige freisin le hoiméastáis glúcóis agus féadann sé glúcós a sholáthar don chomhlacht trí gluconeogenesis nó trí stórtha glycogen a shlógadh [27]. Tá ról ag glycogen phosphorylase (PYGM) i ndianscaoileadh siopaí glycogen, rud a fhágann go bhfuil glúcóis á shlógadh [28]. Mar atá le feiceáil i bhFíor 6A, mar thoradh ar nochtadh 48 h do 100 nM OTA tháinig méadú suntasach ar an léiriú ar an gcódú mRNA do glycogen fosphorylase, go háirithe sna cealla tubule. Mar sin féin, i gcealla feadáin ní raibh an méadú seo ag brath ar riocht saothraithe ach i bhfifibroblasts bhí an slonn spreagtha OTA níos airde i láthair na gcealla feadáin i gcomparáid leis an riocht gan cealla feadáin, catalaíonn Glycogen synthase 1 (G^YSl) an t-imoibriú eile. agus cé go raibh léiriú an phosphorylase uasrialaithe, bhí léiriú an tsynthase á rialú ag OTA i gcealla feadáin agus i fibroblasts i gcomh-ctilture (Fíor 6B). Léiríonn sé seo éifeacht slógtha glúcóis OTA, Go suimiúil, rinne OTA an mRNA léiriú ar an iompróir glúcóis GLUTl (SLC2A1) a rialáil freisin (Fíor 6C), rud a chuir béim ar an smaoineamh go bhfuil éileamh feabhsaithe ar ghlúcós mar gheall ar nochtadh OTA mar gheall ar
Próitéiní a Bhaineann le Mitochondria: NDUFB10 agus MRPS16
Tá tásca ann go bhféadfadh laghdú ar an acmhainneacht mitochondrial a bheith mar thoradh ar nochtadh OTAduáncealla [24] a thaispeánann go bhféadfadh tionchar a bheith ag nochtadh OTA ar fheidhm miteachondrial, a bhféadfadh tionchar breise a bheith ag láithreacht fibroblasts air. Mar sin, ionadaíoch ar chódú RNA eile do phróitéiní miteachondrialacha, léirímid anseo an slonn ar chódú mRNA do NDUFB10 agus MRPS16. Cóid NDUFBt0 don fho-aonad mitochondrial NADH:ubiquinone oxidoreductase B10, ar cuid é den choimpléasc riospráide mitochondrial I agus a shloinntear go mór i gcroí agusduán(géine NCBI. Ar fáil ar líne: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4716 (ar rochtain an 17 Márta 2021)). Cóid géine MRPS16 don phróitéin ribosomal mitochondrial S16, a bhfuil ról aige i sintéis próitéin mitochondrial. Mar a léirítear i bhFíor 7, tháinig laghdú ar an dá mRNA mar thoradh ar nochtadh 24 h OTA sa dá chineál cille. I gcealla tubule, ní raibh tionchar ag láithreacht fibroblasts ar léiriú laghdaithe géine NDUFB10, ach i fibroblasts rinneadh an laghdú a tharlódh ó OTA ar léiriú NDUFB10 a tharrtháil beagán i láthair cealla tubule (Fíor 7A). I gcealla tubule, bhí an léiriú íslithe cheana féin ar an gcódú géine don fho-aonad ribosomal mitochondrial ag OTA níos ísle freisin i láthair fibroblasts, ach i fibroblasts ba chúis le láithreacht cealla tubule léiriú beagán níos airde de MRPS16 mRNA (Fíor 7B). Léiríonn sé seo go bhféadfadh tionchar a bheith ag OTA ar fheidhm mitochondrial ach gur féidir an éifeacht OTA a mhodhnú freisin nuair a bhíonn an dá chineál cille gar dá chéile.
