Comhthionól Tras-scríofa De Novo Bunaithe ar RNA-Seq agus Fionnachtain Géine As Cistanche Deserticola Fleshy Gas-Ⅱ

Aicmiú Feidhme Gach Tras-scríbhinní Léirithe Bunaithe Ar Ointeolaíocht Ghéin Agus Bunachair Shonraí KEGG

Fuarthas anótáil Géine Ontology (GO) ó chomhad comhlachais anótála agus aitheantais UniProt. San iomlán, sannadh 20,907 tras-scríbhinn, arbh ionann iad agus 32.69% den iomlán seichimh léirithe, do 1,745 téarma feidhme. As na téarmaí feidhme iomlána GO, ba iad na sannacháin don phróiseas bitheolaíoch an tromlach (1,116, 63.95%) agus ina dhiaidh sin comhpháirt cheallacha (329, 18.85%) agus feidhm mhóilíneach (300, 17.20%). Chlúdaigh feidhmeanna sannta na n-athscríbhinní sainráite raon leathan de chatagóirí GO, agus liostaíodh na 10 dtéarmaí GO barr leis na hathscríbhinní is mó anótáilte i dTábla 3. Soláthraímid dáileadh na n-athscríbhinní sainráite go léir i dtrí chatagóir Ontology Géine (Feidhm Mhóilíneach, Comhpháirt Cheallach, agus próiseas bitheolaíoch) sa chomhad forlíontach (Tacar Sonraí S3). Léiríodh téarmaí GO a bhaineann le feidhmeanna ceangailteacha agus gníomhaíocht transferase den chuid is mó sa chatagóir feidhm mhóilíneach. Maidir leis na feidhmeanna ceangailteacha, b'ionann an ceangal cation (4,394 tras-scríbhinn) is flúirseach, agus ina dhiaidh sin ceanglaíodh núicléatíd/núicléitíd (3,404 tras-scríbhinn ar an meán) agus ceangal próitéine (2,422 tras-scríbhinn). Cé go bhfuil siad sa ghrúpa gníomhaíochta transferase, is iad na cinn is mó a bhfuil grúpaí ina bhfuil fosfar aistrithe (2,256 tras-scríbhinn, 65.77%). I measc chatagóir na gcomhpháirteanna ceallacha, bhí tras-scríbhinní suite níos infhéitheach (10,581 tras-scríbhinn ar an meán), agus i measc an chatagóir próisis bhitheolaíoch, bhí baint níos mó ag tras-scríbhinní leis an bpróiseas meitibileach bithpholaiméir (6,683 tras-scríbhinn ar an meán), agus ina dhiaidh sin rialáil an phróisis cheallacha (4,841 tras-scríbhinní). ), léiriú géine (4,678 tras-scríbhinní) agus iompar (3,512 tras-scríbhinn).

TUBULOSA CISTANCHE NÁDÚRTHA CHUN GALAIR ALZHEIMER A CHOSAINT PHGS75% ECH 30% ACHT 12%

Chun géinte a mhianaigh a raibh baint acu le bithshintéis lignin agus PhG, rinneadh cuardach ar 21,358 seichimh phróitéin ionchasacha neamh-iomarcach i gcoinne seichimh ghéinte 13 orgánach plandaí i mbunachar sonraí KEGG, agus sannadh iad do 275 cosán KEGG le 5 amas ar a laghad. Tá na 10 cosán is fearr a bhfuil an chuid is mó de na sraitheanna ailínithe liostaithe i dTábla 4. Bhí baint ag an chuid is mó de na cosáin le próisis mheitibileach príomhúla, mar aimínaigéad nó meitibileacht próitéin (ko01230, ko04141, agus ko04120), meitibileacht carbaihiodráit (ko01200 agus ko00500), agus nucleotide nó meitibileacht nucleoside (ko03018, ko00230, agus ko00240). Thairis sin, tá 27 cosán tánaisteach a bhaineann le meitibileacht (Fíor 2), mar bithsintéis cnámh droma terpenoid, biosintéis feinilpropanoid, biosintéis carotenoid, biosintéis alcalóideach isoquinoline, agus biosintéis alcalóideach tropane, piperidine agus pyridine. Tugann na torthaí seo le fios go raibh próisis mheitibileacha ghníomhacha ar bun saC. deserticolafíochán gas. Liostaíodh na tras-scríbhinní sainráite go léir a bhaineann le conairí KEGG sa chomhad forlíontach (Tacar Sonraí S4). Cé go bhfuil roinnt bealaí athraithe go suntasach idir C. deserticola agus plandaí eile, mar rís(S5 Dataset), is é an príomhsprioc atá againn sa staidéar seo ná próifíl tras-sgrìobhaidh iomlán an ghais C. deserticola a nochtadh agus na conairí gaolmhara de bhithshintéis PhG a léiriú. a d'fhéadfadh a bheith úsáideach chun an saothrú a threorú.

