Is Príomhphróitéin é Sidt2 sa Chosán Díghrádaithe Uathphagy-lysosomal agus Tá sé Riachtanach Chun Struchtúr Duán agus Feidhm Scagacháin a Chothabháil Ⅱ
Nov 07, 2023
PLÉ
Léirigh líon mór staidéar go bhfuil baint ag LMPanna le feidhm duáin nó hoiméastáis struchtúrach [21-25]. Fuair ár staidéar roimhe seo go gcuireann an LMP Sidt2 isteach ar an gcosán comharthaíochta athlastacha agus go ndéanann sé damáiste do na cealla mesangial glomerular luch [28]. Sa staidéar seo, den chéad uair, rinneamar imscrúdú ar na héifeachtaí ar struchtúr agus ar fheidhm na nduán luiche de bharr an LMP Sidt2. Fuarthas amach go raibh scriosadh Sidt2 mar thoradh ar chomhleá próisis chos duáin luiche, ramhrú an membrane íoslach, éidéime cille epithelial tubular duánach, damáiste microvilli, agus proteinuria méadaithe ag 24 h, rud a léiríonn go bhfuil feidhm scagacháin lagaithe mar thoradh ar chaillteanas Sidt2. agus struchtúr an duáin luiche, ach níl a mheicníocht mhionsonraithe soiléir.
Toisc gur aonaid fheidhmiúla thábhachtacha iad LMPanna den lysosome [17] agusmífheidhm lysosomalar cheann de na fachtóirí pataigineacha coitianta go leor galar duáin ainsealach (CDKs) (tag. [4, 29]), rinneamar imscrúduithe gaolmhara ar líseasóim tar éis scriosadh Sidt2 agus fuarthas amach gur tháinig laghdú ar líon na líseasóim aigéadach agus an pH an mhéadaigh lysosomes in vitro. Mar sin féin, ní raibh aon athruithe soiléire ar líon na líseasóm príomhúil a bhí ceangailte le huathphagosomes agus ar na líseasóim iomlána trí anailís micreascópachta leictreoin. Is ionann catepsins agus an grúpa is mó d'einsímí próitéalaíocha i lysosomes [30], ina measc tá CTSB ar cheann de na proteases lysosomal is flúirseach [31].
Ós rud é go gcaithfear cathepsins a aigéadú le haghaidh aibithe (gníomhachtú), beidh laghdú suntasach ar dhíghrádú próitéin mar thoradh ar athrú ar pH sa deireadh [32]. Léirigh leibhéil in vivo agus in vitro laghdú ar ghníomhaíocht agus ar ábhar hidrealáis aigéid lysosomal, rud a dhearbhaíonn tuilleadh go gcuireann Sidt2 bac ar fheidhm liosómach trí dhul i bhfeidhm ar aibiú próitéas sna líseasóim.
Cliceáil ANSEO CHUN FOIRMIÚ Luibhe CISTANCHE DO DUINE A FHÁIL
Idir an dá linn, feidhmíonn an lysosome mar ionad athchúrsála le haghaidh díghrádaithe meitibilítí ceallacha agus táirgí dramhaíola ag deireadh autophagy [1]. Tá gnáthfheidhm díghrádaithe lysosomal riachtanach le haghaidh autophagy, homeostasis cille a chothabháil, agus cealla a chumasú chun maireachtáil i stáit fiseolaíocha [33-36]. Tá sé cruthaithe go bhfuil baint ag tarlú agus forbairt go leor galar duáin le huathphagy neamhghnácha [37-39]. Fuarthas amach i staidéir le déanaí gur iompróir DNA/RNA líseasómach é Sidt2. Tá na cineálacha neamhghnácha autophagy trí RNautophagy agus DNautophagy (RDA) tábhachtach le haghaidh díghrádaithe RNA/DNA roghnach [40]. Fuair muid amach roimhe seo go ndéanann scriosadh Sidt2 damáiste do chomhleá autophagosomes agus lysosomes, rud a fhágann nach féidir mitochondria damáiste a dhíghrádú, rud a fhágann damáiste do struchtúr agus d'fheidhm muscle chnámharlaigh [41]. Dá bhrí sin, sa staidéar seo, rinneamar iniúchadh ar autophagy nuair a rinneadh damáiste duáin mar gheall ar scriosadh Sidt2. Thugamar faoi deara go raibh autophagolysosomes carntha i na duáin de Sidt2 - / - lucha trí micreascópacht leictreon. Is próiseas dinimiciúil é autophagy, lena n-áirítear foirmiú autophagosomes agus foirmiú agus díghrádú autophagolysosomes. Tá foirmiú na n-uathphagosomes luath á rialú ag géine Atg, agus tá foirmiú LC3-II ina chomhartha ar fhoirmiú autophagosome [42]. Fuaireamar amach gur mhéadaigh na slonn próitéiní a bhaineann le hútarphagy Atg agus LC3-II araon tar éis scriosadh Sidt2, rud a thugann le fios go bhféadfaí an ghníomhaíocht uathphagaíochta a fheabhsú. Mar sin féin, d'fhéadfadh carnadh LC3-II a bheith mar chúis le bac ar chonair na n-uathphagolysosomes ag deireadh na huathphagaigí.
