le haghaidh tuilleadh eolais:ali.ma@wecistanche.com

Cuid: II Léirithe Duánacha agus Breise Duánacha in Éisc Riabhacha do Dhaoine Fásta Samhail Chistinóis

2.3.5. Ctns−/− Tiús Méadaithe na Coirne i Láthair na Séabra

Cistinosistionchar ar na súile mar thoradh ar carnadh cistine i fíocháin éagsúla, mar shampla an inteachán, conjunctiva, agus epithelium reitineach, áfach, is é an cornea an chuid is mó tionchar mar gheall ar carnadh cystine [19] agus cuireann tiús méadaithe [20]. Ag baint úsáide as staining H&E, thugamar faoi deara gur léirigh ctns - / - séabrafish tiús méadaithe de chiseal stromal na coirne i gcomparáid le séabrafish de chineál fiáin (Fíor10A, B, E). Mar sin féin, níor nocht muid neamhghnáchaíochtaí dealraitheacha san epithelium reitineach de ctns-/ - séabrafish (Fíor 10C, D).

Fíor 9. Meánluas snámha i gcineál fiáin agus ctns-/-iasc séabra. Laghdaítear an meánluas i ctns-/-riabhach i gcomparáid le cineál fiáin sa dá inscne. Déantar an meánluas snámha a thomhas i bpicteil/soicind. Seasann gach ponc do shíobróis amháin, le haghaidh iomlán de n=6 cineál fiáin agus n=6 ctns−/−18-mí séabraimis. ANOVA débhealaigh a bhfuil an tástáil difríochta is lú suntasaí (PLSD) ag Fisher: ** p <>

Fíor 10. Histeolaíocht súl i gcineál fiáin agus ctns−/− séabra. (A, B) Íomhánna ionadaíocha den choirne de chineál fiáin (A) agus ctns -/ - (B) 18- séabra éisc de mhí d'aois. Ciseal stromal na coirne (cinn saighde dubh agus línte dubha). staining H&E. Is ionann na barraí scála agus 50 µm. (C,D) Íomhánna ionadaíocha den reitine de shíobróis de chineál fiáin (A) agus ctns-/ - (B). staining H&E. Is ionann na barraí scála agus 50 µm. (E) Cainníochtú coibhneasta ar thiús ciseal stromal na coirne. Léiríonn gach ponc aon fhicsean amháin de thiús ciseal stromal na coirne. T-tástáil gan péire agus ceartúchán Welch, dhá eireaball: * p <>

2.3.6. Ctns−/− Feinitíopaí Riabhacha breise

I dteannta leis na feinitíopaí a luaitear thuas, rinneamar anailís histeolaíoch ar an inchinn agus ar an éagsúlacht gan difríochtaí idir na cineálacha agus an cineál séabra fiáin a aimsiú. Ina theannta sin, rinneamar measúnú ar fhad coirp agus meáchan ctns-/- agus séabra iasc fiáin de chineál ag 18 mí agus d'aimsigh muid méadú ar mheáchan coirp -/-séabra-éisc agus fuaireamar fad méadaithe coirp i ctns-/ - séabra-iasc i gcomparáid leis an dá ghné inscne fiáine.

3. Plé

Le scór bliain anuas,cystinosistar éis athrú ó ghalar marfach óige go neamhord meitibileach inchóireáilte ar féidir le hothair maireachtáil go haosacht agus ardaois a bhaint amach [21,22]. Nocht marthanacht níos faide na n-othar feinitíopaí galair núíosacha agus d'ardaigh ceisteanna nua maidir le pataigineas agus éifeachtaí fadtéarmacha na teiripí. Maidir leis seo, déantar staidéar ar mhúnlaí ainmhithe fásta de cystinosis níos mó agus níos ábhartha.

Sa staidéar reatha, rinneamar imscrúdú ar an duánach agus extrarenal Léirithe cistinosis sannabhránach de 18 mí, a fhreagraíonn don aois dhaonna 40-50 bliain [23,24]. Ar an gcéad dul síos, dheimhnigh muid go dtugann an tsamhail ctns-/- séabrafish do dhaoine fásta carnadh cistín an chorp uile agus orgáin éagsúla. Saduán, ag an leibhéal histeolaíoch, thugamar faoi deara comharthaí de dhamáiste PTEC arna léiriú ag láithreacht braoiníní eosinafileach iomadúla cosúil le halaine, folúis cíteaplasmacha, agus caillteanas páirteach de theorainneacha scuab. Ina theannta sin, d'fhorbair an séabra ctns-/-fireann hipertróf glomerular. Ar deireadh, léirigh muid gur méadaíodh slonn cleaved-caspase 3 sa PTEC duánach de ctns-/-séabrafish, rud a thugann le fios go bhfuil baint ag apoptosis le pataigineas cistinóis nephropathic i séabrafish. Ós rud écystinosisothair i láthair freisin extrarenal léirithe, rinneamar imscrúdú ar an éifeacht sóchán ctns-/- in orgáin eile inár múnla séabra. Rud suimiúil, fuaireamar amach go raibh ctns-/- sóchán ina chúis le lagú ar anatamaíocht an chraiceann agus go gcuireann sé isteach ar thorthúlacht, ar ghníomhaíocht innill ghluaiste agus ar na súile.

