Conas a rialaíonn próitéiní deisiúcháin membrane cille aistriú comhartha fachtóir trascríobh chun fiobróis duánach a rialú

Teagmháil: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Ríomhphost:audrey.hu@wecistanche.com

Haichang Li

Duántá baint ag fiobróis le dul chun cinn géarmhíochaineduándíobháil do ghalar duáin ainsealach. Tá sé léirithe go bhfuil MG53, próitéin deisithe membrane cille, a chosaint i gcoinne díobhála do chealla epithelial duánach agus gortú duáin géarmhíochaine. Anseo, rinneamar measúnú ar ról MG53 i modhnú naduánfiobróis i lucha atá ag dul in aois agus i lucha a bhfuil bac aontaobhach ureteral orthu (UUO), samhail aitheanta d’fhiobróis duánach forásach. D’fhorbair lucha a raibh eisíothlú MG53 orthu níos mó fiobróis idir-rannóg le haois ná MG53-lucha slána den aois chéanna. Mar an gcéanna, in éagmais MG53,duánbhí áibhéalacha fiobróis i gcomparáid le lucha a raibh slánMG53 acu sa duán bactha i gcomparáid leis an duán contrártha gan bhac nó duáin na lucha a oibrítear le seab. An ureteral bacduáinó lucha easnamhacha MG53 léirigh i bhfad níos mó athlasadh ná duáin ureteral bactha ó lucha slán MG53. Léirigh turgnaimh in vitro go bhféadfadh MG53 dul isteach i núicléis na gcealla epithelial feadánacha proximal agus idirghníomhú go díreach leis an gcomhpháirt p65 den fhachtóir trascríobh NF-kB, ag soláthar míniú féideartha ar athlasadh feabhsaithe in éagmais MG53. Chun é seo a thástáil, tugadh léiriú feabhsaithe MG53 trí chealla a ndearnadh innealtóireacht orthu nó trí sheachadadh próitéin athchuingreach díreach do lucha faoi réir UUO. Laghdaigh sé seo gníomhachtú NF-kB agus athlasadh agus fiobróis duánach maolaithe. Mar sin, d’fhéadfadh ról teiripeach a bheith ag MG53 maidir le hathlasadh ainsealach duáin a chóireáil agus ar an gcaoi sin cosaint a sholáthar in aghaidhfiobróisas a dtagann an feinitíopa galar duáin ainsealach.

Coscann Cistanche tubulosa galar duáin, cliceáil anseo chun an sampla a fháil

Ráiteas Aistritheach Cruthaíonn athlasadh ainsealach athmhúnlú snáithíneach a d'fhéadfadh a bheith mar bhunús leis an aistriú ó ghéarghortú duán go galar duáin ainsealach. Tá baint ag gníomhachtú fachtóir trascríobh próitéin-athlastach fachtóir núicléach-kB (NF-kB) le pataigineas athlasadh na duáin. Anseo, cuirimid fianaise ar fáil go n-idirghníomhaíonn MG53, próitéin deisiúcháin membrane cille a aithníodh roimhe seo, go díreach le NF-kB agus go laghdaíonn sé a ghníomhaíocht trascríobh. Ag an am céanna, is féidir le MG53 a riartar go exogenously laghdú ar athmhúnlú fibrotic na duáin inflamed. Léiríonn na torthaí seo idirghníomhú cosanta idir MG53 agus NF-kB chun forbairt fiobróis duánach trí mheán athlasadh a mhaolú. D’fhéadfadh riarachán cógaseolaíochta MG53 a bheith ina chur chuige dóchasach maidir le cóireáil fiobróis duánach forásach.

Tá mífheidhm duáin, ar féidir a rangú mar ghéarghortú duánach (AKI) nó mar ghalar ainsealach duáin (CKD), tar éis fás ina eipidéim i ndaonraí níos sine. In 2017, shroich leitheadúlacht CKD 14.5 faoin gcéad de dhaoine 65 bliain d’aois agus níos sine, rud a d’fhág go raibh caiteachas Medicare os cionn $84 billiún ar chóireáil.^1,2Tá AKI agus CKD níos coitianta i measc daoine scothaosta, go príomha mar gheall ar an claonadh méadaithe i leith gortú chomh maith le cumas laghdaithe chun an duán atá ag dul in aois a dheisiú. Tá léirithe ag staidéir chliniciúla gur fachtóir riosca mór é CKD do AKI, agus, os a choinne sin, is féidir le heipeasóidí AKI dlús a chur le dul chun cinn CKD i dtreo galar duáin ag an gcéim deiridh. Faoi láthair, tá an chóireáil AKI tacúil go príomha, agus tá cóireáil CKD seanbhunaithe dírithe ar dhul chun cinn moille trí chosc ar an gcóras renin-angiotensin-aldosterone agus anois b'fhéidir trí chosc ar {-2 comh-iompair glúcóis sóidiam.^3,4

Ag brath ar dhéine na díobhála, féadfaidh cealla feadánacha cóngaracha, príomhsprioc na ngéarghortaithe, athruithe a dhéanamh ar dhul chun cinn timthriall na gceall,5,6 meitibileacht, 7 secretion cítocíní próitéin-athlastacha agus próibrotacha, nó aistriú páirteach epithelial-mesenchymal,8 a chinnfidh cé acu an n-éireoidh le hathmhúnlú/deisiú nó an mbeidh sé mí-oiriúnaitheach agus an mbeidh fiobróis duánach mar thoradh air, sainmharc CKD.9,10 Tarlaíonn an t-athmhúnlú seo de ghnáth ar chúlra athlasadh duáin,

soláthar soithíoch laghdaithe, agus táirgeadh próitéiní maitrís extracellular (ECM) agus folaíonn sé caillteanas cealla epithelial agus carnadh collagens, actin muscle a-réidh, agus fibronectin; tá comhghaol ard aige freisin le meath ar fheidhm na duáin.

