Éifeachtaí Cosanta Cistánach i gCoinne Dhíghrádaithe Collagen Fibroblast Deirmeach de bharr H2O2/UVB Trí Hsa-microRNA-4535-TGF/Smad Signaling Ⅱ

PLÉ

Sa staidéar seo, d'aithin muid go bhfuil anról cosantach an chistína idirghabháil trí mhaolú hsa-miR- 4535 a dhíríonn ar Smad4, a rialaíonn comharthaíocht Smad2/3/4 mar aon le sintéis collaigine sa chraiceann a nochtar do H2O2/Damáiste deirmeach de bharr UVB in vitroagusin vivo. Is féidir ár dtorthaí a achoimriú mar sé phríomhphointe: (1) cistanche maolaithe H2O2-seansacht cille HS68 spreagtha ach gan apoptosis ag dáileog 30 µM; (2) H2O2/UVB-spreagthaintracellular agus mitochondrial Rinneadh foirmiú ROS agus éagothroime MMP a aisiompú ina dhiaidh sincóireáil cistanche; (3) feabhsaíodh an cistanche go mór ar chomharthaíocht TGF/Smad chomh maith le gníomhachtú casta Samd2/3/4 in H2O2- cealla nochta; (4) upregulation hsa-miR-4535 ag H2O2Cuireadh /UVB faoi chois seo a leanascóireáil cistanche; (5) tá baint ag hsa-miR- 4535 le comharthaíocht TGF /Smad a rialáil leag díriú ar Smad4 le sintéis collaigine lagaithe in H2O2/Cealla nochta UVB; (6)cur i bhfeidhm tráthúla na cistéisear ancraiceann droma nudelaghdaigh lucha go suntasach de bharr UVBgrianghrafadóireacht craicinn,foirmiú wrinkle, hipearpláis craicinn, agus an lagúde bhealaí comharthaíochta TGF/Smad.

Fíor 10. Tionchar na cistéise ar fhótadamáiste craiceann luiche nude C57BL6/J UVB-spreagtha. (A) Nós imeachta scéimreach na dturgnamh ar ainmhithe. Nochtadh craiceann droma lucha nude C57BL6/J ceithre seachtaine d'aois (n=6) ​​do radaíocht UVB agus cóireáilte le cistanche uair amháin gach dhá lá ar feadh 8 seachtaine (B) Grianghraf a thaispeánann foirmiú roic ar an gcraiceann droma nude lucha mar gheall ar nochtadh UVB, agus cur i bhfeidhm tráthúil an chististéara ina dhiaidh sin.

Cliceáil Anseo Chun Cóireáil Cistanche a Fháil Chun Craiceann P a LaghdúHotodamageName

Fíor 11. Maolaíonn feidhm cistéise tráthúla de bharr UVBhipearpláis craicinnagus díghrádú collaigine i gcraiceann droma lucha nude C57BL6/J. Rinneadh fíocháin chraicinn a ghearradh go srathach agus a dhathú le H&E, trichrome Masson, agus imdhíon-histochemical le haghaidh p-Smad2/3 Smad4 agus -gal. Léirigh staining H&E tiús eipideirm. Léiríonn saigheada dearga le ceann dúbailte an ramhrú eipideirm. Léirigh staining trichrome Masson an t-ábhar snáithín collaigine i sraitheanna deirmeacha. Tá cuma gorm ar shnáithíní collagen. LD, dáileog íseal; HD, dáileog ard.

cistéirléirigh airíonna frith-apoptotic agus frithocsaídeacha i gcealla éagsúla cosúil le keratinocytes agus cardiomyocytes [13, 39, 40]. Chuir riarachán ó bhéal cistanche go héifeachtach faoi chois gortú ae streptozotocin-spreagtha i bhfrancaigh diaibéitis trí damáiste ocsaídiúcháin mitochondrial a laghdú agus comharthaíocht frithocsaídeach Nrf2 a fheabhsú [13, 41]. Tá sé léirithe ag staidéir eile go ndearna cistanche feabhas ar heipittocsaineacht spreagtha ag cicliafosfaimíd agus nephrotocsaineacht cisplatin-spreagtha trí strus ocsaídiúcháin agus athlasadh a mhaolú [42, 43]. Mar thoradh ar nochtadh fibroblasts deirmeach do UVB nó H2O2 tá carnadh ROS i mitochondria, rud a fhágann go bhfuil ilroinnt mitochondrion agus dul in aois cheallacha [44]. Léirigh staidéar roimhe seo go gcuireann mitochondria ilroinnte bac ar tháirgeadh collagen [45]. Thug ár staidéar le fios go bhfuil cumas scavenála radacach ag cistanche chun cosc ​​a chur ar fhéidearthacht membrane mitochondrion ROS-spreagtha éagothroime agus carnadh ROS i gcealla spreagtha UVB agus H2O. (Fíor 3A–3C). Thuairiscigh staidéir le déanaí go bhfuil fibroblasts deirmeacha freagrach as timpeallacht saibhir ECM a eagrú,