Chun iniúchadh breise a dhéanamh ar éifeacht Sidt2 ar an stát autophagy duánach, rinneadh léiriú agus foirmiú próitéin lasta P62 a thomhas, agus freisin rinneadh imscrúdú ar éifeachtaí drugaí a dhíríonn ar autophagy (CQ agus RAPA). Ní mór P62 a chomhcheangal le LC3B agus ansin é a dhíghrádú sa lysosome. Is minic a léiríonn méadú ar leibhéal próitéine P62 bac ar an flosc autophagy [43]. Chun deireadh a chur le cúis an mhéadaithe i dtáirgeadh P62, thomhaiseamar leibhéal mRNA P62 agus fuaireamar amach gur laghdaíodh táirgeadh P62, agus mar sin is dócha gur tharla carnadh LC3-II mar gheall ar dhíghrádú bactha. Chun próiseas na n-uathphagy a fhiosrú tuilleadh, rinneamar turgnamh smeach de chloroquine. Is féidir le cloroquine timpeallacht aigéadach an lysosome a neodrú, agus ina dhiaidh sin, scriosann sé feidhm an lysosome agus bac a chur ar autophagy [44]. Léiríonn an méadú ar phróitéin LC3-II roimh agus tar éis cóireáil CQ líon na n-uathphagosomes díghrádaithe ag líseasóim, ar féidir leo gníomhaíocht na n-útarphaga a léiriú. Is féidir an tástáil smeach CQ céanna a úsáid freisin chun méid díghrádaithe P62 a chinneadh tríd an gcosán autophagolysosome. Ag teacht lenár dtorthaí, mar thoradh ar scriosadh an Sidt2 tháinig laghdú ar shreabhadh autophagy mar gheall ar deireadh bactha an autophagy. Ag an am céanna, i dturgnamh RAPA, tháinig méadú suntasach ar leibhéil phróitéin LC3-II agus P62 sa ghrúpa Sidt2−/−, rud a d’fhéadfadh a thacú tuilleadh go gcuireann easpa Sidt2 isteach ar chéim deiridh na n-útóipéice.
Áirítear le céim deiridh an autophagy foirmiú agus díghrádú autophagolysosomes. D'úsáidamar turgnaimh comh-lonnaithe inmunofluorescence LAMP1 agus LC3B chun comhleá autophagosomes agus lysosomes [45, 46] a bhrath, agus léirigh na torthaí go raibh bac ar chomhleá autophagosomes agus lísisóm tar éis scriosadh Sidt2. Aimsíonn turgnamh lipéadaithe dúbailte Ad-mCherry-GFP-LC3B foirmiú agus díghrádú autophagolysosomes [27]. Dhearbhaigh sé freisin gurb é an bac ar fhoirmiú agus díghrádú autophagolysosomes an phríomhchúis leis an damáiste do struchtúr agus feidhm na duáin tar éis scriosadh Sidt2.
