Apoptóis Idirghabhála Speiceas Ocsaigin Imoibríoch de Chealla Ailse Drólainne Daonna Príomhúla agus Mheitstatacha

RÉAMHRÁ

Tá ailse chalaireicteach ar cheann de na hailse is coitianta ar fud an domhain (Brenneret al., 2014), agus tá a mhinicíocht ag méadú i gcónaí le 2.4 milliún cás measta in 2035, mar gheall ar aiste bia agus stíl mhaireachtála nua-aimseartha, mar aon le gníomhaíocht fhisiciúil laghdaithe. Ní leor na hiarrachtaí atá ar bun faoi láthair chun dul i ngleic leis an eipidéim láithreach d’ailse cholaireicteach agus mar sin tá gá le cineálacha cur chuige nua chun cosc ​​agus cóireáil éifeachtach a dhéanamh lena n-áirítear athruithe ar stíl mhaireachtála i gcomhar le hidirghabhálacha malartacha níos sábháilte ar nós Phytotherapeutics (Weidner).et al., 2015). Bhí fisiteiripe, úsáid plandaí míochaine chun galair a chóireáil, mar chuid dosheachanta de stair ársa an duine. Baineadh úsáid as gléasraí míochaine le fada mar fhoinsí cóireála malartacha le haghaidh ailse, arb ionann iad agus níos mó ná seasca faoin gcéad de na gníomhairí frith-ailse a úsáidtear sa ghnáth-leigheas (Balunas agus Kinghorn, 2005; Saibuet al., 2015). I measc cuid de na samplaí is cáiliúla tá sleachta asCatharanthus roseusG. Don. (Apocynaceae), Taxus baccata L. (Taxaceae), agus Camptotheca acuminate Decne (Nyssaceae) (Cragg agus Newman, 2005; da Rochaet al., 2001). Taispeánadh go n-imríonn roinnt sleachta luibhe agus fíteasceimiceach éifeachtaí antitumor in ailse cholaireicteach a chuirtear i leith táirgeadh speiceas ocsaigin imoibríoch (ROS) agus apoptosis gaolmhar na gceall ailse mar atá i gcás sleachta óMelissa oifigiúil(Weidneret al., 2015)

I measc iarrthóirí fíteiteiripeacha,Cistanche tubulosa, planda fásach seadánacha Orobanchaceae (Jiang et al., 2009) atá scaipthe go forleathan i réigiúin arid agus leath-arid na hAfraice, san Áise, agus i réigiún na Meánmhara, tá sé léirithe go bhfuil airíonna leighis luachmhar. Baineadh úsáid fhorleathan as Cistanche tubulosa i míochaine thraidisiúnta agus moltar go mbeadh éifeachtaí leigheasacha aige in easnamh duánach, leucorrhea galrach, metrorrhagia, neamhthorthúlacht baineann, agus constipation senile (Jiang et al., 2009). rinneadh dianstaidéar ar airíonna Cistanche Tubulosa le deich mbliana anuas lena n-áirítear vasorelaxant (Yoshikawa et al., 2006), hepatoprotective (Morikawa et al, 2010), éifeachtaí frith-hyperglycemic agus hypolipidemic (Xiong et al., 2013). Moladh freisin Cistanche Tubulosa mar fheabhsaitheoir cumhachtach ar an gcóras imdhíonachta, mar thionscnóir foirmiú cnámh, agus mar ghníomhaire frith-aosaithe agus frith-tuirse (Xu et al., 2014). Ina theannta sin, léiríodh go gcuireann sliocht Cistanche tubulosa bac ar sil-leagan amyloid i múnla galar Alzheimer (Wu et al., 2015). In ainneoin a úsáidí teiripeacha éagsúla, níl staidéar déanta fós ar éifeacht Cistanche Tubulosa mar ghníomhaire frith-ailse féideartha.

San obair seo, tá imscrúdú déanta againn ar éifeacht frith-ailse Cistanche Tubulosa ar dhá líne cille ailse drólainne príomhúla agus dhá líne mheiteastáiteacha agus na meicníochtaí féideartha is bun leis an éifeacht sin.