Einsímí Ionchódaithe Géin Iarrthóra a Bhaineann le Bithshintéis Lignin

Is é Lignin an dara polaiméir talún nádúrtha is flúirseach sa ríocht plandaí, ag comhdhéanamh suas le trian den ábhar a fhaightear i gcillbhallaí plandaí. Mar chomhpháirt thábhachtach de bhallaí cille, cuidíonn lignins le hiompar uisce, soláthraíonn siad tacaíocht mheicniúil agus sláine struchtúrach, agus cosnaíonn siad i gcoinne pataiginí agus luibhiteoirí. Tá na róil sin de lignin an-luachmhar chun tacú le fás in airde faoi thalamh C. deserticola san fhásach. Sa staidéar seo, chuireamar i láthair an pictiúr iomlán de bhealaí biosintéise lignin i C. deserticola (Fíor 3), ina bhfuil na monaiméirí lignin biosynthesized ó feiniolalainín trí shraith imoibrithe einsímeacha, lena n-áirítear hiodrocsailiú, methylation, laghdú, agus próiseas polaiméiriú ocsaídiúcháin. Braitheadh ​​einsímí a bhaineann le biosintéis lignin do thrí fhoirm sintéise den chuid is mó i bhfíochán soithíoch (p-hiodrocsaile-feinil (H), guaiacyl (G) agus syringyl (S) lignin) agus 5-hiodrocsaile-guaiacyl lignin nár aithníodh ach amháin. i plandaí COMT (aigéad caiféin 3-O-methyltransferase, EC 2.1.1.68) easnamhach (cosúil le cnag anuas).

Is í amóinia-lyase feiniolalainín (PAL, EC 4.3.1.24) an chéad eochair-einsím i gcosán bithsintéise lignin (Fíor 3) a chlaochlaíonn feiniolalainín go haigéad cinnamach trí dhí-ocsaídiú neamh-ocsaídiúcháin. Cuireadh 6,297 léamh PAL in ord in ord agus cuireadh 7 dtras-scríbhinn PAL le chéile i C. deserticola (Tábla 5). Trí chomparáid cosúlachtaí seicheamh, fuaireamar amach go raibh cosúlachtaí níos mó ná 95% ag 4 acu (comp28550_c1_seq1/2/3/5) leis an seicheamh mRNA de C. deserticola (gi| 289595227|gb|ADD12041.1|), agus bhí cosúlachtaí 77% agus 82% faoi seach ag comp{22}}c1_seq4 agus comp25940_c0_seq1), faoi seach. Léirigh tuar ORF go raibh poitéinseal próitéiní ionchódaithe ag 5 scríbhinn agus iompraíodh iad le fearann ​​lyase aimínaigéad aramatach (PF00221.14). Ina measc, ní fhéadfadh ach an tras-scríbhinn comp28550_c1_seq4 seicheamh iomlán próitéine de 718 n-iarmhar aimínaigéad a ionchódú. Tuairiscíodh go raibh PAL ionchódaithe ag teaghlach multigene beag i bhformhór na speiceas plandaí, mar shampla 4 i Arabidopsis thaliana, 5 i Populus trichocarpa, 3 i Scutellaria baicalensis, agus 7 Cucumis sativus, etc. Mhol ár n-anailís phylogenetic go raibh 4 ann. géinte ionchódaithe PAL i C.

deserticola agus thugamar CdPAL1, CdPAL2, CdPAL3 agus CdPAL4 orthu, faoi seach (S2 Fíor). Is dhá einsím iad 4-coumate-CoA ligase (4CL, EC 6.2.1.12) agus tras-cinnamate 4-monooxygenase (CYP73A, EC 1.14.13.11) atá freagrach as aigéad cinnamic a athrú go dicoumarol-CoA in dhá chúl. orduithe. Tá siad ina gcnámh droma freisin, agus is é a luachanna FPKM slonn ná 39.57 agus 51.93, faoi seach.

