Micreascópacht Seolta ian a Scanadh ar Glomerulus Daonna Beo

Tuilleadh eolais:ali.ma@wecistanche.com

Ruslan Bohovyk1,2|Mykhailo Fedoriuk1,2|Elena Isaeva1,2|Andrew Shevchuk3|Oleg Palygin1|Alexander Staruschenko 1,4

1An Roinn Fiseolaíochta, Coláiste Leighis Wisconsin, Milwaukee, WI, USA2An Roinn um Membraneolaíocht Cheallach, Institiúid Fiseolaíochta Bogomoletz, Kyiv, An Úcráin3Roinn an Leighis, Imperial College London, London, UK4Clement J. Zablocki VA Ionad Leighis, Milwaukee, WI, SAM

ComhfhreagrasAlexander Staruschenko agus Ruslan Bohovyk, Roinn na Fiseolaíochta, Coláiste Leighis Wisconsin, 8701 Watertown Plank Road, Milwaukee, WI 53226, USA.Emails: staruschenko@mcw.edu; rbogovik@gmail.com

Faisnéis mhaoinithe An Roinn Gnóthaí Tréidliachta, Uimhir Deontais/Dámhachtana: I01 BX004024; Institiúid Náisiúnta Croí, Scamhóige agus Fola, Uimhir Deontais/Dámhachtana: P01 HL116264 agus R35 HL135749; Cumann Fiseolaíochta Mheiriceá, Uimhir Deontais/Dámhachtana: Dámhachtain Feabhsaithe Gairme Taighde; An Institiúid Náisiúnta um Diaibéiteas agus Díleácha agusDuánTinneas, Uimhir Deontais/Dámhachtana: DK126720

Teibí

Is sainmharc é damáiste podocyte de ghalair glomerular, mar glomerulosclerosis deighleogach fócasach, a bhaineann go hiondúil le albaminuria marcáilte agus dul chun cinn na paiteolaíochta duánach. Tá neamhghnáchaíochtaí agus caillteanais struchtúracha podocyte nasctha freisin le galar athraithe íosta agus níos coitiantagalar duáin diaibéitis. Anseo chuireamar an teicníc maidir le micreascópacht seoltachta iain (SICM) i bhfeidhm den chéad uair chun an duine úr-aonraithe a mheas.glomerulustopology. Soláthraíonn SICM deis uathúil chun meastóireacht a dhéanamhglomeruluspodocytes chomh maith le deighleoga struchtúracha nephron eile le taifeach leictreon micreascópachta ach i samplaí beo. Taispeántar anseo cur i bhfeidhm an mhodha SICM sa duine beoglomerulus, a sholáthraíonn cruthúnas prionsabal le haghaidh anailís dhinimiciúil sa todhchaí ar mhoirfeolaíocht membrane agus paraiméadair fheidhmiúla éagsúla i gcealla beo.