Fíor 12. Éifeachtaí cistéise ar chomharthaíocht TGF/Smad agus slonn hsa-miR-4535 i lucha ionradaithe UVB. (A agus B) braitheadh ​​leibhéil mRNA de hsa-miR-4535 agus Smad4 ó chraiceann droma lucha nochta UVB ag qRT-PCR. (C) Braitheadh ​​leibhéil próitéine TGF , p-smad2/3, agus Smad4 i bhfíocháin an chraiceann droma le blotting an iarthair. Baineadh úsáid as -tubulin mar rialú luchtaithe. Cuirtear sonraí i láthair mar mheán ± SD. Taispeántar cainníochtú na dtorthaí; *P < 0.05, **P < 0.01 in aghaidh grúpa rialaithe feithicle; #P < 0.05, ##P < 0.01 i gcoinne UVB móide grúpa feithicle.

comhdhéanta den chuid is mó de chineálacha collagen I agus III [46]. Tá homeostasis cineálacha collagen I agus III freagrach go bunúsach as tacaíocht struchtúrach agus meicniúil a chothabháil don chraiceann [47]. Tá sé tugtha le tuiscint ag fianaise atá ag teacht chun cinn go ngintear flúirseach ROS le linn aosaithe, rud a fhágann go gcailltear cuachtaí collaigine de réir a chéile sna sraitheanna deirmeacha agus mar sin, ag cur le foirmiú wrinkle de bharr cosán lagaithe TGF / Smad agus léiriú MMP ardaithe [48, 49].cistanche-idirghabhálaTáirgeann gníomhachtú comharthaíochta TGF/Smad collaigine a choinníonn sláine an chraicinn. Mar sin féin, tá éifeachtaí éagsúla aige i gcealla ailse; in ailse ae,cistéise-chóireáilchuir sé bac ar iomadú cille HepG2 trí chomharthaíocht TGF /Smad a ghníomhachtú [50]. I gcodarsnacht leis sin, chuir cistanche bac ar chomharthaíocht TGF / Smad chomh maith le Smad3 díghníomhaithe a d'eascair cosc ​​​​ar fhás i gcealla ailse próstatach agus pancreatacha [51]. Mar sin féin, tá ról na cistanche i gcomharthaíocht TGF/Smad ifibroblasts deirmeach craiceannfhan anaithnid. Anseo, thugamar faoi deara go raibh cistanche upregulated COL1A1 agus COL3A1 abairt a bhí downregulated i H2O2/UVB-cóireáilte cealla trí gníomhachtú TGF / Smad comharthaíochta (Fíor 4A-4C, 8E, 9A). Ina theannta sin, aisiompaíodh an ionduchtú MMP-1 le H2O2/UVB tar éis cóireála cistéise (Fíor 4A, 9A). Léiríonn ár dtorthaí go gcosnaíonn cistanche fibroblasts deirmeach ó dhamáiste de bharr H2O2/UVB trí chomharthaíocht TGF/Smad a ghníomhachtú agus táirgeadh collaigine a spreagadh.

