Measúnú Cainníochtúil ar Insítí Athlasta i mBithopsí Trasphlandúcháin Duán ag Úsáid Ilphléacs Aimpliú Comhartha Tyramide Agus Foghlaim Dhomhain

Teagmháil: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Ríomhphost:audrey.hu@wecistanche.com

Meic Hermsen¹Valery Volk²Jan Hinrich Bräsen²et al

Teibí

Is fachtóir riosca láidir é feidhm ghreamaithe mhoillithe (DGF) maidir le forbairt fiobróis idir-rannach agus atrophy feadánacha (IFTA) i trasphlandú duáin. Is féidir le measúnú cainníochtúil ar insiltí athlastacha i mbithóipí duánach othar DGF marcóirí réamh-mheastacháin a nochtadh d’fhorbairt IFTA. Sa staidéar seo, chomhcheangail muid aimpliú comhartha tyramide ilphléacs (mTSA) agus líonraí néarúla convolutional (CNNanna) chun measúnú a dhéanamh ar an micrithimpeallacht inflammatory i bithóipsí duánach othar DGF (n=22) a glacadh ag 6 seachtaine tar éis trasphlandúcháin. Bhí othair srathaithe maidir le forbairt IFTA (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" one="" mtsa="" panel="" was="" developed="" for="" visualization="" of="" capillaries,="" t-="" and="" b-lymphocytes,="" and="" macrophages,="" and="" a="" second="" mtsa="" panel="" for="" t-helper="" cell="" and="" macrophage="" subsets.="" the="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged="" and="" custom-made="" python="" scripts="" enabled="" conversion="" to="" artificial="" brightfield="" whole-slide="" images="" (wsi).="" we="" used="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" with="" cytoplasmatic="" staining="" patterns="" in="" immunohistochemistry="" and="" developed="" two="" new="" cnns="" for="" the="" detection="" of="" macrophages="" and="" nuclear-stained="" lymphocytes.="" f1="" scores="" were="" 0.77="" (nuclear-stained="" lymphocytes),="" 0.81="" (cytoplasmatic-stained="" lymphocytes),="" and="" 0.82="" (macrophages)="" on="" a="" test="" set="" of="" artificial="" brightfield="" wsi.="" the="" cnns="" were="" used="" to="" detect="" inflammatory="" cells,="" after="" which="" we="" assessed="" the="" peritubular="" capillary="" extent,="" cell="" density,="" cell="" ratios,="" and="" cell="" distance="" in="" the="" two="" patient="" groups.="" in="" this="" cohort,="" the="" distance="" of="" macrophages="" to="" other="" immune="" cells="" and="" peritubular="" capillary="" extent="" did="" not="" vary="" significantly="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" between="" patient="" groups.="" cd163+="" cell="" density="" was="" higher="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (p="" <="" 0.05).="" cd3+cd8−/cd3+cd8+="" ratios="" were="" higher="" in="" patients="" with=""><10% ifta="" development="" (p="" <="" 0.05).="" we="" observed="" a="" high="" correlation="" between="" cd163+="" and="" cd4+gata3+="" cell="" density="" (r="0.74," p="" <="" 0.001).="" our="" study="" demonstrates="" that="" cnns="" can="" be="" used="" to="" leverage="" reliable,="" quantitative="" results="" from="" mtsa-="" stained,="" multi="" spectrally="" imaged="" slides="" of="" kidney="" transplant="">

Coscann Cistanche deserticola galar duáin, cliceáil anseo chun an sampla a fháil

Réamhrá

Tá feidhm ghreamaithe mhoillithe (DGF) tar éis trasphlandú duáin ilfhachtóiriúil agus baineann go príomha le tréithe deontóra agus am ischemia. Déantar cur síos ginearálta ar DGF mar an ngá atá le scagdhealú laistigh de 7 lá tar éis trasphlandúcháin agus is fachtóir riosca láidir é do ghortú duáin ainsealach [1-3]. Comhpháirt chlasaiceach de ghortú duánach ainsealach is ea láithreacht fiobróis interstitial agus atrophy feadánacha (IFTA). Mar sin féin, ní théann gach othar DGF ar aghaidh go dtí forbairt IFTA, agus ní thuigtear go dona fós an caidreamh casta idir DGF agus IFTA. Tarlaíonn sé seo ar dtús mar gheall ar an aga moille idir imeachtaí a d’fhéadfadh a bheith ina gcúiseanna agus meath feidhme, agus sa dara háit mar gheall ar éifeachtaí athraitheacha agus casta ionduchtóirí ionchasacha amhail diúltú agus fo-iarmhairtí cógas [1, 4]. Tá cur síos déanta i go leor staidéar ar láithreacht ginearálta athlasadh agus macrophages ar leith mar thuar le haghaidh caillteanas graft [5-8]. Mar sin féin, ní thuigtear go hiomlán na bunphróisis phaiteolaíocha, agus ní bhíonn caillteanas nódúcháin fadtéarmach mar thoradh ar leibhéil arda athlasadh i gcónaí. Mar thoradh ar spreagthaigh comhshaoil, faigheann macrophages feidhmeanna speisialaithe agus polaraítear iad i feinitíopaí éagsúla. Tugann staidéir iomadúla le fios go bhfuil baint ag fo-chineálacha macrophage sonracha (macrophage a ghníomhaítear go malartach) le hathmhúnlú fíocháin trí dheisiú fíocháin nó fiobróis a spreagadh. Is eol go bhfuil an polarú i dtreo feinitíopa athmhúnlaithe fíocháin (uaireanta pro-fibrotic) ag brath ar raon leathan spreagthaí comhshaoil, i measc cinn eile a sholáthraíonn subtypes limficítí T-helper [9-11]. Léirigh measúnú ar dhaonraí cille T-chúntóra sa ghreamacht tráth DGF fochineál T-chúntóir 1 forleithne, ach níor imscrúdaíodh comhghaolta le toradh nódúcháin nó dul chun cinn chuig IFTA go dtí seo [12]. D'fhéadfadh measúnú cuimsitheach ar an micri-thimpeallacht athlastach atá dírithe go sonrach ar mhacróipeanna agus fo-thacair cille T-chúntóra i gcohóirt othar roghnaithe go cúramach léargas a thabhairt ar an bhfáth go dtéann roinnt othar DGF, ach nach bhfuil gach othar DGF ar aghaidh chuig forbairt IFTA.

Mar sin féin, cuireann roinnt teorainneacha (teicniúla) bac ar imscrúdú cuimsitheach ar insiltí athlastacha. Tacaíonn teicnící inmunhistochemistry traidisiúnta (IHC) agus inmunofluorescence le léirshamhlú ach líon teoranta marcóirí cille i rannóg fíocháin amháin. Níl sé inmhianaithe blúirí beaga luachmhara fíocháin cosúil le bithóipsí duán a ghearradh go sraitheach agus tá sé deacair an caidreamh idir cealla i gcodanna éagsúla a léirmhíniú. Ina theannta sin, tagann leibhéal suntasach inathraitheachta idirbhreathnadóirí le measúnú cainníochtúil ar insíothlú athlastacha trí mheastachán amhairc [13]. Braitheann teicnící próiseála íomhá traidisiúnta ar nós tairseach picteilín, tairseach, agus deighilt atá bunaithe ar mhoirfeolaíocht ar réamheolas ar gach léiriú cille moirfeolaíoch agus déine stainse fíocháin ar fud tacar sonraí [14-16]. Dá bhrí sin, is minic a bhíonn easpa stóinseachta ag na modhanna seo maidir le héagsúlachtaí íomhánna bitheolaíocha agus teicniúla agus is minic a aistrítear go dona go tacair sonraí nua nó sheachtracha. Chuir an t-ardú ar phaiteolaíocht dhigiteach dlús le forbairt modhanna malartacha chun íomhánna lánsleamhnáin (WSI) a mheasúnú [17, 18]. Tá sé cruthaithe go bhfuil múnlaí domhainfhoghlama, go sonrach, líonraí néaracha conbhlóideacha (CNNanna) in ann struchtúir bhitheolaíocha ábhartha a dheighilt agus a bhrath i sleamhnáin histeapaiteolaíocha [19-23]. Tá an poitéinseal ag na teicníochtaí seo aistriú ó mheastachán amhairc suibiachtúil agus próiseáil íomhá thraidisiúnta go braite cille atá cruinn, oibiachtúil agus in-atáirgthe.