Tarlaíonn athmhúnlú fiobróis mar thoradh ar athlasadh ainsealach a d’fhéadfadh a bheith mar bhunús leis an aistriú ó AKI go CKD.11–13 Tugann taighde carnach le fios go bhfuil baint ag fachtóir trascríobh fachtóir núicléach-kB (NF-kB) le pataigineas athlasadh duáin de bharr ionfhabhtú, gortaithe, nó trasphlandú.11,12,14 Tosaíonn gníomhachtú an chosáin chanónach NF-kB le gníomhachtú an choisceora NF-kB (IkB) kinase, as a dtagann fosfar agus díghrádú IkBa agus traslonnú núicléach heitrea-iméirí NF-kB.15 Is féidir le gníomhachtú comharthaí NF-kB i gcealla epithelial duán agus insíothlú cealla imdhíonachta a fháil as truicearaí paiteolaíocha amhail nochtadh do lipopolysaccharides (LPSanna) nó gortú ischemia-athfhriotú.16 Léiríonn staidéir phróifílithe mhóilíneach nfkb1 mar phríomhspreagthóir fiobróis duán.¹⁷Chomh maith le cealla feadánacha duáin, cuireann cealla imdhíonachta dúchasacha ar nós macrophages agus cealla dendritic le gortú duáin, athlasadh, agus athmhúnlú fibrotic.^13,18–20

Tá cistanche éifeachtach chun mífheidhmiú duáin a chóireáil

Tugann an fhianaise atá ag fás le fios go ndéanann fachtóirí rúndachta matán-díorthaithe (.i. mióicíní) fiseolaíocht chórasach a mhodhnú trí chrostalk fíocháin chun tionchar a imirt ar dhul chun cinn na ngalar duáin.²¹MG53 (ainmnithe freisin TRIM72) is próitéin móitíf trípháirteach muscle-saibhrithe (TRIM) le feidhm ríthábhachtach i deisiú membrane cille.²⁴Tá deisiú membrane MG53-i gceist le géarghortú do mhatán cnámharlaigh a mhaolú,²⁵duáin,²⁶croí,²⁷ na scamhóga, 28 inchinn,^29,30agus craiceann.³¹D'aithin ár staidéir roimhe seo leibhéal íseal de léiriú MG53 sa duán, atá ina phríomh-chomhpháirt i gcosaint AKI, agus bhí lucha a bhí easnamhach i MG53 (mg53 / ) níos mó i mbaol AKI de bharr strus.²⁶Léirigh muid le déanaí freisin go gcuireann ardú leanúnach MG53 sa chiorcal feabhas ar dheisiú agus ar athghiniúint gortú fíocháin.32 Ní fios go fóill na róil choibhneasta atá ag MG53 a bhaineann go sonrach le duáin agus eistrí i bhfiobróis duánach modhnú le linn CKD forásach.

Le déanaí, tháinig forbairt ar ról MG53 maidir le cosaint fíocháin a mhodhnú trí chosc ar athlasadh, go háirithe trí chomharthaíocht NF-kB a mhodhnú. Mar shampla, maolaíonn MG53 néartocsaineacht agus néar-athlasadh spreagtha ag LPS trí chosc a chur ar an gcosán TLR4/NF-kB,33 agus rialaíonn MG53 cairdiach slonn KChIP2 chun athmhúnlú leictreifiseolaíoch a rialú le linn hipertrófaithe cardio.34 Ina theannta sin, léirigh muid feidhm dhéach de MG53 i cosc a chur ar fhreagairt hipir-athlastach maladaptive le linn ionfhabhtú víreas fliú sublethal A, arb iad is sainairíonna é táirgeadh iomarcach interferon-b, trí ghníomhachtú IRF3/NF-kB a shochtadh agus cosc ​​a chur ar chomharthaíocht infhéitheach infhéitheach Ca2þ i macrophages.35 Ina theannta sin, tar éis dáileog mharfach den fhliú A. ionfhabhtú víreas, léiríodh go gcuireann MG53 cosc ​​ar bhásmhaireacht agus damáiste scamhóg, ní trí thionchar díreach a bheith aige ar na leibhéil víreasacha per se ach trí stoirm cítocín a mhaolú (interferon-b, interleukin-6, agus interleukin-1b) trí rialáil dhiúltach. den NLRP3 inflammasome agus cosc ​​ar phiroptosis na scamhóg.36 Thairis sin, bhí cóireáil ainsealach ard-dáileog ar MG53 eisghineach nasctha le NF-kB a chur faoi chois – athlasadh idirghabhála sa chroí aosta.37 Tugann na staidéir seo le fios gur féidir le MG53 comharthaíocht neamhbhuan NF-kB a mhodhnú le linn athlasadh ach ní dhearnadh staidéar ar cibé an dtarlaíonn sé seo i gcomhthéacs athlasadh duáin.

Mholamar go rialaíonn MG53 athlasadh na nduán trí ghníomhaíocht tras-scríbhinne NF-kB a mhodhnú agus dá réir sin is féidir leis an fiobróis duánach a tharlaíonn mar thoradh ar athlasadh ainsealach a mhaolú. Rinneadh an staidéar seo chun aghaidh a thabhairt ar an hipitéis seo.

