R-Phycoerythrin Ó Colaconema Formosanum (Rhodophyta), Ábhar Frith-ailléirgeach Agus Collagen a Chur Chun Cinn Le haghaidh Cosmeceuticals

Coimriú:CistancheName(cistanche), coimpléasc lí a fhaightear in algaí dearga, a bhaintear agus a íonúó alga dearg nua-aitheanta,Colaconema foirmle, agus scrúdaíodh a bithghníomhaíochtaí. éNochtadh gocóireáil cistanche resulted in high cell viability (>70 faoin gcéad ) go dtí na línte cille mamaighNIH-3T3, RBL-2H3, RAW264.7, agus Hs68, agus ní raibh aon éifeacht acu ar mhoirfeolaíocht na gceall i gcealla NIH-3T3.Bhí a éifeacht choiscthe neamhshuntasach ar tháirgeadh IL-6 agus TNF- i lipopolysaccharide-spreagthacealla RAW264.7. Mar sin féin, ianófár cailciam A{23187-spreagtha - hexosaminidase scaoileadhi gcealla RBL H3 go héifeachtach ar mhodh dáileog-spleách. Ina theannta sin, nochtadh éa bheith neamh-irritating d'fhíocháin eipideirm bionic. Go háirithe, cuireadh táirgeadh procollagen chun cinn icealla Hs68. Tríd is tríd, léirigh na sonraí gocistéiríonaithe óC. formosanumtaispeántais frith-ailléirgeach agusbithghníomhaíochtaí frith-aosaithe gan aon tocsaineacht iarmhartach breathnaithe ar línte cille iolracha mamaighchomh maith le fíocháin epidermal, rud a thugann le tuiscint gur ábhar núíosach é an macromóilín seo d'acmhainneachtúsáid chosmaidigh.

Keywords: cosmaideacha; foirmi Colaconema;Cistanche; frith-ailléirge;frith-aosú

Cliceáil Anseo Chun Táirgí Cistanche Frith-Aosaithe a Fháil Ar Díol

1. Réamhrá

Is orgánaigh fhótaisintéiseacha iad algaí a fhaightear ar thalamh agus san aigéan. Mar chuid de na táirgeoirí príomhúla san aigéan, soláthraíonn algaí ocsaigin agus cothaithigh d'orgánaigh eile, a rialaíonn éiceachóras na mara. Fásann macroalgae (ar a dtugtar feamainn freisin) i gceantair chósta agus níl gnáthorgánaigh acu a fhaightear go coitianta i bplandaí talún [1]. Is féidir Macraalgae a idirdhealú trína lí agus déantar iad a chatagóiriú i dtrí ghrúpa, is iad sin Clorophyta (algaí glasa), Rhodophyta (algaí dearga), agus aicme Phaeophyceae (algaí donn) Ochrophyta [1]. Tá an ráta fáis macroalgae sách tapa, agus is féidir a gcoinníollacha fáis a ionramháil chun táirgeadh comhdhúile bithghníomhacha cosúil le próitéiní, polyphenols, agus líocha a rialú.2]. Go háirithe, de réir mar a tháinig méadú ar eolas a fháil ar chomhdhúile atá díorthaithe feamainne, tá méadú tagtha ina dhiaidh sin ar thaighde agus ar fhorbairt chun na comhdhúile seo a úsáid in iarratais leighis agus breiseán bia [3–6]. Ina theannta sin, tá níos mó tosaíochta ag baint le comhábhair nádúrtha seachas comhdhúile sintéiseacha i gcosmaidí, mar is gnách go mbíonn comhábhair nádúrtha níos sábháilte i gcomparáid leis an gceann deiridh. Tuairiscíodh go bhfuil algaí saibhir i substaintí bithghníomhacha amhail aigéid shailleacha neamhsháithithe, polyphenols, polaisiúicrídí, aimínaigéid, agus líocha [7,8]. Tá coimpléisc lí ar a dtugtar phycobiliproteins i gcuid acu, ar féidir iad a chatagóiriúphycoerythrocyanin (PEC), phycocyanins (PC), phycoerythrin (PE), agus allophycocyanins (APC) [9]. Is féidir PE, an príomh-lí i bhfeamainn dhearg, a fhochatagóiriú tuilleadh i C-phycoerythrin (C-PE), B-phycoerythrin (B-PE), agus Cistanche (cistanche) agus de réir a speictrim ionsúcháin, agus de réir an ghrúpa. na n-orgánach fótaisintéiseach a tháirgeann iad: C do chianóbaictéir, B do Bangiophyceae (Rodophyta fifilamentous primitive), agus R do Rhodophyta níos casta [10]. I measc na líocha seo, is é cistanche an phycobiliprotein is flúirseach in algaí dearga. Is próitéin oligomeric intuaslagtha in uisce é cistanche a úsáidtear go coitianta mar chlib fluaraiseacha i gcomhchíteiméadracht, i dtástálacha ELISA, agus i micreascópacht fhluaraiseachta [11–14] chomh maith le photosensitizer i teiripe ailse [15]. Ina theannta sin, tá sé léirithe go bhfuil airíonna bitheolaíocha ag PE, lena n-áirítear éifeachtaí frithvíreasacha, feabhsaithe díolúine, frith-ocsaídiúcháin, frith-athlasadh agus frith-meall (féach an páipéar athbhreithnithe le do thoil i [féach le do thoil).15] chun faisnéis níos coibhneasta a fháil), rud a fhágann gur cumaisc idéalach í le haghaidh feidhmeanna sna tionscail bia agus bithleighis, taighde ar bhitheolaíocht mhóilíneach, chomh maith le dath agusiarratais chosmaideacha [11,15,16].

