Staidéar ar éifeacht acteoside (comhábhar gníomhach i Cistanche Deserticola) ar NAFLD trí autophagy a aslú

Achoimre:

 

Cuspóir:Chun an fheidhm uathrialach a bhaineann le haicéid ghníomhach acteoside (ACT) i Cistanche Deserticola a fhiosrú agus a éifeacht ar ghalar ae sailleach neamh-mheisciúil (NAFLD).

ModhannaChun echinacoside a ghlacadh agus gníomhú mar rudaí taighde, rinneadh 1 {{0 0 μmol/l ACT agus echinacoside (ECH) a chomhcheangal le coscaire uathrialach-lysosome Bleomycin A1 le haghaidh cóireála idirghabhála. Baineadh úsáid as imdhíonadh próitéine chun an leibhéal léirithe coibhneasta de phróitéin autophagy próitéin a bhrath próitéin a bhaineann le próitéin 1 slabhra solais 3 (LC {3- ii). Rinneadh cealla HepG2 a idirghabháil le tiúchain éagsúla ACT in vitro, agus braitheadh ​​inmharthanacht na gceall ag baint úsáide as an modh salann tetrazolium. Baineadh úsáid as samhail NAFLD a tógadh in vitro le hidirghabháil drugaí chun braoiníní lipid a dhathú ag baint úsáide as modh dathaithe ola dearg O ola agus leibhéil tríghlicríde intracellular a bhrath. Breathnaigh ar logánú braoiníní próitéine agus lipid LC3 trí theicneolaíocht imdhíonfhluaraiseacht. Is féidir leis an Acht Torthaí autophagy a spreagadh go suntasach i gcealla Hepg2, agus méadaítear go suntasach an leibhéal léirithe de LC 3- II i gcomparáid leis an ngrúpa rialaithe (cóireáilte le ACT ina n -aonar) (1.36 ± 0. faoi ​​seach), le tábhacht staitistiúil (P0.05). 50 μmol/l Acht autophagy a spreag go mór i gcealla Hepg2, agus méadaíodh go mór an leibhéal léirithe de phróitéin LC 3- II (1.83 ± 0.53, 0.35 ± 0.18, faoi seach). Bhí an leibhéal TG de chealla HEPG2 sa ghrúpa idirghabhála ACT (19.11 ± 1.68) i bhfad níos ísle ná an grúpa i ngrúpa samhail cille vitro NAFLD (34.15 ± 1.90), agus bhí na difríochtaí suntasach go staitistiúil (P.<0.05). The number of positive lipid droplets in HepG2 cells in the ACT intervention group decreased significantly, and the number of autophagosomes inside the cells increased significantly, showing clear co localization with lipid droplets in space. Conclusion Cistanche deserticola ACT has significant autophagy induction ability, and it may have potential preventive and therapeutic effects on NAFLD.

 

Eochairfhocail:Galar ae neamh -alcólach saille;Cistanche Deserticola;AicteosideAutophagy

 

TCM Herb Cistanche le haghaidh cóireáil ar ghalar ae neamh-mheisciúil sailleach (NAFLD)

Cliceáil ar an pic chun tuilleadh sonraí a fháil

 

Le cúpla bliain anuas, sailleach neamh-mheisciúilgalar ae(NAFLD) is coitianta anoisgalar ae ainsealach, le leitheadúlacht dhomhanda de thart ar 25% de dhaonra na ndaoine fásta, agus meastar go bhfuil dlúthbhaint aige le siondróm meitibileach [1]. Cé go bhfuil an dóchúlacht go mbeidh deacrachtaí a bhaineann le hae in othair NAFLD níos lú ná 10%, is fachtóir riosca é NAFLD do ghalair a bhaineann le hae, mar shampla cioróis agus ailse ae príomhúil, a fhorchuireann ualach eacnamaíoch ollmhór ar othair [2-5]. In ainneoin an aird mhéadaitheach a íocadh le NAFLD, níor tugadh dóthain aire do NAFLD mar ghalar ainsealach tábhachtach. Dá bhrí sin, is fadhbanna práinneacha iad tuiscint dhomhain bhreise ar phataiginí NAFLD agus ar straitéisí éifeachtacha cóireála a chuardach [{6-7].