Tá cistanche éifeachtach chun galair duáin a chóireáil

MODHANNA

Staidéir ainmhithe

Chloígh na turgnaimh go léir le hainmhithe le Treoir na nInstitiúidí Náisiúnta Sláinte um Chúram agus Úsáid Ainmhithe Saotharlainne agus lean siad prótacail arna gceadú ag Coiste um Chúram agus Úsáid Ainmhithe Institiúideach Ollscoil Stáit Ohio. Cineál fiáin aois-oiriúnaithe (WT) nó mg53^-/-Baineadh úsáid as neamhlitreacha den phór 129S1/SvImJ22 chun ról MG53 a bhunú i modhnú fiobróis duánach de bharr bhacainn úiréadra agus aontaobhach (UUO). Ceannaíodh lucha C57B6/J (9–10 seachtaine) ó Jackson Labs.

Maidir le staidéir ar ghortuithe duán, cuireadh UUO ar lucha (9-12 seachtaine) chun fiobróis duán a spreagadh. Rinneadh ainéistéisiú ar lucha trí isoflurane (1.5 faoin gcéad –2.0 faoin gcéad ) chun plána domhain ainéistéise a chinntiú. Rinneadh an nós imeachta UUO tríd an úiréadar clé a cheangal le 5-0 síoda máinliachta faoi dhó de réir na bprótacal foilsithe.38 Ní raibh ach incision craiceann bhoilg ar lucha seama. Chun éifeacht rhMG53 ar ghortú bacainn duáin a mheas, fuair 1 ghrúpa de lucha UUO rhMG53 (2 mg/kg) trí instealladh vein eireaball ag tosú díreach tar éis máinliacht UUO (lá 0) agus ansin go laethúil ar feadh 7 lá, le 2 dáileoga breise ar laethanta 9 agus 11. Fuair ​​grúpa rialaithe de lucha UUO instealltaí seile de réir an sceidil chéanna. Maraíodh lucha ar an lá 12 tar éis obráid UUO, bhí na duáin perfused in situ le saline maolánach fosfáit, agus bailíodh samplaí fíocháin ó na duáin UUO agus an duán contralateral le haghaidh histeolaíocht agus anailís blot an Iarthair.

I staidéir ar leith, WT agus mg53^-/-rinneadh máinliacht UUO nó sham ar lucha agus maraíodh iad ar an 7 lá tar éis na hoibríochta. Tugadh MG53 do lucha ag baint úsáide as cur chuige teiripe cille-bhunaithe.39 RAW Bhí 264.7 macraphages ionfhabhtaithe le doxycycline (DOX)-spleách Ad tPA-MG53-cháithníní víreasacha silíní ar feadh 24 uair an chloig. Na cealla ionfhabhtaithe (ag tiúchan de {{1{53}} /100 ml saline in aghaidh na lucha) a instealladh vein eireaball isteach i lucha díreach tar éis máinliachta (instealladh lá 0). Fuair ​​​​lucha 4 instealladh de chealla RAW aistrithe Ad-tPA-MG53 ar laethanta 0, 1, 3, agus 6. Díreach tar éis an lá 0 instealladh cille, rinneadh lucha a randamach i ngrúpa a fuair agus grúpa nach bhfuair DOX (2). mg/ml i dtuaslagán siúcrós 5 faoin gcéad) ina n-uisce óil ar feadh 7 lá agus ansin maraíodh iad. Bailíodh samplaí fíocháin ó dhuán UUO agus ó dhuán contrathaobhach le haghaidh anailísí histeolaíochta, RNA agus próitéine.

Anailísí staidrimh Cuirtear sonraí in iúl mar acmhainn -SD. Rinneadh comparáid laistigh de ghrúpaí trí úsáid a bhaint as t-thástáil an Mhic Léinn agus 2 bhuntaighde thurgnamhach á gcur i gcomparáid H Li et al.: Déanann MG53 NF-kB a mhodhnú i bhfiobróis duánach 2 Kidney International (2021) -, -–-ghrúpaí agus 1-anailís bealaigh ar athraitheas do níos mó ná 2 ghrúpa (Graphpad Prism 8.2; GraphPad) agus an tástáil chomparáid iolrach Bonferroni nó Holm-Sidak ad hoc ina dhiaidh sin. Measadh go raibh luach P < 0.05="" suntasach="" go="">

Modhanna forlíontacha Modhanna iomlána lena n-áirítear meastóireacht histologach, tomhais creatiníne serum, tógálacha plasmid, cultúr cille agus aonrú cille epithelial feadánacha príomhúil, ullmhú adenovirus agus ionfhabhtú cille, measúnacht trasghluaiseacht núicléach NF kB p65, imdhíon-histochemistry agus íomhánna comhfhócasach, measúnacht tuairisceora luciferase NF-kB, cytokine Tá measúnú imdhíon-sorbent einsím-nasctha, codánúchán fíocháin, imdhíonadh, coimmunoprecipitation, imoibriú slabhra cainníochtúil polaiméaráise fíor-ama (Tábla Forlíontach S1), agus táirgeadh rhMG53 sna Modhanna Forlíontacha.

sliocht cistanche tubulosa: cóireáil galar duáin

TORTHAÍ

Forbraíonn lucha a bhfuil ablation MG53 acu fiobróis duánach atá ag brath ar aois

Chuireamar i gcomparáid leis an éifeacht aosaithe ar fheidhm na duáin agus fiobróis i mg53^-/-agus lucha WT. Dhearbhaíomar ár mbreathnóireacht roimhe seo, cé nach raibh leibhéil creatiníne serum lucha óga (2 mhí) le agus gan MG53 difriúil go mór, níos sine (16-20 mí) mg53-/-léirigh lucha creatinín séiream i bhfad níos airde ná rialuithe WT aois-mheaitseála (Fíor 1a). Bunaithe ar staining trichrome, fuair muid amach go mg53-/-bhí níos mó fiobróis duáin ag lucha i gcomparáid le lucha WT, ag tosú ag aois 5 mhí agus ag leanúint ar aghaidh trí 20 mí d'aois (Fíor 1b agus c). Baineadh úsáid as staining imdhíon-histocheimiceach chun meastóireacht a dhéanamh ar an tionchar a bhí ag ablation MG53 ar insíothlú leukocytes, monocytes, agus macrophages i 2-mí agus 5-duáin luiche de mhí d’aois (Fíor 1d agus e). Bhí leibhéil chomhchosúla leukocytes infhéitheach ag duáin ó WT óg agus ó lucha mg53-/-, ach fuarthas i bhfad níos mó cealla athlastacha i mg53 / duáin ná duáin WT i lucha 5-mí d'aois.