Ó na torthaí thuas, is féidir linn a thabhairt i gcrích go laghdaítear líon na líseasóim aigéadach mar gheall ar easpa Sidt2 agus go mbíonn tionchar ag mífheidhmiú aigéadaithe na líseasóim ar aibiú einsímí hidrolyzed. B’fhéidir gurb é seo an chúis is tábhachtaí le damáiste don chonair díghrádaithe autophagy-lysosome chomh maith le neamhoird chomhleá autophagosome agus lysosome. Idir an dá linn, d'fhéadfadh go mbeadh dlúthbhaint ag an bpróiseas autophagy lagaithe leis an struchtúr duánach damáiste agus feidhm an scagaire tar éis scriosadh Sidt2 (Fíor 8). Ní thugann ár staidéar aghaidh ach ar chuid d’éifeachtaí Sidt2 ar struchtúr agus feidhm na duáin, ach is é an rud atá suimiúil ná go bhfuil carnadh príomhphróitéiní autophagy agus lagú struchtúr agus feidhm na duáin de bharr scriosadh Sidt2 cosúil leis na hathruithe ar phríomhphróitéiní autophagy agus proteinuria méadaithe go suntasach le feiceáil i nephropathy diaibéitis [37, 47]. D'fhéadfadh deisiú feidhm lysosome a bheith ina straitéis nua féideartha maidir le cóireáil nephropathy diaibéitis [37]. Táimid ag súil go gcuirfidh Sidt2 bealach ar fáil le hiniúchadh a dhéanamh ar phataigineas agus cóireáil galair duáin sa todhchaí.
Tástáil próitéine fuail i lucha Roghnaíodh go randamach 12- lucha WT seachtain d'aois agus Sidt2 -/ - cuireadh lucha fireanna i gcaighin meitibileach agus troscadh ach tugadh uisce dóibh. Bailíodh samplaí fuail 24 uair, agus ansin tástáladh iad le haghaidh próitéin fuail (Institiúid Bithinnealtóireacht Nanjing Jiancheng, CHN, C035-2-1) (féach na hÁbhair Fhorlíontacha le haghaidh modhanna mionsonraithe). Cealla Ceannaíodh podocytes glomerular luch MPC5 ó BeNa Culture Collection, agus saothraíodh iad le 10% FBS (Excell Bio, Meiriceá Theas, FSP500) agus DMEM íseal-ghlúcóis (Sigma-Aldrich, 6046). Ceannaíodh cealla mesangial glomerular SV40 MES 13 luch ó bhanc cille coiste caomhnaithe cultúir tipiciúil Acadamh Eolaíochtaí na Síne, agus saothraíodh iad le 10% FBS (Excell Bio, Meiriceá Theas, FSP500) agus glúcóis ard DMEM (Sigma-Aldrich, 6429) . Coinníodh tiúchan CO2 an bhosca saothraithe cille ag 5% agus coinníodh an teocht ag 37 céim. Ceannaíodh cloroquine (CQ) agus rapamycin (RAPA) ó Sigma-Aldrich (C6628, V900930). Rinneadh 10 mM CQ agus 25 mg/mL rapamycin a thuaslagadh in uisce ultra-íon. Cuireadh CQ leis an mhias petri ionas go raibh an tiúchan deiridh 50 μM, agus gor ar feadh 16 h mar choscóir autophagy. Cuireadh Rapamycin leis an mhias petri ag tiúchan deiridh de 15 μM agus gor é ar feadh 2 h mar ghníomhaí autophagy. Baineadh úsáid as córas veicteoirí lentivirus géine-eagarthóireachta CRISPR/Cas9 chun na plasmidí géine Sidt2 Lenticrispr-v2 (AddgenePlasmid49535, Feng Zhang) a bhaint, agus úsáideadh an uirlis deartha ar líne sgRNA (http://crispr.mit.edu/) chun dearadh sgRNA dírithe ar Sidt2.