Plé
Tá anduánatá i mbaol ó éagsúlacht de shubstaintí nephrotocsaineacha a bhfuil an baol ann go dtarlóidh géarmhíochaine nó cróitisteip duánacha[1]. Chun staidéar a dhéanamh ar thionchar substaintí nephrotocsaineacha ar chineálacha éagsúla cille agus chun láimhseáil ainmhithe a laghdú, cuireadh cultúir cille i bhfeidhm go forleathan. Tá buntáiste breise ag na saothráin chill seo gur féidir coinníollacha turgnamhacha a rialú agus éifeachtaí sonracha substainte a imscrúdú ag baint úsáide as cineál sainithe cille. Seachas na buntáistí neamhdhíospóideacha seo, tá roinnt cúinsí fós ann: mar shampla, sa "orgán baile" cineál amháin cille (m.sh. cealla tubule cóngaracha saduán) atá timpeallaithe ag cineálacha eile cille (eg, fibroblasts) le hidirspleáchais manifolb. Dá bhrí sin, d'fhéadfadh sé nach mbeadh an t-imoibriú ar shubstaint a breathnaíodh nuair nach raibh ach cineál amháin cille in úsáid mar an gcéanna i láthair na gceall in aice láimhe sa bhfíochán bunaidh. I múnla comhdhéanta de dhá chineál cille duánach francach éagsúla, tá sé léirithe go bhfuil tras-chaint ann idir cealla tubule agus fibroblast, rud a fhágann go bhfuil imoibrithe le feiceáil nuair a bhí an dá chineál cille gar dá chéile [20]. Mar sin féin, nuair a dhéantar comparáid idir torthaí an stitdy sin agus torthaí a breathnaíodh ag baint úsáide as cealla tubule duánach daonna, tagann sé chun solais go bhfuil na cealla francacha níos láidre ná mar a insíonn an duine dá n-imoibriú ar chóireáil le nephrotoxin uileláithreach, ochrafoxin A (OTA) [7]. Dá bhrí sin, tá gá le múnla comhchultúr comhdhéanta de chealla daonna. Bhunaíomar samhail den sórt sin trí úsáid a bhaint as an líne cille tubule proximal daonna HK2 agus fibroblasts daonna. Cealla HK2 a fhástar ar ionsáigh scagaire agus a tugadh le chéile le fibreblastaí, a fhástar ar bhun 6-phláta tobair. Tar éis bunpharaiméadair a thaifeadadh mar apoptosis agus necróis, d'úsáideamar an tsamhail seo chun sonraí tosaigh a fháil ar éifeacht ochratoxin A ar roinnt próitéiní agus RNAanna a bhaineann le timthriall cille, EMT, agus meitibileacht cheallacha a dhíspreagadh.
Marthanas Cille Bunaithe ar ábhar próitéine, ba chosúil nach raibh éifeacht shuntasach ag OTA ná ag an riocht cultúir. Mar sin féin, aistríodh an gaol idir apoptosis agus necróis i dtreo necróis sa dá chineál cille nuair a saothraíodh cealla le chéile. Is eol go gcothaíonn OTA apoptosis i gcealla feadáin [29] agus go síneadh níos lú freisin i fibroblasts [7]. Léirítear é seo sna torthaí láithreacha freisin. Is díol spéise é gur tháinig laghdú ar rátaí apoptóis sa dá chineál cille de bharr láithreacht an chineáil cille eile faoi seach, ach scaoileadh LDH feabhsaithe. Is é seo an chéad leid gur féidir le láithreacht cineál eile cille tionchar a imirt ar fheidhm cheallacha agus gur féidir imoibriú na gceall le substaint thocsaineach a bheith difriúil i gcomhchultúr i gcomparáid le mona-chultúr.