Cliceáil chun fo-iarsmaí cistanche agus Cistanche le haghaidh galar duáin

1. RÉAMHRÁ

GlomerulusLéiríonn sé tuft de ribeadáin atá suite ag an gcuid iontrála den néaróin, áit a bhfuil an fhuil scagtha go roghnach ar fud an bhacainn scagacháin glomerular comhdhéanta de chealla endothelial, membrane íoslach glomerular, agus podocytes. Tá próisis phríomhúla agus tánaisteacha podocytes in aice láimhe fite fuaite, rud a chruthaíonn scairt scoilte a chlúdaíonn go docht le ribeadáin glomeruli. Tá moirfeolaíocht chasta ag an scairt seo agus is é an bac deiridh ar scagachán fola a chuireann le roghnaíocht mhéide agus a cheadaíonn tréscaoilteacht do mhóilíní níos lú ná an albaimin. Tuairiscíodh laghdú ar líon na podocyte agus ar éifeachtúlacht próisis chos i glomerulosclerosis deighleogach fócasach, galar athraithe íosta, agus nephropathy diaibéitis.1-3 Thairis sin, is féidir caillteanas podocytes agus modhnú a n-ailtireachta a bheith le feiceáil ag céimeanna an-luath deduángalair a d'fhéadfadh a bheith mar bhonn agus níos measa dá ndul chun cinn. Tá íomháú ardtaifigh ar mhoirfeolaíocht na gceall ag éirí ina huirlis riachtanach agus úsáideach chun staidéar a dhéanamh ar struchtúir cheallacha agus ar an ról a imríonn siad i bhfeidhm na gceall agus dul chun cinn galair.4 Is modh a úsáidtear go forleathan é micreascópacht leictreoin (SEM) chun staidéir den sórt sin a dhéanamh. Mar sin féin, éilíonn sé nósanna imeachta casta iolracha le haghaidh ullmhú samplaí, rud a fhágann go bhfuil sé dodhéanta anailís a dhéanamh ar shampla beo.5 Mar sin, tá géarghá le huirlisí nua a fhorbairt chun staidéar a dhéanamh ar athruithe ar mhoirfeolaíocht podocyte i samplaí beo. Teicníc is ea modh Taiscéalaí Hopping um Mhicreascóip Seolta ian a Scanadh (SICM) a chumasaíonn íomháú ardtaifigh, neamhoptúil ar dhromchlaí cille beo le moirfeolaíocht choimpléascach.6-8Is é an buntáiste is mó a bhaineann leis an modh seo ná go bhfuil sé gar do roinnt nanaiméadar taifeach spásúil agus raon fada Z (ingearach), ar féidir a chur i bhfeidhm ar shamplaí beo le moirfeolaíocht convoluted faoi choinníollacha fiseolaíocha ábhartha. Is teicníc íomháithe ilmhódach é SICM is féidir a chomhcheangal le teicnící bunaithe eile, anailís chomhthráthach agus dhinimiciúil ar mhoirfeolaíocht membrane, agus paraiméadair fheidhmiúla éagsúla, mar shampla toirt cille, féidearthachtaí membrane, sruthanna ian-chainéil aonair, agus fiú dinimic na coimpléisc próitéine membrane. i gcealla beo.9-11 Anseo, soláthraímid sampla de chur i bhfeidhm SICM chun anailís a dhéanamh ar mhoirfeolaíocht an duine bheoglomerulusstruchtúr.