Is suíomhanna díleá intracellular iad lysosomes agus meastar gurb iad na comhordaitheoirí ríthábhachtacha de mheitibileacht cille [25]. A bheith ina galar stórála lysosomal, is é an príomhghné decystinosisis carnadh cystine lysosomal [26,27]. Is díol suntais é, fuaireamar méadú 54-méadú ar chistin i gcorp iomlán na míosa i gcomparáid le cineál fiáin, agus, inár staidéar roimhe seo [10], léirigh larbhaí séabra-éisc cystinosis ag 6 lá tar éis an toirchithe. 13-méadú fillte. Ar an iomlán, tugann na sonraí seo le fios go carnann cistín le linn an tsaoil i gcistinosis séabraisc. Tá sé deimhnithe ag crómatagrafaíocht leachta agus anailís mais-speictriméadrachta, i measc na n-orgán go léir,duánsare an suíomh is fearr le haghaidh carnadh cistín. Tuairiscíodh swelling lysosomal agus braoiníní eosinophilic cosúil le hyaline taobh istigh de na líosóim i PTEC atá luchtaithe le cistín [28,29] agus, i mbithóipí daonna, feictear criostail chistin mar spásanna cruth ilmorphous laistigh de na macrophages interstitial agus an cíteaplasma PTEC [27]. I bhfíochán daonna, is próiseas carnach é carnadh agus criostalú cistín a tharlaíonn le linn an tsaoil. Inlíne, níor aimsíodh criostail chistín sa ctns / - séabrafish ag céim an larbha [10] agus, inár dturgnaimh phíolótacha, fuair muid amach go bhfuil cruth ilmorphous na gcriostal cistine le feiceáil ag aois 3 agus 6 mhí agus go bhfuil siad le feiceáil go soiléir. ag 18-mí d'aois, rud a thugann le tuiscint go bhfuil dul chun donais de réir a chéile ar éifeachtaí cystinosis saduán.

Cliceáil chunÉifeachtaí cistanche do ghalair duáin

Chun athruithe histeolaíocha na glomeruli a mheas, thomhaiseamar achair dhromchla capsúl Bowman, an tuft glomerular, agus spás ctns-/ - séabrafish Bowman ar chodanna dhaite PAS. Fuaireamar amach gur fhorbair ctns-/-séabraisc hipertróf glomerular, rud a thugann le tuiscint go bhfuil hipear-scagadh. D'fhéadfadh go gcuirfí an damáiste éadromglomerular a breathnaíodh ar na heicneáin -/ - riabhacha i leith cumas athghiniúna an riabhánaighduán, a bheith in ann nephrons nua a chur leis, chomh maith le nephrons atá ann cheana féin a dheisiú [30].

Chomh maith leis an damáiste histological, tá sé léirithe go bhfuil carnadh cistine a ghníomhachtúproteinkinaseCtriggeringapoptosisinPTEC[12]. Mar sin, rinneamar measúnú ar an slonn caspase scoilte i PTEC agus fuaireamar amach gur léirigh na ctns-/-zebrafish méadú caspase-3 agus ilroinnt núicléach. Fuarthas láithreacht caspase scoilte-3 go príomha i gcealla a bhailigh na folúis cíteaplasmacha, rud a thugann le tuiscint go dtarlaíonn apoptosis sa PTEC gortaithe. D'fhéadfadh meicníocht bhreise amháin a d'fhéadfadh an apoptosis méadaithe a mhíniú ná láithreacht speiceas ocsaigine imoibríoch mar gheall ar glutathione laghdaithe a bhaineann le carnadh cistín [31]. Mar sin féin, tá gá le tuilleadh staidéir chun a mheas an bhfuil an mheicníocht seo le sonrú in ctns-/-iasc séabra.

Cé goduáiniad na horgáin chéad agus is mó a mbíonn tionchar orthu,cystinosisIs galar ilchórasach é ina bhfuil baint ag orgáin éagsúla, amhail an craiceann, gonads, súile agus matáin. Ón litríocht, is eol go léiríonn othair cystinosis go minic aosú craiceann roimh am, gruaig fhionn, agus dath craiceann cothrom [13]. Is é is cúis leis an bhfeinitíopa deiridh sin ná an bhaint atá ag iompar cistinóisin le rialáil meileaninsintéise[32] agus ag cothabháil lí níos dorcha tríd an iompróir cistéineach nua-aimsithe MFSD12 [33]. Go spreagúil, chuir ár múnla ctns - / - séabraiascach fásta patrún craiceann hypopigmented agus chonaic agus léirigh sé dáileadh lagaithe melanin nár breathnaíodh ag céim an larbha [10].

Freisin,cystinosisis cúis le neamhthorthúlacht i bhfireannaigh, agus is eol go bhfuil baineannaigh torthúil [14]. Tugann sonraí le déanaí le fios go bhféadfadh neamhthorthúlacht a bheith mar thoradh ar dhíghiniúint testicular forásach, rud a d’fhágfadh go n-athrófaí cáilíocht seamhan, nó mar gheall ar bhac i gcuid neamhshainithe de chóras eisfheartha na bhfear. D’fhéadfadh tionchar a bheith ag na struchtúir atá bactha ar cháilíocht an tseamhain, go háirithe sna réigiúin ina bhfuil trastomhas an-bheag ag duchtanna, mar shampla, an retetestis[16]. Inzebrafish, tá an sperm go genicprocessis an-chosúil le mamaigh; áfach, is é ceann de na príomhdhifríochtaí ná go dtarlaíonn spermatogenesis sna cysts [34]. Inár staidéar, fuaireamar méadú ar spermatozoa sa chist spermatogenic de ctns-/-séabrafish, áfach, níor thángamar ar chomharthaí díghiniúna magairlí. Mar sin, d’fhéadfadh an feinitíopa cur síos a thabhairt le tuiscint go bhfuil bac ag leibhéil testicular as a dtagann scaoileadh níos lú spermatozoa sa chomhshaol, ach tá gá le tuilleadh staidéir chun an hipitéis seo a dhearbhú. Ag an leibhéal feidhme, is cosúil go léiríonn an laghdú ar líon na n-uibheacha agus na huibheacha toirchithe laghdaithe lagú ar thorthúlacht ctns-/-riabhach.