Léirigh staidéir a rinneadh le déanaí go bhfuil ról tábhachtach ag autophagy ceallach i bhfiseolaíocht ae agus i bpaiteolaíocht [8]. Tá mífheidhm uathrialaithe nó dírialú bainteach le héagsúlacht galair ae marGalar ae a bhaineann le halcól[9], NAFLD [10], steatohepatitis neamh-mheisciúil [11], agus carcinoma hepatocellular [12]. Is iad tréithe paiteolaíocha NAFLD ná sil-leagan iomarcach tríghlicrídí (TG) agus braoiníní lipid neodracha eile (LD) i hepatocytes faoi spreagadh neamh-mheisciúil. Maidir leis an ae, is iad an dá phríomhbhealach a rialaíonn catabolism na LDS seo ná lipolysis agus autophagy.
Tá an cosán lipolysis á rialú ag lipéid neodracha cíteaplasmacha, mar shampla lipase hormóin-íogair agus lipase TG. Sa chonair chomhfhreagrach lipoautophagy, is féidir LDS a ghlacadh go roghnach trí phróitéiní a bhaineann le autophagy a earcú chun autophagosomes a fhoirmiú, agus ansin déantar an LDS atá cuimsithe ag autophagosomes a sheachadadh tuilleadh chuig lysosomes agus déantar lipase aigéadach i lysosomes a dhianscaoileadh. Dá bhrí sin, is straitéis éifeachtach é lipoautophagy a ghníomhachtú i hepatocytes chun NAFLD a chosc agus a chóireáil.
Is leigheas luibhe lómhar Síneach é Cistanche Deserticola a úsáideadh go forleathan i gcleachtas cliniciúil i bhfoirmlí míochaine traidisiúnta na Síne. Ag an am céanna, baineadh úsáid as le fada mar fhorlíonadh bia sláinte. Tá éagsúlacht de chomhábhair bhithghníomhacha i Cistanche Deserticola, agus is é Cistanche Deserticola phenylethanol glycosides an ceann is tábhachtaí. De réir mar a tuairiscíodh go bhfuil go leor gníomhaíochtaí bitheolaíocha tábhachtacha ag ionadaithe gliocóisídí phenylethanoid, echinacoside (ECH) agus verbascoside (ACT), amhail cosaint antioxidant, neuroprotective, imdhíon -imdhíonachta agus ae [13]. Maidir le cosaint ae, fuair staidéir amach gur féidir le ECH an t-ae a chosaint trí idirghabhálaithe athlastacha a laghdú, cosc ​​a chur ar athrú fachtóir fáis, agus leibhéal na ngéinte a bhaineann le fiobróis ae a laghdú. Tá éifeacht chosanta shuntasach ag Acht ar dhamáiste ae ceimiceach agus drugaí a spreagann drugaí, amhail alcól, teitreaclóiríd charbóin, agus lipopolysaccharide. Laghdaíonn an tAcht strus ocsaídiúcháin de bharr ceimiceáin thocsaineacha, baintear ocsaigin imoibríoch carntha san ae, agus laghdaíonn sé tiúchan malondialdehyde. Ag an am céanna, méadaíonn sé go mór gníomhaíocht dismutase superoxide ae agus laghdaítear an t -ábhar glutathione, agus feabhsaíonn sé go mór damáiste histeapaiteolaíochta ae agus apoptosis. Mar sin féin, níl aon tuarascáil litríochta ábhartha ann maidir le cibé an bhfuil baint ag gliocóisídí phenylethanoid de Cistanche Deserticola i bpróiseas an uathrialaithe chun cosaint ae a chur i bhfeidhm. Bunaithe ar seo, d'úsáid an staidéar seo modhanna traidisiúnta bitheolaíochta cille agus samhail chill in vitro chun an éifeacht a bhí ag cistanche deserticola phenylethanoid a fhiosrú go réamh-uathrialach agus rinne sé iniúchadh ar a fheidhmeanna cógaseolaíochta féideartha, agus é mar aidhm aige bonn eolaíoch a sholáthar d'fhorbairt drugaí sa todhchaí.

 

1 Ábhair agus Modhanna

1.1 Ábhair

1.1.1 Ábhair Taighde Baineadh úsáid as ECH agus ACT mar ábhair taighde.