Tá sé mar aidhm ag an staidéar seo modh a fhorbairt chun measúnú oibiachtúil, cainníochtúil a dhéanamh ar mharcóirí cille il-athlasacha, ag dul timpeall ar an ngá atá le síneadh sraitheach sleamhnáin fhairsing. Chun é sin a dhéanamh, cuirimid le chéile IHC ilphléacs, íomháú ilspeictreach, agus samhlacha domhainfhoghlama. Chun infheidhmeacht na dteicníochtaí seo a léiriú, déanaimid staidéar ar chomhghaolú an mhicrea-thimpeallacht athlastach, arna chainníochtú ag samhlacha domhainfhoghlama, le forbairt IFTA i mbithóipí grafta faireachais na n-othar DGF.

sliocht cistanche cóireáil galair duáin

abhair agus modhanna

Chun measúnú a dhéanamh ar an micrithimpeallacht athlastach i mbithóipí duánach othar DGF, rinneamar IHC ilphléacs ar bhithóipí faireachais a glacadh 6 seachtaine tar éis trasphlandúcháin. Bhí othair srathaithe maidir le forbairt IFTA (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" multiplex="" ihc="" was="" performed="" using="" tyramide="" signal="" amplification="" (mtsa)="" panels.="" one="" mtsa="" panel="" was="" designed="" for="" the="" visualization="" of="" capillaries,="" macrophages,="" and="" t="" and="" b="" lymphocytes="" (panel="" i),="" and="" one="" mtsa="" panel="" for="" the="" visualization="" of="" polarized="" t-helper="" lymphocytes="" and="" macrophages="" (panel="" ii).="" second,="" the="" mtsa="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged,="" and="" custom-made="" python="" scripts="" were="" used="" to="" convert="" the="" multispectral="" images="" to="" artificial="" brightfield="" ihc="" wsi.="" converting="" the="" slides="" to="" artificial="" ihc="" wsi="" allowed="" for="" the="" application="" of="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" in="" ihc="" [22].="" this="" existing="" cnn="" was="" designed="" for="" cytoplasmatic="" lymphocyte="" markers.="" hence,="" a="" second="" and="" third="" cnn="" was="" developed="" in="" this="" study="" for="" the="" quantification="" of="" macrophages="" and="" nuclear="" lymphocyte="" markers="" in="" ihc="" wsi.="" these="" three="" cnns="" were="" subsequently="" used="" to="" quantitatively="" assess="" the="" inflammatory="" infiltrates="" in="" the="" two="" patient="" groups="" and="" to="" study="" the="" correlations="" of="" the="" inflammatory="" microenvironment="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" with="" the="" development="" of="" ifta="" 6="" months="" after="">

Samplaí fíocháin

D’úsáideamar bithóipsí faireachais ó fhaighteoirí trasphlandúcháin duán ag Scoil Leighis Hannover (Hannover, an Ghearmáin), a fuarthas i gcomhthéacs clár bithóipse faireachais ionchasaigh. Ba iad seo a leanas na critéir chuimsithe: Tarlú DGF (sainithe mar<500 ml="" urine="" production="" within="" the="" first="" 24="" h="" after="" transplantation="" and/or="" the="" need="" for="" dialysis="" within="" 7="" days="" post-transplantation),="" absence="" of="" rejection="" in="" any="" of="" the="" surveillance="" biopsies="" or="" biopsies="" for="" cause="" within="" the="" first="" year="" post-transplantation,="" and="" absence="" of="" ifta="" in="" the="" surveillance="" biopsy="" taken="" at="" 6="" weeks="" after="" transplantation="" (based="" on="" the="" pathology="" report="" and="" graded="" according="" to="" the="" banff="" lesion="" grading="" system="" [24]).="" all="" patients="" were="" treated="" with="" dialysis="" because="" of="" no,="" or="" insufficient="" graft="" function,="" variably="" manifested="" by="" (combinations="" of)="" anuria,="" oliguria,="" metabolic="" de-arrangement="" with="" acidosis,="" or="" hyperkalemia.="" none="" of="" the="" patients="" had="" hyperkalemia="" or="" hypervolemia="" alone.="" formalin-fixed,="" paraffin-embedded="" tissue="" (ffpe)="" from="" biopsies="" taken="" 6="" weeks="" and="" 6="" months="" post-transplantation="" was="" collected.="" six="" patients="" did="" not="" undergo="" a="" surveillance="" biopsy="" procedure="" 6="" months="" after="" transplantation.="" instead,="" the="" surveillance="" biopsy="" was="" taken="" at="" 3="" months="" post-transplantation="" was="" included="" (n="3)" or="" the="" nearest="" cases="" with="" sufficient="" cortical="" tissue="" (here="" defined="" as="" ≥4="" glomeruli)="" in="" both="" the="" 6="" weeks="" and="" the="" 6="" months="" biopsy="" were="" included="" in="" the="" study="" (n="24)." one="" case="" was="" excluded="" because="" of="" interstitial="" nephritis="" of="" unknown="" cause="" and="" one="" more="" case="" due="" to="" fixation="" artifacts.="" a="" final="" number="" of="" 22="" patients="" were="" included="" in="" this="" study="" (table="">

Measúnú IFTA

Fuarthas méid na fiobróis interstitial (ci) agus atrophy feadánacha (ct) (IFTA) ag 6 seachtaine agus 6 mhí, arna chur in iúl ag baint úsáide as córas grádaithe loit Banff [24] ón tuarascáil paiteolaíochta. Chun measúnú níos mine a dhéanamh ar an ngaol idir insiltí luatha athlasadh agus forbairt IFTA, rinneadh gach sleamhnán daite PAS a dhigitiú lena athscrúdú ag baint úsáide as scanóir sleamhnáin digiteach Flash II Pannoramic 250 (3DHistech, an Ungáir) le 20 × oibiachtúil ag taifeach 0.24 μm/ picteilín. Scóráil triúr paiteolaithe duáin an WSI PAS den dá phointe ama (6 seachtaine agus 6 mhí) le haghaidh mhéid IFTA (céatadán an achair dromchla, le eatraimh 10 faoin gcéad). Baineadh úsáid as meánscóir IFTA na bpaiteolaithe mar scór deiridh chun an t-athrú ar IFTA idir 6 seachtaine agus 6 mhí tar éis trasphlandúcháin a ríomh. Bhí othair srathaithe ag méadú absalóideach ar scór IFTA de 10 faoin gcéad nó níos mó (n=13) agus ní raibh nó<10% increase="" of="" ifta="" (n="9)" (table="" 1).="" recipient="" characteristics,="" donor="" characteristics,="" and="" banff="" ci,="" ct,="" ti,="" i,="" and="" i-ifta="" lesion="" scores="" (obtained="" from="" the="" pathology="" report)="" are="" listed="" in="" table="" 1="" for="" both="" patient="" groups.="" significant="" differences="" between="" patient="" groups="" were="" assessed="" using="" the="" independent="" samples="" mann–whitney="" u="" test="" or="" fisher's="" exact="" test="" and="" are="" displayed="" in="" table="">

Ina theannta sin, rinneadh comparáid idir scóir lota Banff idir pointí ama ag baint úsáide as tástáil céimeanna sínithe Wilcoxon. Nocht sé seo difríochtaí suntasacha idir bithóipsí 6 seachtaine agus 6 mhí do chatagóirí Banff ti (p=0.017), ci (p=0.004), agus ct (lch=0.011) .

Ilphléacs TSA staining

Rinneamar IHC ilphléacs ag baint úsáide as mTSA chun marcóirí ilcheall a shamhlú sna bithóipsí 6 seachtaine. Tar éis gortha le hantasubstaint phríomhúil agus tánaisteach, cuireadh cóireáil ar an bhfíochán le tyramide lipéadaithe fluaraiseacha. Déanann an peroxidase capall-raidis ón antasubstaint thánaisteach catalyzes ar fhoirmiú fréamhacha tyramide gníomhach. Ceanglaíonn na fréamhacha tyramide go comhfhiúsach leis na hiarmhair tyrosine ar an antigen. Cheadaigh an ceangal buan seo an coimpléasc antashubstainte bunscoile-tánaisteach a bhaint as teas-spreagtha agus an taisce tyramide fluaraiseacha á chaomhnú [25]. Chuir sé seo ar chumas an chothaithe leantach ina dhiaidh sin le tuilleadh antasubstaintí ón speiceas céanna i gcoinne na sprice antigens.