Léiriú cliniciúil eile decystinosis, a dhéanann difear go ginearálta d'othair ag tosú ón dara deich mbliana den saol, tá myopathy, arb iad is sainairíonna cur amú muscle agus laige [1]. Rud suimiúil, fuaireamar amach gur laghdaigh ctns-/- séabrafish a bhí i láthair gníomhaíocht innill ghluaiste i gcomparáid le rialú, ag moladh feidhm mhatánchleasaithe lagaithe. Is fiú a thabhairt faoi deara, ní raibh an feinitíopa seo i láthair i larbhaí [10], rud a thugann le tuiscint go gcuireann sé isteach ar ctns-/-séabrafish le linn chéim níos déanaí an ghalair. In ainneoin seo, níor aimsíodh aon difríochtaí histolaíochta infheicthe sna matáin. D’fhéadfadh gur mífheidhmiú miteachondrial nach bhféadfaí a bhrath trí ghnáthstaidéir histeolaíochta [35-37] a bheith mar thoradh ar ghníomhaíocht laghdaithe an innill. Dá bhrí sin, tá gá le breis meastóireachta ar thréithriú cuimsitheach mitochondria i séabraisc chistinosis.

Chomh maith leis na feinitíopaí thuasluaite, léirigh roinnt staidéir go léiríonn othair chistinosis comharthaí súl cosúil le fótafóibe agus blepharospasm [1], agus go bhfuil an choirne ar cheann de na codanna súl is mó a bhfuil tionchar aige agus mar thoradh air sin tá carnadh criostail chistin agus tiús méadaithe [20]. Mar sin féin, is beag atá ar eolas faoi na cúiseanna atá le tiús méadaithe na coirne. Mar shampla, tugadh le tuiscint go bhfuil an feinitíopa a thuairiscítear mar gheall ar mhífheidhm subclinical de chealla epithelial agus/nó endothelial as a dtagann stromaledema[20]. Inár staidéar, fuaireamar amach go bhfuil méadú ar thiús ciseal stromal na coirne i dtaispeántas ctns-/-zebrafish fásta, rud a thugann le fios go léiríonn ár múnla comharthaí mífheidhmithe coirne icystinosis.

Ciste le haghaidhduánfeidhm

Ceann de na bearnaí is mó le líonadh chun tuiscint chuimsitheach a fháil aircystinosisis é sin an easpa múnla ainmhí a athchaomhnaítear go hiomlán an galar daonna. Forbraíodh go leor samhlacha luiche, a thaispeánann carnadh cistín ach gan an t-iomlán a atáirgeadhduánachfeinitíopa [8,26]. Go sonrach, chuir an luch C57BL/6 carnadh cistín i láthair i roinnt orgán, a ardaíonn le haois [8]. Ina theannta sin, taispeánann an tsamhail luch C57BL/6 loit feadánacha cóngaracha ag tosú ó 6 mhí d'aois. Mar an gcéanna, inár múnla, téann loit feadánacha cóngaracha in olcas le himeacht ama. Mar sin féin, ag an leibhéal glomerular, chuir an tsamhail luch C57BL/6 gnáth-fheinitíopa i láthair, agus léiríonn ár múnla séabrafish fásta hipertróf glomerular. Ina theannta sin, teipeann ar mhúnla luiche C57BL/6 aithris a dhéanamh ar an torthúlacht lagaithe a breathnaíodh i ndaoine, agus cuireann an tsamhail ctns-/-séabraéisc cistíní spermatogenic saibhrithe i spermatozoa i láthair agus laghdaigh táirgeadh uibheacha. Ag an leibhéal súil, cuireann an dá luch[38]agus samhail-riabhais/samhail an tsúile neamhghnácha neamhghnácha i láthair. Ar a mhalairt, ag leibhéal an chraiceann, ní thaispeánann an tsamhail luch seo táirgeadh lagaithe melatonin [8], atá le feiceáil sa mhúnla séabraiascach fásta mar phátrún craiceann hypopigmented. Ar deireadh, ag an leibhéal iompraíochta, cuireann ár múnla ctns−/- séabrafish gníomhaíocht innill laghdaithe i láthair, rud a d’fhéadfadh a bheith mar gheall ar lagú ar fheidhm miteachondrial nó d’fhéadfadh gur éifeacht thánaisteach an mheáchain mhéadaithe is cúis leis.cystinosisséabra. Tríd is tríd, tá an chuma ar an scéal go ndéanann ár múnla ctns−/- séabrafish an galar daonna a athchaitheamh níos fearr. Le déanaí, Shimizu et al. bhunaigh sé sóchán Ctnsugl comhghéineach úrnua i mbrú francach a chuir i láthairduánachloit agus criostail chistin i líosóim anduáncortex [7]. Mar sin féin, tá tréithriú níos mionsonraithe ar an tsamhail fós in easnamh. Dá bhrí sin, tá géarghá le samhlacha feidhmiúla nua a fhorbairt agus a thréithriú chun galair an duine a athchaipitliú.

Mar fhocal scoir, léirigh muid go n-atáirgeann ár múnla ctns-/- séabrafish daoine fásta go bhféadfadh roinnt feinitíopaí daonna de pholl gainimh chistín a bheith úsáideach chun staidéar a dhéanamh ar phataigineas an ghalair i ndaoine fásta agus chun éifeachtaí fadtéarmacha drugaí núíosacha a thástáil le haghaidh ceartú duánach agus seach-.duánachléirithe.

4. Ábhair agus Modhanna

4.1. Cothabháil agus Pórú Riabhach

Láimhseáladh agus coinníodh riabhach i gcomhréir le rialacháin leasa ainmhithe KU Leuven (Formheas Eiticiúil nr.142/2019). Don staidéar seo, chuireamar ctns-/-riabhach riabhacha san áireamh ag 18 mí d'aois agus an riabhoil ​​rialaithe de chineál fiáin sa dá inscne. Rinneadh cur síos ar na sonraí maidir le giniúint na ctns-/-séabrafish inár staidéar roimhe seo [10].