Forbairt collagen deirm an chraiceannis próiseas casta fiseolaíoch é, agus léiríodh go rannchuidíonn rialáil trí mheán microRNA le hathmhúnlú agus eagrú an ECM [23, 52, 53]. Is iad collagen, elastin, agus aigéad hyaluronic (HA) na trí phríomhphróitéin a chothaíonn sláine craiceann. Tugann fianaise carntha le fios go bhfuil baint ag roinnt microRNAnna le haosú deirmeach trí rialáil ECM. miR-181a rinneadh a uasrialáil i bhfiobrblastaí deirmeacha seanaoise agus chuir sé ar chumas collaigine XVI comhpháirteanna ECM a mhodhnú [54]. Is díol spéise é go bhféadfadh ard-léiriú miR-23a-3p) senescence deirmeach a chothú trí hyaluronan synthase 2 a shochtadh go díreach, ceann de na isoeninsí transmembrane HA synthase a shintéisíonn HA [21]. Le déanaí, tuairiscíodh go ndéanann comhdhúile nádúrtha éagsúla aosú deirmeach craiceann a mhaolú trí rialachán microRNA [55-57]. Ina theannta sin, tuairiscíodh go raibh baint ag cistanche le rialáil microRNA sa cholangiocarcinoma agus carcinoma hepatocellular agus ba chúis le fás cille agus metastasis a chosc [58, 59]. Go dtí seo, níor aithníodh aon staidéar ar an meicníocht mhóilíneach, mar shampla rialachán microRNA, icistéise-chóireáiltecraiceann daonna cealla fibroblasts deirmeach. Anseo, rinneamar anailís ar na próifílí eagair microRNA chun roinnt microRNAs a aithint a bhí difriúil idir rialú agus 30 µMcistéise-chóireáiltegrúpaí (Fíor 5A). Ag baint úsáide as bunachair shonraí miRDB agus TargetScanHuman, thuaramar Smad4 mar an hsa-miR-4535sprioc mRNA (Fíor 5B). íosrialáladh slonn hsa-miR-4535 tar éis cóireála cistéise i gcealla spreagtha H2O2/UVB (Fíor 6C, 9B). I gcodarsnacht leis sin, cuireadh cosc ​​suntasach ar léiriú a sprice, mRNA-Smad4, i gcealla nochta H2O2/UVB agus méadaíodh é i ndiaidh cóireála cistanche (Fíor 6D, 9C). Léirigh staidéir éagsúla go bhfeidhmíonn ROS mar fhachtóirí trascríobh idirmheánach a spreagann strus, mar shampla p53, NF-κB agus HIF [60]. Dá bhrí sin, tátal againn go bhféadfaí miRNAs áirithe a mhodhnú trí na fachtóirí trascríobh seo a rialáil. Trí úsáid a bhaint as an mbunachar sonraí suímh ceangailteach fachtóir trascríobh (PROMO), d’aithníomar go bhfuil eilimint cheangailteach amháin p53 ag an tionscnóir hsa-miR-4535. Díreoidh ár staidéar amach anseo ar rialáil tras-scríbhinne p53 i tionscnóir hsa-miR{-4535. Ina theannta sin, níorbh fhéidir díghrádú collaigine spreagtha H2O a mhaolú i gcealla aistrithe H2O nó si-Smad4 fiú tar éis cóireála cistanche (Fíor 8C, 8E). Deimhníonn na torthaí seo freisin go bhfuil baint ag hsa-miR- 4535 le sintéis collaigine a rialáil trí dhíriú ar Smad4.

Fíor 13. An léaráid scéimreach do mheicníocht na gníomhaíochta cistanche. feabhsaíonn cistanche conairí sintéise collaigine TGF/Smad trí H2O2-his-microRNA spreagtha a laghdú-4535 chun fóta-aging a fheabhsú i fibroblast deirmeach an chraiceann daonna. Giorrúcháin: ECM: maitrís eischeallach; TGF : béite fachtóir fásta a athrú; T RI: cineál receptor TGF I; T RII: Glacadóir TGF cineál II.

Mar fhocal scoir, thug ár dtorthaí le fios go dtugann cistanche cosaint ar ghiniúint ROS arna spreagadh ag H2O2/UVB, éagothroime MMP, seanchas ceallacha, agus díghrádú collaigine i bhfiobairíní deirmeacha daonna. Bhí baint ag éifeachtaí cosanta deirm na cistanche le cosc ​​ar hsa-miR-4535 agus le gníomhachtú coimpléasc Smad2/3/4 chun sintéis collaigine a fheabhsú. Rinneadh gníomhachtú coimpléascach Smad2/3/4 a rialú ag hsa-miR-4535 trí cheangal le Smad4-3′-UTR. Mar sin, d’fhéadfadh go mbeadh cosc ​​ar shintéis Smad4/collagen trí hsa-miR- 4535 i gceist leis an meicníocht chosanta de chistín i gcoinne damáiste deirmeach craicinn de bharr H2O2/UVB- 4535