Rinneadh mTSA ar dhá shleamhnán as a chéile ó na bithóipsí faireachais 6 seachtaine. D'fhorbraíomar dhá phainéal mTSA chun measúnú a dhéanamh ar an méid insíothlaithe athlastacha agus ribeadáin peritubular inár ngrúpaí othar. Bhí antashubstaintí frith-CD3, CD4, CD8, CD20, CD68, agus CD34 ann ar phainéal I. Baineadh úsáid as Painéal II chun polarú cille T-helper agus macrophage a imscrúdú trí úsáid a bhaint as antasubstaintí frith-CD4, Tbet, GATA3, CD68, agus CD163. Tá sonraíochtaí antashubstainte, caoluithe, agus orduithe stainithe liostaithe i dTábla Forlíontach 1. Rinneadh na sleamhnáin go léir a dhíhiodráitiú i xiléin, díhiodráitíodh iad in eatánól 95 faoin gcéad, nite in uisce sconna, agus bruite iad chun epitóp a aisghabháil i 10x tris-borate-EDTA caolaithe (TBE 10x). , 0658, VWR Life Sciences, US) maolán. Tar éis fuaraithe síos, nite na sleamhnáin i dtuaslagán hidrigine peroxidase 3 faoin gcéad le haghaidh blocáil peroxidase endogenous agus nite le maolán saline tris-buffered le 0.05 faoin gcéad Tween 20 (822184, Merck KGaA, an Ghearmáin) (TBS-T). Rinneadh blocáil próitéine trí úsáid a bhaint as TBS-T le 1 faoin gcéad de shéiream albaimin buaibheach (BSA) (mTSA céim 1). Goradh antasubstaintí príomhúla ar feadh 1 h ag teocht an tseomra, nó thar oíche ag ceithre chéim Celsius (mTSA céim 2). Tar éis níocháin i TBS-T, goradh na sleamhnáin le hantasubstaint tánaisteach comhchuingeach HRP (Poly-HRP-GAMs/Rb IgG, VWRKDPVO999HRP, Immunologic, An Ísiltír) ar feadh 30 nóiméad ag teocht an tseomra (mTSA céim 3). Ansin, rinneadh TSA ag baint úsáide as fluorophores Opal TSA ó Kit IHC datha Opal (NEL811001KT, Akoya Biosciences, SAM) (mTSA céim 4) (tá fluorophores agus a n-antasubstaintí comhfhreagracha liostaithe i dTábla Forlíontach 1). Baineadh an coimpléasc antashubstaint-TSA le timthriall fiuchphointe i maolán TBE (céim 5 mTSA). Rinneadh céimeanna mTSA 1–5 arís go dtí gur dhaite na sleamhnáin le gach antasubstaint ón bpainéal imní. Clúdaíodh na sleamhnáin le fluoromount-G le DAPI (00-4959-52, Thermo Fisher, SAM).

cisteán luibhe

Ilphléacs TSA bailíochtú

Is féidir le timthriallta fiuchphointe arís agus arís eile difear a dhéanamh ar an sprioc-chleamhnas epitope. Léiríonn roinnt antasubstaintí patrún staining níos laige tar éis an fíochán a bheith bruite go minic, tá níos mó timthriallta fiuchphointe ag teastáil ó antasubstaintí eile chun an déine staining is fearr a bhaint amach, agus ní dhéantar difear do dhaoine eile ar chor ar bith. Rinneamar measúnú ar an éifeacht seo do gach antasubstaintí a úsáideann IHC chromogenic ar fhíochán tonsilí rialaithe FFPE. I gcás gach antashubstainte a tástáladh (n=9), gearradh sé chuid (4 μm tiubh). Rinneadh na sleamhnáin go léir a dhí-phailiú i xiléin, díhiodráitíodh iad in eatánól 95 faoin gcéad, nite in uisce sconna, agus bruite iad le haghaidh aisghabhála epitope i 10x TBE caolaithe (timthriall fiuchphointe a haon). Tar éis fuarú síos, stóráiltear sleamhnán amháin in aghaidh an fhrithchorp tástála i saline maolánach fosfáit (PBS). Bhí na sleamhnáin atá fágtha bruite arís. Rinneadh an timthriall seo arís cúig huaire. Ina dhiaidh sin nite na sleamhnáin go léir i dtuaslagán sárocsaíd hidrigine 3 faoin gcéad agus sruthlaithe i PBS ina dhiaidh sin. Goradh antasubstaintí príomhúla (Tábla Forlíontach 1) ar feadh 1 h ag teocht an tseomra. Tar éis goir, nite na sleamhnáin i PBS. Bhí gá le gor breise le blocáil iar-antasubstaintí (PAB) ar feadh 15 nóiméad (blocáil VWRKDPVB, Imdhíoneolaíochta, an Ísiltír) ar na sleamhnáin a dhaite le frith-CD68, an Tibéid, agus GATA3. Tar éis gortha, nitear na sleamhnáin i PBS agus goraíodh iad le hantasubstaint thánaisteach comhchuingeach HRP (tar éis PAB VWRKDPVB110HRP, Immunologic, The Netherlands, do dhaoine eile, féach Tábla Forlíontach antashubstainte tánaisteach 1). Rinneadh léirshamhlú agus úsáid á baint as 3,3′- diaminobenzidine (DAB) (Bright-DAB, VWRKBS04, Immunologic, An Ísiltír). Léirítear na torthaí i bhFíor Forlíontach 1. Bunaithe ar na torthaí seo, chinneamar an t-ord antashubstainte is fearr do na turgnaimh mTSA, mar atá liostaithe i dTábla Forlíontach 1.

Má chomh-locántar epitopes spéise, is féidir leis an taiscí tyramide cur isteach ar a chéile. Chun tástáil a dhéanamh ar an gcosc steiriúil seo, d'úsáideamar sleamhnáin fíocháin rialaithe tonsilí agus rinneamar iad seo a dhaite lenár bpainéil mTSA. Cuireadh an léiriú antasubstainte sa mTSA i gcomparáid leis an léiriú i sleamhnáin aon-dhaite, a chuaigh tríd an líon céanna timthriallta fiuchphointe. Níor thugamar faoi deara difríochtaí i bpatrúin dhaite idir na sleamhnáin dhaite singil agus ilphléacs (samplaí san áireamh ó phainéal I, Fíoracha Forlíontacha. 2 agus 3). Baineadh úsáid as gach antashubstaint phríomhúil sa mTSA sa chaolú céanna a úsáideadh le haghaidh IHC crómaigineach. Optamaíodh déine an chomhartha fluaraiseach trí chaoluithe réitigh TSA a choigeartú.

Ilphléacs íomháú TSA

Rinneadh íomháú ilspeictreach ag baint úsáide as Córas Íomháithe Vectra Polaris (CLS143455, Akoya Biosciences, SAM) le cuspóir 20x, ag taifeach 0.49 μm in aghaidh an picteilín, agus ag baint úsáide as DAPI, FITC, CY3, Texas Red, agus Ciúbanna speictreach Cy5. Ceadaíonn an córas Vectra roghnú láimhe de réigiúin le haghaidh éadáil ilspeictreach, a roinntear ina dhiaidh sin ag an gcóras ina tíleanna (Fíor 1.1). Rinneadh speictream an fhluaraiseachta uathoibríoch agus gach fluarafóir Opal TSA a réamhthaifeadadh i “leabharlann” speictreach agus úsáid á baint as Bogearraí Inform Advanced Image Analysis 2.4.6. (Akoya Bitheolaíochtaí, SAM). Chuir an leabharlann speictreach ar a gcumas an tíl ilphléacs a dhianscaoileadh ina il-thíleanna singil a léirigh an méid a chuireann gach fluairafóir ("dímheascadh"). Ba é an toradh a bhí air seo ná tíleanna monacrómacha, ilchainéil, gach cainéal ag freagairt d'fhliúra singil agus mar sin, antashubstaint (Fíor 1.2).