1.1.2 Ábhair Ceannaíodh cealla Hepg2 ó Wuhan Punosai Life Science Co. Ceannaíodh trypsin ó Hyclone Company, SAM, ceannaíodh serum bólachta féatais (uimhir bhaisc: {04-002-1 a) ó BI Company, Ceannaíodh Penicillin/Streptomycin (Uimhir Baisc: SV30010.01) ó Hyclone Company, USA, MTT (BATCH Uimhir: M8180) Ceannaithe ó SoleBated, BEIJ, MTT (BATCH UIMHIR: M8180) Ba é Power a ceannaíodh ó Solebated, Berba, MTT (Uimhir BATCH: M8180) a ceannaíodh ó CUIDEACHTA, CUIDEACHTA, CUIDEACHTA (BATCH CUIDEACHTA, CUIDEACHTA CUIDEACHTA A BHAINEANDADH ó CUIDEACHTA, BEIBA, BERBA, MTT (BATCH: Ceannaíodh an tSín, TG (uimhir bhaisc: BC0625) ó Solebao Company, Beijing, an tSín, Ola Dearg O (Uimhir Lot: O {{{}} g), ceannaíodh dimethyl sulfoxide (uimhir lán: BCBZ1685) ó Sigma-Aldrich, SAM; Ceannaíodh an coscaire uathrialach-lysosome bafilomycin A1 (BAFA1, Uimhir Lot: TLRL-BAF1) ó Invitrogen, SAM; Ceannaíodh an gníomhaire uathrialach rapamycin (uimhir lán: S17098) ó Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd, an tSín; Próitéin Microtubule-a bhaineann le Slabhra Solais 3 (LC3, Uimhir Lot: L7543, Speicis: Coinín, Cóimheas Caolúcháin: 1: {1 000) agus -Actin (Uimhir Lot: ZRB1312, Speicis: Coinín, Caolúcháin Ceannaithe: 1: 5 000} Ceannaíodh antasubstaintí ó Sigma-ALDIA: {5 000}}) ó Sigma-ALDMA, USAA, USA; Ceannaíodh antasubstaint tánaisteach (4010-05, speicis: cóimheas frith-choinín gabhair, cóimheas caolúcháin: 1: 1 000) ó Southern Biotech, USA Company, Alexa Fluorescent Fluorescent, antasubstaint tánaisteach (Uimhir Lot: 43328, 546 Fluorescent Fluorescent Fluorescent: Fíor-antasháin DÍOSPÓIREACHTA (Uimhir Lot: 43328, Fluorescent Fluoresty: Fíorú Fluilliú Folution: Fíorú:}: \ t Ceannaíodh 1: 1000) ó Sigma-Aldrich Company, SAM, agus ceannaíodh Bodipy 493/501 (Uimhir Lot: D3922) ó Invitrogen Company, SAM.

 

1.2 Modhanna

1.2.1 Cultúr na gCillíní

Rinneadh cealla HepG2 a shaothrú i meán glúcóis ard modhnaithe Dulbecco, ina raibh 10% serum bólachta féatais, 100 U/ml peinicillin agus 100 ug/ml streptomycin i ngobharán 37 céim, 5% goir dé -ocsaíde carbóin. Nuair a shroich an chumraíocht cille 85%, rinneadh fo -dhobharshaothrú, plating, idirghabháil agus oibríochtaí eile.

 

1.2.2 Braite Imdhíonachta Próitéin

1.2.2.1 Acht agus Cóireáil ECH

LC 3- ⅱ Is féidir le leibhéal léirithe próitéine i gcealla Hepg2 BAFA1, mar choscóir caidéil prótóin, a bheith ina chúis le próitéin LC {3- ⅱ chun comhiomlán a dhéanamh i gcainníochtaí móra i gcealla, rud a mhéadaíonn an cumas ionduchtaithe uathrialaithe. Dá bhrí sin, is féidir úsáid chomhcheangailte BAFA1 a úsáid mar chóras monatóireachta uathrialaithe chun an cumas ionduchtaithe uathrialaithe a mheas. Aistríodh cealla HepG2 sa chéim fáis logartamach go miasa cultúir cille 3.5 cm do chultúr thar oíche. Baineadh úsáid as 100 μmol/L Act, ECH agus BAFA1 le haghaidh idirghabhála ar feadh 12 h. Rinneadh na cealla a ní le tuaslagán maolánach fosfáite réamh-fhuaraithe (PBS) agus iad a líonta láithreach i maolán lysis próitéine RIPA ar feadh 10 nóiméad. Rinneadh lártheifneoiriú ar an supernatant agus socraíodh an tiúchan próitéine iomlán ag baint úsáide as trealamh measúnachta comhchruinnithe próitéine aigéid dé -chinicininic. Tar éis cainníochtú le maolán sulfáit sóidiam dodecyl, téitear an sampla ag 95 céim ar feadh 10 nóiméad chun an próitéin a shéanadh. Ansin tógadh 30 μl den sampla le micropipette agus leictreafóiriú ar fhoirmiú polyacrylamide.
Tar éis an leictreafóiréis, aistríodh an próitéin ón ghlóthach go membrane nitrocellulose, a cuireadh bac le 1 0% bainne thar oíche, a ghoradh le príomh -antashubstaint ar leith ag teocht an tseomra ar feadh 1 h, nite le maolán fosfáite ina bhfuil 0.5% triton, agus a ghrúpáil le antasubstaint thánaisteach ar leith ag teocht an tseomra le haghaidh 1 h. Baineadh úsáid as an modh ECL le haghaidh forbairt datha. Socraíodh iad mar ghrúpa rialaithe bán, Rapamycin Group, Group Group, Grúpa ACT, Grúpa Rapamycin+BAFA1, Grúpa ECH+BAFA1 agus Grúpa ACT+BAFA1.

