Éifeachtaí Cosanta Agus Meicníochtaí Procyanidins ar Ghalar Parkinson In Vivo Agus In Vitro Cuid 2

Déan teagmháil le do thoiloscar.xiao@wecistanche.comle haghaidh tuilleadh eolais

2.7.Éifeachtaí ríomhairí pearsanta ar an Strus Ocsaídeach de Zebrafish Larae cóireáilte le MPTP

Laghdaíodh foirmiú méadaithe ROS incheallach (Fíor 7a,b) de bharr cóireáil larbhaí riabhacha éisc le ríomhairí pearsanta. Ina theannta sin, léirigh torthaí an mheasúnaithe sárocsaídiúcháin lipid gur chuir nochtadh PC (16 ug/ml) bac ar na leibhéil MDA spreagtha MPTP i larbhaí zebrafish (Fíor 7c). Ina theannta sin, aisiompaíodh an laghdú MPTP-spreagtha ar ghníomhaíocht GSH-Px le cóireáil PC （16 ug / mL ） (Fíor 7d), agus ríomhairí pearsanta (4,8, agus 16 ug / ml) laghduithe méadaithe MPTP-spreagtha i CAT agus SOD gníomhaíocht (Fíor 7e,f).

Figure 7. Effects of PCs on oxidative stress of zebrafish larvae treated with MPTP. (a)ROS levels were measured by fluorescent microscopy and imaging analysis;(b)ROS levels were measured via imageJ software;(c) MDA levels;(d) GSH-Pxactivity;(e)CATactivity;(f) SOD activity. F and p values of the one-way analysis of variance are presented above each chart.The results of Tukey's post hoc test are presented for selected comparisons: ns, p>0.05;*,p<><0.01;***, p=""><0.001; the="" error="" bars="" are="">

Cliceáil anseo le do thoil chun tuilleadh a fhoghlaim

2.8. Éifeachtaí ríomhairí pearsanta ar Nr2/ARE Patlhroay i Zebrafish Laroa-spreagtha MPTP

Thaispeáin cóireáil larbhaí séabraéisc le ríomhairí pearsanta an réamhbheartas go raibh baint ag gníomhachtú conairí Nr2/ARE le hairíonna cosanta PC-idirghabhála. Rinneadh slonn na marcóirí Nrf2, HO-1, NQO1, GCLC agus GCLM a uasrialáil trí chóireáil ríomhairí pearsanta i gcomparáid le nochtadh MPTP amháin (Fíor 8a-e).

Figure 8. Effects of PCs on Nrf2/ARE pathway in MPTP-induced zebrafish larvae. (a) Nrf2 levels;(b)HO-1 levels;(c)NQO1 levels;(d) GCLClevels;(e) GCLM levels. F and p values of the one-way analysis of variance are presented above each chart. The results of Tukey's post hoc test are presented for selected comparisons: ns,p>0.05;*,p<><><0.001:the error="" bars="" are="">

3. Plé

Léiríonn ríomhairí pearsanta cumas láidir scavening radacach agus gníomhaíocht frithocsaídeach, agus tá ról ríthábhachtach ag strus ocsaídiúcháin, de bharr giniúint iomarcach ROS nó/agus an córas cosanta frithocsaídeach lagaithe, i PD[37-39]. Mar sin féin, níl sé soiléir cé acu an féidir le ríomhairí pearsanta ról neuroprotective a imirt trí éifeachtaí frithocsaídeacha. Bhí sé mar aidhm ag an taighde seo iniúchadh a dhéanamh ar mheicníocht mhóilíneach ríomhairí pearsanta i gcoinne samhlacha PD MPP móide /MPTP-spreagtha.