Próitéin agus Slonn RNA Rinneamar ár gcuid staidéir a leathnú trí phróitéin agus slonn RNA ar roinnt próitéiní a roghnaíodh go heiseamláireach a chinneadh agus na RNAs a chódú dóibh. Toisc gur léiríodh go raibh tionchar ag OTA ar thimthriall cille [21,30], rinneadh staidéar ar léiriú CDKN1A/p21. De réir thorthaí Dubourg et.al [21], tháinig léiriú feabhsaithe ní hamháin ar CDKN1A mRNA ach freisin ar phróitéin CDKN1A/p21 i gcealla tubule mar thoradh ar OTA. Sna cealla seo, ní raibh tionchar ag láithreacht fibroblasts ar slonn CDKN1A mRNA, ach i fibroblasts bhí éifeacht soiléir comhchultúrtha le feiceáil agus flúirse mRNA feabhsaithe le feiceáil sa chomhchultúr amháin. Mar sin féin, níor léiríodh an méadú seo ar raidhse mRNA go hiomlán le léiriú próitéine, rud a mhol meicníochtaí rialála breise. Féadfar staidéir timthriall cille a chur leis chun léargas breise a fháil ar an tionchar ar thimthriall cille. Fuarthas amach go raibh ról ag kinase 2 (CDK2) Cyclin-spleách i dírialú OTA-spreagtha ar an timthriall cille [21]. I gcealla feadáin, cuireadh feabhas ar a léiriú mRNA ag OTA i gcomhchultúr ach ní raibh tionchar ag cealla feadáin ar fibroblasts. Le chéile, tugann na torthaí le fios go bhfuil tionchar ag láithreacht fibroblasts ar an timthriall cille i gcealla tubule.
Breathnaíodh éifeacht chomhchultúr eile maidir le léiriú COX2 i fibroblasts. Maidir le fibroblasts ba chúis le láithreacht cealla tubule léiriú próitéin feabhsaithe go soiléir (cosúil leis na torthaí a breathnaíodh i gcealla francach [20]), nach raibh le feiceáil do na cealla tubule nár léirigh aon spleáchas cultúir. Léiríonn sé seo go bhfuil ról na fibroblasts i athlastachagalair duáind’fhéadfadh sé gur beag an meas atá déanta orthu ag staidéir a d’úsáid fifibroblasts i mona-shaothrú. Cuirtear an vimentin próitéin filament idirmheánach in iúl go bunreachtúil i fibroblasts agus tá sé in iúl níos mó le linn trasdul epithelial-go-mesenchymal (EMT) i gcealla epithelial [10]. Cé go bhfuil sé léirithe go bhféadfadh nochtadh fada OTA a bheith mar thoradh ar léiriú feabhsaithe collagen III nó fibronectin i gcealla tubule [7], sa staidéar reatha bhí léiriú an vitimín Vimentin próitéin EMT-léiriú i gcealla feadáin níos ísle fiú tar éis nochtadh OTA, neamhspleách. de choinníollacha cultúir. Ina theannta sin, bhí an abairt de fibronectin mRNA agus próitéin sách níos ísle agus ní feabhsaithe. Ina theannta sin, i fibroblasts, níor léiríodh aon slonn athraithe ionas nach n-áitíonn na torthaí seo i bhfabhar EMT a tharlódh ó OTA, mar a léirigh daoine eile [31].
Feabhsaíonn CISTANCHE FEIDHM Duán/Duánach
Chun tástáil bhreise a dhéanamh an féidir le comhchultúr tionchar a imirt ar an bhfreagra ceallach ar an strus a tharlódh ó OTA, chinneamar léiriú roinnt RNAanna a roghnaíodh go heiseamláireach a bhaineann le apoptosis-neacróis, forbairt ailse agus meitibileacht fuinnimh. Tá ról suntasach ag RNAanna fada neamhchódaithe i go leor próisis rialála ceallacha agus a ndíráil, agus freisin i fiobróis duánach nó ailse [32]. WISP1-Is RNA fada neamhchódaithe é AS1 arna tharlú ag OTA agus arna shloinneadh i gcealla meall duánach [24]. Fuaireamar gur chuir a upregulation ag OTA sa dá chineál cille agus comh-chultúr feabhas ar an upregulation. Ligeann sé seo dul in olcas ar éifeacht WISP1-AS1 ar an gcothromaíocht apoptosis-neacróis agus foirmiú siadaí is dócha. Mar sin is féidir an scaoileadh LDH feabhsaithe a breathnaíodh sa chomhchultúr a mhíniú go páirteach ar a laghad trí ábhar feabhsaithe WISP1-AS1, a léiríodh go bhfuil gá leis le haghaidh neacróis a tharchuirtear le OTA [24].