 

1.2.2.2 Rinne tiúchain éagsúla den Acht idirghabháil ar leibhéal léirithe LC {3- ⅱ próitéin i gcealla Hepg2

Aistríodh cealla HepG2 an chéim fáis logartamach go dtí miasa cultúir cille 3.5 cm le haghaidh cultúir thar oíche, agus baineadh úsáid as 25, 50, agus 100 μmol/L ACT in éineacht le BAFA1 le haghaidh cóireála idirghabhála ar feadh 12 h, agus braitheadh ​​an leibhéal léirithe de LC 3- ⅱ próitéin trí imdhíonacht próitéin. Bunaíodh an grúpa rialaithe (CON Group, rialú bán), an grúpa ocras (Grúpa STA, Cóireáil Ocras HepG2), 25, 50, agus 100 μmol/L Act Group, agus BAFA1 in éineacht le grúpa 25, 50, agus 100 μmol/L ACT.

1.2.3 Modh MTT chun ráta marthanais na gceall Hepg2 a bhraitear le comhchruinnithe éagsúla ACT do 24 agus 48 h
Rinneadh cealla Hepg2 sa chéim fáis logartamach a ionaclú i bpláta tobair 96- le dlús ionaclaithe measartha agus saothraithe i gorlann ar feadh 12 h. Cuireadh 2 {0, 40, 60, 80, agus 100 μmol/l Acht le haghaidh 24 agus 48 h. Cuireadh tuaslagán 0.5 mg/ml MTT leis i dtimpeallacht dorcha agus é a ghoradh i gorlann. Tar éis 4 h, cuireadh an supernatant i leataobh, cuireadh 100 μl de dhé -ocsaíd démheitil le gach tobar, agus chroitheadh ​​na cealla i gcroiteoir teochta tairiseach ag 37 céim ar feadh 10 nóiméad. Braitheadh ​​an luach dlús optúil (OD) ag tonnfhad de 490 nm le marcóir einsím, agus ríomhadh an ráta marthanais cille.

 

1.2.4 Tógáil in vitro de mhúnla cille NAFLD

Rinneadh meáchan áirithe d'aigéad palmitic (PA) a mheá agus a dhíscaoileadh go hiomlán i méid áirithe de isopropanol chun tuaslagán stoc 100 mmol/L PA a ullmhú, a roinneadh agus a stóráladh ansin i gcuisneoir céim -20 le húsáid níos déanaí. Rinneadh an tuaslagán stoc PA a chaolú go 100 μmol/L ag baint úsáide as meán cultúir iomlán, agus cuireadh 1% de albaimín serum bólachta saor ó aigéad sailleach. Rinneadh na cealla a ghoradh ag 37 céim ar feadh 3 h chun an tuaslagán ionduchtaithe a ullmhú. Aistríodh cealla HepG2 sa chéim fáis logartamach go mias cultúir cille 3.5 cm ag dlús cuí do chultúr thar oíche, agus ansin baineadh úsáid as an tuaslagán ionduchtaithe ullmhaithe le haghaidh idirghabhála.