Is féidir le Cistanche díolúine a fheabhsú

Sa staidéar seo, i gcomparáid leis an ngrúpa MPP móide / MPTP-aonar, d'ardaigh ríomhairí pearsanta leibhéal gníomhaíochta na n-einsímí frithocsaídeacha go suntasach (lena n-áirítear GSH-Px, CAT, agus SOD) agus laghdaigh leibhéil ROS agus MDA. Tá na torthaí reatha comhsheasmhach le staidéar roimhe seo a thugann le tuiscint go bhfeabhsaíonn forlíonadh íseal PC trí aiste bia gníomhaíochtaí GSH-Px, CAT, agus SOD i bainbh scoite [40]. Tugann staidéar eile le fios freisin go méadaíonn ríomhairí pearsanta gníomhaíochtaí CAT agus SOD go suntasach agus go laghdaítear an t-ábhar MDA, agus go bhfeabhsaítear cáilíocht an speirm ghabhair[41]. Tugann na torthaí seo le fios go bhfuil éifeacht chosanta ag ríomhairí pearsanta ar dhamáiste ocsaídiúcháin na gcealla nerve. Ina theannta sin, d'fheabhsaigh ríomhairí pearsanta inmharthanacht cille i gcomparáid leis an ngrúpa MPP móide-aonar i gcealla PC12 MPP móide-spreagtha, mhéadaigh go suntasach an t-achar iomlán ar athraíodh a ionad, agus laghdaigh dlús cille TH móide i gcoibhneas leis an ngrúpa MPTP i larbhaí séabra iasc spreagtha MPTP. Léiríonn na sonraí seo go bhfuil éifeacht chosanta ag ríomhairí pearsanta ar chealla nerve.

Thugamar faoi deara freisin gur mhéadaigh ríomhairí pearsanta go suntasach carnadh núicléach Nrf2 i gcomparáid le carnadh MPP móide amháin i gcealla PC12. Go deimhin, rinne ríomhairí pearsanta uasrialú suntasach ar leibhéil slonn NQO1, HO-1, GCLM, agus GCLC[42]. Ina theannta sin, baineadh úsáid as tosta Nfr2gene trí Nrf2 siRNA chun imscrúdú a dhéanamh ar ról gníomhachtú Nrf2/ARE i néarchosaint trí mheán ríomhairí pearsanta i gcoinne damáiste ocsaídiúcháin MPP móide-spreagtha: léirigh cealla a aistríodh le Nrf laghdú suntasach i slonn Nrf2. Fuair ​​​​an staidéar reatha seo amach freisin gur chuir cnagáil Nrf2 deireadh le cosaint trí mheán na ríomhairí pearsanta i gcoinne lagú MPP móide-chóireáilte in inmharthanacht cille agus éifeachtaí frithocsaídeacha ríomhairí pearsanta. Tá na torthaí seo comhsheasmhach le staidéar roimhe seo a thug le tuiscint go gcuireann feabhas ar ghníomhachtú an chosáin Nrf2 / ARE le neuroprotection [43].

Is cosán suntasach frithocsaídeach é an conair Nrf2/ARE [44-46]. Go hiondúil, tá Nrf2 ina chónaí sa chiteaplasma, áit a bhfuil sé ceangailte leis an próitéin choisctheach, Keapl[47,48]. Nuair a théann cealla faoi strus ocsaídiúcháin, dícheanglaíonn Nrf2 ó Keap1, cuireann sé tús leis an gcóras cosanta frithocsaídeach ingenous, agus ina dhiaidh sin aistríonn sé isteach sa núicléas [46,49,50]. Idirghníomhaíonn sé ansin le ARE chun sraith géinte cosantach cille agus frithocsaídeacha a ghníomhachtú, lena n-áirítear GCLC, GCLM, NQO1, agus HO-1 [51-54]. Mar fhreagra ar strus ocsaídiúcháin, dícheanglaíonn Nrf2 ó Keap1 sa chitosól agus ansin déantar é a thraslonnú isteach sa núicléas, ceangailteach leis an seicheamh ARE chun trascríobh géinte cryoprotective [{44-46] a ghníomhachtú. Léiríonn na torthaí reatha gur féidir le ríomhairí pearsanta an cosán Nrf2/ARE a ghníomhachtú, Nrf2 a aistriú ón cíteaplasma go dtí an núicléas, carnadh sa núicléas, slonn GCLC, GCLM, NOO1, agus HO-1 a rialáil agus cumas na cealla chun seasamh in aghaidh strus ocsaídiúcháin. Go deimhin, d’fhéadfadh go mbeadh an cosán Nrf2/ARE ina sprioc cógaseolaíochta de ríomhairí pearsanta chun PD a chosc.