Tiontú go IHC saorga gealaí

Bunaithe ar chomhordanáidí stóráilte, fuaite na tíleanna chun WSI ilchainéil a chruthú ag baint úsáide as script python saincheaptha (Fíor 1.3). Tiontaíodh na cainéil a sheasann don chomhartha DAPI (IDAPI) agus na cainéil a sheasann do cheann de na hantasubstaintí (IIHC) go haematocsailín saorga agus staining DAB, faoi seach (Fíoracha 1.4 agus 1.5). Bunaithe ar hematoxylin crómatach aitheanta agus DAB Cx, comhordanáidí Cy tar éis trasfhoirmiú lí-sáithiúcháin-dlúis (HSD), fuarthas veicteoirí stain i staidéir roimhe seo [26, 27]. Baineadh úsáid as na veicteoirí stainse seo chun na luachanna dearg-glas-gorm a ríomh don IHC réimse gealaí (Fíor 1.5), mar:

le CR, st an t-ionsú solais de dhath st sa chuid dearg den speictream. Ríomhadh luachanna do B agus G ar an mbealach céanna.

Anailís íomhá

Réigiúin spéise (ROI)

Rinneadh na réigiúin spéise (ROI) a anótáil do gach cás sa chohórt ag baint úsáide as bogearraí an ardáin anailíse sleamhnáin uathoibrithe (ASAP; leagan 1.9, atá ar fáil mar bhogearraí foinse oscailte ar GitHub). Is éard a bhí sna ROIanna seo ná tubulointerstitium cortical, rud a fhágann nach n-áirítear an capsule, glomeruli, agus artairí. Ós rud é go meastar go bhfuil athlasadh i réigiúin fochaipse duánach neamhshonrach i bpaiteolaíocht trasphlandúcháin, rinneadh anailís go príomha ar na bithóipsí sa staidéar seo gan an réigiún fochaipíneach a áireamh (sainithe mar 400 µm faoi bhun an capsule). Ar an dara dul síos, rinneamar na hanailísí arís agus arís eile lena n-áirítear an réigiún subcapsular. Tá samplaí amhairc de na ROIanna san áireamh in Fíor 4 Forlíontach.

Brath limficítí CNN I

Rinneadh anailís ar na híomhánna saorga gealaí IHC a léiríonn staining CD3, CD4, CD8, agus CD20 ag baint úsáide as CNN atá ann cheana féin le hailtireacht U-Net [22, 28]. Dearadh an gréasán seo go sonrach chun marcóirí limficítí cíteaplasma a bhrath in IHC. Is féidir feidhmíocht CNN a chur in iúl i beachtas, athghairm, agus scór F1-, nuair:

Bhain an CNN beachtas de {{0}}.76 amach, aisghairm 0.79, agus scór F1-0.78 ar an tacar tástála a úsáideadh sa pháipéar bunaidh, comhdhéanta de WSI traidisiúnta IHC. Chun cealla dearfacha aonair a bhrath ní mór aschur CNN a thairseach, agus iarphróiseáil ina dhiaidh sin. Toisc go raibh an staining CD3 sa phainéal mTSA níos láidre i gcomparáid le CD4, CD8, agus CD20, baineadh úsáid as tairseach braite réad níos ísle do na trí cinn deiridh (0.4) agus an tairseach braite réad bunaidh le haghaidh CD3 (0.7). Chun measúnú a dhéanamh ar fheidhmíocht CNN ar na WSIanna IHC gealaí saorga sa staidéar seo, baineadh úsáid as ceithre WISI IHC gealgháire saorga (CD8 agus CD20 ó dhá othar) mar thacar tástála sa staidéar seo. Gineadh nótaí ponc (n=1115) le bogearraí ASAP. Tar éis an líonra a chur i bhfeidhm, ríomhadh beachtas, aisghairm, agus scór F1- chun feidhmíocht CNN a mheas. Measadh go raibh braite fíor-dhearfach má fuarthas iad laistigh de 4 µm (meántrastomhas limficíte) ó nóta fírinne na talún. Nuair a thángthas ar dhá bhrath laistigh de raon 4 µm, níor measadh go raibh ach an bhrath is gaire don nóta fíor-dhearfach. Ina dhiaidh sin, úsáideadh braite limficítí CNN I chun anailís a dhéanamh ar gach WSI IHC réimse geal saorga a ionadaíonn marcóirí limficítí cíteaplasma (CD3, CD4, CD8, agus CD20).

Brath limficítí CNN II

Roghnaíodh an anailís ar WSI IHC gealaí saorga le patrúin smálaithe núicléacha (mar a chuirtear i láthair ag T-bet agus cainéil GATA3) a ionadaíonn DAPI agus CD4 le cur le chéile in aon WSI amháin (4). Baineadh úsáid as veicteoirí staine a fuarthas i staidéir roimhe seo chun comhartha DAPI a dhathú go gorm (hematoxylin) agus an comhartha CD4 donn (DAB), rud a d'fhág go raibh réimse geal saorga IHC WSI (5).

oiliúint riachtanach, bailíochtú, agus tástáil CNN nua. Chun na críche seo, gearradh naoi sleamhnán ó fhíochán rialaithe FFPE duáin, tonsilí, agus aguisín. Bhí na sleamhnáin seo daite IHC le frith-Tibéid (clón 4B1{{10}}, 14-5825-82, Thermo Fisher Scientific, SAM) agus frith-GATA3 (clón L50-823, CM -405B, Biocare Medical, an Ísiltír) antasubstaintí. Rinneadh na sleamhnáin a dhigitiú trí úsáid a bhaint as scanóir sleamhnáin digiteach Pannoramic 25{0 Flash II ag taifeach 0.12 μm/picteilín. Tháirg beirt bhreathnóirí 5726 poncanna thar réigiúin éagsúla ag baint úsáide as bogearraí ASAP. Baineadh úsáid as nótaí ó chúig shleamhnán chun ailtireacht U-Net CNN a oiliúint ag baint úsáide as paistí de 256 × 256 picteilín le méid picteilín de 0.49 μm/ picteilín. Baineadh úsáid as dhá WSI chun an CNN a bhailíochtú agus chun an tairseach braite réad a chinneadh (0.4). Rinneadh feidhmíocht CNN ar WSI traidisiúnta IHC a mheasúnú ar thacar tástála siarchoinneálach de dhá WSI IHC. Rinneadh measúnú ar fheidhmíocht CNN ar réimse geal saorga IHC WSI ar thacar tástála tánaisteach a chuimsigh ceithre WSI gealréimse saorga (an Tibéid agus GATA3 ó dhá othar) le 1082 nóta ponc. Ríomhadh beachtas, athghairm, agus scór F chun an fheidhmíocht ar an dá thacar tástála a mheas. Measadh go raibh braite fíor-dhearfach má fuarthas iad laistigh de 4 µm ó nóta fírinneachta. Nuair a thángthas ar dhá bhrath laistigh de raon 4 µm, níor measadh go raibh ach an bhrath is gaire don nóta fíor-dhearfach. Ina dhiaidh sin, baineadh úsáid as braite limficítí CNN II chun anailís a dhéanamh ar gach WSI IHC gealréimsí saorga a léiríonn marcóirí núicléacha (limficítí) (An Tibéid agus GATA3).