Ag dul in aoisar cheann de na mórcheisteanna a bhaineann leis an gcraiceann, go háirithe do dhaoine atá faoi lé solas na gréine (nó gathanna ultraivialait) agus aer truaillithe ar feadh tréimhsí fada ama. Mar sin, díríonn an chuid is mó de tháirgí a bhaineann le cúram craiceann ar an gcraiceann a chosaint agus an próiseas aosaithe a mhoilliú. Is é craiceann an chéad líne cosanta do chorp an duine, agus cuidíonn sé le cosc ​​a chur ar an carnadh damáiste ó thruailliú, solas na gréine, agus strus ocsaídiúcháin nach féidir a sheachaint inár saol laethúil [17]. Le blianta beaga anuas, tá tomhaltóirí skeptical faoi chomhábhair cheimiceacha i dtáirgí cosmaideacha; dá bhrí sin, tá éileamh méadaitheach ar tháirgí atá inbhuanaithe don chomhshaol a tháirgtear trí úsáid a bhaint as acmhainní nádúrtha [1]. Sleachta algach, mar iad siúd óArtrospiraagusChlorella vulgaris, a thuairisciú go bhfuil siad tairbheach trí éifeacht teannta a imirt ar an gcraiceann, foirmiú stria a chosc, agus sintéis collagen a chur chun cinn [18]. De réir dealraimh, cuimsíonn na comhdhúile bithghníomhacha atá freagrach as na héifeachtaí frith-aosaithe seo polaisiúicrídí sulfáitithe, comhdhúile feanólacha, peptídí, aimínaigéid cosúil le mycosporine, agus líocha, i measc daoine eile.19,20]. Ina theannta sin, scrúdaíodh na substaintí bithghníomhacha a íonaíodh ó na heastóscáin algach le haghaidh bithghníomhaíochtaí sonracha atá tairbheach don chraiceann, agus cruthaíodh go heolaíoch go raibh na substaintí sách sábháilte, rud a cheadaigh cosmaidí a fhoirmiú ag baint úsáide as na substaintí bithghníomhacha íonaithe in ionad na n-sleachta iomlána [21]. Mar sin, tá éileamh ard ar cosmeceuticals ina bhfuil eastóscáin nó meitibilítí íonaithe a dhíorthaítear ó algaí [1]. I staidéir roimhe seo, straitéis saothraithe atá indéanta ó thaobh na teicneolaíochta agus na heacnamaíochta le haghaidh táirgeadh cobhsaí bithmhaiseColaconema foirmlebhunaigh Lee agus Yeh go rathúil in 2021 trí aonrúColaconema foirmleó dheisceart na Téaváine ag baint úsáide as córas laistigh [22,23]. Mar alga seadánacha,C. formosanumscoite amach ón macralga ar dtúsSarcodia suiaei ndeisceart na Téaváine [23]. Leis an próitéin ard (30 faoin gcéad de mheáchan tirim) agus ábhar cistanche ard (5 mg g−1 d) a fuarthas don speiceas seo [22], C. formosanumbuntáistí tionsclaíochta ollmhóra le haghaidh eastóscadh cistanche, agus táthar ag súil go mbeidh praghas margaidh cistanche níos inacmhainne. Ina theannta sin, thuairiscigh ár ngrúpa modh chun cistanche a bhaintear as a íonúC. formosanum[24]. Go bhfios dúinn, éifeachtaí cistanche óC. formosanumar chealla mamacha, chomh maith lena acmhainneacht mar bhithábhar nua sa tionscal cosmaidí, nach bhfuil iniúchadh déanta go fóill. Dá bhrí sin, sa staidéar seo, baineadh úsáid as anailísí in vitro éagsúla, mar shampla cíteatocsaineacht cille, measúnuithe díghrádaithe, cumas frith-athlastach, tástálacha frith-ailléirge, agus tástálacha sintéise procollagen chun na hipitéisí seo a fhíorú.