TUBULOSA CISTANCHE NÁDÚRTHA CHUN FEIDHM Gnéis A FHEABHSÚ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

ÁBHAR AGUS MODHANNA

Bailiú agus ullmhú sliocht plandaí

Bailíodh samplaí Cistanche tubulosa ó na limistéir fhásaigh i Catar in 2014 agus dheimhnigh an luibheolaí barántúlacht an ghléasra. Cuirtear samplaí dearbháin i gcartlann sa Roinn Tocsaineolaíochta agus Ilchuspóireach ag ADLQ. Meiltíodh na samplaí plandaí grian-triomaithe le Retsch Knife Mill Grindomix GM300 ina phúdar mín. Baineadh fiche gram de phúdar le 200 ml d'uisce ultrapure thar oíche ag 37 céim ar chroiteoir rothlach ag 200 rpm. An amhEastóscáin Cistanche tubulosa (CTE)a lártheifneoiriú ar feadh 30 nóim ag 8000 rpm chuig comhdhúile neamh-intuaslagtha millíní, bailíodh sárshaothar agus triomaíodh é ag baint úsáide as Triomadóir Reo Saorchrios Labconco 6 móide. Athdhéantar an t-úsc triomaithe i Meán-Iolar Athraithe Dulbecco (DMEM, SIGMA, an Ghearmáin) go tiúchan 20 mg/ml agus scagtar steiril é trí scagaire membrane 0.2-micron.

Línte cille agus cothabháil cille

Fuarthas línte cille carcinoma drólainne daonna CaCo2, SW620, agus LoVo ó Cell Lines Service (CLS, Eppelheim, an Ghearmáin) agus ba bhronntanas cineálta é líne cille HCT 116 ó Roinn na nEolaíochtaí Bitheolaíochta agus Comhshaoil, Ollscoil Catar. Díorthaíodh CaCo2 agus HCT11 ón suíomh príomhúil carcanóma drólainne agus díorthaíodh SW620 agus LoVo ón suíomh méadastatach. Rinneadh cealla SW620, HCT116, agus LoVo a shaothrú agus a chothabháil in DME Meánach agus coinníodh cealla CaCo2 in Íosmhéid Meán Riachtanach Eagle (EMEM, SIGMA, an Ghearmáin). Fásadh na cealla mar mhonashraith saothraithe ag 37 céim i meán faoi seach arna fhorlíonadh le séiream bó féatais 10% (FBS, SIGMA, an Ghearmáin) agus 1% Peinicillin/Streptomycin (SIGMA, an Ghearmáin) in atmaisféar humidithe ina raibh 5% dé-ocsaíd charbóin.

Measúnú inmharthanachta cille

Úsáideadh an mheasúnacht {{0}}[4,5-dimethylthiazol-2-il]-2,5-diphenyltetrazolium (MTT) chun gníomhaíocht cíteatocsaineacha a mheas. CTE mar a cuireadh síos níos luaithe (Jaganjac et al., 2010). Ba é an dlús síolúcháin de chealla CaCo2, HCT116, SW620, agus cealla LoVo saothraithe i 96-phlátaí tobair ná 104 cill in aghaidh an tobair. Plátáladh cealla i meán faoi seach arna fhorlíonadh le 10% FBS 24 uair roimh chóireáil. Tar éis 24 uair an chloig, baineadh an meán agus déileáladh le cealla le 0, 0.25, 0.5, 1, agus 2 mg / mL de CTE ar feadh 24, 48, agus 72 uair an chloig ag 37 céim in atmaisféar humidithe ina raibh 5% CO2. Ar chóireáil CTE, baineadh an meán agus cuireadh 40 µL de thuaslagán MTT (0.5 mg/mL) le gach tobar.

Tar éis 3 h goir, baineadh an réiteach MTT, díscaoileadh an táirge formazan i dimethylsulfoxide (DMSO, SIGMA, an Ghearmáin), agus tomhaiseadh an t-ionsúcht ag 590 nm le léitheoir microplate (Infinite 200 PRO NanoQuant, Tecan Trading AG, an Eilvéis) .