4.2. Tomhas Cistine

Tomhaiseadh leibhéil chistine mar dhainséarach (cineál-éisc fhiáin, n=3andctns−/-iasc fireann, n=3) agus cuireadh an méid in iúl mar phróitéiní nmol/mg. Ar an gcéad dul síos, íobraíodh séabraisc le tumoideachas i MS (300 mg/L) trí-chainíne (300 mg/L), ina dhiaidh sin, rinneadh samplaí fíocháin a fhuaimniú i láthair 200 µL de 5 mM N-ethylmaleimide (NEM, St. Louis, MO, SAM, Sigma-Aldrich E3876) i saline maolánach fosfáite (PBS) Dulbecco ar feadh uasmhéid 200 mg de fhíocháin do gach lysate. Ina dhiaidh sin, cuireadh 100 µL d’aigéad sulfosalicileach 12 faoin gcéad (SSA) le gach aonchineálach, agus lártheifneoiríodh samplaí ag 12,000 g ar feadh 10 nóiméad, 4◦C. Stóráladh súithíní ina raibh cistín ag -80◦C go dtí am na hanailíse, agus tuaslagadh millíní thar oíche ag 4◦C i 300 µL de 0.1 M NaOH agus coinníodh iad ag -80◦C go dtí go ndéantar próitéin a thomhas ag baint úsáide as Kit Imoibrí Próitéin Pierce BCA. Ina dhiaidh sin, normalaíodh an méid (nmol) de chistin go dtí an chainníocht (mg) próitéine ó gach sampla. Ar aghaidh, 50 µan t-supernatant ina raibh an chistín spíonta le 50 µL den tuaslagán caighdeánach inmheánach (Cystine d6) agus vortexed ar feadh 5 s; ansin eastósctar an meascán le 200 µL aicéatóintríle, vortexed ar feadh 30 s, agus ansin lártheifneoiriú ag 16,000 g ar feadh 9 nóiméad. Rinne UHPLCAgilent1290InfinityII6470 (Agilent technology, Santa Clara, CA, USA) anailís ar chrómatagrafaíocht leachta agus mais-speictriméadracht agus é feistithe le foinse ESI-JET-STREAM ag feidhmiú sa mhodh ian deimhneach (ESI plus ). Ba é MassHunter (Stáisiún Oibre Agilent Technologies, Barcelona, ​​an Spáinn) na bogearraí a úsáideadh chun an trealamh seo a rialú agus chun sonraí a anailísiú. Ba é an colún deighilte a úsáideadh ná InfinityLab Poroshell 120 HILIC 1.9 µm 100×2.1 mm (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, SAM).

4.3. Hematoxylin agus Eosin agus Staining Aigéad-Shiff Tréimhsiúil

Riabhach (iasc baineann de chineál fiáin, n=3; iasc fireann den chineál fiáin, n=3; ctns−/−iasc baineann, n=3; ctns−/− iasc fireann, n íobartha=3) le tumoideachas i MS meatánasulfónáit tricaine-222 (300 mg/L), ina dhiaidh sin, socraíodh an séabra iasc iomlán i 4 faoin gcéad paraformaildéad maolánach (4 faoin gcéad PFA) ag 4 ◦C ar feadh 1 seachtaine . Tar éis dó a bheith nite le PBS faoi dhó, aistríodh an séabraisc chuig tuaslagán EDTA (100 mM, pH=8) le haghaidh an díchalaithe ar feadh seachtaine 1 eile, agus ina dhiaidh sin a neadú isteach i bparaifín. Gearradh fíocháin séabraéisigh leabaithe paraifín (4-µmthickness) arLeicamicrotome(LeicaBiosystems,Wetzlar,An Ghearmáin). Dathaíodh na codanna le H&E agus PAS de réir na bprótacal caighdeánach.

Staidéir fhóiritheolaíochta ar shúile séabraí (cineál fiáin baineann, n=3agus iasc baineann, n=3), rinneadh súile a enúsú agus a shocrú i 4 faoin gcéad PFA ag teocht an tseomra ar feadh 4 h. An leabú seo a leanas isteach sa mheán teocht gearrtha optamach (Tissue-Tek® VIP®; Sakura Finetek, an tSeapáin), 10- µm rinneadh criosghearrthacha (Cryostar NX70, Thermofisher Scientific, Tóiceo, an tSeapáin). Dathaíodh na codanna le H&E de réir na ngnáthphrótacal. Rinneadh na híomhánna le micreascóp réimse geal Leica (Leica DM6, Wetzlar, an Ghearmáin).

4.4. Immunohistochemistry (Cleaved Caspase-3 staining)

Rinneadh codanna leis an bhfíochán séabrafish úr-ghearrtha a dhí-dhíhiodráitiú agus a athhiodráitiú. Cuireadh codanna faoi réir aisghabháil antaigin teas-spreagtha ag baint úsáide as maolán citrate 10 mM (pH=6). Tar éis blocála le 5 faoin gcéad de Sheirim Gabhar Gnáth (NGS) i dPBS, goraíodh na codanna le caspase frith-scoilteacha coinín-3 (Cell Signaling, Danvers, MA, SAM, caolú 1:200) agus ina dhiaidh sin bhí caolú frith-choine. -Envision, antashubstaint thánaisteach lipéadaithe HRP (Dako Products, Agilent, Santa Clara, CA, SAM). Mar rialú diúltach, baineadh úsáid as serum coinín gnáth. Baineadh úsáid as Diaminobenzidine (DAB, DAKO, Glostrup, an Danmhairg) mar chromogen. Ina dhiaidh sin, rinneadh na codanna a fhrithdhaite le H&E, díhiodráitíodh iad, agus feistíodh iad.