Seo a leanas na sraitheanna primer: F: 5′-ACCACACCGTGACCC CAC-3′, R: 5′-GTTGCGGGTCACTGGGTGT{5}}′, arna shintéisiú ag cuideachta biteicneolaíochta (Sangon Biotech, Shanghai, CHN). Ag baint úsáide as an gcóras lentivirus CRISPR/Cas9, rinneadh an plasmid Lenticrispr-v2 a líneáil agus a nascadh leis an déphléacsach sgRNA annealaithe chun an plasmid athchuingreach Lenticrispr-v{{1{{180}}}} Sidt2 a thógáil. Baineadh úsáid as imoibrí aistrithe Vigofect (Biteicneolaíocht bhríomhar, Beijing, CHN) chun an plasmid Lenticrispr-v2 agus Lenticrispr-v2-Sidt2 plasmid athchuingreach a aistriú chun an lentivirus a thógáil. Aistríodh an lentivirus a fuarthas isteach sna cealla MPC5 agus SV40 MES 13. Tar éis 48 h, goradh na cealla le purinomycin ar feadh 72 h roimh an roghnú. Ba iad na cealla a tháinig slán ná an grúpa Sidt2+/+ agus an grúpa Sidt2−/− ar éirigh leo a aistriú. Baineadh úsáid as leithlisiú RNA agus assay PCR fíor-ama Trizol (Invitrogen) chun RNA a bhaint as cealla duáin luch, agus bhí an modh RT-PCR sonrach mar a thuairiscítear roimhe seo [21]. Ba iad seo a leanas na sraitheanna primers de RT-PCR: Actin (ciall: F: 5′- GGACTCC TATTTGGGGTGACG-3′, R:5′-CTTCTCCATGTCGTCCCAGT-3′), P62(ciall: F:5 ′- GGACCCATCTACAGAGGCT G-3′, R: 5′-ATCACAATGGTGGAGGGTGC-3′), Sidt2(ciall: F:5′- TAGTGCCTGTTACCACGTCTGC-3′, R:5TG'-GGATGCTAG {48}}′). blotting an Iarthair Is é an modh sonrach mar a luadh cheana [28]. Sa staidéar seo, áiríodh le hantasubstaintí príomhúla coinín frith-LC3B (1:1000; Sigma-Aldrich L7543), coinín frith-P62 (1:1000; Abcam ab205719), frith-luiche Actin (1:1000; Sigma Aldrich A5316), coinín frith-Sidt2 (1:1000; Invitrogen PA5-69064), coinín frith-Atg5 (1:1000; Teicneolaíocht Comharthaíochta Cille 9980S), coinín frith-Atg7 (1:1000; Cell Signaling Technology 8558S) , coinín frith-Atg12 (1:1000; Teicneolaíocht Comharthaíochta Cille 2011S), frith-LAMP1 luch (1:1000; Santa Cruz Biteicneolaíocht H4A3), coinín frith-catepsin B (1:1000; Teicneolaíocht Comharthaíochta Cille 31718S). Ad-mCherry-GFP-LC3B Rinneadh na cealla a ionaclú ar miasa Petri de bhun gloine Nunc. Tar éis fás go dlús oiriúnach, cuireadh Ad-mCherry-GFP-LC3B leis (am Beyo, Shanghai, CHN, C3011-10 mL), agus mar thoradh air sin bhí tiúchan deiridh de 10 −11 vp/mL. Tar éis spreagadh a dhéanamh ar feadh 48 h, breathnaíodh líon na bpointí fluaraiseachta mCherry agus GFP go díreach faoin micreascóp confocal léasair (Leica SP8, an Ghearmáin). Imdhíon-fhluaraiseacht Rinneadh na cealla a ionaclú ar miasa Petri ar bhonn gloine agus socraíodh iad le paraformaildéad. Tar éis blocála, goradh na cealla thar oíche le hantasubstaint phríomhúil, agus ansin goraíodh iad le hantasubstaint thánaisteach ar feadh 90 nóiméad sa dorchadas. Baineadh úsáid as an micreascóp comhfhócasach scanadh léasair (Leica SP8, an Ghearmáin) de na cealla tar éis na núicléis a ruaimniú le DAPI (1 ug/mL). I measc na n-antasubstaintí príomhúla bhí P62 (1:200; Abcam ab205719), LAMP1 (1:200; Santa Cruz Biteicneolaíocht H4A3), LC3B (1:200; Sigma-Aldrich L7543); áiríodh ar antasubstaintí tánaisteacha frith-luiche frith-luiche dara Cy{3-IgG frith-luiche gabhar Affinipure comhchuingeach (H + L) (1:200; Proteintech SA00009-1), CoraLite488-gabhar Affinipure comhchuingeach frith-luch IgG (H + L) (1:200; Proteintech SA00013-1), CoraLite594- comhchuingeach Affinipure gabhar frith-choine IgG (H + L) (1:200; Proteintech SA{{144) }}). Maidir le LysoTracker (Beyotime, Shanghai, CHN, C1046), rinneamar na cealla a ionaclú ar miasa Petri ar bhonn gloine freisin. Tar éis fás go dlús oiriúnach, cuireadh sreabhán