Ina theannta sin, léirigh imdhíon-histochemistry le haghaidh actin muscle a-réidh agus fibronectin, 2 phróitéin maitrís eischeallacha a fhaightear go coitianta i réimsí fiobróis duán, staining feabhsaithe (3- go 8-huaire) feabhsaithe i glomeruli agus tubulointerstitium na duáin ó 3- {4}}mg53-/- mí d’aois i gcomparáid le 10-lucha WT mí d’aois (Fíor Forlíontach S1).

Spreagann UUO athlasadh géaraithe duáin agus fiobróis i mg53-/- lucha Mhéadaigh leibhéil MG53 na nduán a braitheadh ​​trí imdhíonadh 7 lá tar éis UUO (Fíor 2a). Léirigh na duáin mg53- /- UUO fiobróis áibhéalacha, le limistéar breise tríchróim-dhaite 30 faoin gcéad, ná duáin WT UUO (Fíor 2b).

Modhnaíonn MG53 gníomhachtú NF-kB agus logánú núicléach p65

Rinneadh measúnú ar ghníomhaíocht NF-kB (p65) sa tsamhail UUO. Méadaíodh líon na n-iomlán p65 (t-p65) go suntasach i duáin UUO ó WT agus mg53 / lucha, ach bhí gníomhachtú NF-kB, a measadh mar phosphorylation de p65, níos mó (16-huaire) sa mg53 / UUO duáin ná an duán WT UUO (2-huaire) i gcomparáid le hainmhithe a oibrítear le seab (Fíor 3a). Rinneamar anailís ar na leibhéil choibhneasta RNA a bhaineann le fachtóir fáis b1 (TGF-b1) a chlaochlú (TGF-b1), inhibitor activator plasminogen-1 (PAI-1), agus collagen cineál I alfa 1 (Col1a1) sa duán a bhfuil bac uirthi.40 Táimid braitheadh ​​​​leibhéil ísle de léiriú géine in ainmhithe sham agus ionduchtú comhchosúil (TGF-b1, w10 huaire; PAI-1, w40 huaire; Col1a1, w40 huaire) sa duán UUO ó WT agus mg53 / (Fíor 3b). Chun scrúdú a dhéanamh ar dháileadh spásúil MG53 sa cortex duáin faoi ghnáthchoinníollacha, rinneadh anailís ar chodáin fíocháin duánach. Fuaireamar go rialta 10-níos mó próitéine cíteasól iomlán ná an phróitéin núicléach iomlán a eastósctar. Bhí na leibhéil t-p65 inchomparáide sa chodán citosolic idir WT agus mg53-/- lucha ach bhí siad níos airde sa chodán núicléach de mg53-/- lucha (Fíor 3c). Braitheadh ​​MG53 sa chodán citosol (le tubulin mar mharcóir citosol). Gan choinne, braitheadh ​​​​méid suntasach MG53 ag an gcodán núicléach (le histone H3 mar mharcóir codán núicléach).

Chun an toradh seo a dhearbhú, rinneamar scrúdú freisin ar logánú MG53 i gcodáin matán cnámharlaigh (Fíor Forlíontach S2). Rinneamar ár gcuid staidéir roimhe seo a atáirgeadh ina ndearna MG53 logánú don chitosól agus don membrane sarcolemmal (triphosphatase adenosine sóidiam-potaisiam mar mharcáil ar chodán membrane)22,23,25 ach freisin braitheadh ​​​​MG53 núicléach saibhrithe ó mhatán cnámharlaigh.

Idirghníomhaíonn MG53 le p65 chun gníomhaíocht trascríobh spreagtha fachtóir-a- meall neacróis a rialú Chun ár dtorthaí codánúcháin fíocháin a dhearbhú, rinneamar na staidéir imdhíon-histochemical seo a leanas. I gcealla epithelial feadánacha proximal saothraithe WT, fuarthas p65 go príomha sa chitosól ach logánta go núicléis in éagmais MG53 (Fíor 4a). Nuair a dhéileáil na cealla seo le LPS (5 mg) ar feadh 8 uair an chloig, bhí an secretion cítocine pro-inflammatory i bhfad níos mó i mg53 / cealla ná cealla WT (Fíor 4b).