Cóireáil galar duáin: Cistanche

4.5. Staining Gorm Toluidín agus TEM

RiabhachduánachBaineadh fíocháin (séabraimis fireann de chineál fiáin, n=3 agus ctns−/− séabrafish fireann, n=3) agus socraíodh iad i maolán fosaithe EM (1.5 faoin gcéad glútaraildéad/1 faoin gcéad paraformaildéad h) . Ina dhiaidh sin, rinneadh na fíocháin duánacha iar-shocraithe le 2.5 faoin gcéad glutaraldehyde/1.2 faoin gcéad acrolein i maolán seasta (0.1 mol/L cacodylates, 0.1 mol/L siúcrós, pH 7.4) agus 1 faoin gcéad osmium tetroxide, agus neadaithe isteach ar roisín. Rinneadh codanna leath-tanaí (0.5-µm tiús) a dhathú le gorm tolúidín. Bhí na hailt ultrathin dhaite le aicéatáit úráinil. Bailíodh na híomhánna trí úsáid a bhaint as micreascópacht leictreoin tarchuir JEM{= 3 EX (JEOL Ltd, Tóiceo, an tSeapáin) le mórmhéaduithe éagsúla.

4.6. Anailís Íomhá Digiteach

Rinneadh sleamhnáin dhaite a dhigitiú ag baint úsáide as Scanóir Ultra-Gasta Philips 1.6 RA (Philips, Eindhoven, An Ísiltír)

4.6.1. Anailís Hypertrophy Glomerular

Chun anailís a dhéanamh ar hipertróf glomerular i séabraisc, tomhaiseadh achair dromchla (µm2) capsule Bowman, spás Bowman, agus tuft glomerular ar shleamhnáin dhaite PAS. Áiríodh agus tomhaiseadh gach glomeruli in aghaidh na coda ag baint úsáide as bogearraí ImageJ. Úsáideadh meán na dtomhas ó gach séabraisc le haghaidh anailís staitistiúil.

4.6.2. Anailís Slonn Caspase-3 scoilte

Twoobserversscoredthecleavedcaspase-3expressioninthetubulesofeachzebrafish. The semiquantitative score was conducted on the three randomized tubular fields in each zebrafish(20×magnification). Thepercentageofcaspase-3positivearearelativetothetotal area of tubules was scored as 1 (negative staining), 2 (1–10% positive staining), 3 (10%–25% positive staining), 4 (>staining dearfach 25 faoin gcéad). Úsáideadh meán an scóir ó gach séabraisc le haghaidh anailís staitistiúil.

4.6.3. Tiús Anailís Stróma Coirne

Tomhaiseadh tiús stroma choirne an riabhánaigh (maighnéadú 10 ×) ag na hachair chéanna ó lár na súl trí úsáid a bhaint as bogearraí ImageJ ar séabrafish. I gcás gach pictiúr, tógadh n=7 tomhas ag láithreacha éagsúla i gcuid na súl (lárnach, lár, imeallach) feadh na coirne ag eatraimh 100 µM. Baineadh úsáid as meán na dtomhas le haghaidh anailís staitistiúil.

4.7. Staidéar Torthúlachta

Rinneadh measúnú ar an torthúlacht trí riabhach baineann agus fireann a chúpláil (iasc fireann de chineál fiáin, n=4 agus iasc baineann de chineál fiáin, n=6 agus iasc ctns−/−fireann, n=4 agus ctns−/−iasc baineann, n=6) i dtráidire sceathraí. An mhaidin dár gcionn, uair an chloig tar éis an tsolais, bailíodh suthanna agus taifeadadh líon iomlán na n-uibheacha a tháirgtear. Rinneadh uibheacha toirchithe a scagadh agus a chomhaireamh ó na cinn neamhthorthúla trí úsáid a bhaint as micreascópacht éadrom. Rinneadh an pórú n=7 uair sa tseachtain i ndiaidh a chéile. Eisiata dhá thurgnamh a d'fhág nach raibh aon táirgeadh uibheacha ag an am céanna i gcineál fiáin agus ctns-/-séabraisc.

4.8. Gníomhaíocht Gluaisteán

Riabhach (iasc baineann de chineál fiáin, n=6; iasc fireann den chineál fiáin, n=6; ctns−/−iasc baineann, n=6; ctns−/− iasc fireann, n=6) sna gnáthaonaid tithíochta agus, tar éis am oiriúnaithe de 5 nóiméad, scannánaíodh iad ar feadh 5 nóiméad. Rinneadh fístaifeadadh ag baint úsáide as GoPro® HERO 7 a cuireadh ar bharr an umair, rud a thairgeann radharc barr den iasc ag snámh. Socraíodh ráta réitigh agus fráma faoi seach go 1080 p (1920×1080) agus 30 fps. Rinneadh anailís ar fhíseáin le Rianaire.árianú ar na conairí ar an séabrait aonair ar fud an turgnaimh. Rinneadh anailís ar na conairí ina dhiaidh sin le cód python saincheaptha chun an meánluas locomotor (picteilín / soic) a dhíorthú i ngach grúpa [39].

Cistanche-duánach

4.9. Meáchan coirp agus Tomhais Fad

Rinneadh riabhoil a thumadh i 300mg/Loftricainemethanesulfonate MS-222. Tar éis neamhláithreacht fhreagra ar spreagthaigh sheachtracha a fhíorú, cuireadh an séabra eotanaithe ar fhíochán páipéir agus triomaíodh é. Rinneadh fad an riabhánaigh eotanúcháin a mheas agus caliper á úsáid, á thomhas ó bharr an bhéil go dtí an peduncle caudal. Rinneadh meáchain an riabhánaigh eotanúcháin a mheas le scála anailíse.