Measúnacht apoptosis

Braitheadh ​​apoptosis i gcealla CaCo2, HCT116, SW620, agus LoVo trí úsáid a bhaint as PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I le 7-Amino-Actinomycin D (7-AAD) mar ruaim ríthábhachtach (Becton). Dickinson International, An Bheilg) de réir threoir an mhonaróra. Go hachomair, síolaíodh cealla i 24-plátaí tobair ag dlús 5×104 cealla/tobar i meán faoi seach arna fhorlíonadh le 10% FBS ar feadh 24 h sular cuireadh CTE leis (0, 0.5 , nó 1 mg/mL). Tar éis gor 24 CTE, baineadh cealla, nite faoi dhó le saline fuar maolánach fosfáit, agus dhaite le Phycoerythrin (PE) Aguisín V agus 7-AAD ar feadh 15 nóiméad ag teocht an tseomra sa dorchadas. Rinneadh anailís ar chealla dhaite laistigh de uair an chloig de réir cíteiméadracht sreafa ag baint úsáide as FACS. Cítiméadar sreafa Aria III agus bogearraí FACSDiva (Becton Dickinson) ag ráta sreafa íseal le 104 ceall ar a laghad. Baineadh úsáid as cóireáil ar chealla ar feadh 4 huaire an chloig le camptothecin 6 µM (SIGMA) mar rialú dearfach don mheasúnacht.

Táirgeadh ROS intracellular

Scrúdaíodh táirgeadh ROS intracellular ag baint úsáide as 2,7- diacetate dichlorodihydrofluorescein (DCFH-DA, SIGMA, an Ghearmáin). Is taiscéalaí neamhfhluaraiseacha é DCFH-DA, a ocsaídítear le ROS incheallach chuig an gcomhdhúil fluaraiseacha 2,7- dichlorofluorescein (DCF) (Poljak-Blazi et al., 2{011). Rinneadh measúnú DCFH DA ar an mbealach céanna agus a chuireamar síos roimhe seo (Cindric et al, 2013; Poljak-Blazi et al., 2011). Go hachomair, b'ionann an dlús síolúcháin de chealla CaCo2, HCT116, SW620, agus LoVo a saothraíodh i 96-phlátaí tobair dubha agus 104 cill in aghaidh an tobair. Plátáladh cealla sa mheán faoi seach agus forlíonadh 10% FBS ar feadh 24 uair. Sular ghoradh cealla cóireála le 10 µM DCFH-DA ag 37 céim ar feadh 30 nóiméad in aer 5% CO2 / 95%. Ansin nite cealla agus cuireadh cóireáil orthu le 0, 0.5, agus 1 mg/mL de CTE sa mheán w/o feanól dearg. Rinneadh monatóireacht leanúnach ar fhoirmiú ROS intracellular ar feadh 25 uair an chloig ag 37 céim agus 5% CO2 ag baint úsáide as léitheoir microplate le fluaraiseacht barr agus modúl rialaithe gáis (Infinite 200 PRO, Tecan Trading AG, An Eilvéis). Tomhaiseadh an déine fluaraiseachta le tonnfhad excitation de 500 nm agus braite astaíochtaí ag 529 nm. Bhí na haonaid treallach, aonaid fhluaraiseachta choibhneasta (RFU), bunaithe go díreach ar dhéine fhluaraiseachta.

TUBULOSA CISTANCHE NÁDÚRTHA CHUN FEIDHM DUINE A FHEABHSÚ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Giniúint superoxide mitochondrial

Measadh cumas CTE chun giniúint sárocsaíde trí miteacoindria a aslú trí úsáid a bhaint as taiscéalaí dearg MitoSOX (Life Technologies) atá tréscaoilteach cille, dírithe ar mhiotochondria agus Hoechst 33342 le haghaidh staining núicléach (Teicneolaíochtaí Beatha). Síolaíodh cealla CaCo2, HCT116, SW620, agus LoVo i 96-phlátaí tobair ag dlús 104 chealla in aghaidh an tobair i meán faoi seach arna fhorlíonadh le 10% FBS ar feadh 24 uair an chloig . Ansin luchtaíodh na cealla le 4 µM de MitoSOX agus 2 µM de Hoechst 33342 ar feadh 20 nóiméad, nite an iomarca dath, agus déileáladh le toibreacha le 0, 0.5, agus 1 mg/mL de CTE ar feadh 24 uair ag 37 céim agus 5% CO2. Tomhaiseadh an déine fluaraiseachta le tonnfhad excitation de 510 nm agus braite astaíochtaí ag 580 nm do MitoSOX agus tonnfhad excitation de 350 nm agus braite astaíochtaí ag 461 nm do Hoechst 33342 ag baint úsáide as léitheoir microplate le fluaraiseacht barr (Infinite 200 PRO, Tecan Trading AG, An Eilvéis)