Rinneadh na ceithre chineál lignins a bhithshintéisiú trí bhealaí éagsúla a bhí á rialú ag trí phríomheinsím, cinnamoyl-CoA reductase (CCR, EC 1.2.1.44), shikimate o-hydroxycinnamoyltransferase (HCT, EC 2.3.1.133), agus ferulate{{1{1} {56}}}hidrocsaile (F5H, CE 1.14.-.-). Tuairiscíodh CCR mar phointe rialaithe ar chonair na lignins [50, 51] a rinne catalú ar X-CoA (X lena n-áirítear dicoumarol, caffeoyl, feruloyl, 5-hiodrocsaile-feruloyl, agus sinapoyl) isteach i Y-aildéad (Y lena n-áirítear p. -cougar, caffeoyl, buaircíneach, 5-hiodrocsaile-buaircíneach, agus Léim), agus rinne HCT catalú ar p-coumaroyl-CoA go haigéad shícimiceach p-coumaroyl/p-coumaroyl quinic acid. Rialaigh an dá einsím, díreach cosúil le lasc, biosintéis lignins P-hiodrocsaile-feinile nó na trí chineál eile lignins. Ba lasc brainse eile é F5H a rialaíonn lignin syringile agus 5-hydroxyl-guaiacyl lignin. Einsímí tábhachtacha eile lena n-áirítear aigéad caffeic 3-O-methyltransferase (COMT, EC 2.1.1.68), caffeoyl-CoA O-methyltransferase (CCoAOMT, EC 2.1.1.104), agus cinnamyl-alcól dehydrogenase (CAD, EC 1.1.1.195 ) braitheadh ​​freisin sainráite. Tá faisnéis mhionsonraithe léirithe liostaithe i dTábla 6. Cuirfidh na géinte einsíme seo a aithníodh sa staidéar seo acmhainn luachmhar ar fáil do staidéir ghéanómacha feidhmiúla sa phlanda íocshláinte tábhachtach seo. Roghnaíodh 10 géin a bhaineann le cosán bithsintéise lignins i dTábla 6 le haghaidh fíorú RT-qPCR chun ár dtorthaí RNAseq (Fíor 4) a dhearbhú, agus léirigh a gcomhghaolta arda (comhéifeacht comhghaolaithe Pearson: 0.90343) ardchruinneas agus in-atáirgtheacht ár n-anailís transcriptome. Liostaíonn Tacar Sonraí S1 na seichimh primer a úsáidtear san anailís seo.

TUBULOSA CISTANCHE NÁDÚRTHA CHUN FEIDHM Gnéis A FHEABHSÚ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Einsímí Ionchódaithe Géin Iarrthóra a Bhaineann le Bithshintéis PhGanna

Is eol gurb iad gliocóisídí feinileatánóideach (PhGanna) na príomh-chomhábhair ghníomhacha i C. deserticola le gníomhaíochtaí chun cumas gnéasach a fheabhsú, fréamhacha saor in aisce a scavening, agus frith-aosú. Is iad trí chomhpháirt cheimiceacha de PhGanna aigéad orgánach, saccharide, agus aglycon feinileatánól (Fíor 3). Is táirgí de chonair biosintéise feinilpropanoid iad na haigéid orgánacha lena n-áirítear aigéad caiféin, aigéad ferulic, agus aigéad coumalic. Is iad na comhpháirteanna saccharide lena n-áirítear glúcóis agus rhamnose táirgí de chonairí meitibileachta carbaihiodráit, mar stáirse agus meitibileacht shiúcrós, aimín siúcra agus meitibileacht siúcra nucleotide, meitibileacht fruchtós agus mannose, etc. Mar sin féin, níl an cosán biosintéise de chuid feinileatánól soiléir fós. Anseo, mholamar dhá bhealach bithsintéise feinileatánóil bunaithe ar ár sonraí seichimh. Is é ceann amháin an cosán d'aigéad caiféin nó d'aigéad ferulic a thuairiscítear, ar a dtugtar freisin an cosán aigéad cinnamic atá cosúil le cosán cnámh droma biosintéise lignin. Tá ceann eile bunaithe ar chonair meitibileachta feiniolalainín (Fíor 3), inar baineadh amach an feiniolalainín go feinileatánól trí 'chonair Enrlich' ar a dtugtar a fuarthas den chéad uair i giosta céad bliain ó shin agus a bhailíochtaíodh i bláthanna petunia, trátaí, agus rós. Braitheadh ​​ceithre ghéin einsíme a ionchódaíonn aspartate/tyrosine aminotransferase, histidine-fosfáit aminotransferase, agus oxidase príomh-aimín atá freagrach as feiniolalainín a thiontú go feinileatánón, in iúl i gas C. deserticola. Is féidir táirge eatánóil feanile a ocsaídiú tuilleadh le monooxygenase nó a mheitiliú trí mheitilaistriúchán isteach ina dhíorthaigh (aglycon eatánól feinile) a ghlacann páirt i mbithshintéis PhG. Go hachomair, moladh dhá bhealach bithshintéise tuartha d'aglycon feinileatánólC. deserticolaach teastaíonn tuilleadh staidéir amach anseo.