4.10. Anailís staitistiúil

Rinneadh anailís staitistiúil ag baint úsáide as SPSS (IBM, Nua-Eabhrac, NY, SAM) agus GraphpadPrim (GraphPadSoftware, LaJolla). Dataoftwogroupswereanalyzedusingunpaired t-tástáil le ceartúchán Welch, dhá eireaball. Rinneadh anailís ar shonraí dhá athróg neamhspleácha chatagóireacha le ANOVA dhá bhealach agus tástáil difríochta is lú suntasaí Fisher (PLSD). Measadh go raibh difríochtaí le p < 0.05="" suntasach="" go="">

4.11. Staidéar Torthúlachta

Chun comparáid a dhéanamh idir rátaí táirgeachta uibheacha idir cineál fiáin agus ctns-/-iasc séabra, rinneadh anailís cúlchéimnithe Poisson ag baint úsáide as Cothromóidí Meastacháin Ghinearálta le hearráidí caighdeánacha láidre chun comhghaolú rátaí le turgnaimh a chur san áireamh. Chun comparáid a dhéanamh idir an tairiscint odds rinneadh uibheacha a úsáidtear idir cineál fiáin agus ctns-/-zebrafish anailís aischéimnithí alóiseach ag baint úsáide as Cothromóidí Meastacháin Ghinearálta le hearráidí caighdeánacha láidre chun cuntas a thabhairt ar an comhghaol idir na corrlaigh laistigh de thurgnaimh.

Ábhair Fhorlíontacha: Tá na hábhair seo a leanas ar fáil ar líne ag https://www.mdpi.com/article/ 10.3390/ijms22179398/s1.

Ranníocaíochtaí Údair: Coincheapú, SPB, JH, LvdH, HJB, EL; modheolaíocht, SPB, JH, LDG, HT, TN, PB, SC, BG; bogearraí SPB, JH, LDG, HT, TN; bailíochtú, SPB, JH, LDG, PB, LvdH, HJB, agus EL; anailís fhoirmiúil, SPB, JH, LDG, HT, TN; imscrúdú, LvdH, HJB, EL; acmhainní, HJB agus EL; coimeád sonraí, SPB, JH, LDG, LvdH, HJB, EL; scríbhneoireacht — dréacht-ullmhú bunaidh SPB, JH; scríbhneoireacht — athbhreithniú agus eagarthóireacht, LvdH, HJB, EL; léirshamhlú, LvdH, HJB, EL; maoirseacht, PdW, LvdH, HJB, EL; riarachán tionscadail, LvdH, HJB, EL; éadáil maoinithe, HJB, EL Tá an leagan foilsithe den lámhscríbhinn léite agus aontaithe ag na húdair go léir.

Maoiniú: Ba mhaith leis na húdair aitheantas a thabhairt don chiste inmheánach ó KULeuvenC1GranttoE.L. (C14/17/113), Deontas Chomhairle Scoláireachta na Síne do JH (CSC n◦ 201508500109), agus comhaltacht iardhochtúireachta FWO chuig LDG (12I3820N).

Ráiteas an Bhoird Athbhreithnithe Institiúideach: Rinneadh an staidéar de réir threoirlínte Dhearbhú Heilsincí, agus d’fhaomh Coiste Eitice KU Leuven n.142/2019 é. Buíochas: Ba mhaith linn buíochas a ghabháil le: Didier Cagnini as meastóireacht a dhéanamh ar histeolaíocht na hinchinne sa dá ctns−/−agus cineál-saotharlann fiáin, KathleeenLambaerts, FrédéricHendrickxandKimvanKelst as a dtacaíocht agus a gcúnamh leanúnach sa KU Leuven Aquatics, an áis tacaíochta theicniúil do Peter Neeskensic. den TEM, agus Ron Wolterbeek le haghaidh anailís staitistiúil.

Coinbhleachtaí Leasa: Dearbhaíonn na húdair coinbhleacht leasa. Thefundershadnoroleindearadh an staidéir; maidir le bailiú, anailísiú nó léirmhíniú sonraí; i scríobh na lámhscríbhinne, nó sa chinneadh na torthaí a fhoilsiú.

Tagairtí

1. Elmonem, MA; Veys, KR; Solamhán, NA; van Dyck, M.; van den Heuvel, LP; Levtchenko, E. Cystinosis: athbhreithniú. Dílleachtlann J. Rare Dis. 2016, 11, 47. [CrossRef]

2. Jezegou, A.; Llineres, E. ; Áine, C.; Kieffer-Jaquinod, S.; Ó Riagáin, S.; Aupetit, J. ; Chablis, A. ; Sagne, C. ; Debacker, C. ; ChadefauxVekemans, B.; et al. Is onnmhaireoir aimínaigéad lysosomal cationic é próitéin heiptaheileach PQLC2 atá mar bhunús le gníomh cistéamín icystinosisteiripe. Proc. Natl. Acad. Sci. Stáit Aontaithe Mheiriceá 2012, 109, E3434–E3443. [CrossRef] [PubMed]

3. Besouw, MT; Levtchenko, GA An prognóis de chistinosis nephropathic a fheabhsú. Int. J. Nephrol. Renova. Dis. 2014, 7, 297–302. [CrossRef]

4. Brodin-Sartorius, A.; Tete, MJ; Niaudet, P.; Antignac, C. ; Aoi, G. ; Ottolenghi, C.; Carbán, M. ; Mhaighis, D.; Finscéal, C. ; Lesavre, P. ; et al. Cuireann teiripe cysteamine moill ar dhul chun cinn cystinosis nephropathic i ndéagóirí déanacha agus daoine fásta. KidneyInt. 2012, 81, 179–189. [CrossRef]