2. Ábhair agus Modhanna

2.1. Baint Cistanche (cistanche) as Colaconema Formosanum

Saothraíodh an alga i gorlanna (Tominaga, Cathair Taipei, Taiwan) ag 20± 1 ◦C, 60 ± 10 µmol fótóin m−2 s −1 (dé-óid astaithe solais, solas bán faoi stiúir), agus solas 12:12 h: fótatréimhse dorcha in eascra 5 L le 4L de mheán uisce farraige steiriliú PES (30 psu) ar feadh roinnt laethanta chun sampla oibre a fháil. Ansin, an modh a bhaint as cistancheC. formosanumsa staidéar seo a mhodhnú ón modh a thuairiscigh Lee et al. [24]. Ar dtús, baineadh phycobiliproteiní as an alga úrC. formosanum(100 g meáchan fliuch) i 1 L de saline maolánach fosfáit (PBS, pH 7.4) ag 4◦C. Chun díghrádú phycobiliprotein a choscle linn na dturgnaimh, 5 mM NaN3 agus cuireadh 4 mM EDTA le PBS. An algaí úrhomogenized ag baint úsáide as FastPrep{{0}} homogenizer (TeenPrep, 6 thimthriall, 4.0 m·s−1ar feadh 5 s;MP Bithleighis, Solon, OH, SAM). Rinneadh an sliocht a scagadh go garbh chun smionagar a bhaint, aguscuireadh an scagáit faoi lártheifneoiriú ag 20,000 rpm ag baint úsáide as lártheifneoir bairille (Beckman Coulter, Brea, California, SAM). Bailíodh an súithín dearg, ar a dtugtar sliocht cistanche, agusstóráilte ag 4◦C sa dorchadas. Rinneadh codánúchán ar an sliocht cistánach ina dhiaidh sinle (NH4)2MAR SIN,4 ag 20-60 faoin gcéad (w/v) saturation at4◦C. Bhí sulfáit amóiniam soladach go mallcurtha leis ag stirring mhín, agus fágadh an réiteach a scíth a ligean ar feadh 2 h, agus ina dhiaidh lártheifneoiriúag 10,000 rpm ar feadh 20 nóiméad ag 4◦C agus foirmiú deascán. Díscaoileadh an deascáni PBS (pH 7.4) agus scagdhealaithe thar oíche i gcoinne an mhaoláin chéanna. An dialyzed dearg-daiteCuireadh an réiteach trí 0.22-µm scagaire membrane (Merck Millipore, Burlington, MA,USA).

2.2. Íonú an chistín trí Chrómatagrafaíocht Mhalartaithe ian ag Úsáid Leacht Próitéin MhearCrómatagrafaíocht (FPLC)