Anailís staitistiúil

Taispeánadh staitisticí tuairisciúla mar an meán +/− SD. Rinneadh measúnú ar thábhacht na ndifríochtaí idir grúpaí trí úsáid a bhaint as T-thástáil na nDaltaí agus an triail Chi-chearnóg. Nuair a cuireadh níos mó ná dhá ghrúpa i gcomparáid, d’úsáideamar ANOVA aontaobhach le tástáil iar hoc cuí. Úsáideadh SPSS 11.01 do Mircosoft Windows. Measadh go raibh difríochtaí le P níos lú ná 0.05 suntasach go staitistiúil.

TORTHAÍ

Léirítear éifeacht CTE ar iomadú línte cille ailse drólainne daonna i bhFíor 1. Léirigh gach tiúchan CTE a tástáladh éifeacht láidir coisctheach ar líne cille CaCo2 ar bhealach tiúchana agus ama-spleách (Fíor 1A). Chuir seachtó dó uair an chloig de chóireáil CTE bac ar fhás cealla CaCo2 de níos mó ná 60% i gcomparáid le rialú (p < {2.05 do gach tiúchan). Braitheadh ​​tionchar suntasach cóireála CTE ar fhás cille HCT116 freisin ag pointí uile-ama ag an dá chomhchruinniú is airde (1 mg/mL agus 2 mg/mL), ag baint amach níos mó ná laghdú 70% ar an tiúchan deiridh (Fíor 1B, p < 0.05). Cé gur laghdaigh an dá chomhchruinniú CTE níos ísle (0.25 agus 0.5 mg/mL) fás cealla HCT116 go suntasach tar éis 24 uair an chloig (p.<0.05), they had no significant effect following 72 hours of treatment compared to control (p>{{0}}.{{10}}5). Deimhníodh níos mó ná 60% den tiúchan ab airde (p < 0.05) (Fíor 1C), cosc ​​ar iomadú ama agus tiúchana le CTE i gcealla LoVo. agus laghdaigh gach ceann de na ceithre chomhchruinniú CTE a tástáladh fás na gceall SW62{0 tar éis 48 uair an chloig (Fíor 1D, p < 0.05 do chách). Tar éis 72 uair an chloig de chóireáil, níor breathnaíodh an éifeacht chéanna ach amháin don dá chomhchruinniú is airde (p <0.05) agus níor léirigh tiúchan 0.25 agus 0.5 mg/mL aon éifeacht shuntasach i gcomparáid le rialú (p> 0.05). Rinneadh tástáil bhreise ar thionchar na cóireála CTE 0.5 agus 1 mg/mL ar ionduchtú apoptosis i ngach ceann de na ceithre líne cille (Fíor 2). Braitheadh ​​líon méadaithe cealla le linn apoptosis luath i HCT116 agus LoVo tar éis 24-uair an chloig cóireála le 0.5 mg/mL (lch<0.05, Figure 2B and 2C) and in all cell lines at 1 mg/mL (p<0.05). A significant increase in necrotic or late apoptotic cell number was further observed in CaCo2 and SW620 cell lines (p<0.05, Figure 2A and 2D). The ability of CTE to induce intracellular ROS production is demonstrated in Figure 3. Three hours following CTE treatment there was a strong increase in intracellular ROS production in all cell lines (p<0.05). The intracellular ROS production increased progressively throughout the 25 hours of treatment in a time and concentration-dependent manner. Furthermore, the staining of cells with a mitochondria-targeted probe revealed a strong impact of CTE on mitochondrial superoxide production in a concentration-dependent manner (Figure 4). The highest increase in superoxide production by mitochondria was observed in HCT116 (69%, Figure 4B) and LoVo cells (82%, Figure 4C) following 24-hour treatment with 1 mg/mL of CTE.