Comharthaí galar cistanche-duáin

2. ÁBHAR AGUS MODHANNA

Don turgnamh, d'úsáideamar cuid den limistéar cortical ón duine trasphlandúcháin a cuireadh i leataobhduána dheighilt agus a stóráil i dtuaslagán caomhnaithe Wisconsin agus ina dhiaidh sin gor i dtuaslagán salanda fiseolaíoch ocsaiginithe (PSS).12 Rinneadh glomeruli duánach a leithlisiú trí úsáid a bhaint as teicníc vibrodissociation mar a thuairiscítear roimhe seo.13 Ligeann an cur chuige seo glomeruli duánach dea-chaomhnaithe a leithlisiú ón duine.duáin. Chun íomháú SICM a dhéanamh, duine úr scoiteglomerulusceangailte le dromchla gloine polai-L-lísín a cuireadh isteach sa seomra cille líonadh le tuaslagán PSS. Suiteáladh samplaí de láimh sna treoracha xy faoi mhicreascóp optúil inbhéartaithe Nikon TE2000-U (Nikon Instruments). Le haghaidh an taiscéalaí hopping, úsáideadh nanaipipéad gloine borosilicate íomháithe SICM le friotaíocht de thart ar 100 MΩ, a fhreagraíonn do thrastomhas barr measta timpeall 120 nm. Tarraingíodh nanaipipéid leis an lasadh cothrománach/tarraingt den chineál donn P-97 (Sutter Instruments, Novato, CA). Líonadh na nanaipipéid leis an tuaslagán PSS céanna a úsáideadh don dabhach agus cuireadh iad sa treo z le actuator piezoelectric. Tomhaiseadh an sruth ian a bhí ag sileadh trí na nanaipipéid le aimplitheoir paiste-clamp Axopatch 700B (Axon Instruments) i mód clampála voltais agus rinne an rialaitheoir uilíoch sainmhodhnaithe (ICAPPIC Ltd, RA) monatóireacht air, a rialaíonn suíomh samplaí agus pípéad ag an am céanna. 6 Rinneadh na turgnaimh go léir ag teocht an tseomra (20-22 céim ). Le haghaidh íomháithe struchtúir casta convoluted, mar shampla próisis chos podocytes saglomerulus, d'úsáideamar modh backstep/hopping SICM is infheidhme chun topagrafaíocht na gceall beo le taifeach ard a íomháú.6,14 Is éard atá i gcéim amháin an phrionsabail hopping ná teagmhas nuair a dhéantar an sruth tagartha a thomhas tríd an nanaipéad a shuíomh go maith os cionn an sampla. Ansin, téann an nanaipipéad feadh na hais z go dtí an dromchla samplach go dtí go dtiteann an leibhéal sruth tomhaiste go dtí an pointe socraithe réamhshocraithe a fhreagraíonn do ~ 1.0 faoin gcéad -1.2 faoin gcéad den sruth tagartha. Ag an nóiméad seo, cuirtear deireadh leis an gcur chuige, déantar comhordanáidí XYZ na n-actuators piezo XY agus Z a thaifeadadh mar chomhordanáid an dromchla samplach don chéad phointe íomháithe, agus tarraingítear siar an pípéad ar shiúl ón dromchla. Athdhéantar an nós imeachta seo ansin ag gach pointe íomháithe aonair feadh an xy-ais arna chinneadh ag réiteach réamhshocraithe agus raon achair scanadh. I gcás Fíor 1B, b'ionann raon scanadh agus réitigh íomhá 30 µm × 30 µm agus 512 px × 512 px, agus i bhFíor 1C bhí 5 µm × 5 µm agus 480 px × 480 px, faoi seach. Rinneadh sonraí topagrafaíochta amh SICM agus iarphróiseáil íomhánna ag baint úsáide as bogearraí anailíse micreascópachta SICM ImageViewer (ICAPPIC Ltd, RA).

FIGIÚR 1 Cur i bhfeidhm íomháú Micreascóip Seolta ian a Scanadh. A, Duine úr scoiteglomerulusceangailte leis an dromchla gloine poly-Llysine. Taispeántar ar thaobh na láimhe clé micripipéad ag druidim le dromchla an glomerulus chun íomháú SICM a dhéanamh. B, Sampla de chomhpháirteanna bacainn scagacháin glomerulus, lena n-áirítear soithí clúdaithe podocyte agus coise, arna léiriú ag SICM. 45 min le haghaidh scanadh achar iomlán (30 × 30 µm, taifeach 512 × 512 picteilín; athruithe z-ais 15 µm). C, Radharc méadaithe ar ailtireacht próisis coise tánaisteacha podocyte daonna arna nochtadh ag SICM ardtaifigh. 12 min le haghaidh scanadh achar iomlán (taifeach 5 × 5 µm, taifeach 480 × 480 picteilín; athraíonn z-ais 3 µm). Taispeántar barraí scála