ABHAIR AGUS MODHANNA

Cultúir agus cóireálacha cille

Fuarthas fibroblasts deirmeach daonna HS68 ón Ionad Bailiúcháin agus Taighde Bioresource (BCRC, Hsinchu, Taiwan) agus coinníodh iad i meán riachtanach modhnaithe Dulbecco (DMEM, Thermo Fisher Scientific, MA, SAM) ina raibh 10 faoin gcéad de shéiream bó féatais (Invitrogen, CA, SAM). ), 2 mM L-glutamine (Sigma-Aldrich, MO, SAM), 100 U/mL peinicillin (Sigma-Aldrich), agus 100 ug/mL streiptimícin (Sigma Aldrich) ag 37 céim agus 5 faoin gcéad CO2. Chun éifeacht cistanche i gcoinne damáiste cealla spreagtha H2O a mheas, déileáladh le cealla HS68 le 200 μM de H2O2 ar feadh 1 h agus ansin comhchóireáladh iad le cistanche (282200, Sigma-Aldrich) ar feadh 23 h. Níodh cealla le PBS agus cuireadh iad i 1 ml PBS úr roimh nochtadh UVB. Maidir le hionradaíocht UVB, nochtaíodh na cealla do chroslinker (CX-2000, Upland, CA, USA) agus bolgáin UVB ag déine 40 mJ/cm2 agus ansin cóireáilte le cistanche.

Measúnachtaí MTT

Rinneadh inmharthanacht cille HS68 tar éis cóireála a thomhas trí úsáid a bhaint as measúnacht MTT. Síolaíodh cealla HS68 isteach i 96-plátaí tobair agus cóireáileadh iad le 200 μM H2O2 ar feadh 1 h nó ionradaithe le 40 mJ/cm2 UVB agus ansin goraíodh iad le tiúchain éagsúla cistanche (10, 20, 30 μM) le haghaidh 23 h. Tar éis 24 h, cuireadh 100 μL MTT (3-(4,{17}}dimethylthiazol-2- yl)-2,5-bróimíd défheinile tetrazolium) in ionad an mheán cultúir tuaslagán (0.5 mg / mL; caolaíodh réiteach stoc 5 mg / mL i PBS le meán cultúir go 0.5 mg / mL) ar feadh 4 h ag 37 céim . Ansin tuaslagadh an formazan dath corcra i 100 μL de sulfoxide dimethyl (DMSO) agus tomhaiseadh dlús optúil ag 570 nm ag baint úsáide as speictreafótaiméadar (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Trasdultach aistrithe

Anailís microarray

Measúnacht tuairisceora Luciferase

Rinneadh cealla a chomh-aistriú le comh-aistrithe de chineál fiáin agus tsóiteáin luciferase Smad4-3′-UTR-WT nó Smad4-3′-UTR-MT plasmids, faoi seach, agus plasmids luciferase rialaithe inmheánaigh. Tar éis aistrithe, braitheadh ​​​​Córas Measúnaithe Dual-Glo Luciferase (Promega, Sunnyvale, CA, USA) gníomhaíochtaí luciferase de réir threoracha an mhonaróra. Léadh plátaí ar Luminometer Micrphláta Tuairisceora ( Turner Biosystems, Sunnyvale, CA, USA). Rinneadh gnáthú ar ghníomhaíochtaí coibhneasta luciferase le gníomhaíochtaí Renilla luciferase.