Toisc gur mhol na sonraí seo go bhféadfadh MG53 idirghníomhú le p65 chun léiriú cítocine athlastach a rialáil, rinneadh measúnú ar idirghníomhú díreach idir p65 agus MG53 trí thástálacha coimmunoprecipitation ag baint úsáide as cealla HEK293 a comh-aistrithe le Flag-p65 agus HA-MG53. Léiríomar idirghníomhaíocht lag (Fíor 4c). Dheimhnigh comhaistriú plasmid GFP-p65 agus RFP-MG53 agus anailís chomhfhócasach comhlonnú p65 agus MG53 (Fíor 4d). Rinneamar cainníochtú ansin an bhfuil tionchar ag MG53 ar ghníomhaíocht trascríobh NF-kB (p65) tar éis spreagadh TNF trí ghníomhaíocht luciferase a thomhas ó líne chill tuairisceora trascríobh NF-kB / 293- GFP-Luc cobhsaí a aistríodh go sealadach le ceachtar veicteoir PHM6 nó HA-MG53. Sna cealla tuairisceora tá slonn lentivirus aistrithe tuairisceoir firefly luciferase tiomáinte ag tionscnóir cíteomegalovirus íosta i gcomhar le 4 chóip de chomhdhearcadh eilimintí freagartha trascríobh NF-kB (suíomh kB) in aghaidh an tsrutha. In éagmais TNF-a, braitheadh ​​​​gníomhaíocht luciferase intreach an-íseal i gcealla tuairisceora a léirigh próitéiní MG53. Chuir MG53 gníomhaíocht trascríobh TNF-a-fuaite NF-kB (p65) faoi chois thart ar 40 faoin gcéad (Fíor 4e).

Chuir ró-eisiúint MG53 cosc ​​ar thrasuíomh núicléach NF-kB p65 ar TNF-cóireáil NF-kB p65 a aistrigh go dtí an núicléas ar chóireáil TNF-a san epithelium tubule proximal duánach.41 Iniúchadh a dhéanamh an bhféadfadh cóireáil le MG53 aistriú núicléach NF-kB p65 a mhaolú ar spreagadh TNF-a, rinneamar ró-léiriú ar MG53 i gcealla HKC-8 trí aistriú víreasach DOX-spleách Ad-tPA-MG53 nó trí chóireáil le MG53 daonna athchuingreach (rhMG53). Ag baint úsáide as antashubstaint mhonaclónach sonrach MG, tar éis ionduchtaithe DOX-spleách MG53 braitheadh ​​trí imdhíonadh. Bhí MG53 i láthair ag leibhéal an-ard i gcealla HKC-8 aistrithe Ad-tPA-MG53,

comhionann le 1 ng rhMG53/mg lysate cheallacha. I gcodarsnacht leis sin, ghlac HKC-8 méid i bhfad ní ba lú de rhMG53 (Fíor 5a). Deimhníodh gur ghlac HKC-8 le lipéad fluaraiseachta FL rhMG53-8 le micreascópacht chomhfhócasach (Fíor Forlíontach S3). Tar éis cóireáil TNF-a, ba é 15 go 30 nóiméad an t-am chun gníomhachtú p65 a bhuaic (Fíor 5b). Faoi choinníollacha basal, bhí cónaí ar NF-kB p65 go príomha sa chitosól, agus níor athraigh ró-expression MG53 é seo (Fíor 5c agus d). Mar sin féin, tar éis spreagadh TNF-a, d'aistrigh p65 go dtí na núicléis i gcealla HKC-8 gan ró-bhrú MG53. I gcomparáid leis sin, tháinig laghdú 33 faoin gcéad ar thrasuíomh núicléach p65 (cealla tugtha rhMG53) go 50 faoin gcéad (cealla trasduchtaithe tugtha DOX) i gcealla róshéimhithe MG53 (Fíor 5c agus d).

Rinneadh aistriú uchtaithe cealla RAW a ndearnadh innealtóireacht orthu isteach sa tsamhail UUOmouse le 1 - 106 cealla a riaradh trí instealladh féitheacha eireaball díreach tar éis máinliacht UUO. Roinneadh lucha go randamach i ngrúpa a fuair gnáth-uisce óil (-DOX) agus i ngrúpa a fuair DOX (2 mg/ml) in uisce óil. Fuair ​​lucha UUO RAW gach lá eile le haghaidh 4 instealladh san iomlán. Baineadh na duáin 7 lá tar éis máinliachta.

Léiríodh go raibh laghdú suntasach (30 faoin gcéad) ar fhiobróis duánach ag lucha a insileadh le RAW a ndearnadh innealtóireacht orthu agus ina dhiaidh sin ionduchtú DOX (30 faoin gcéad) fiobróis duánach i gcomparáid leo siúd nach bhfuair cealla ar bith nó iad siúd a insileadh le cealla RAW a ndearnadh innealtóireacht orthu ach gan ionduchtú Dox (66 faoin gcéad limistéar snáithíneach; Fíor 6a agus b).

Níor tháinig ach daonra beag RAW/Ad-tPA-MG53 slán ón bhfaireachas ar an gcóras reticuloendothelial faoi dheireadh na dturgnamh. Dheimhnigh staining immunohistochemistry gur léiriú RAW-idirghabhála MG53 RAW-idirghabhálaithe DOX sa duán (Fíor 6c). Is díol spéise é go raibh cóimheas p-65/t-p65 níos ísle (thart ar 40 faoin gcéad) ag duáin UUO ó lucha RAW-inslithe agus iad siúd a tugadh RAW gan DOX (Fíor 6d agus e). Deimhníodh an leibhéal p-p65 laghdaithe le staining immunohistochemistry p-p65 (S536) ar duáin UUO (Fíor 6f). Is dóigh linn go bhféadfadh scaipeadh MG53 arna sheachadadh ag Raw/Ad-tPA-MG53/þDOX agus glacadh le cealla tubule proximal duán a bheith rannpháirteach i laghdú p-p65 (S536) agus laghdú athlasadh duáin UUO. I gcomparáid le duáin UUO-amháin, tháinig méadú suntasach ar léiriú TGF-b1, PAI- 1, agus Col1a1 i nduáin UUO ó lucha a insileadh le RAW gan DOX (gan ionduchtú MG53). D'fhéadfaí ardú na ngéinte próibrotach seo a chur i leith ionduchtú imoibriú láidir allagraft ó chealla ionsuite isteach i lucha imdhíon-inniúlachta. Mar sin féin, léirigh duáin UUO ó lucha a insileadh le RAW agus a tugadh DOX (MG53 ionduchtú) i bhfad níos ísle (laghdú 60 faoin gcéad -72 faoin gcéad) PAI-1 agus leibhéil réasúnta níos ísle de TGF-b1 agus Col1a1 ná lucha gan chóireáil DOX (Fíor 6g).