3. TORTHAÍ AGUS PLÉ

Tá cáilíocht íomhá SICM inchomparáide le SEM agus ceadaíonn sé scrúdú beacht arglomerulusstruchtúr dromchla, lena n-áirítear soithigh fola agus podocytes, agus ailtireacht na bpróiseas tánaisteach coise.4 In ár staidéar roimhe seo, d'úsáideamar íomháú SICM chun meastachán a dhéanamh ar na hathruithe struchtúracha paiteolaíocha i bpróisis chos podocyte i bhfrancaigh nephropathy diaibéitis cineál 2 (T2DN).15 Táimid rinne sé anailís chomparáideach ar ailtireacht tríthoiseach an bhacainn scagacháin podocyte i bhfrancaigh neamh-diaibéitis agus T2DN. Nocht ár sonraí caillteanas suntasach de phróisis coise podocyte i glomeruli T2DN ag soláthar meastóireacht chruinn ar athruithe histeapaiteolaíocha a tharla i nephropathy diaibéitis atá mar bhunús le nephrinuria agus albaminuria sna francaigh seo.15 Anseo, don chéad uair, léirigh muid cur chuige rathúil i measúnú na dtrí - struchtúr dromchla tríthoiseach glomerulus daonna beo atá scoite amach go húr. Is struchtúir sféarúla iad glomeruli duánach daonna le trastomhas timpeall 300 µm16; mar sin, caithfidh barr an phípéad druidim go cúramach le barr an réigiúin leasa. Tá raon scanóir xy-ais 25 µm z agus 30 × 30 µm ag ár socrú SICM, rud a chuir ar ár gcumas íomhá ardtaifigh a fháil den chuid mhór denglomerulusdromchla. Braitheann an t-am fála go mór ar an raon scanadh, ar an réiteach, agus ar mhéid tip leictreoid hopping. Le haghaidh íomháú cille beo i struchtúir chasta cosúil le glomerulus úrscoite, athraíonn an t-am scanadh ó 10 go 50 nóiméad in aghaidh an fhráma (féach an finscéal Fíor le haghaidh tuilleadh sonraí). D’fhéadfadh go n-eascródh déantúsáin íomháithe a léirítear mar aistrithe cothrománacha agus ingearacha idir na timthriallta athshuite pípéad ionchais mar thoradh ar éifeacht charnach an ardtaifigh, an limistéar scanadh mór, agus luaineachtaí stoichastic i gcórais bheo. Tabhair faoi deara go bhféadfadh méadú ar an am fála agus ar dhéantáin íomháithe, cosúil le picteilíní dorcha nó olc, i gcéimseataí casta leis na hathruithe tobanna ar na láithreacha dromchla. Léiríonn íomhá topagrafaíochta SICM (Fíor 1A) ribeadáin glomerular clúdaithe ag próisis chos podocyte príomhúla agus tánaisteacha atá le feiceáil go soiléir. Ceadaíonn SICM íomhánna samplacha a fháil le raonta scanadh éagsúla sa scála nanaiméadar, ag coinneáil leibhéal réitigh leordhóthanach.17 Léiríonn Fíor 1B ailtireacht na bpróiseas coise tánaisteacha podocyte daonna arna nochtadh ag SICM ardtaifigh. Is féidir anailís bhreise ar íomhánna topagrafaíochta den sórt sin a úsáid chun staidéar a dhéanamh ar athruithe moirfeolaíocha ar phróisis coise podocyte faoi choinníollacha paiteolaíocha agus mar fhreagra ar iarratais éagsúla drugaí.

Cur i bhfeidhm na teicníochta SICM chun imscrúdú a dhéanamh ar struchtúr dromchla tríthoiseach na samplaí fíocháin bhoga, lena n-áirítearglomerulusagus cealla podocyte, a tugadh isteach ar dtús ag Nakajima et al4. Na húdair a úsáidtearduánslices chun an teicníc seo a chur i gcomparáid le SEM traidisiúnta. Anseo, leathnaíomar na staidéir seo chun glomerulus daonna a chónaí. Agus an cur chuige seo á úsáid againn, nocht muid an poitéinseal iontach atá ag teicníc SICM chun scrúdú tapa iontaofa a dhéanamh ar anglomerulusbac scagacháin. Ceann de na buntáistí móra a bhaineann le SICM (chomh maith le samplaí beo a úsáid) ná nach dteastaíonn nósanna imeachta il-shamplaí ullmhaithe a theastaíonn go hiondúil le haghaidh íomháú micreascóip EM, lena n-áirítear réiteach díhiodráitithe agus fosaithe. Dá bhrí sin, ceadaíonn SICM crapadh samplaí a breathnaíodh le EM a sheachaint, rud a d’fhéadfadh toisí iarbhír míthreoracha a bheith mar thoradh air. Is é an rud is tábhachtaí ná go gceadaíonn SICM fíor-ama ar glomeruli úr-aonraithe tástáil a dhéanamh ar dhinimic ghluaiseacht na bpróiseas coise mar fhreagra ar an nochtadh géar do dhrugaí spéise. Ar deireadh, is féidir an pípéad SICM a úsáid chun taifeadtaí paiste-clamp a dhéanamh de shruthanna aon chainéil.18Chun na críche sin, tar éis an léarscáil topagrafaíochta a atógáil, cheadaigh na bogearraí fála (ICAPPIC Ltd, RA) coscán rialaithe den ghloine SICM. taiscéalaí hopping ar dhromchla an tseomra, laghdú ar fhriotaíocht mhicrileictreoid do na coinníollacha paiste-clamp (7 go 12 MΩ) agus é a dhéanamh oiriúnach don taifeadadh aon-chainéil sa turgnamh céanna. Ceadaíonn an SICM suíomh cruinn an leictreoid paiste-clamp a roghnú ar an dromchla cille bunaithe ar shonraí topagrafacha trí chur chuige ingearach dea-rialaithe le cruinneas nanaiméadar, agus mar thoradh air sin cruthaítear gigaseal teagmhála go héasca leis an membrane ceallacha ar a dtugtar Smart Patch.19