Fíor 1:ÉifeachtCistanche tubulosaar inmharthanacht línte cille ailse drólainne. Cuirtear inmharthanacht cille arna thomhas ag measúnacht MTT de chealla (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo, agus (D) SW620 i láthair mar chéatadán den líne chill ailse drólainne neamhchóireáilte rialaithe. Tugtar meánluachanna (±SD) do 5 mhacasamhail den turgnamh ionadaíoch: (*) tábhacht p<0.05 in comparison to control untreated respective cells.

Fíor 2: Iondaíonn sliocht uisce Cistanche tubulosa apoptosis i gcealla ailse drólainne daonna. Cuirtear anailísí citeiméadrachta sreafa Annexin-V-FITC ar chealla (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo, agus (D) SW620 i láthair mar chéatadán de líne chill ailse drólainne neamhchóireáilte rialaithe. Tugtar meánluachanna (±SD) do 3 mhacasamhail den turgnamh ionadaíoch: (*) tábhacht p<0.05 in comparison to control untreated respective cells.

Fíor 3: Spreagann sliocht uisce Cistanche tubulosa táirgeadh ROS incheallach in am agus dáileog-spleách. Cuirtear táirgeadh ROS arna thomhas ag measúnacht DCFH-DA i gcealla (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo, agus (D) SW620 i láthair mar mheánluachanna RFU (±SD) do na 5-macasamhlacha faoi seach de turgnamh ionadaíoch. (*) Tábhacht lch<0.05 in comparison to control untreated colon cancer cells. 

Fíor 4: Spreagann sliocht uisce Cistanche tubulosa táirgeadh sárocsaíde mitochondrial i gcealla ailse drólainne daonna. Cuirtear déine fluaraiseachta i gcealla MitoSOX Red dírithe ar mhiotochondria i gcealla A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo agus (D) SW620 i láthair mar chéatadán de líne cille ailse drólainne neamhchóireáilte rialaithe. Tugtar meánluachanna (±SD) do 5 mhacasamhail den turgnamh ionadaíoch: (*) tábhacht p<0.05 in comparison to control untreated colon cancer cells.

PLÉ

Cé gur thuairiscigh staidéir níos luaithe airíonna leighis iomadúla Cistanche tubulosa, is é seo an chéad tuarascáil ar a éifeacht frith-iomadaithe i gcealla urchóideacha. Léirigh comhdhúile bithghníomhacha Cistanche tubulosa a eastósctar le huisce, tuaslagóir an-polar, bithghníomhaíocht láidir frithailse. Rinneamar comparáid roimhe seo idir éifeachtúlacht Cistanche tubulosa atá solubilithe in uisce agus tuaslagóirí eile cosúil le meatánól agus aicéatáit eitile, ach léirigh eastóscáin uisce na gníomhaíochtaí frith-ailse is bisiúla (sonraí gan a bheith léirithe).

Tá sé léirithe againn go bhfuil cumas CTE ag 1 mg/mL agus 2 mg/mL bac a chur ar 60% d’fhás línte cille ailse drólainne bunscoile agus meatastatach araon, rud a léiríonn ról a d’fhéadfadh a bheith tábhachtach deCistanche tubulosamar chóireáil ailse drólainne. I gcomparáid le cealla gnáth, tá cealla ailse tréithrithe go ginearálta ag suaitheadh ​​i hoiméastáis redox agus straitéis choiteann na teiripí frithailse atá ann faoi láthair chun cur le strus ocsaídiúcháin cheallacha (Yang et al, 2013). Cé go bhfuil ról tábhachtach ag leibhéil ísle fiseolaíocha ROS mar mhóilíní comharthaíochta, is féidir le táirgeadh iomarcach ROS cur le héagobhsaíocht ailse agus le hurchóideacht (Liou agus Storz, 2010). Go paradacsach, fágann an éagothroime seo i hoiméastáis deargocsaí cealla ailse níos leochailí do bhás cille de bharr ROS (Jaganjac et al., 2008; Nogueira agus Hay, 2013). Is féidir éifeacht frith-iomadaithe CTE a tuairiscíodh sa staidéar seo a idirghabháil trí mheicníochtaí eischeallacha agus infhéitheacha éagsúla de chomhdhúile aitheanta agus anaithnide laistigh den sliocht, ag díriú ar ilbhealaí a bhfuil róil riachtanacha acu in apoptosis. Chun idirdhealú a dhéanamh idir modhanna éagsúla báis cille, rinneamar imscrúdú ar an meicníocht fhéideartha atá freagrach as an gcíteatocsaineacht a breathnaíodh de bharr CTE.