Maolaíonn riarachán sistéamach rhMG53 gníomhachtú NF-kB agus forbairt fiobróis i lucha atá faoi réir UUO

Thástáil muid cibé an léirigh rhMG53 éifeacht fhrithshnáithíneach chomhchosúil leis an teiripe cille RAW a ndearnadh innealtóireacht air a cuireadh síos níos luaithe. Léirigh ár sonraí cógaschinéiteacha roimhe seo an leathré ghearr, a scaiptear (thart ar 90 nóiméad i gcreimirí) rhMG53.42 D’fhulaing lucha riarachán ainsealach de 2 go 6 mg/kg

rhMG5326,37 go maith, mar sin baineadh úsáid as an straitéis riaracháin a léirítear i bhFíor 7a. Tugadh feithicil (salanda) nó rhMG53 (2 mg/kg) go randamach do lucha UUO gach lá ar feadh na chéad 7 lá tar éis na máinliachta agus ansin gach lá eile go dtí gur maraíodh iad ar an lá 12. Thaispeáin duáin sheama agus chontrathaobhacha thart ar choibhéis t-p65 agus leibhéil slonn fibronectin, agus na leibhéil p-p65 beagán méadaithe i nduáin chontrártha i gcomparáid le duáin shalacha. Tar éis UUO, mhéadaigh t-p65 na duáin. I gcomparáid le hainmhithe cóireáilte salanda, laghdaíodh an cóimheas p-65/t-p65 sna duáin UUO d’ainmhithe cóireáilte rhMG thart ar 37 faoin gcéad , ach tháinig méadú thart ar 27 faoin gcéad ar IkBa (Fíor 7b agus c). Ina theannta sin, tháinig laghdú thart ar 33 faoin gcéad ar fibronectin (Fíor 7b agus c). Dhearbhaigh immunohistochemistry go raibh rhMG53 i láthair sna duáin UUO tar éis cóireála (Fíor 7d). Laghdaíodh fiobróis iomlán i nduáin UUO cóireáilte rhMG (Fíor 7e). Mar sin féin, bhí an léiriú RNA de TGF-b1, PAI-1, agus Col1a1 cosúil i lucha cóireáilte le ceachtar salanda nó rhMG53 (Fíor 7f).

Tá cistanche éifeachtach chun mífheidhmiú duáin a chóireáil

PLÉ

Is próitéin TRIM saibhrithe muscle é MG53 a aithníodh ar dtús mar chomhpháirt fheiceálach d’innealra deisiúcháin membrane plasma.22,26,42,43 Mar sin féin, níl gníomhartha MG53 teoranta do muscle chnámharlaigh, agus is féidir MG53 a scaoileadh isteach sa scaipeadh mar a myokine.32 Tá sé léirithe againn roimhe seo gur féidir le MG53 athlasadh a rialú le linn damáiste fíocháin in orgáin chianda.27,29,33,35–37 Leathnaíonn an t-imscrúdú reatha scóip chosaint orgán MG{53-idirghabhálaithe chuig an duán. Bainimid de thátal as gur féidir le MG53 athlasadh infhéitheach agus fiobróis duánach a mhaolú trí bhac a chur ar ghníomhachtú cítocine-spreagtha ar an bhfachtóir trascríobh pro-athlastach agus próifrótach NF-kB. Tá an chonclúid seo bunaithe ar na breathnuithe seo a leanas: (i) scriosadh géiniteach MG53 i lucha gnáth.

mar thoradh ar laghdú ar fheidhm na duáin mar an lucha d'aois a bhí in éineacht le méadú ar fiobróis duáin agus insíothlú na duáin ag leukocytes agus macrophages; (ii) i múnla díobhála duán murine UUO, léirigh duáin bhacaithe lucha easnamhacha níos mó fiobróis agus athlasadh ná MG53-lucha lán; (iii) Rinneadh táirgeadh TNF-a agus interleukin-6trí chealla epithelial feadánacha cóngaracha LPS-cóireáilte a mhaolú i láthair MG53; (iv) laghdaigh cóireáil le nó ró-eisiúint MG53 i líne chill epithelial feadánacha cóngarach gníomhachtú NF-kB spreagtha TNFa trí thrasuíomh núicléach na comhpháirte p65 de-kB a bhlocáil (Fuarthas go raibh MG53 ceangailte go díreach le p65, cé go lag); agus (v) laghdaíodh fosfarylation de p65, céim riachtanach i ngníomhú NF-kB, sna duáin bactha de lucha UUO cóireáilte le MG53 athchuingreach a tharlódh chun overexpress MG53 i macrophages. Ina theannta sin, méadaíodh an coscaire ar ghníomhachtú NF-kB, IkBa, sna duáin bhac de lucha UUO a stealladh le hathchuingreachMG53.