Brath Macrophage CNN

I gcodarsnacht le braiteadh limficítí, níl sainaithint mhacrafagáin aonair aonchiallach. Go háirithe i radharcanna cnuasaithe, is féidir a bheith ag súil le leibhéal suntasach inathraitheachta breathnóirí. Mar sin, baineadh úsáid as líon i bhfad níos mó cásanna agus nótaí daonna chun oiliúint a chur ar an tríú CNN tiomnaithe chun CD68 móide agus CD163 móide macrophages a bhrath. Bailíodh sleamhnáin dhaite IHC (n=111) ó fhíochán duánach dúchasach agus trasphlandúcháin. Rinneadh stainings IHC ag baint úsáide as frith-CD68 (clón PG-M1, GA61361-2, Dako Omnis, an Danmhairg nó clón KP1, M0876, Dako, an Danmhairg) nó frith-CD163 (clóin MRQ -26, nó antasubstaint 10D6, NCL-L-CD163, Leica Biosystems, RA). Rinneadh na sleamhnáin IHC a dhigitiú trí úsáid a bhaint as scanóir sleamhnáin dhigitigh lánléargais 25{0 Flash II nó Scanóir Sleamhnán Aperio AT2 (Leica Biosystems, Wetzlar, an Ghearmáin) ag taifeach 0.24 nó 0 .25 μm/picteilín, faoi seach. Tháirg ceithre bhreathnadóir 37,709 nótaí ponc thar iolracha ROIanna sna WSIanna, ag baint úsáide as prótacal le haghaidh anótáil macrafáis, a comhaontaíodh tar éis na dturgnaimh phíolótacha tosaigh. Baineadh úsáid as na nótaí ó 101 sleamhnán chun oiliúint a chur ar ailtireacht YoloV2 CNN [29]. Tá Yolo oiriúnach go sonrach do thascanna atá dírithe ar thascanna braite. Cuireadh oiliúint ar an líonra, a bhí comhdhéanta de sheacht gciseal réitigh, ar phaistí de 256 × 256 picteilín a bhaintear amach ag taifeach 0.98 μm/picteilín le boscaí teorann de 21 μm (bunaithe ar mheánmhéid macrophage). Baineadh úsáid as deich MSU chun an CNN a bhailíochtú agus chun an tairseach braite réad (0.45) agus paraiméadair faoi chois neamh-uasmhéid (0.05) a chinneadh. Rinneadh feidhmíocht CNN ar WSI traidisiúnta IHC a mheasúnú ar thacar tástála siarchoinneálach de dheich MSU IHC. Rinneadh measúnú ar fheidhmíocht CNN ar réimse geal saorga IHC WSI ar thacar tástála tánaisteach a chuimsigh ceithre WSI gealréimse saorga (CD68 agus CD163 ó dhá othar) le 1033 nóta ponc. Ríomhadh scóir bheachtais, aisghairme agus F1 chun an fheidhmíocht ar an dá shraith tástála a mheas. Measadh go raibh braite fíor-dhearfach má fuarthas iad laistigh de 21 µm (meántrastomhas macraiphage) ó nóta fírinne na talún. Nuair a aimsíodh níos mó braite laistigh de raon 21µm, níor measadh go raibh ach an braite is gaire don anótáil fíordhearfach. Ina dhiaidh sin, baineadh úsáid as an braite macraphage CNN chun anailís a dhéanamh ar gach MSC IHC réimse geal saorga a ionadaíonn marcóirí macraphage (CD68 agus CD163).

cistanche tubolosa testosterone

Dearfach dúbailte

Rinneadh measúnú ar dearfacht na gceall ar dhá mharcóir (dearfach dúbailte) trí líon na bpictiúr a chinneadh idir braite cille sna bealaí éagsúla. Má bhí an fad idir dhá bhrath lymphocyte<4 µm,="" the="" cell="" was="" considered="" double-positive.="" for="" macrophages,="" this="" was="" set="" to=""><21µm. this="" was="" used="" to="" assess="" cd3+cd4+,="" cd3+cd8+,="" cd4+tbet+,="" cd4+gata3+,="" and="" cd68+cd163+="">

Ríomhadh líon na gceall taobh istigh de na ROIanna, agus bhí dlúis cille bunaithe ar chomhaireamh ceall agus limistéar an ROI anótáilte.

Caidrimh spásúla

Ligeann braiteadh cille uathoibrithe i MSU imscrúdú a dhéanamh ar ghaolmhaireachtaí spásúla idir cealla. Socraíodh an meánfhad is giorra (i réigiúin gan an réigiún subcapsular san áireamh) le haghaidh cealla CD68 móide agus CD3 móide , CD3 móide CD8 móide , agus CD20 móide cealla i WSI an phainéil I don dá ghrúpa othar, agus idir CD163 móide cealla agus CD4 móide , CD4 móide Tbet plus , agus CD4 móide GATA3 móide sa WSI don dá ghrúpa othar.

Méid ribeach peritubular

D'fhonn a mhéid ribeach imeallach a mheasúnú, rinneadh anailís ar WSIanna neamh-mheasctha a sheasann don chainéal CD34 i bhFidsí (ImageJ leagan 2.0.0, SAM, macraí agus forlíontáin: "Oscail agus Dúblaigh", "ASAP Léitheoir ROI”) [30]. Cinneadh picteilíní dearfacha trí thairseach uathoibríoch agus ina dhiaidh sin léiríodh iad mar chéatadán de líon iomlán na bpicteilín laistigh den ROI.

Anailís staitistiúil

Ríomhadh dlúis na ndaonraí cille seo a leanas sna bithóipsí 6 seachtaine: T-limficítí (CD3 móide ), T-limficítí citotocsaineacha (CD3 móide CD8 móide ), B-limficítí (CD20 móide ), macrophages (CD68 móide ), painéil I agus II), macrophages polaraithe (CD68 móide CD163 móide , CD163 móide ), limficítí T-chúntóir 1 (CD4 móide Tbet móide ), agus limficítí T-helper 2 (CD4 móide GATA3 móide ). Ríomhadh comhéifeachtaí comhghaoil ​​Spearman chun measúnú a dhéanamh an raibh comhghaol idir dlús limficítí T-helper 1 agus T-helper 2 (CD4 móide Tbet plus , CD4 móide GATA3 plus ) agus dlús macraphage polaraithe (CD68 móide CD163 móide nó CD163 móide ). Thugamar faoi deara comhartha CD68 (fluorophore 540 nm) sna IHCanna saorga CD4 (fluorophore 520 nm) de phainéal I. Dá bhrí sin, tuairiscímid freisin na dlúis cille le haghaidh CD3 móide cealla CD8 -. Chun measúnú a dhéanamh ar dhifríochtaí idir grúpaí othar a bhfuil torthaí éagsúla IFTA acu, tuairiscímid luachanna dlúis cille airmheánacha, íosta agus uasta in aghaidh an ghrúpa. Rinneadh measúnú ar dhifríochtaí suntasacha i ndlús cille agus i méid ribeach imlíne (sainmhínithe mar an céatadán picteilín deimhneach CD) idir grúpaí agus úsáid á baint as tástáil U Mann-Whitney le haghaidh samplaí neamhspleácha. Rinneadh measúnú ar cé acu an léiríonn othair le torthaí difriúla IFTA CD3 móide CD8-/CD3 móide CD8 móide cóimheasa cille, trí úsáid a bhaint as t-tástáil le haghaidh samplaí neamhspleácha. Rinneadh measúnú ar dhifríochtaí idir grúpaí othar i gcaidrimh spásúla CD68 móide agus CD163 móide cealla le cealla imdhíonachta eile le haghaidh suntasachta ag baint úsáide as tástáil U Mann-Whitney le haghaidh samplaí neamhspleácha.

Torthaí

Brath cealla dearfacha IHC bunaithe ar CNN

D'fhonn CNNanna a bhí ann cheana a chur i bhfeidhm, a forbraíodh ar dtús do mhicreascópacht ar réimse geal, athraíodh íomhánna fluaraiseachta mTSA ina n-íomhánna saorga ar réimse geal. Tá samplaí de réigiúin dhaite mTSA lena n-íomhánna saorga comhréire IHC gealaí san áireamh i bhFíor 2. Léirítear sampla de WSI IHC réimse gealaí saorga i bhFíor Forlíontach 4. D'fhéadfaí na WSIanna iltaifigh a oscailt agus a fheiceáil i mbreathnú sleamhnán digiteach bogearraí ar nós ASAP agus Aperi ImageScope [v12.4.3.5008]. Mar a léiríodh i bhFíor 2, bhí an WSI IHC gealaí saorga oiriúnach d'anailís uathoibrithe ag CNNanna a forbraíodh ar dtús do WSI traidisiúnta IHC.

Baineadh úsáid as trí CNN chun measúnú cainníochtúil a dhéanamh ar chealla athlastacha sna bithóipí trasphlandúcháin dhaite 6 seachtaine mTSA: chun limficítí a bhrath le staining IHC cíteaplasma (CNN I) agus núicléach (CNN II) agus chun macraphage a bhrath. Léiríonn Tábla 2 feidhmíocht CNN (scóir bheachtais, aisghairme, agus F{1-) maidir le tacair coinneála de WSIanna IHC dhaite DAB agus WSIanna IHC gealréimsí saorga. Go hiondúil bhí feidhmíocht CNN chomh maith, nó níos fearr ná an bhunlíne CNN ar cuireadh síos air roimhe seo (le scór F1-0.78), ar taispeánadh go raibh feidhmíocht aige atá inchomparáide le breathnóirí láimhe a bhfuil taithí acu [22] . Cé gur léirigh an braite limficítí CNN II feidhmíocht beagán laghdaithe ar íomhánna fíorúla gealaí i gcomparáid leis na fíor-íomhánna DAB (ar a ndearnadh oiliúint ar an CNN), chonacthas a mhalairt don CNN le haghaidh braite macrafáis.