Cainteanna

Le blianta beaga anuas, tá géanóm plandaí forbartha go tapa le cur i bhfeidhm na teicneolaíochta seicheamhaithe den chéad ghlúin eile, agus is beag taighde a díríodh ar ghéanómaíocht phlandaí íocshláinte fásaigh. Is gá go práinneach taighde géanómach nó tras-traipeolaíoch a dhéanamh chun tuiscint a fháil ar a oiriúnú do thriomach agus do thimpeallachtaí salandachta agus ar chonair bhithshintéise na bpríomh-chomhpháirteanna bithghníomhacha. Fionnachtain trascríobh de novo do roinnt gléasraí leighis,

mar shampla Panax ginseng, Ginkgo biloba, agus Glycyrrhiza uralensis baineadh úsáid as an ardán Roche 454 den chéad uair dá fhad léite. Mar gheall ar an gcumas éifeachtach cóimeála le léamha gearra, go háirithe na léamha péireáilte buntáisteacha, baineadh úsáid fhorleathan as seicheamhú agus cóimeáil tras-scríbhinní bunaithe ar Illumina d'orgánaigh mhúnla agus neamhmhúnla. Sa staidéar reatha, ghineamar thart ar 8G de 101 bp léite deiridh péireáilte agus tháirgeamar seichimh unigéin níos faide le meánfhad 725 bp. D'fhéadfadh sonraí tras-scála a bhaineann go sonrach le gas sonraí tagartha úsáideacha a sholáthar agus d'fhéadfaí iad a úsáid chun meitibileacht thánaisteach na gcomhpháirteanna bithghníomhacha de C. deserticola a mhianadóireacht. D'éirigh le 81.62% de na léamha amh iomlána scagairí cáilíochta déine (lena n-áirítear bearradh cuibheora agus aischur léithe ar chaighdeán íseal) roimh thionól, rud a thugann le tuiscint go bhfuil ardchaighdeán ár sonraí seicheamhaithe, agus bhí 82.08% de na léitheanna ardcháilíochta úsáideach le haghaidh cóimeála. Seans gur earráidí seicheamhaithe, paraiméadair tionóil et al. Bhí na léitheanna ardcháilíochta sin nár úsáideadh fós ina gcuidiú le feabhas a chur ar thionól de novo mar aon le léamha níos faide ó ardán eile (cosúil le Roche 454) amach anseo.