Go hachomair, tá poitéinseal iontach ag an modh a bhfuil cur síos air anseo chun staidéar a dhéanamh ar glomeruli agus ar dheighleoga nephron úr-aonraithe eile. Ina theannta sin, léiríonn sé gur féidir úsáid a bhaint as daonnaduánsamplaí gan ullmhú ilchasta chun athruithe moirfeolaíocha sa staidéar ar phaiteolaíochtaí a mheas.

Cistanche le haghaidh galar duáin

BUÍOCHAS

Mhaoinigh an Roinn Gnóthaí Tréidliachta I01 BX004024, an Institiúid Náisiúnta Croí, Scamhóige agus Fola R35 HL135749 agus P01 HL116264, an Institiúid Náisiúnta um Dhiaibéiteas agus Díleácha taighde taighde i saotharlann na n-údar.DuánGalair R01 DK126720, agus Gradam Feabhsaithe Gairme Taighde Chumann Fiseolaíochta Mheiriceá.

COIMHLINT LEASA

Is scairshealbhóir é an Dr. Andrew Shevchuk agus faigheann sé na táillí comhairliúcháin ó ICAPPIC Ltd.

RANNÍOCAÍOCHTAÍ AN ÚDAR

Ruslan Bohovyk: Coincheapú (comhionann); Coimeád sonraí (luaidhe); Anailís fhoirmiúil (luaidhe); Scríbhneoireacht-bunaidh dréacht (ionann); Scríbhneoireacht-athbhreithniú & eagarthóireacht (comhionann). Mykhailo Fedoriuk: Coimeád sonraí (ag tacú); Anailís fhoirmiúil (ag tacú); Scríbhneoireacht-athbhreithniú & eagarthóireacht (comhionann). Elena Isaeva: Coincheapú (ag tacú); Coimeád sonraí (ag tacú); Anailís fhoirmiúil (ag tacú); Scríbhneoireacht-bunaidh dréacht (tacaíocht); Scríbhneoireacht-athbhreithniú & eagarthóireacht (comhionann). Andrew Shevchuk: Coincheapú (ag tacú); Bogearraí (tacaíochta); Bundréacht a scríobh (ag tacú); Scríbhneoireacht-athbhreithniú & eagarthóireacht (comhionann). Oleg Palygin: Coincheapú (comhionann); Anailís fhoirmiúil (ag tacú); Modheolaíocht (tacaíochta); Riarachán tionscadail (tacaíocht); Scríbhneoireacht-bunaidh dréacht (tacúil); Scríbhneoireacht-athbhreithniú & eagarthóireacht (comhionann). Alexander Staruschenko: Coincheapú (luaidhe); Riarachán tionscadail (luaidhe); Acmhainní (luaidhe); Maoirseacht (luaidhe); Scríbhneoireacht-bunaidh dréacht (ionann); Scríbhneoireacht-athbhreithniú & eagarthóireacht (comhionann).

RÁITEAS AR FÁILTEACHT SONRAÍ

Tá na sonraí a thacaíonn le torthaí an staidéir seo ar fáil ón údar comhfhreagrach arna iarraidh sin go réasúnach.