Tá sampla de mheasúnú dearfach dúbailte uathoibríoch rathúil san áireamh in Fíor 3.

Comhghaol de chineálacha éagsúla cille

Breathnaíodh an comhghaol is láidre idir CD4 móide GATA3 móide dlús cille agus CD163 móide dlús cille (comhéifeacht Spearman 0.75, p < 0.001)="" sa="" bithóipse="" 6="" seachtaine="" (fíor="" fhorlíontach="" fíor="" 5a).="" bhí="" an="" comhghaol="" seo="" níos="" laige="" idir="" cd4="" móide="" tbet="" móide="" dlús="" cille="" agus="" cd163="" móide="" dlús="" cille="" (comhéifeacht="" spearman="" 0.61,="" p="">< 0.01)="" (fíor="" fhorlíontach="" fig.="" 5b)="" .="" nuair="" a="" bhí="" daonra="" na="" gceall="" á="" teorannú="" go="" macrophages="" dearfacha="" dúbailte="" (cd68="" móide="" cd163="" móide="" ),="" ba="" é="" comhéifeacht="" comhghaoil="" ​​spearman="" ná="" 0.65="" (p=""><0.01) le="" cd4="" móide="" gata3="" móide="" cealla="" agus="" 0.66="" (p="">< 0.01)="" le="" cd4="" móide="" cealla="" tbet="" móide="" (fig.="" forlíontach="" 5c,="" d).="" níor="" athraigh="" na="" torthaí="" ach="" an="" réigiún="" subcapsular="" a="" chur="" san="" áireamh="" sna="">

Comparáid idir insíothlú athlastachaothair ag dul ar aghaidh chuig IFTA i gcoinne neamh-IFTA

Léirigh othair a chuaigh ar aghaidh chuig IFTA ag 6 mhí CD163 i bhfad níos airde mar aon le dlús cille sna bithóipsí a glacadh 6 seachtaine tar éis trasphlandúcháin (meánmhéid 505 cill/mm2) i gcomparáid le hothair nár chuaigh ar aghaidh chuig IFTA (370 cill/mm2 airmheánach; p=0 .043) (Tábla 3). Mar thoradh ar chuimsiú an réigiúin subcapsular tháinig laghdú beag ar an éifeacht seo (p=0.051). Baineadh úsáid as CD68 agus CD4 sa dá phainéal. Sleamhnáin dhaite le painéal mTSA Thaispeáin mé níos mó dearfacht CD68 ná na sleamhnáin dhaite le painéal mTSA II. Tá dlús cille CD4 níos airde i bpainéal mTSA II i gcomparáid le painéal mTSA I (Tábla 3).

Bhí an méid ribeach imeallach cosúil le bithóipse seachtaine 6 d'othair DGF le torthaí éagsúla IFTA (Tábla 3), nuair a eisiamh (p=0.74) agus lena n-áirítear (p=0.90) an réigiún subcapsular. ón anailís/san anailís.

Léirigh measúnú ar CD3 móide CD8-/CD3 móide CD8 móide cóimheasa cille cóimheas i bhfad níos airde in othair le<10% ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (ratio="" of="" 17.5)="" than="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" (ratio="" of="" 9.80;="" p="0.043)" (table="">

Rinne an meánfhad is giorra ó chealla CD68 móide go CD3 móide , CD3 móide CD8 móide , agus CD20 móide cealla (painéal I) agus ó chealla CD163 móide go CD4 móide , CD4 móide Tbet plus , agus CD4 móide GATA3 móide cealla (painéal II) gan difríocht shuntasach a dhéanamh idir grúpaí othar. Léirítear na torthaí i bhFíor 4.

sliocht cistanche: feabhas a chur ar fheidhm duáin agus neart fisiceach

Plé

Sa staidéar seo, d'fhorbraíomar modh chun cainníochtú cruinn agus oibiachtúil a dhéanamh ar insiltí cille athlastacha i mbithóipí grafta na n-othar trasphlandúcháin duán le DGF a théann timpeall ar ghearradh sraitheach fairsing ar ábhar bithóipse duáin. Chun na críche sin, chomhcheangaileamar IHC ilphléacs, aimpliú comhartha tyramide, íomháú ilspeictreach, agus cainníochtú ag CNNanna. Bhí muid ar an gcéad duine a d'athraigh sonraí ilspeictreacha tílithe go híomhá chróigineach shaorga amháin in aghaidh an mharcóra cille, ag éascú anailís WSI agus cur i bhfeidhm CNNanna atá deartha le haghaidh IHC réimse geal. Dhearamar dhá CNN nua chun limficítí agus macraifítí daite núicléacha a bhrath agus léirigh muid ginearáltacht CNNanna a forbraíodh ar WSI traidisiúnta IHC go dtí WSI IHC geal-réimse saorga. Léiríodh infheidhmeacht ár modh trí úsáid a bhaint as na torthaí cainníochtúla a fuair na CNNanna chun staidéar a dhéanamh ar chomhghaolú an mhicrea-thimpeallacht athlastach i mbithóipí 6 seachtaine d’othair DGF le forbairt IFTA 6 mhí tar éis trasphlandúcháin.

D’úsáideamar fearas smádaithe láimhe a bhí ar fáil go tráchtálach don IHC ilphléacs chun cealla imdhíonachta agus ribeadáin imeallacha a fheiceáil i mbithóipí faireachais a fuarthas 6 seachtaine tar éis trasphlandúcháin. Is éard a bhí sa nós imeachta staining ilphléacs ná ilchéimeanna níocháin, gor agus fiuchphointe fíocháin agus tá roinnt réitigh imoibrí i gceist leis. Tá an-tábhacht mar sin le bailíochtú modhanna fairsinge agus le rialuithe cáilíochta, agus moltar úsáid a bhaint as antasubstaintí sonracha a thugann déine stainse comhsheasmhach. In ainneoin na gcéimeanna bailíochtaithe a rinneadh, chonacthas patrúin staining cosúil le macrophage sna cainéil CD4 de shleamhnáin ó phainéil mTSA I agus II. Ní dhearnadh timthriallta staining CD4 agus CD68 i ndiaidh a chéile, dá bhrí sin ní fhéadfaí an feiniméan seo a bhaint de bharr stripping neamhiomlán antasubstainte CD68 (Tábla Forlíontach 1). Cé go bhfuil cur síos déanta ar tharluithe annamha dé-dhearfach macrophage le CD4 [31], tá míniú níos sochreidte i ngaireacht na speictrim astaíochta fluorophore a úsáideadh le haghaidh CD4 (520 nm) agus CD68 (540 nm) léirshamhlú, clúdaithe araon. trí chiúb scagacháin FITC an mhicreascóp fhluaraiseachta. Is féidir é seo a chur faoi deara "fuiliú" an comhartha CD68 láidir isteach sa chainéal CD4. Bhí go leor den chomhartha seo eisiata ó anailís sa phainéal I toisc nár úsáideadh ach cealla CD4 móide a bhí dearfach le CD3 le haghaidh anailíse cille T-chúntóir ginearálta. Mar sin féin, shocraigh muid measúnú neamhdhíreach a dhéanamh ar chealla T-chúntóra ginearálta freisin, ag baint úsáide as CD3 móide CD8 - mar ionadach. I bpainéal II, níor úsáideadh CD4 ach i gcomhcheangal leis an Tibéid agus GATA3, rud a chuir teorainn leis an riosca maidir le húsáid braite bréagach-dearfach.

Breathnaíodh dearfacht CD68 níos ísle i bpainéal II i gcomparáid le painéal I. Tugaimid hipitéis go bhfuil sé seo mar thoradh ar chosc steric ag taisce tyramide a bhaineann le CD163 ("éifeacht scátha") [32]. Thugamar faoi deara i bhfad níos mó cealla CD163-dearfacha sa chohórt a ndearnadh staidéar air ná i bhfíochán tonsilí a úsáideadh chun cosc ​​​​a chur ar steiric a sheiceáil, ag míniú b’fhéidir cén fáth nár aimsíodh an éifeacht seo le linn bailíochtaithe.