4. Ábhair agus Modhanna

4.1. Comhdhúile Ceimiceacha agus Imoibrithe

Ceannaíodh gníomhairí MPP plus agus MPTP ó Sigma (St. Louis, MO, SAM), agus fuarthas an Kit Counting Cell-8 ó Beyotime (Shanghai, an tSín). Fuarthas na ríomhairí pearsanta, 2', 7/- diacetate dichlorofluorescin, MDA, GSH-Px, SOD, agus feisteáin diagnóiseacha CAT ó Solarbio (Beijing, an tSín). Ceannaíodh an RNAiso Plus, PrimeScriptTMRT Imoibrí Kit le gDNA Eraser, agus SYBRPremix Ex TaqTMⅡI ó Takara (Shiga, an tSeapáin); fuarthas an Nrf2-siRNA, control-siRNA, agus Lipofectamine 2000 ó GenePharma (Shanghai, an tSín). Ar deireadh, fuarthas na hantasubstaintí príomhúla, Nrf2, HO-1, GCLC, GCLM, NAD(P)H: NQO1, Lamin B, GAPDH, Antityrosine Hydroxylase (TH), agus antasubstaintí tánaisteacha comhfhreagracha ó Proteintech (Wuhan, an tSín). ).

4.2.Cultúr na gCeall

Fuarthas cealla PC12 ón mBailiúchán Náisiúnta de Chultúr Ceall Fíordheimhnithe. Coinníodh na cealla i DMEM arna fhorlíonadh le séiream bó féatais 10 faoin gcéad agus streiptimícin peinicillin (100 U/mL; 100 ug/mL) i gorlann atmaisféar tais ag 37 céim le 5 faoin gcéad CO2 [59].

4.3. Measúnacht Inmharthanachta Cille

Goradh PC12cells (1 × 104 cealla / tobar) le 1,2or4ug/mLof PCsor deprenvl (30 μM) ar feadh 24 h, agus ansin goraíodh iad le 1.5 mM MPP móide ar feadh 24 h. Ansin, cuireadh 10 μL de thuaslagán Kit Comhairimh Cille-8 le gach tobar agus gor é ar feadh 1 h. Tomhaiseadh an absorbance ag 450 nm [60].

4.4. Cothabháil Éisc

Dheonaigh coiste caomhnaithe agus úsáide ainmhithe an ionaid ainmhithe turgnamhacha, Ollscoil Zhejiang (ZJU20200125) faomhadh eiticiúil maidir le húsáid ainmhithe. Fuarthas iasc séabra fásta (brú AB) ó lárionad ainmhithe saotharlainne Ollscoil Zhejiang (Hang Zhou, an tSín) agus coinníodh iad ag 28±1 céim faoi thimthriallta 14h éadrom/10h dorcha. Tugadh Artemia nauplii do na héisc faoi dhó sa lá [61]. Chun suthanna a tháirgeadh, cuireadh riabhiasc fásta in umair pórúcháin thar oíche ag cóimheas 1:1 fireann: baineann. Cuireadh tús le sceathraí tar éis na soilse a chasadh an mhaidin dár gcionn agus críochnaíodh iad i 2 h. Ardaíodh suthanna in uisce suth （13.7 mM NaCl, 540 μM KCl, 25 uM Na2HPOA44 uM KHPOA, 300 uM CaCl2, 100 μM MgSO, 420 μM NaHCO3, pH 7.28 〉