Cuireadh na samplaí dialyzed de cistanche faoi réir crómatagrafaíochta ian-mhalartaithe icolún luchtaithe HiTrap DEAE FF (5 mL), a bhí réamhchothromaithe le 50 mM PBS (pH 7.4) ina raibh 10 mM NaCl. Tar éis na samplaí a rith, nite an colún go forleathan ag baint úsáide as maolán cothromaíochta. Rinneadh crómatagrafaíocht ian-mhalartaithe ina dhiaidh sin ag ráta elution 5 mL/nóiméad ag baint úsáide as elution grádán líneach idir 0.0 agus 500 mM NaCl. Bailíodh na codáin dearga eluted. An elutedrinneadh anailís ar chodáin de réir speictreafótaiméadracht UV-Vis ag baint úsáide as meánbhrú NGCcóras crómatagrafaíochta (BIO-RAD, Hercules, CA, SAM) ag tonnfhaid 280, 498, 566,agus 620 nm. Rinneadh anailís bhreise ar na codáin cistéise a fuarthas agus úsáid á baint as ionsúspeictream ó 300 go 700 nm agus a ritheadh ​​trí 0.22-µm scagaire (Merck Millipore,Burlington, MA, SAM).

2.3. Cultúr na Cille

Mar líne cille macrophage murine, saothraíodh RAW264.7 le DMEM ina raibh 4mM L-glutamine, décharbónáit sóidiam 1.5 g/L, agus 10 faoin gcéad FBS.Coinníodh na cilllínte go léir go comhsheasmhach agus coinníodh iad laistigh de shraith seomra tais37 céim le 5 faoin gcéad CO2, a buaileadh dhá uair sa tseachtain ag baint úsáide as nósanna imeachta caighdeánacha.

2.4. Grádú moirfeolaíoch agus Inmharthanacht na gCeall

MeasúnachtNIH-3Síoltadh cealla T3 i 96-phláta tobair (1× 104 cealla in aghaidh an tobair, Corning, Nua Eabhrac, NY, USA) le meán cultúir agus d'fhág a réiteach thar oíche. Cóireáladh cealla ansin le meán cultúir ina raibh {{0}} (rialú diúltach), 0.25, 0.5, 1, 2, 5, agus 10µg/mL de shleachta cistanche. Áiríodh na toibreacha ina bhfuil meánmhéid arna fhorlíonadh le 10 faoin gcéad DMSO (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAM) sa triail freisin mar ghrúpa rialaithe dearfach. Tar éis 24-h goir, rinneadh anailís ar ghrádú moirfeolaíoch do gach grúpa ag baint úsáide as an sainmhíniú ó [25], le gráid 0, 1, 2, 3, agus 4 gan ionadaíocht ar bith, beag,imoibríocht éadrom, measartha agus dian, faoi seach. Cuireadh imoibrí 1 mg/mL MTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAM) 48-h iarchóireála in ionad an mheáin chultúir agus gor é ar feadh 3 h. Cuireadh isopropanol isteach i toibreacha tar éis deireadh a chur leis an imoibrí MTT chun formazan a thuaslagadh, agus rinneadh anailís ar phlátaí ag baint úsáide as speictreafótaiméadar (Jasco Spectrophotometer V-630) ag tonnfhad 570 nm [26]. Más rud é go raibh an leibhéal inmharthanachta cille don dáileog sliocht cistanche is airde níos lú ná 70 faoin gcéad den ghrúpa rialaithe, ansin measadh go raibh sé citotocsaineach [25]. Ríomhadh céatadán inmharthanacht na gceall ag baint úsáide as an gcothromóid seo a leanas:

Inmharthanacht cille (dlús optúil, OD)=(OD na gceall nochta/OD na gceall rialaithe)× 100

2.5. Tástáil Frith-athlasadh

Chun a chinneadh anfrith-athlasadhcumas cistánach, idirleukin-6 (IL-6) agus fachtóir-alfa neacróis siadaí (TNF ) a aimsíodh sa staidéar seo de réir na bprótacal mar a thuairiscítear in [27,28]. Síolaíodh cealla RAW264.7 i 24-phláta tobair (5× 105 cealla/tobar) (Corning, Nua-Eabhrac, NY, SAM) agus d'fhág sé chun socrú síos thar oíche ag 37 céim . An lá dár gcionn, rinneadh cealla a chomhchóireáil le lipopolysaccharides (LPS, 1µg/mL, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAM) agus tiúchain mhéadaitheacha cistánach (0 (rialú diúltach), 1.25, 2.5, 5, 10, agus 20µg/mL). I gcomhthráth, rinneadh grúpa cille breise a comhchóireáladh le LPS agus an t-inhibitor p38 MAPK SB203580 (3µBunaíodh M, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAM) mar ghrúpa rialaithe dearfach. Tar éis 24 h, bailíodh an comhshnaidhm do gach grúpa chun an IL-6 a tháirgtear agus TNF- a bhrath . Cuireadh samplaí supernantant ar an Quantikine® Feisteáin ELISA Ceapaire Dathmhéadrach (Córais T&F, Minneapolis, MN, SAM). Céatadán an choisc ( faoin gcéad ) { {0 }}× (sampla/rialú). Ina theannta sin, cuireadh na cealla faoi mheasúnú MTT chun inmharthanacht cille a mheas tar éis cóireálacha.