Tá IHC ilphléacs comhcheangailte le híomháú ilspeictreach chun micrea-thimpeallacht an meall a scrúdú i roinnt staidéar oinceolaíochta, agus le déanaí freisin chun anailís a dhéanamh ar dhiúltú allagraft duáin [33-35]. Chun rannchuidiú na marcóirí go léir i sleamhnáin mTSA a bhaint as, déantar codanna a íomháú le córas Vectra nó le micreascóp fluaraiseachta comhchosúil le socrú ilspeictreach. Tar éis íomhá forbhreathnaithe íseal-mhéadaithe a thaifeadadh, roinneann an córas Vectra an fíochán ina tíleanna agus déanann sé na tíleanna a scanadh go ilspeictreach. Mar thoradh air seo tá tíleanna íomhá le speictream rannchuiditheach iolrach. Toisc go bhfuil speictream na bhfluarafór singil ar eolas ón "leabharlann speictreach réamhthaifeadta", is féidir na tíleanna ilphléacs a dhianscaoileadh ina il-tíleanna singil a léiríonn ranníocaíocht gach fluairafóir ("dímheascadh"). I bhformhór na staidéar, déantar anailís ar na híomhánna neamh-mheasctha ina dhiaidh sin le bogearraí tráchtála. I go leor cásanna, ní thacaíonn na cláir seo le hanailís MSU, bíonn deacracht acu anailís a dhéanamh ar chealla cnuasaithe, agus is minic nach mbíonn siad athléimneach i gcoinne déantáin agus éagsúlachtaí stainse. Trí na tíleanna neamh-mheasctha a thiontú go WSIanna IHC gealfhíde saorga, chuir sé ar ár gcumas CNN atá ann cheana féin a dhearadh go sonrach chun limficítí a bhrath in IHC [22] (dá dtagraítear mar bhrath limficítí CNN I) a chur i bhfeidhm. Is féidir leis an líonra seo limficítí aonair agus cnuasaithe a bhrath le cruinneas ard agus iad athléimneach i gcoinne staining chúlra (Fíor 2, CD3). Ina theannta sin, chuireamar oiliúint ar dhá CNN nua chun cealla le patrúin smálaithe núicléacha a bhrath (Tibéid, GATA3) (brath limficítí CNN II) agus chun macrophages a bhrath. Tá sé an-deacair macrophages a bhrath mar gheall ar a bpatrún scaipthe stainse. Mar sin cuireadh oiliúint ar an CNN braite macrophage ag baint úsáide as nótaí ceathrar saineolaithe éagsúla. Sula ndearnadh na nótaí, beartaíodh cruinnithe iolracha inar pléadh agus a ndearnadh measúnú ar na critéir chun anótáil a dhéanamh ar mhacrophages. Ba é an toradh a bhí air seo ná líonra atá in ann maicreaphages a bhrath ar bhealach in-atáirgthe agus é láidir do smálú neamhshonrach (Tábla 2, Fíor 2, agus Fíor Fhorlíontach 6). Go bhfios dúinn, is é seo an chéad algartam chun macraphage a bhrath i ranna histeapaiteolaíochta scanta. Rinneamar tástáil ar fheidhmíocht na dtrí líonra ar fad ar thacar tástála comhdhéanta de WSI traidisiúnta IHC (cosúil leo siúd a úsáidtear le linn oiliúna) agus ar thacar tástála tánaisteach a chuimsigh MSC IHC réimse geal saorga, a gineadh ó na híomhánna a thaifeadtar go ilspeictreach. Léiríonn gach CNN feidhmíocht an-mhaith ar na tacair thástálacha príomhúla agus scóir F1-cosúla ar na tacair tástála tánaisteacha. Ríomhadh méadracht feidhmíochta braite limficítí CNN I ar ghnáthfhíocháin, ar dhéantáin, agus ar bhraislí cille. Ní raibh aon déantáin fíocháin agus níos lú braislí cealla san IHC réimse gealaí saorga den dara sraith tástála. Is féidir leis seo feidhmíocht iomlán níos fearr an líonra seo ar an dara sraith tástála a mhíniú. Rinneadh an CNN braite macrophage a thraenáil agus a thástáil ar nótaí ó cheithre nótaí éagsúla. Cé gur pléadh go háirithe critéir anótála, breathnaíodh éagsúlachtaí i stíl anótála mar sin féin. Mar sin is dócha go bhfuil íogaireacht an CNN áit éigin i lár na foircinní stíl anótála. Ba é anótaire amháin a ghin na nótaí don dara sraith tástála, agus is cosúil go raibh siad ag teacht le híogaireacht CNN.

Trí úsáid a bhaint as na CNNanna a bhfuil cur síos déanta orthu, ligeadh dúinn imscrúdú a dhéanamh ar an insreabhadh athlastach le cruinneas gan fasach i sraith uathúil de bhithóipí luathfhaireachais a roghnaíodh go dian ar othair trasphlandúcháin le DGF.

Ar an drochuair, b'éigean samplaí iolracha a eisiamh ón anailís, go príomha mar gheall ar fhíocháin iarmharach neamhleor tar éis obair dhiagnóiseach. Fiú amháin le méid teoranta an tacair sonraí, fuaireamar CD163 i bhfad níos airde mar aon le dlúis cille i mbithóipí na n-othar DGF a chuaigh ar aghaidh go dtí forbairt IFTA, atá ag teacht le ról féideartha profibrotic na gceall seo [11]. Cé go raibh an treocht a breathnaíodh comhsheasmhach le sonraí foilsithe, níorbh fhéidir linn a dhearbhú an éifeacht díobhálach a bhí ag láithreacht luath CD68 móide macraifíse a tuairiscíodh roimhe seo do ghrúpaí othar trasphlandúcháin duán eile [7, 36, 37]. Fuaireamar comhghaol dearfach idir na dlúis CD4 móide GATA3 móide cealla agus CD163 móide cealla, a d’fhéadfadh a dheimhniú an méid a chuireann limficítí T-chúntóir 2 le micrea-thimpeallacht pro-fibrotic. Cé nár thángthas ar aon bhithmharcóirí tuarthacha nua d’fhorbairt IFTA in othair DGF sa staidéar seo, d’éirigh linn modhanna a fhorbairt chun measúnú cruinn, in-atáirgthe agus inscálaithe a dhéanamh ar insíothlú athlastach i bhfíochán gann ar nós bithóipse trasphlandúcháin. Tá na modhanna seo luachmhar le haghaidh staidéir chainníochtúla amach anseo ar athlasadh i bhfíochán histeapaiteolaíoch.

Chun tuirse adrenal a mhaolú le cistanche, cliceáil anseo chun tuilleadh sonraí a fháil

Infhaighteacht sonraí

Is féidir iarratais chomhoibrithe a bhaineann le húsáid sonraí a chuirtear i láthair sa staidéar seo a sheoladh chuig an údar comhfhreagrach (jeroen.vanderlaak@radboudumc.nl) nó FF (Feuerhake. Friedrich@mh-hannover.de).

Buíochas

Gabhaimid buíochas le Mark Gorris agus Kiek Verrijp as a gcomhairle maidir le staining agus íomháú mTSA, Merijn van Erp as feidhmiúlacht shaincheaptha ImageJ a fhorbairt, agus Sophie van den Broek, Milly van de Warenburg, agus Martijn Otten as an fhírinne a ghiniúint don líonra braite macraphage. Ina theannta sin, gabhaimid buíochas le Irina Scheffner as a cuid cabhrach le bailiú sonraí cliniciúla.

Ranníocaíochtaí údairMH, VV, JS, WG, FF, BS, LBH, agus JAWML

dhear an staidéar. Bailíodh agus chuir JS, WG, agus FF ábhar othar agus sonraí cliniciúla ar fáil. Chomhordaigh FF na hiarrachtaí a rinneadh ag MHH. Scóráil JHB, EJS, agus JK an sleamhnán PAS do chéatadán IFTA. Rinne MH staining mTSA, bailíochtú painéil I agus II, agus íomháú agus dí-mheascadh phainéil I. VV íomháithe agus painéal II neamh-mheasctha. D'fhorbair DJG na modhanna chun tíleanna mTSA a thiontú go WSI réimse gealaí saorga. Rinne MH na tiontuithe. D'fhorbair ZS-C na CNNanna braite limficítí agus scríobh sé na scripteanna le haghaidh cainníochtaí limficítí. D'fhorbair JL na CNNanna braite macraphage agus scríobh sé na scripteanna le haghaidh cainníochtaí macrafáis. Rinne MH na cainníochtaí cille agus ribeach. Rinne NSS na hachair chill a ríomh. Rinne MH, BS, LBH, agus JAWML anailís ar na sonraí. Rinne MH na figiúirí agus dhréachtaigh sé an páipéar. Rinne na húdair go léir athbhreithniú agus faomhadh ar an leagan deiridh den lámhscríbhinn.