Sliocht CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12% in aghaidh Alzhermer

Tugann ár sonraí le fios go méadaíonn CTE táirgeadh ROS incheallach agus bás cille de bharr ROS dá bharr. Tá ról ríthábhachtach ag staid Redox na cille freisin i rialáil apoptosis agus tá an slabhra iompair leictreon mitochondrial ar cheann de na suíomhanna móra de ghiniúint cheallacha ROS (Trachootham et al., 2008). Ina theannta sin, d'fhéadfadh an ROS intracellular apoptosis ceallacha a chur faoi deara trí bhealaí neamhspleácha agus mitochondria-spleách (Sinha et al., 2013). Go deimhin, léiríonn ár gcuid sonraí freisin go bhfuil seachtrachú fosfatidylserine spreagtha ag CTE, ina éifeacht choitianta in apoptosis, i línte cille ailse bunscoile agus meiteastatacha araon, rud a thugann le tuiscint go bhfuil meicníocht an bháis spreagtha ag CTE idirghabhála ag apoptosis seachas necróis. Is straitéis cheartaitheach é gníomhachtú apoptosis i gcealla ailse agus féadfaidh go leor drugaí frith-ailse éifeachtaí apoptotic a imirt i gcealla ailse.

D’fhéadfadh comhdhúile nó eastóscáin a bhfuil gníomhaíochtaí pro-apoptotic acu i gcealla ailse a bheith úsáideach mar sin i dtaighde ar dhrugaí frith-ailse (Wong, 2011). Chun a chinneadh an bhfuil an éifeacht pro-apoptotic spreagtha ag CTE idirghabhála trí mheicníocht ROS spreagtha le mitochondria, thomhaiseamar táirgeadh superoxide ag baint úsáide as taiscéalaí fluaraiseachta spriocdhírithe mitochondria i gcealla cóireáilte CTE. Léiríonn ár gcuid sonraí go soiléir go spreagann CTE táirgeadh superoxide mitochondrial, rud a thugann le tuiscint go ndéantar gníomhaíocht frith-ailse Cistanche tubulosa ar a laghad a idirghabháil go páirteach trí mheicníocht ROS arna spreagadh ag mitochondria.

CONCLÚIDÍ

Mar fhocal scoir, tugann ár sonraí le fios go bhféadfadh sliocht uisce an ghléasra fásaigh Cistanche tubulosa a bheith ina iarrthóir geallta do chur chuige frith-ailse i gcomhar le teiripí traidisiúnta eile chun ailse drólainne a chosc agus a chóireáil. Léirímid freisin go ndéantar tocsaineacht an tsleachta plandaí i gcoinne cealla ailse a idirghabháil trí tháirgeadh ROS incheallach méadaithe agus, go páirteach ar a laghad, trí apoptosis atá ag brath ar mhiotochondrial. Tá tuilleadh staidéir ar siúl chun na comhábhair aonair atá gníomhach go bitheolaíoch atá freagrach as gníomhaíocht in aghaidh ailse a leithlisiú agus a shaintréithe.

Tá gá le tuilleadh taighde chun úsáid fhéideartha an tsleachta seo mar oibreán éifeachtach chemopreventive a mheas agus chun meicníochtaí gníomhaíochta ar chealla ailse drólainne ag an leibhéal móilíneach a thuiscint. Tá gá le tuilleadh staidéir réamhchliniciúla agus cliniciúla freisin chun na héifeachtaí tairbhiúla sláinte a breathnaíodh a dhearbhúCistanche tubulosa le haghaidh ailse a chosc.

 CISTANCHE TUBULOSA FHEABHSÚ COFFE CISTANCHE Cuimhne PHGS FRITH-TUILLEADH 75% ECH 30% ACHT 12%