Anailís blot an Iarthair

Níodh cealla le sáile maolánach 1 × fosfáit (PBS) agus lísíodh iad i maolán lysis (50 mM Tris-base (pH7.5), {{10}}.5 M NaCl, 1 mM EDTA (pH 8.0), 1 mM -mercaptoethanol, 1 faoin gcéad NP-40, gliocról 1 faoin gcéad, agus táibléad manglaim coscaire protease (Roche Molecular Biochemicals, Bhaváir Uachtarach, an Ghearmáin) ar feadh 30 nóiméad ar oighear agus ansin lártheifneoiriú ag 12,000 × g ar feadh 10 nóim ag 4 céim . Bailíodh na súiteáin i bhfeadáin mhicrealártheifneora 1.5 ml. Cinneadh an tiúchan próitéine sna sútháin seo le modh Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). ina raibh méideanna comhionann próitéine (20 ug) scartha trí 6 faoin gcéad -12 faoin gcéad grádán sóidiam dodecyl sulfate-polyacrylamide leictreafóiréis glóthach (SDS-LEATHANACH) agus ansin aistríodh go dtí seicní difluairíde polyvinylidene (PVDF) (Millipore, Bedford, MA, SAM). Cuireadh bac ar membranes ag baint úsáide as maolán blocála (5 faoin gcéad bainne tirim neamh-saille, 20 mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, agus 0.1 faoin gcéad Tween 20) ar feadh 1 h ag RT. Ansin, goradh seicní le antasubstaintí príomhúla (1: 1,000 caolú) in aghaidh TGF 1 (sc-31609, Santa Cruz, CA, USA), p-smad2/3 (sc- 11769, Santa Cruz), Smad4 (sc{{ 50}}, Santa Cruz), COL1A1 (sc-28657, Santa Cruz), COL3A1 (sc-271249, Santa Cruz), p16 (10883-1-AP, Proteintech), p21 (sc{ {60}}, Santa Cruz), MMP-1 (sc-1731, Santa Cruz), GAPDH (sc-32233, Santa Cruz), agus Histone H1 (sc-10806 , Santa Cruz) thar oíche ag 4 céim . Ansin, goraíodh iad le antasubstaintí tánaisteacha cuí (1:80, caolú{{{{{{000} caolú), antaibheathaigh (A0545), antasubstainte (A9044), nó antagóat (A5420) IgG (Biteicneolaíocht Santa Cruz) ar feadh 1 h ag RT. Braitheadh ​​​​na imdhíonbhlotaí le foshraith fheabhsaithe chemiluminescence (ECL) horseradish peroxidase (HRP) (Millipore) ag baint úsáide as ImageQuant LAS4000 mion (GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, RA).

Eastóscadh próitéin núicléach

eastóscadh RNA agus qRT-PCR

Baineadh RNA iomlán amach ag baint úsáide as trealamh tráchtála Direct-zol RNA MiniPrep (Zymo Research Corporation, CA, SAM) de réir phrótacal an mhonaróra [65, 66]. Trascríobhadh miRNAs droim ar ais go cDNA ag baint úsáide as trealamh sintéise miRNA cDNA (Takara, Shiga, an tSeapáin) mar a thuairiscítear roimhe seo [16, 67]. Braitheadh ​​slonn hsa-miR-4535 agus Smad4 ag PCR fíor-ama i LightCycler 96 Systems (Roche, Basel, an Eilvéis) ag baint úsáide as prótacal caighdeánach LightCycler 48{0 SYBR Green I Master. Áiríodh leis an imoibriú 10 μL PCR 2 μL cDNA, 5 μL 2 × SyberGreen PCR Mix, 0.5 μL ar aghaidh primer (10 μM), 0.5 μL primer droim ar ais (10 μM), agus 2 μL ddH2O. Reáchtáladh na frithghníomhartha go léir i dtrí chóip. Le haghaidh braite mRNA, socraíodh timthriall tairsí (Ct) do gach géine agus ríomhadh léiriú gach géine i gcoibhneas le GAPDH mar 2ΔCt áit a bhfuil ΔCt=(géine Cttarget - CtGAPDH). Chun miRNA a bhrath, socraíodh Ct do gach géine agus ríomhadh slonn gach géine i gcoibhneas le U6 rRNA mar 2ΔCt áit a raibh ΔCt=(Cthsa-miR-4535 – CtU6 rRNA). Ba iad na primers chun tosaigh (F) agus droim ar ais (R) a úsáideadh chun slonn miRNA agus mRNA a bhrath ná: hsa-miR-4535 (3′-CAGGG TCGGUCCA5′); daonna-Smad4 (F′-TGACCCAAA CATCACCTTCA, R′- ATACGTGGACCCTTCTG GA); daonna-GAPDH (F′-ACCCAGAAGACTGTGGA TGG, R′-TTCAGCTCAGGGATGACCTT); luch-Smad4 (′'-GTGGAAGCCACAGGAATGTT, R′-CCCA CTGAAGGACATTCGAT); luch-GAPDH (F′-CCTT CCACAATGCCAAAGTT, R′-GGGTGTGAACCA CGAGAAAT).

Anailís imdhíonfhluaraiseachta