5. Cherqui, S. Teiripe Cysteamine: Cóireáil le haghaidh cystinosis, ní leigheas. Duán Int. 2012, 81, 127–129. [CrossRef]

6. David, D.; Princiero Berlingerio, S.; Leamhainm, MA; Oliveira Arcolino, F.; Solamh, N. ; van den Heuvel, B.; Gijsbers, R.; Levtchenko, Bunús E.Móilíneach na gCistinóis: Dáileadh Geografach,Iarmhairtí Feidhmiúla na Sócháin sa CTNSGene, agus Poitéinseal Deisiúcháin. Nephron 2019, 141, 133–146. [CrossRef] [PubMed]

7. Shimizu, Y .; Yanobu-Takanashi, R.; Nakano, K.; Háise, K. ; Shimizu, T. ; Okamura, T. Tá scriosadh sa ghéin Ctns ina chúis le mífheidhmiú tubular duánach agus carnadh cistín i bhfrancaigh LEA/Tohm. Mamó. Géanóm 2019, 30, 23–33. [CrossRef]

8. Nevo, N .; Chol, M.; Bailleux, A. ; Kalatzis, V. ; Muirisset, L.; Devuyst, O.; Gubler, MC; Antignac, C. feinitíopa duánach ancystinosisTá samhail na luiche ag brath ar chúlra géiniteach. Nephrol. Diailigh. Trasphlandú 2010, 25, 1059–1066. [CrossRef] [PubMed]

9. Elmonem, MA; Berlingerio, SP; van den Heuvel, LP; de Witte, PA; Lowe, M. ; Levtchenko, GA GéiniteachDuánachGalair: Ról Múnlaí Riabhach atá ag Teacht Chun Cinn. Cealla 2018, 7, 130. [CrossRef] [PubMed]

10. Elmonem, MA; Khailil, R.; Khodaparast, L. ; Khodaparast, L. ; Arcolino, FO; Morgan, J.; Pastore, A. ; Tylzanowski, P.; Níl, A.; Lowe, M. ; eadal. Léiríonn cistinosis(ctns)sóiteáin séabraimis an glomerular agus an fheidhm thubular fhuaimneach. Sci. Ionadaí 2017,7, 42583. [CrossRef]

11. Lusco,MA;Najafian,B.;Alpers,CE;Fogo,ABAJKDAatlasofRenalPaitology:Cistinosis. Táim. J.KidneyDis. 2017,70,e23–e24. [CrossRef]

12. Páirc, MA; Pejovic, V. ; Kerisit, KG; Junius, S.; Thoene, JG Apoptosis méadaithe i fibroblasts cystinotic agusduánachTagann cealla epithelial tubule proximal ó chistéiniliú próitéin kinase C deilt. J. Am. Soc. Nephrol. 2006, 17, 3167–3175. [CrossRef]

13. Veys, KRP; Leamhainm, MA; Dhaenens, F. ; Van Dyck, M.; Janssen, M.; Cornelissen, EAM; Hohenfellner, K.; Reda, A.; Quatresooz, P. ; van den Heuvel, B.; et al. Aosú Intreach Feabhsaithe Craicinn i gCistinosis Nephropathic Measúnaithe ag Tomagrafaíocht Comhtháthaithe Optúil Ard-Sainmhínithe. J. Infheistiú. Deirmól. 2019, 139, 2242–2245. [CrossRef]

14. Besouw, MT; Kremer, JA; Janssen, MC; Levtchenko, GA Stádas torthúlachta in othair chistinosis fireann a bhfuil cóireáil orthu le cistaimín. Fertil. Steiril. 2010, 93, 1880–1883. [CrossRef]

15. Veys, KR; D'Hauwers, KW; van Dongen, A.; Janssen, MC; Besouw, MTP; Goossens, E. ; van den Heuvel, LP; Wetzels, A. ; Levtchenko, GA An Chéad Choincheap Rathúil a Spreagann Othar Cystinosis Fireann. JIMD Ionadaí 2018, 38, 1–6. [CrossRef] [PubMed]

16. Rohayem, J. ; Haffner, D.; Cremers, JF; Huss, S.; Wistuba, J. ; Weitzel, D.; Kliesch, S.; Hohenfellner, K. Feidhm testicular i bhfireannaigh le cystinosis nephropathic naíonán. Hum. Atáirgeadh. 2021, 36, 1191–1204. [CrossRef] [PubMed]

17. Blakey, H. ; Proudfoot-Jones, J.; Knox, E. ; Lipkin, G. Thoirchis i mná le cystinosis. Clin. Duán J. 2019, 12, 855–858. [CrossRef]

18. Dogulu, CF; Tsilou, E. ; Rubin, B. ; Fitzgibbon, EJ; Kaiser-Kupper, MI; Rennert, OM; Gahl, WA Hipirtheannas infhéitheach Idiopathic i cystinosis. J. Péidiatraí. 2004, 145, 673–678. [CrossRef] [PubMed]

19. Dixon, P. ; Críostóir, K.; Chauhan, A. Ról féideartha collagen stromal i criostalú cistín in othair cystinosis. Int. J. Pharm. 2018, 551, 232–240. [CrossRef]

20. Katz, B. ; Melles, RB; Schneider, JA; Rao, NA Tiús coirne i gcistinosis nephropathic. Br. J. Ophthalmol. 1989, 73, 665–668. [CrossRef] [PubMed]

21. Nesterova, G. ; Gahl, WA Cystinosis: Forás galair inchóireáilte. Péidiatraí. Nephrol. 2013, 28, 51–59. [CrossRef] [PubMed]

22. Ariceta, G. ; Giordano, V. ; Santos, F. Éifeachtaí cóireáil fadtéarmach cysteamine in othair lecystinosis. Péidiatraí. Nephrol. 2019, 34, 571–578. [CrossRef] [PubMed]