saothraithe cille ina raibh tiúchan deiridh LysoTracker de 75 nM leis na cealla, ar tógadh grianghraf díobh tar éis 45 m de spreagadh. Úsáid ImageJ chun líon na poncanna fluaraiseacha agus comhéifeacht comhghaolaithe Pearson a chomhaireamh. Breathnú ar mhicreascóp leictreon Tarchuir Ó gach grúpa, roghnaíodh lucha fireann 3 seachtaine Sidt2-/ - agus WT go randamach chun samplaí micreascóp leictreon den fhíochán duáin a ullmhú, agus tá an modh sonrach mar a thuairiscítear níos luaithe [48] , a ghlacadh go randamach pictiúir de na hailt ag baint úsáide as micreascóp leictreon, tá níos mó ná 10 pictiúir a tógadh ó rannóga duáin do gach luch, roghnaigh randamach 3-5 pictiúir de 8000 × formhéadú ó na pictiúir micreascóp leictreon de gach luch, ríomh líon na n-uathphagolysosomes sa phictiúr, agus cuir an grúpa Sidt2−/− i gcomparáid leis an ngrúpa WT. Maidir le samplaí micreascóip leictreon cille a ullmhú, scríob nach lú ná 105 ceall le scraper cille agus cruinnigh iad i bhfeadán EP, ansin lártheifneoir ag 800 rpm/nóim ar feadh 5 m, caith an comhshnáthán agus líon isteach leis an fostóir leictreon-mhicreascóp é. Tar éis é a stóráil i gcuisneoir 4 céim ar feadh níos mó ná 1 h, is féidir é a chur isteach le haghaidh iniúchta. Ghlac KingMed Diagnostics (Guangzhou, an tSín) an lámhaigh micreascóp leictreon. LysoSensor Rinneadh na cealla a ionaclú ar 96-phláta tobair. Tar éis fás go dtí dlús oiriúnach, cuireadh meán réamhthéite (37 céim ) leis ina raibh 1 µM LysoSensorDND-160® (Thermo Fisher L7545). Goradh na cealla ar feadh 5 nóiméad ag 37 céim , agus ansin baineadh an meán agus cuireadh in ionad é tar éis na cealla a ní trí huaire le PBS. Baineadh úsáid as modh WellScan chun an pláta i BioTek Citation 5 (BioTek, Winooski, VT, USA) a léamh. Tomhaiseadh fluaraiseacht ag baint úsáide as tonnfhaid excitation/astaithe Ex360nm/Em450nm agus Ex380nm/Em540nm, agus socraíodh an pH líseasóim ón gcóimheas idir Em540 agus Em450. Anailís staidrimh Cuireadh na torthaí in iúl mar mheán ± SEM. Rinneadh comparáid staitistiúil idir dhá ghrúpa trí úsáid a bhaint as t-thástálacha neamhphéireáilte. Nuair a úsáideadh bogearraí Graphics 8.0 le haghaidh anailís staitistiúil, measadh go raibh P < 0.05 suntasach go staitistiúil. Rinneadh gach grúpa turgnaimh sa staidéar seo arís ar a laghad trí huaire go neamhspleách. FÁILTEACHT SONRAÍ Tá na tacair sonraí a ghintear agus/nó a ndearnadh anailís orthu le linn an staidéir reatha ar fáil ón údar comhfhreagrach ar iarratas réasúnach.
TAGAIRTÍ
1. Settembre C, Fraldi A, Medina DL, Ballabio A. Comharthaí ón lysosome: ionad rialaithe le haghaidh imréiteach ceallacha agus meitibileacht fuinnimh. Nat Rev Mol Cell Biol. 2013; 14:283–96.
2. Lamming DW, Bar-Peled L. Lysosome: An mol comharthaíochta meitibileach. Trácht. 2019; 20:27-38.
3. Ballabio A. An lysosome uamhnach. EMBO Mol Med. 2016; 8:73–76.
4. Yamamoto T, Takabatake Y, Takahashi A, Kimura T, Namba T, Matsuda J, et al. Cuireann mífheidhmiú líseasómach a chothaítear ar aiste bia ard-saille agus flosc uathphagach lagaithe le lipotocsaineacht sna duáin. J Am Soc Nephrol. 2017; 28: 1534-51.
5. Nonclercq D, Wrona S, Toubeau G, Zanen J, Heuson-Stiennon JA, Schaudies RP, et al. Gortú tubular agus athghiniúint sa duán francach tar éis nochtadh géar do gentamicin: staidéar ar chúrsa ama. Ren Fail. 1992; 14:507–21.
Seirbhís Tacaíochta Wecistanche-An t-onnmhaireoir cistanche is mó sa tSín:
Ríomhphost:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Teil:+86 15292862950
Siopa Le haghaidh Sonraí Breise:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