4.5. Tomhas ROS

Chun táirgeadh ROS a thomhas, nochtaíodh cealla PC12 (2 × 10 4 cill/tobar) do 1,2 nó 4 ug/mL de ríomhairí pearsanta nó deprenyl （30 μM） ar feadh 24 h agus ansin gortha iad le 1.5 mM MPPt ar feadh 24 h 【64】. Nochtadh na cealla le tuaslagán diacetate 10 μM 2',7'-Dichlorofluorescin i gcoinníollacha dorcha ar feadh 30 min; Baineadh an tuaslagán ruaime ansin, agus nite na cealla le saline maolánach fosfáit (PBS) 3 huaire. Breathnaíodh íomhánna na gceall ag baint úsáide as micreascóp comhfhócasach scanadh léasair Olympus (Olympus, príomhchathair Tóiceo, an tSeapáin). Rinneadh déine fhluaraiseachta na gceall a chainníochtú trí úsáid a bhaint as bogearraí Image J v1.8.0 (Olympus, príomhchathair Tóiceo, an tSeapáin). Cuirtear na torthaí in iúl mar chéatadán d’achar na réigiún ROS sa ghrúpa rialaithe.

Chun táirgeadh ROS a thomhas, nochtaíodh na larbhaí zebrafish ag 3 lá tar éis toirchithe (dpf) do deprenyl （40 μM） nó 4,8 nó 16 ug/ml de ríomhairí pearsanta le nó gan 400 μM MPTP ar feadh 4 lá. Aistríodh larbhaí riabhiasc ag 7 dpf go 24-pláta tobair (10 larbhaí in aghaidh an ghrúpa), cóireáilte le tuaslagán diacetate 20 μM 2',7'-Dichlorofluorescin, agus gortha ar feadh 60 nóiméad sa dorchadas ag 28.5 céim [65 ]. Ansin nite na larbhaí trí huaire le meán suth chun barrachas 2',7'-Dichlorofluorescin diacetate a bhaint. Breathnaíodh íomhánna de na larbhaí daite ag baint úsáide as micreascóp comhfhócasach scanadh léasair Olympus. Rinneadh déine fhluaraiseachta an larbha aonair a chainníochtú trí úsáid a bhaint as bogearraí Image J. Cuirtear na torthaí in iúl mar chéatadán d’achar na réigiún ROS sa ghrúpa rialaithe. 4.6.Measúnú ar MDA, GSH-Px, SOD, agus CAT

Nochtadh cealla PC12 (2 × 104 cealla / tobar) do 1,2 nó 4 ug / ml de ríomhairí pearsanta nó deprenyl （30 μM） ar feadh 24h, agus ansin gortha iad le 1.5 mM MPP móide ar feadh 24h. Ansin, cuireadh 1 ml de sliocht le cealla 4 × 10 céim, agus briseadh cealla trí lártheifneoiriú ultrasonaic ag 8000 rpm ag 4 céim ar feadh 10 nóiméad. Cuireadh an comhshnámh ar oighear ansin le haghaidh tástála, agus cuireadh imoibrithe leis chun MDA, GSH-Px, SOD, agus CAT a chinneadh, faoi seach. Rinneadh trí chóip de gach innéacs.

Goradh na larbhaí seabraéisc ag 3dpf le deprenyl (40 μM) nó 4,8 nó 16 ug/mL ríomhairí pearsanta le nó gan 400 μM MPTP ar feadh 4 lá. Ansin, rinneadh aonchineálú ar 0.05 g de fhíochán larbhaí zebrafish agus 0.5 ml de sliocht i ndabhach oighir agus ansin lártheifneoiríodh iad ag 4 céim ar feadh 10 nóiméad. Cuireadh an ollnóva ar oighear le haghaidh tástála. Cuireadh imoibrithe leis ina dhiaidh sin chun MDA, GSH-Px, SOD, agus CAT a chinneadh, faoi seach. Rinneadh trí chóip de gach innéacs.