23. Gilbert, MJ; Zerulla, TC; Tierney, KB Riabhach (Danio rerio) mar mhúnla chun staidéar a dhéanamh ar aosú agus aclaíocht: Laghdaíonn cumas fisiceach agus in oiliúint le haois. Cait. Gerontól. 2014, 50, 106–113. [CrossRef] [PubMed]

24. Gerhard, GS; Kaufman, EJ; Wang, X. ; Stewart, R.; Moore, JL; Kasales, CJ; Demidenko, E.; Cheng, KC Trasnaíonn an saol agus feinitíopaí seanaoise in dhá shraith Riabhach (Danio rerio). Cait. Gerontól. 2002, 37, 1055–1068. [CrossRef]

25. Saftig, P. ; Klumperman, J. Biogenesis lysosome agus próitéiní membrane lysosomal: Comhlíonann gáinneáil feidhm. Nat. An tUrr Mol. Cill Biol. 2009, 10, 623–635. [CrossRef]

26. Cherqui, S.; Sevin, C. ; Hamard, G. ; Kalatzis, V. ; Sich, M. ; Pequignot, MO; Gogat, K.; Abitbol, ​​M. ; Broyer, M.; Gubler, MC; et al. Carnadh cistine intralysosomal i lucha easpa cystinosis, an próitéin lochtach i cystinosis. Mol. cill. Biol. 2002, 22, 7622–7632. [CrossRef]

27. Raggi, C. ; Luciani, A. ; Nevo, N.; Antignac, C. ; Tír Eoghain, S.; Devuyst, O. Difríocht, agus aberrations an urrann endolysosomal arb iad is sainairíonna céim luath de cystinosis nephropathic. Hum. Mol. Géinte. 2014, 23, 2266–2278. [CrossRef]

28. Crua, GC Roinnt áiseanna le haithint histeolaíoch ar nephropathy braoiníní hyaline i staidéir ar thocsaineacht nócha lá. Tocsain. Paitól. 2008, 36, 1014–1017. [CrossRef]

29. Sacarcan, A. ; Timmons, C. ; Baum, M. Dáileadh intracellular de chistín i feadáin chóngaracha atá luchtaithe le cistín. Péidiatraí. Res. 1994, 35, 447–450. [CrossRef]

30. Kroeger, PT, Jr .; Wingert, RA Ag baint úsáide as séabrafish chun staidéar a dhéanamh ar ghéineas podocyte le linn fhorbairt agus athghiniúint na duáin. Geineasas. 2014, 52, 771–792. [CrossRef]

31. Sumayao, R. ; McEvoy, B.; Newsholme, P.; McMorrow, T. Cuireann carnadh cistín lysosomal chun cinn depolarization mitochondrial agus ionduchtú géinte redox-íogair i gcealla tubular duánach proximal daonna. J. Fisiol. 2016, 594, 3353–3370. [CrossRef]

32. Chiaverini, C. ; Sillard, L. ; Flori, E.; Ito, S.; Briganti, S.; Wakamatsu, K.; Fontas, E. ; Bearard, E.; Cailliez, M. ; Comhrá, P.; et al. Is próitéin melanosomal é Cystinosin a rialaíonn sintéis melanin. FASEB J. 2012, 26, 3779–3789. [CrossRef]

33. Déanann Adelmann,CH;Traunbauer,AK;Chen,B.;Condon,KJ;Chan,SH;Kunchok,T.;Lewis,CA;Sabatini,DMMFSD12allmhairiú cistéin a allmhairiú isteach i meileanosóim agus lísisóm. Nádúr 2020, 588, 699–704. [CrossRef]

34. Leail, MC; Cardoso, ER; Nobrega, RH; Batlouni, SR; Bogerd, J. ; Franca, ó chlé; Schulz, RW Meastóireacht histeolaíoch agus steireolaíoch ar speirmatogenesis séabratach (Danio rerio) le béim ar na glúine speirmatagonacha. Biol. Atáirgeadh. 2009, 81, 177–187. [CrossRef] [PubMed]

35. Sansanwal, P. ; Sarwal, MM Uathphagaí mitochondrial neamhghnácha i nephropathiccystinosis. Útphagy 2010, 6, 971–973. [CrossRef] [PubMed]

36. Bellomo, F. ; Signorile, A. ; Tamhma, G. ; Ranieri, M.; Emma, ​​F.; De Rasmo, D. Tionchar leibhéal timthriallach-AMP mitochondrial aitíopúla i cystinosis nephropathic. cill. Mol. Sci Saol. 2018, 75, 3411–3422. [CrossRef] [PubMed]

37. De Rasmo, D.; Signorile, A. ; De Leo, E.; Polishchuk, EV; Ferretti, A. ; Raso, R. ; Russo, S.; Polishchuk, R.; Emma, ​​F.; Bellomo, F. MitochondrialDynamicsofProximalTubularEpithelialCellsinNephropathicCystinosis. Int. J.Mol. Sci. 2019, 21, 192. [CrossRef]

38. Kalatzis, V. ; Serratric, N. ; Hippert, C. ; Payet, O.; Ardt, C. ; Cazevieille, C.; Muiris, T. ; Hamel, C. ; Malecaze, F.; Antignac, C. ; et al. Déanann na haimhrialtachtaí ocular i samhail ainmhí cystinosis aithris ar phataigineas an ghalair. Péidiatraí. Res. 2007, 62, 156–162. [CrossRef]

39. Romero-Ferrero, F.; Bergomi, MG; Hinz, RC; Heras, FJH; de Polavieja, GG idtracker.ai: Gach duine aonair a rianú i gcomhchnuasaigh bheaga nó mhóra ainmhithe gan mharcáil. Nat. Modhanna 2019, 16, 179–182. [CrossRef]