WISP1-AS1bhí amhras ann freisin go raibh ról aige i meitibileacht lena n-áirítear mitochon dria [24]. I gcealla epithelium gastric, léiríodh go raibh OTA ina chúis le mífheidhmiú mitochondrial [33]. Le haghaidhduáncealla, tá torthaí conspóideacha ann maidir le cibé an bhfuil tionchar ag nochtadh OTA ar acmhainneacht miteachondrial nó nach bhfuil [21,24]. D’fhéadfadh poitéinseal laghdaithe miteachondrial a bheith mar thoradh ar mhiotachondria lagaithe nó d’fhéadfadh damáiste miteachondrial a leanúint. D'fhéadfadh feidhm lagaithe a bheith mar thoradh ar léiriú laghdaithe na bpróitéiní miteachondrialacha agus d'fhéadfadh sé go mbeadh acmhainneacht athraithe miteachondrial mar thoradh air. Cuireann feidhm lagaithe miteachondrial iallach ar an gcill bealaí eile a úsáid chun soláthar fuinnimh a chinntiú. Is féidir soláthar fuinnimh faoi ranníocaíocht mhíchuí miteachondrial a chothabháil trí úsáid mhéadaithe a bhaint as glicealú as a dtiocfaidh táirgeadh feabhsaithe lachtáit. Mar sin féin, i gcealla HEK293, suthach daonnaduánlíne cille, fuarthas amach go raibh laghdú ar glicealú mar thoradh ar OTA agus bhí an méid lachtáit fheabhsaithe de bharr táirgeadh lachtáit ó glutamine ag brath ar léiriú an lncRNA WISP1-AS1 [24]. I gcodarsnacht leis sin, i gcealla epithelia gastric, d'fhéadfaí a thaispeáint go bhfuil nochtadh OTA mar thoradh ar athchlárú meitibileacht glúcóis i dtreo glicealú agus gníomhaíocht timthriall aigéad tricarboxyic níos lú [34]. Is féidir linn a thaispeáint anseo go bhfuil (1) mar thoradh ar OTA ar léiriú mRNA laghdaithe de dhá phróitéin mitochondrial roghnaithe go hionadaíoch, a bhfuil ról acu i sintéis próitéin mitochondrial (MRPS16) agus táirgeadh fuinnimh (NDUFB10) agus (2) go rialaíodh einsímí láimhseála glycogen. ar bhealach inar féidir glúcós feabhsaithe a shlógadh (GYS1 síos agus PYGM in airde). Ina theannta sin, is cosúil go n-eascródh cumas iompair GLUT1 níos airde. Mar sin féin, bhí na hathruithe seo de bharr OTA beagnach neamhspleách ar choinníollacha cultúir.
Mar fhocal scoir, léirigh muid, faoi choinníollacha comhchultúr, go bhféadfadh imoibriú na gcealla a bheith difriúil ó na frithghníomhartha a breathnaíodh i mona-chultúr, cé nach raibh na paraiméadair go léir a ndearnadh staidéar orthu anseo ag brath ar chultúr. Mar sin féin, bunaithe ar na torthaí a chuirtear i láthair anseo, ba cheart gurbh fhearr úsáid an chomhchultúir más féidir, rud a sheachnódh an fhéidearthacht maoirseacht a dhéanamh ar na héifeachtaí nach dtarlóidh nuair a dhéantar staidéar ar chineál cille amháin amháin. Tá an cheist fós faoi conas a dhéanann na cealla cumarsáid idir a chéile. Nocht staidéir i múnla comhchultúr francach meicníocht spleách COX [20] agus i lucha, is cosúil go bhfuil aigéad retinoic rannpháirteach i gcroschaint cheallacha deduáncealla [35]. Ina theannta sin, tá an cheist fós, más rud é, cén fáth agus conas a chuireann OTA isteach ar mheitibileacht fuinnimh cheallacha agus ar ról na mitochondria ann.