Bhí scriosadh géiniteach MG53 i lucha gnáth ceadaithe do na héifeachtaí díobhálacha a bhaineann le dul in aois ar na duáin. Tugann sé seo le tuiscint go soláthraíonn láithreacht MG53 endogenous leibhéal bonnlíne cosanta le linn aosú. Ar an gcaoi chéanna, mar gheall ar chaillteanas MG53 endogenous rinneadh AKI de bharr bacainn níos measa. An duáin UUO carntha MG53, b'fhéidir a léiríonn gníomhaíocht iargúlta myokine ó muscle chnámharlaigh. Níl sé soiléir fós conas is féidir matán MG53 a earcú don duán le linn díobhála; áfach, is minic a fhorbraíonn duáin damáiste hypoxia agus bíonn sé faoi strus ocsaídiúcháin,^44,45comharthaí a d’fhéadfadh freastal ar MG53 a earcú. Más ea, d’fhéadfaí an ais “muscle-duán-imdhíonachta cille” seo a ghiaráil chun damáiste duáin a mhaolú.46 Mar mhalairt air sin, cuireann cealla duáin leibhéil ísle MG53 in iúl ag bunlíne,²⁶agus, le linn gortú géara nó ainsealacha, d’fhéadfaí táirgeadh MG53 a uasrialáil.

Tá NF-kB ina thiománaí trascríobh feiceálach ar athlasadh agus fifibrosis i gortú duáin agus ag dul in aois.^14,17,47,48Moladh dúinn imscrúdú a dhéanamh an bhféadfaí éifeachtaí MG53 a idirghabháil trí NF-kB mar gur mhol láithreacht MG53 san urrann núicléach aonchineálach duán go bhféadfaí cur isteach tras-scríobhach a dhéanamh. Níl logánú núicléach MG53 gan fasach. I múnla transgenic overexpressing miócairdiach MG53, núicléach MG53 rialáil an abairt de peroxisome proliferator-gníomhachtaithe receptor-alfa ag an leibhéal transcriptional agus tionchar metabolism lipid cairdiach.49 Thairis sin, léirigh muid le déanaí rhMG53 faoi chois gníomhachtú NF-kB chun teip croí a bhaineann le haois a mhaolú. trí laghdú cytokines pro-inflammatory, apoptosis, agus strus ocsaídiúcháin i cardiomyocytes d'aois.³⁷

Tá an mheicníocht mhóilíneach maidir le conas a mhodhnaíonn MG53 slógadh núicléach/cíteaplasma p65 fós doiléir. Níl aon chomhartha logánaithe núicléach ag MG53, ach tá 3 chomhartha easpórtála núicléach toimhdeacha N-críochfort saibhir i leucine ann, móitíf atá aitheanta ag onnmhairiú próitéin onnmhairiúcháin núicléach.⁵⁰Bhí an t-idirghníomhú díreach idir MG53 agus p65 sách lag mar an t-aon nó an príomh-éifeacht suaiteach a bhí ag MG53 ar ghníomhachtú NF-kB. Cé gur dealraitheach go ndéanann MG53 difear do shuttling dinimiciúil nucleocytoplasmic de chomhpháirteanna ríthábhachtacha NF-kB, tá na meicníochtaí cruinne fós le cinneadh.

Is cosúil gurb é an toradh criticiúil a bhaineann le hathchosaint MG53-idirghabhála ná athmhúnlú fibrotic a laghdú trí athlasadh NF-kB-idirghabhála a mhaolú. Is próiseas casta é fiobróis duán a bhaineann le sil-leagan pathologic de phróitéiní ECM éagsúla.51 Ba chosúil go raibh éifeachtaí soiléire ag MG53 ar an fibronectin próitéin ECM. Mhéadaigh fibronectin sna duáin UUO easnamhach i MG53 agus laghdaigh sé i lucha UUO cóireáilte le MG53. Tá sé níos deacra léiriú próitéiní ECM eile i láthair agus as láthair MG53 a thuiscint. Léiríomar roimhe seo go rialaíonn rhMG53 comharthaíocht TGF-b1/Smad go diúltach agus go gcuireann sé sintéis na bpróitéiní ECM faoi chois i staidéar in vitro. mg53 / ainmhithe easnamhacha. Tháinig laghdú ar na tras-scríbhinní seo ar ainmhithe UUO a spreagtar chun MG53 a ró-bhrú trí luchóg víreasach a riar.

macrophages, ach nuair a tugadh MG53 athchuingreach, ní raibh aon éifeacht le feiceáil. D’fhéadfadh sé gur cás dóthanach dóthanach é seo mar go raibh na leibhéil MG53 infhéitheach a baineadh amach i bhfad níos airde in ainmhithe mar gheall ar an veicteoir macrophage i gcomparáid le MG53 athchuingreach. Ina theannta sin, níor rinneadh leibhéil próitéine a thomhas, agus d'fhéadfadh imeachtaí iar-thscríbhinne an ECM in UUO a mhodhnú. Tá gá le tuilleadh taighde chun ról MG53 atá ag teacht chun cinn maidir le próitéiní sonracha ECM a mhodhnú. Mar fhocal scoir, léirigh an staidéar seo go bhféadfadh myokine cuidiú le hathlasadh bunlíne in orgán iargúlta cosúil leis an duán a rialáil agus, le linn díobháil duánach a shocrú, go bhféadfadh sé cabhrú le hathlasadh a mhaolú agus a rialú. Léiríonn Fíor 8 samhail oibre de ról MG53 in athchosaint. Le linn patrúin móilíneacha a bhaineann le damáiste (DAMP, mar shampla TNF-a) agus patrúin móilíneacha a bhaineann le pataigin (PAMP, mar shampla LPS) a spreagadh agus strus ischemic, cuirtear an comhartha NF-kB i ngníomh sa duán. Cosnaíonn MG53 an duán trí chosc a chur ar phosphorylation agus gníomhachtú comharthaíochta NF-kB, ag cobhsú IkBa, agus ag laghdú slógadh núicléach p65, ag cur bac ar ghníomhachtú clár pro-athlastach. Cé go bhféadfadh MG53 ingenous na héifeachtaí seo a idirghabháil, molaimid go bhféadfaí cosaint níos láidre a sholáthar trí úsáid a bhaint as MG53 go teiripeach, rud atá indéanta bunaithe ar chumas MG53 exogenous chun díobháil in UUO a laghdú. Tá gá le himscrúdú breise chun tuiscint a fháil ar conas is féidir an myokine seo a shaothrú go cliniciúil.

tairbhe cistanche: ae agus frith-fiobróis a chosaint

NOCHTADH

Tá leas cothromais ag JM i TRIM-edicine, Inc., a fhorbraíonn rhMG53 chun galair daonna a chóireáil. Tá paitinní ar úsáid MG53 i seilbh Ollscoil Rutgers agus Ollscoil Stáit Ohio. Níor dhearbhaigh na húdair eile go léir aon leasanna iomaíocha.