 

1.2.5 ACT Idirghabháil Múnla na Cille In vitro NAFLD Braite TG agus Dearg Ola D Dearg O

 

1.2.5.1 Braite TG

Aistríodh cealla HepG2 sa chéim fáis logartamach go mias cultúir cille 3.5 cm don chultúr de réir an ghrúpa rialaithe bán, an ghrúpa samhail agus an ghrúpa idirghabhála ACT. Rinneadh an grúpa eiseamláireach a spreagadh le tuaslagán ionduchtaithe 100 μmol/L PA, agus spreagtar an grúpa idirghabhála ACT le tuaslagán ionduchtaithe 100 μmol/L PA agus cuireadh 50 μmol/L ACT leis ag an am céanna. Ba é an t -am idirghabhála ná 24 h. Bain an sean-chultúr go réidh go réidh, nigh an dromchla cille go mall le PBS réamh-fhuaraithe uair amháin, cuir 100 μl/mhias de thuaslagán RiPA lysis réamh-fhuaraithe, go hiomlán lyse ar oighear ar feadh 15 nóiméad, lártheifneoir ag 4 chéim agus 12 000 r/min do 10 nóiméad, bailigh an supernatant, tóg an t-ábhar eile le haghaidh enzmatic le haghaidh enzmatic de 10 μl, déan an t-ábhar a bhrath, a bhrath, a bhrath le haghaidh enzmatic, a bhrath, a bhrath le haghaidh enzmatic le haghaidh enzmatic, a bhrath le haghaidh enzmatic, le haghaidh 10 n-enzatic, a bhrath le haghaidh enzy. De réir na dtreoracha trealaimh TG, agus ar deireadh ceartaigh an leibhéal TG in aghaidh an mg próitéine.

1.2.5.2 Dearg Ola o Dhaingneoireacht

Aistríodh cealla HepG2 sa chéim fáis logartamach go mias cultúir 3.5 cm a bhí clúdaithe le duillín steiriúil do chultúr thar oíche. D'eascair 100 μmol/L PA na cealla chun braoiníní lipid a dhéanamh. Ag an am céanna, cuireadh Acht 50 μmol/L le haghaidh idirghabhála ar feadh 24 h.
Bailíodh na sleamhnáin cille, nite 3 huaire le PBS réamh-fhuaraithe, socraithe le formaildéad 4% ag teocht an tseomra ar feadh 10 nóiméad, nigh siad dromchla na cille le PBS, chuir sé an tuaslagán oibre daite dearg ullmhaithe, daite ag teocht an tseomra sa dorcha Uisce driogtha, agus séalaithe, agus grianghraf faoi mhicreascóp.

 

1.2.6 Breathnóireacht imdhíonfhluaraiseacht ar autophagosomes agus braoiníní lipid tar éis cóireála ACT

Aistríodh cealla HepG2 sa chéim fáis logartamach go mias cultúir 3.5 cm a bhí clúdaithe le duillín steiriúil do chultúr thar oíche. 1 {0 0 μmol/L PA Úsáideadh PA chun foirmiú braoiníní lipid sna cealla a spreagadh. Ag an am céanna, cuireadh an tAcht leis le haghaidh cóireála idirghabhála ar feadh 24 h. Bailíodh na sleamhnáin cille, nite 3 huaire le PBS réamh-fhuaraithe, socraithe ag teocht an tseomra ar feadh 10 nóiméad le formaildéad 4%, permeabilized ag teocht an tseomra ar feadh 15 nóiméad le maolán permeabilization ina bhfuil 0.1% saponin, blocáilte ag teocht an tseomra le haghaidh 1 h le serum gabhar, a bhfuil an t-am ar fad le p le haghaidh p le haghaidh 1 H le LC le LC {{}}} le cur isteach 3 le 3 le p le p le p le p le p le pt, agus le teocht an tseomra a chur leis le Lc {} le cur le 3 le cur leis an mbreiseán le cur leis an t-am le cur leis Le antasubstaint thánaisteach ar leith atá lipéadaithe ag fluaraiseacht ar leith, arna ghoradh ag teocht an tseomra agus ar shiúl ó sholas ar feadh 1 h. Tar éis an ghoir antasubstainte, glanadh na sleamhnáin 3 huaire le PBS, agus iad ag teacht le chéile le probe braoiníní lipid-sonrach 493/503 ag teocht an tseomra ar feadh 10 nóiméad, nite le PBS, agus séalaithe le meán rónta frith-lapaigh, triomaithe aer-triomaithe sa dorchadas, breathnaithe le micreascóp cófraí ​​laser, agus taifeadta. Socraíodh an grúpa rialaithe bán, an Grúpa Cóireála Rapamycin agus an Grúpa Idirghabhála ACT.

 

1.3 Anailís Staitistiúil

SPSS25. 0 Baineadh úsáid as bogearraí staitistiúla le haghaidh anailíse sonraí. Cuireadh na sonraí cainníochtúla in iúl mar x ± s. Baineadh úsáid as anailís aontreo ar athraitheas agus ar thástáil LSD-T. P<0.05 was considered statistically significant.