MaoiniúThacaigh an tionscnamh ERACoSysMed (tionscadal SysMIFTA) leis an obair seo mar chuid de Chreatchlár Fís 2020 an Aontais Eorpaigh arna thairiscint ag ZonMw (deontas uimh. 9003035004), le cómhaoiniú ó Aireacht Taighde agus Oideachais na Gearmáine (BMBF), deontas uimh. . FKZ031L-0085A (SysMIFTA), FKZ01ZX1710A (MicMode-I2T), agus FKZ01ZX1608A (SYSIMIT). Fuair ​​JAWML táillí comhairleoireachta ó Philips (An Ísiltír), agus deontais ó

ContextVision, Philips (An Ísiltír), agus Sectra (An tSualainn), lasmuigh den obair a cuireadh isteach. Fuair ​​JK tacaíocht airgeadais ón Dutch Kidney Foundation (tionscadal DEEPGRAFT, Deontas Uimh. 17OKG23).

Comhlíonadh caighdeáin eiticiúla

Coinbhleacht leasaNí dhearbhaíonn na húdair aon leasanna iomaíocha.

Faomhadh eitice agus toiliú le bheith rannpháirteachRinneadh bailiú agus anailísiú sonraí le toiliú eolasach an othair agus le faomhadh an bhoird eitice (uimh. 2765) de Scoil Leighis Hannover.

Nóta FoilsitheoirTá Springer Nature neodrach i gcónaí maidir le héilimh dhlínsiúla i léarscáileanna foilsithe agus i gcaidreamh institiúideach.

Rochtain OscailteTá an t-alt seo ceadúnaithe faoi Creative Commons Attribution 4.0 Cheadúnas Idirnáisiúnta, a cheadaíonn úsáid, comhroinnt, oiriúnú, dáileadh agus atáirgeadh in aon mheán nó formáid, chomh fada agus a thugann tú creidmheas cuí don bhunúdar(na húdair ) agus an fhoinse, nasc a sholáthar leis an gceadúnas Creative Commons, agus cuir in iúl an ndearnadh athruithe. Tá na híomhánna nó ábhar tríú páirtí eile san alt seo san áireamh i gceadúnas Creative Commons an ailt mura gcuirtear a mhalairt in iúl i líne chreidmheasa don ábhar. Mura bhfuil ábhar san áireamh i gceadúnas Creative Commons an ailt agus mura bhfuil d’úsáid bheartaithe ceadaithe ag rialachán reachtúil nó má sháraíonn tú an úsáid cheadaithe, beidh ort cead a fháil go díreach ó shealbhóir an chóipchirt.

Tagairtí

1. Siedlecki A, Gaeilge W, Brennan DC. Feidhm grafta moillithe sa trasphlandú duáin. Am J Trasphlandú. 2011; 11:2279–96.

2. Khalkhali HR, Ghafari A, Hajizadeh E, Kazemnejad A. Fachtóirí riosca maidir le caillteanas graft fadtéarmach i bhfaighteoirí trasphlandúcháin duánach le mífheidhmiú allograft ainsealach. Trasphlandú Clin Cait. 2010; 8:277–82.

3. Yarlagadda SG, Coca SG, Formica RN, Poggio ED, Parikh CR. Comhlachas idir feidhm ghreamaithe mhoillithe agus allograft agus maireachtáil othar: athbhreithniú córasach agus meitea-anailís. Trasphlandú Dial Nephrol. 2009; 24: 1039-47.

4. Schröppel B, Legendre C. Feidhm ghreamaithe duánach moillithe: ó mheicníocht go haistriúchán. Duán Int. 2014;86:251–8.

5. Mengel M, Reeve J, Bunnag S, Einecke G, Jhangri GS, Sis B, et al. Tá scóráil athlasadh iomlán níos fearr ná scór reatha athlasadh Banff maidir le toradh a thuar agus an méid suaitheadh ​​móilíneach in allagraftaí duánach. Am J Trasphlandú. 2009; 9:1859–67.

6. Cosio FG, Grande JP, Wadei H, Larson TS, Griffin MD, Stegall

MD. Tuar meath ina dhiaidh sin ar fheidhm allagrafta duán ó bhithóipí faireachais luatha. Am J Trasphlandú. 2005; 5:2464–72.

7. Toki D, Zhang W, Hor KLM, Liuwantara D, Alexander SI, Yi Z, et al. Ról na macrófaigí i bhforbairt fiobróis allagraft duánach daonna sa chéad bhliain tar éis trasphlandúcháin. Am J Trasphlandú. 2014; 14:2126–36.

8. Ikezumi Y, Suzuki T, Yamada T, Hasegawa H, Kaneko U, Hara M, et al. macrophages gníomhachtaithe mar mhalairt ar an pathogenesis na díobhála ainsealach allograft duáin. Pediatra Nephrol. 2015;30:1007–17.

9. Biswas SK, Mantovani A. Plaisteacht macrophage agus idirghníomhú le fo-thacair limficítí: ailse mar paraidím. Nat Immunol. 2010; 11:889–96.

10. Cinneann Anders HJ, Ryu M. Micrea-thimpeallachtaí duánach, agus feinitíopaí macrophage dul chun cinn nó réiteach athlasadh duánach agus fiobróis. Duán Int. 2011; 80:915–25.

11. Ordikhani F, Pothula V, Sanchez-Tarjuelo R, Jordan S, Ochando J. Macrophages i trasphlandú orgáin. Teorainneacha Imdhíonachta. 2020; 11: 582939.

12. Loverre A, Divella C, Castellano G, Tataranni T, Zaza G, Rossini M, et al. Fothacar cille T cúntóirí 1, 2, agus 17 in othair trasphlandúcháin duánach a bhfuil feidhm ghreamaithe mhoillithe acu. Transpl Int. 2011; 24:233–42.

13. Klauschen F, Müller KR, Binder A, Bockmayr M, Hägele M, Seegerer P, et al. Scóráil limficítí a spreagann siadaí: ó mheastachán amhairc go foghlaim meaisín. Seimineár Biol Ailse. 2018; 52:151–7.

14. Lauren J, Häyry P, Paavonen T. Modh bunaithe ar anailís íomhá chun paraiméadair innéacs damáiste allagraft ainsealach a chainníochtú. AMPS. 2006; 114:440–8.

15. Malpica N, Solórzano CO, de, Vaquero JJ, Santos A, Vallcorba I, García-Sagredo JM, et al. Algartaim tairseacha a chur i bhfeidhm ar dheighilt na núicléis cnuasaithe. Cíteiméadracht. 1997; 28:289–97.

16. Lai YK, Rosin PL. Tairseach ciorclach éifeachtach. Íomháú Trasmheánach IEEE. 2014; 23: 992 – 1001.

17. Litjens G, Kooi T, Ehteshami Bejnordi B, Setio AAA, Ciompi F, Ghafoorian M, et al. Suirbhé ar fhoghlaim dhomhain in anailís íomhá leighis. Med Íomhá anal. 2017; 42:60–88.

18. Madabhushi A, Lee G. Anailís íomhá agus meaisínfhoghlaim i bpaiteolaíocht dhigiteach: dúshláin agus deiseanna. Med Íomhá anal. 2016; 33:170–5.

19. Ehteshami Bejnordi B, Veta M, Diest PJ, veain, Ginneken B, veain, Karssemeijer N, Litjens G, et al. Measúnú diagnóiseach ar algartaim dhomhainfhoghlama chun metastases nód limfe a bhrath i mná a bhfuil ailse chíche orthu. JAMA. 2017; 318: 2199-210.

20. Hermsen M, Bel T, de, Boer M, den, Steenbergen EJ, Kers J, Florquin S, et al. Measúnú histeapaiteolaíoch atá bunaithe ar dhomhainfhoghlaim ar fhíochán duáin. J Am Soc Nephrol. 2019; 30: 1968-79.