BUÍOCHAS

Thacaigh na hInstitiúidí Náisiúnta Sláinte (NIH) R01-DK106394 (JM, BHR, agus P-HL) agus NIH R{01-AG062896 (P-HL agusBHR) leis an obair seo. Fuair ​​an tionscadal seo tacaíocht pháirteach freisin ó chiste intramuralLockwood ó Ollscoil Stáit Ohio (P-HL) agus dámhachtain ón Ionad Náisiúnta um Chun Cinn na nEolaíochtaí Aistritheacha (NCATS; P-HL, uimhir dhámhachtana UL1TR002733). Is ar na húdair amháin atá an t-ábhar freagrach as an ábhar agus ní gá gurb ionann é agus tuairimí oifigiúla an NCTS nó an NIH.

RANNÍOCAÍOCHTAÍ AN ÚDAR,

PD, P-HL, JM, agus BHR a cheap agus/nó a dhear na staidéir; rinne HL, PD, P-HL, ZL, agus XZ na turgnaimh, fuair siad sonraí, agus rinne siad anailís ar shonraí; Rinne PD, P-HL, agus BHR léirmhíniú ar na torthaí; agus dhréachtaigh, athbhreithníodh agus cheadaigh P-HL agus BHR an lámhscríbhinn. Léigh na húdair go léir an leagan deiridh agus cheadaigh sé é.

ÁBHAR FORLÍONTACH

Comhad Forlíontach (PDF) Modhanna Forlíontacha.

Tábla S1.Seichimh primer. Fíor S1. mg53-/- taispeánann lucha deascadh feabhsaithe próitéin ECM. Dathaíodh fíocháin duáin de chineál fiáin (10 mí d'aois) agus mg53- /- le 40 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; gorm, painéil chlé), actin matán réidh (SMA; glas, dara painéil), fibronectin (dearg, an tríú painéil), agus cumaiscthe (painéil ar dheis). Barra ¼ 25 mm. Cainníochtú limistéar fiobróis duánach (n ¼ 3 in aghaidh an ghrúpa). Cuirtear sonraí i láthair mar mhodh -SD. T-tástáil an mhic léinn. ***P <>

Fíor S2.Dáileadh matán cnámharlaigh MG53 idir núicléas agus cíteaplasma. Rinneadh matán cnámharlaigh-díorthaithe ó chineál fiáin (WT) ormg53-/- lucha a chodánú agus a imdhíonadh le hantasubstaint frith-MG53 saincheaptha (3 mg lysates) agus marcóirí urrann cille (20 mg lysates). Úsáidtear triphosphatas adenosine sóidiam-potaisiam mar mharcóir membrane cille, histone H3 mar mharcóir núicléach, agus tubulin mar mharcóir citosóil.

Fíor S3.HKC{0}} glacann cealla tubula proximal duán go sonrach le AlexaFluor 647-lipéad rhMG53. lipéadaíodh rhMG53 (Trimedicine) agus serum-albaimin buaibheach (BSA; ThermoFisher Scientific) le feisteáin Lipéadaithe Antashubstaintí Alexa Fluor(AF) (Life Technologies) de réir phrótacal an déantóra. Saothraíodh cealla HKC-8 ar mhias bun gloine Delta TPG (Bioptechs Inc.) i meán modhnaithe Eagle's (DMEM) ag Dulbecco le 10 faoin gcéad de shéiream bó féatais (FBS) i láthair próitéiní lipéadaithe, BSA-AF647 (ar chlé ) agus rhMG53-AF647 (ar dheis), ar feadh 24 uair. Tógadh íomhánna Z-stack ó mhicreascóp comhfhócasach LSM780 (Zeiss). Taispeánann íomhánna cealla ag bun na miasa. Barra ¼ 25 mm.

Fíor S4.Innealtóireacht cealla RAW chun an rún MG53 induchtach a idirghabháil. (A) Bhí cealla RAW ionfhabhtaithe le Ad-tPA-MG53 ar feadh 24 uair agus déileáladh leo gan (doxycycline [Dox]) nó le Dox (þDox, 1 mg / ml) ar feadh 24 uair an chloig breise chun léiriú tPA-MG53 a spreagadh. Thaispeáin íomhánna comhfhócasacha ionduchtú slonn MG53 (antashubstaint saincheaptha frith-MG53, dearg, painéil íochtair) ó chealla RAW cosúil le macrophage (staining F4/80, painéil bairr). Barraí ¼ 25 mm. (B, C) Anailís blot an Iarthair ar lysates cille (i méid 0.6, 3, agus 6 mg) le haghaidh léiriú spreagtha tPA-MG53 agus MG53 ó chealla RAW ionfhabhtaithe (B) agus an cultúr comhfhreagrach comhdhlúthúcháin meán (i méideanna 2, 5, agus 1{0ml) (C). Lódaíodh cainníochtaí éagsúla rhMG53 (i méid 0.2, 1, 0.05, agus0.025 ng) mar chaighdeáin. Mw, marcóirí meáchan móilíneach.