2.6. Measúnacht Díghrádaithe

Mar líne chill leoicéime basafilic francach, úsáidtear an líne chill RBL-2H3 mar mhúnla do chrannchealla. RBL-2Taispeánann cealla H3 feinitíopaí crann mucosal agus aithnítear iad mar uirlis iontach chun rialáil freagairtí crannchealla a imscrúdú [29]. Mar sin, baineadh úsáid as an líne chill RBL-2H3 sa tástáil seo chun imscrúdú a dhéanamh ar an éifeacht a d’fhéadfadh a bheith ag cistanche ar dhíghrádú cranncheall. Baineadh úsáid as -hexosaminidase mar mharcóir chun monatóireacht a dhéanamh ar dhíghrádú cranncheall [30]. Tá an modh braite -hexosaminidase a mhodhnú ón tagairt [31]. RBL-2Síoltadh cealla H3 ag 1× 105 cealla in aghaidh an tobair i 24-plátaí saothraithe cille tobair (Corning, Nua-Eabhrac, NY, SAM). Cuireadh cóireáil ar chealla ar dtús le 1µM ianófár cailciam A23187 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, SAM) ina dhiaidh sin cuireadh dáileoga éagsúla cistanche (0 (rialú diúltach), 1.25, 2.5, 5, 10, agus 20 leisµg/mL) agus gor ar feadh 2 h. Ag an am céanna, cealla a bhí gortha le 100µBaineadh úsáid as M quercetin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAM) mar rialú dearfach. An mhodheolaíocht a úsáidtear le haghaidh - fuarthas cainníochtú hexosaminidase ó staidéir a foilsíodh roimhe seo [32,33]. Tar éis cóireála, beidh an comhshó (30µBailíodh L) ó gach tobar agus aistríodh iad chuig 96-pláta tobair nua sular cuireadh 50 leisµL de 4-nítrifeinil N-aicéitil- -D-glucosaminide (NP-GlcNAc, 1.3 mg/mL i maolán citrate (pH 4.5), Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAM). Fágadh an pláta chun fanacht ag 37 céim ar feadh 1 h, agus cuireadh deireadh leis an imoibriú trí 80 a chur leisµL de 0.5 M NaOH. Rinneadh anailís ar an pláta ansin le haghaidh aon fhoirmiú p-nitrophenolate ag baint úsáide as speictreafótaiméadar (Jasco, Halifax, NS, Ceanada) ag tonnfhad 405 nm. Baineadh úsáid as cealla a fágadh ón bpláta saothraithe bunaidh i measúnacht MTT chun inmharthanacht cille a scrúdú tar éis cóireálacha.