TUBULOSA CISTANCHE NÁDÚRTHA CHUN FEIDHM Gnéis A FHEABHSÚ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Léirigh líon mór tras-scríbhinní comhchruinnithe (30,098) cosúlachtaí seicheamh ard le géinte aitheanta i mbunachair shonraí poiblí, rud a thugann le tuiscint gur chlúdaigh ár sonraí péireáilte bunaithe ar Illumina codán suntasach de na tras-scríbhinní de C. deserticola. D’fhéadfadh tras-scríbhinní gan aon amas BLAST bheith mar gheall ar 3’ nó 5’ réigiún neamhaistrithe, RNA neamhchódaithe, nó seichimh ghéinte nua C. deserticola. Rinneadh nótaí ar na tras-scríbhinní sainráite do raon leathan de chatagóirí GO agus de bhealaí KEGG (Táblaí 3 agus 4), inar sannadh go leor tras-scríbhinní do bhealaí tánaisteacha a bhaineann le meitibileacht. Mar is eol dúinn, is féidir le phenylpropanoid feidhmiú mar chomhdhúil frithmhiocróbach inducible le salutary iontach do stíl mhaireachtála faoi thalamh [1], agus gníomhú freisin mar mhóilín comhartha in idirghníomhaíochtaí plandaí-miocrób seachas a fóntais íocshláinte [68, 69]. Úsáidtear terpenoid le haghaidh biosintéise de chomhpháirteanna bithghníomhacha (cosúil le 6- deoxycatalpol) [70]. Fuaireamar amach go raibh na géinte a bhí bainteach leis an gcosán biosintéise cnámh droma feinilpropanoid agus terpenoid an-fhlúirseach i C. deserticola. Níos tábhachtaí fós, léirigh fionnachtain conairí dea-léirithe de bhithshintéis lignin (Fíor 3) próiseas meitibileach gníomhach lignin i ngas C. deserticola. Braitheadh ​​​​na géinte einsíme go léir a bhfuil baint acu le biosintéis lignin (Fíor 3) in iúl, agus bhí flúirse cainte níos ísle ag ceithre phríomh-einsím lena n-áirítear PAL, CCR, HCT, agus F5H (FPKM 26.47, 3.89, 3.4, agus 3.83, faoi seach) i gcomparáid le géinte einsímí eile (Tábla 6). Is fiú staidéar breise a dhéanamh ar cibé acu an bhféadfadh nó nach bhféadfadh athrú slonn na dtrí ghéinte sin tionchar a imirt ar tháirgeadh lignin i C. deserticola. Is príomh-einsím é PAL i biosintéis lignin agus tá baint aige freisin le biosintéis feinilpropanoid, resveratrol, flavonoid, agus coumarin [71-74]. Braitheadh ​​​​muid ceithre ghéinte PAL ar leith sa genome C. deserticola (S2 Fig) a bhí comhthráthach leis an PAL sin a bhí ionchódaithe ag teaghlach il-ghéine beag [39, 43, 45-49] agus cruthaíodh tuilleadh go bhféadfadh sé ról tábhachtach a imirt i flosc carbóin meitibileach. .

Is é PhG an príomh-chomhábhar gníomhach i C. deserticola. Tá na géinte a bhfuil baint acu le bithshintéis feinileatánóil tábhachtach do cháilíocht C. deserticola. Rinneamar dhá bhealach bithshintéise éagsúla d'eatánól feinile agus 17 ngéinte einsíme a bhfuil baint acu le bithshintéis PhG i ngas C. deserticola a asbhaint. Asbhaineadh na próisis iar-chaiféic/aigéad feiriúil (Fíor 3) freisin den chéad uair bunaithe ar fhoirmle struchtúrach d'idirmheánacha agus d'airíonna catalacha na n-einsímí comhfhreagracha, ina ndéanfaí an t-aigéad caiféin/fheiriúil a ocsaídiú den chéad uair i ndíorthaigh feinilpiriúváit; ansin, díothaíodh an grúpa carboxyl de bharr decarboxylase; Ar deireadh, rinneadh grúpa aildéid a thiontú ar ais go grúpa alcóil trí dhíhidrogenase. Is é seo an chéad chur i bhfeidhm de theicneolaíocht seicheamhú péireáilte Illumina chun tras-scríbhinn iomlán C. deserticola a imscrúdú agus chun léann RNA-seq a chur le chéile gan géanóm tagartha. Soláthróidh an staidéar seo acmhainní úsáideacha agus seichimh ghéinte do thaighde géanóm feidhme agus próitéamaíocht ar C. deserticola sa todhchaí.

Conclúidí

Sa staidéar seo, rinneamar próifíl ar transcriptome gas C. deserticola bunaithe ar shonraí seicheamhaithe ard-tréchur, aithníodh géinte a bhfuil baint acu le conairí bithsintéise lignin, agus tátal againn freisin conair ionchasach bithshintéise PhGanna, rud a luathóidh an tuiscint go cinnte. de na próisis fiseolaíocha débhríoch agus an luach míochaine iontach sa leibhéal móilíneach. Go dtí seo, is é seo an chéad iarracht de novo an tras-scríbhinn iomlán de ghas deserticola C. a chur le chéile agus chun conair biosintéise na gcomhpháirteanna míochaine a bhrath ag baint úsáide as tacair sonraí seicheamhaithe bunaithe ar Illumina. Féadfaidh ár staidéar forbairt leigheasanna nádúrtha agus roghnú cultivars le tréithe míochaine a chur chun cinn.

TUBULOSA CISTANCHE NÁDÚRTHA CHUN FEIDHM Gnéis A FHEABHSÚ PHGS75% ECH 30% ACT 12%