Cinneadh Gníomhaíochtaí LDH agus Caspase-3 agus Ábhar PróitéinLe haghaidh lysis, nitear cealla faoi dhó i maolán PBS fuar-oighear, bailíodh agus lísíodh iad i maolán MOPSTriton (20 mM 3-(N-morpholino)aigéad própánsulfónach, pH 7.4, 0. 1 faoin gcéad Triton X100). Cinneadh ábhar próitéine i lysates cille ag baint úsáide as aigéad bicinchoninic [36,37]. Socraíodh gníomhaíocht LDH i lysates meáin nó cealla mar thomhas le haghaidh necróis de réir Bergmeyer [38] mar a thuairiscítear go mion i [20]. Cinneadh gníomhaíocht Caspase-3 mar thomhas le haghaidh apoptosis ag baint úsáide as an tsubstráit florigenic caspase (DEVD-AFC) mar a thuairiscítear in [39]. Go hachomair, goraíodh lísáit cille 60 µL le maolán imoibrithe 65 µL (20 mmol/L piperazine-1,4-bis(2ethanesulfonic acid (PIPES), 4 mmol/L EDTA, 0.2 faoin gcéad {{26}) }[(3-cholaminopropil)démheitiolammonio]-1-própánsulfáit (CHAPS), 10 mmol/L dithiotreitol (DTT), pH 7.4) ina bhfuil 42 µmol/L DEVD-AFC (Aspglu-val-asp{{ 36}}aimín-4-trifluoromethylcoumarin, tiúchan deiridh) ag 37 ◦ C. Tomhaiseadh fluaraiseacht an táirge scoilte (AFC) ag excitation 400 nm agus astú 505 nm. Rinneadh AFC scoilte a chainníochtú trí chuar calabraithe ag baint úsáide as AFC aitheanta comhchruinnithe.
RT-PCR Baineadh úsáid as imoibrí Trizol (Life Technologies, Darmstadt, an Ghearmáin) a leithlisiú aigéad ribonúicléach iomlán (RNA). Níodh cealla agus ina dhiaidh sin lísíodh iad le himoibrí Trizol agus aistríodh iad isteach i bhfeadán imoibrithe. Tar éis clóraform agus lártheifneoiriú a chur leis (12,000× g), bailíodh an chéim uachtarach agus meascadh é le hiopropanól fuar oighir. Tar éis lártheifneoraithe (12,000× g) baineadh an súiteán agus nite an millíní faoi dhó le 75 faoin gcéad eatánól agus tuaslagadh in uisce é ar deireadh. Rinneadh tras-scríobh droim ar ais ag baint úsáide as trealamh tráchtála ó Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAM) de réir a threoracha. Rinneadh PCR fíor-ama ag baint úsáide as imoibrí SYBR Green (Invitrogen). Rinne Microsynth AG, Balgach, an Eilvéis na primers a shintéisiú. Taispeántar seichimh primer i dTábla 1. Ríomhadh an modh 2∆∆Ct athrú fillte ar shloinneadh géine ag baint úsáide as slonn EEF2 agus RPS17 mar thagairtí. Ba é léiriú an dá ghéinte seo na cinn nach raibh chomh athraithe (más rud é in aon chor) i sonraí seicheamhaithe RNA nuair a dhéantar comparáid idir OTA cóireáilte agus cealla HK2 neamhchóireáilte (torthaí neamhfhoilsithe).
Blotanna an Iarthair Tar éis na próitéiní a scaradh trí leictreafóiréis glóthach sóidiamdodecylsulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE), aistríodh próitéiní isteach ar membrane nítriginalóis. Ina dhiaidh sin, cuireadh bac ar shuíomhanna saor-cheangailteacha an scannáin le tuaslagán 5 faoin gcéad de bhainne tirim neamhshaille i sáile maolánach TRIS (bonn TRIS 3 mM, 140 mM NaCl, 0.17 mM Tris -HCl, pH 7.4) ina bhfuil 0.1 faoin gcéad Tween20. Cuireadh leis na chéad antasubstaintí caolaithe i saline TRIS móide 5 faoin gcéad de shéiream albaimin buaibheach (TRIS-BSA, le haghaidh caoluithe féach Tábla 2) agus gor na seicní thar oíche. Tar éis níocháin, cuireadh antasubstaintí tánaisteacha fluaraiseachta-chúpláilte i TRIS-BSA ar feadh 90 nóiméad. Taifeadadh fluaraiseacht an dara antasubstaintí trí úsáid a bhaint as córas braite LICOR.
Feabhsaíonn CISTANCHE Péine Duán/Duánach