2.7. Tástáil Greannú Craicinn

Chun a fhíorú nach mbeadh cur i bhfeidhm tráthúla ina chúis le greannú an chraiceann, eipideirmBaineadh úsáid as fíochán mall chun aithris a dhéanamh ar chás inar cuireadh cisteastán i bhfeidhm ar an leibhéal fíocháin. AnIs príomhthástáil é measúnú ar ghreannú eipideirm le haghaidh aon fheiste leighis nó táirge chosmaidigh ionas nach gcuirfí ar fáil do thomhaltóirí ach táirgí a mheastar a bheith sábháilte don chraiceann. Tuairiscíodh go mbíonn tástálacha traidisiúnta ainmhithe ní hamháin ina gcúis le pian agus míchompord d’ainmhithe tástála, ach freisinní raibh tástáil den sórt sin ionadaíoch i gcónaí do na héifeachtaí a breathnaíodh ar dhaoine; dá bhrí sin, meastar go bhfuil sé buntáiste ag baint úsáide as fíochán bithónach atógtha mar go bhfuil cineálacha iomadúla cille acu timpeallaithe ag micri-thimpeallacht áitiúil, ag ionsamhladh craiceann daonna in vivo [34]. Rinneadh éifeachtaí cistanche ar ghreannú craicinn a mheas trí úsáid a bhaint as an bhfíochán eipideirm bithónach EpiDerm™ (MatTek LIFE SCIENCES, Ashland, MA, USA) de réir threoracha an mhonaróra agus le turgnaimh de réir na modheolaíochta a modhnaíodh ó thagairtí [35–37]. Cuireadh na hiontáin ina raibh an sampla EpiDerm isteach i 6-phláta tobair (Corning, New York, NY, USA) ina raibh DMEM réamhthéite. Méid 100µCuireadh L DMEM ina bhfuil {{{0}} (rialú diúltach) nó 1 mg/mL cistanche íonaithe (tiúchan deiridh 0.1 mg/mL) isteach i gcultúr na gceall ar bharr an tsampla EpiDerm. D'fheidhmigh fíocháin a ndearnadh cóireáil orthu le sulfáit dodecyl sóidiam 5 faoin gcéad (SDS) mar rialú dearfach. Tar éis 1-h goir i dtimpeallacht humidithe de 37◦C, 5 faoin gcéad CO2 gorlainne, baineadh na hiontáin agus nite iad faoi dhó le PBS (pH 7.4), agus ina dhiaidh sin cuireadh iad i 24-pláta tobair ina raibh 300µL de thuaslagán MTT 1 mg/mL (i DMEM). Tar éis 3-h goir, cuireadh isopropanol i bhfeidhm chun criostail formazan MTT a thuaslagadh. Aistríodh an comhshnámh chuig 96-pláta tobair, agus tomhaiseadh an sampla ag OD de 570 nm ag baint úsáide as speictreafótaiméadracht. Ríomhadh inmharthanacht choibhneasta de réir na cothromóide a bhfuil cur síos déanta air i Roinn2.4. Meastar go bhfuil ceimiceáin greannach nuair a laghdaíonn siad inmharthanacht cille go dtí níos lú ná 50 faoin gcéad (Catagóir 2), agus meastar gur neamhghreannaithe iad ceimiceáin a mbíonn inmharthanacht cille níos mó ná 50 faoin gcéad mar thoradh orthu (Gan Chatagóir) [37]. 

2.8. Sintéis Procollagen

ScrúdúRinneadh cealla Hs68 a ionaclú i 24-phláta tobair (2× 105 cealla/tobar) agus fágtha le socrú thar oíche. Cóireáladh cealla ina dhiaidh sin le meán cultúir ina raibh {{0}}, 0.625, 1.25, 2.5, 5, agus 10µsliocht cistanche g/mL. Cóireáladh an grúpa rialaithe dearfach le 100 ng/mL de fhachtóir fáis claochlaithe (TGF)- 1 (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAM) [38,39]. Ansin, 72-h iarchóireála, bailíodh an comhshnáthán ó gach sampla agus rinneadh é a bhrath procollagen. Monaclón frith-daonna procollagen Cineál IC Peptide (PIP) (Takara Bith, Shiga, an tSeapáin). (MK101) de réir threoracha an mhonaróra chun procollagen a bhrath. Ina theannta sin, rinneadh an measúnú MTT chun inmharthanacht cille a mheas tar éis cóireála.

2.9. Anailís staitistiúil

Rinneadh anailís ar na sonraí agus úsáid á baint as IBM SPSS Statistics 22.0 (IBM Corp, Armonk, NY, USA). Chuireamar na sonraí do gach grúpa faoi réir tástála Kolmogorov-Smirnov ar dtús chun a fhíorú go raibh siad dáileadh de ghnáth ( > 0.05) [40]. Daltait-úsáideadh tástáil chun inmharthanacht cille a anailísiú, IL-6, TNF- , - cosc ​​​​hexosaminidase, fíocháin epidermal, agus táirgeadh procollagen. Cuirtear na sonraí go léir i láthair mar mhodhanna± diall caighdeánach (SD), le gach turgnamh a dhéantar i quintuplicate. Ap-value < 0.05 measadh go raibh tábhacht staitistiúil leis.