4.7. Ullmhú Próitéin Uile-chill, Cíteaplasma, agus Núicléach

Le haghaidh eastóscadh próitéin uile-chill, bailíodh cealla agus goraíodh iad le maolán lysis RIPA ina raibh 1 faoin gcéad PMSF agus 1 faoin gcéad manglam coscaire protease ar feadh 30 nóiméad ar oighear. Rinneadh lártheifneoiriú ar lísáití cille, agus bailíodh agus stóráladh an súthaire. Chun codáin fhocheallach a ullmhú, próiseáladh samplaí cille ag baint úsáide as an trealamh eastósctha próitéin núicléach agus cíteaplasma. Rinneadh measúnú ar an gcion próitéine trí úsáid a bhaint as measúnacht BCA (Beyotime, Shanghai, China).

4.8. Nrf2 siRNA Aistriú

Baineadh úsáid as Nrf2-siRNA chun Nrf2 a leagadh. Aistríodh cealla PC12 le Nrf2-siRNA (80 nM) nó control-siRNA ag baint úsáide as Lipofectamine 2000, de réir an lámhleabhair. 4.9.Blotáil an Iarthair

Réitíodh samplaí próitéine ag SDS-PAGE agus aistríodh iad chuig seicní dé-fluairíde polaiviniledéine (PVDF). Nochtadh na blotaí d'antasubstaintí príomhúla cuí: Nrf2, Keap1, HO{-1, NQO1, GCLC, GCLM, Lamin B, GAPDH agus antashubstaintí tánaisteacha comhchuingeacha peroxidase. Rinneadh bannaí próitéine a léirshamhlú ag baint úsáide as ECL (Beyotime, Shanghai, an tSín) chomh maith le himoibrithe braite blotála an Iarthair [36,43].

4.10.Tástáil Iompraíochta Locomotor

Goradh na larbhaí séabra iasc ag 3dpf le deprenyl (40 μM) nó 4,8 nó 16 ug/ml de ríomhairí pearsanta le nó gan 400uM MPTP ar feadh 4 lá. Ansin cuireadh na héisc riabhacha 7 dpf i 24-phlátaí toibreacha (1 iasc in aghaidh an tobair agus 12 larbhaí in aghaidh an ghrúpa), agus taifeadadh an fad iomlán a shnámh gach iasc níos mó ná 10 nóiméad. Rinneadh monatóireacht agus anailís ar iompar Zebrafish ag baint úsáide as córas rianaithe físeáin uathoibrithe (Any-maze 4.73, Stoelting, Wood Dale, IL, SAM)[66].

4.11.Eastóscadh Iomlán RNA, Trascríobh Droim ar Ais, agus Imoibriú Cainníochtúil Slabhra Polaiméaráise Fíor-Ama

Baineadh úsáid as RNAiso Plus ag baint úsáide as RNA de réir threoracha an déantóra. Trascríobhadh RNA droim ar ais ag baint úsáide as Kit Imoibrí PrimeScriptTMRT le Léirscriosán gDNA, ag leanúint treoracha an mhonaróra. Rinneadh anailís chainníochtúil PCR fíor-ama ar chóras PCR Fíor-Ama ViATM 7 Bithchórais Fheidhmeach ag baint úsáide as SYBRPremix Ex TaqTM II (Takara, Shiga, an tSeapáin). Baineadh úsáid as -actin mar ghéin thagartha agus ríomhadh slonn coibhneasta géine ag baint úsáide as an modh 2-△Ct. Tá na seichimh primer a úsáideadh sa taighde liostaithe i dTábla 1.

4.12. Iasc Riabhach Imdhíonachán Frith-thioróisín Hiodrocsaaláis(TH)Imdhíon-Sléibhe

Goradh larbhaí riabhiasc ag 1 dpf le deprenyl （40 μM） nó 4,8 nó 16 ug/ml de ríomhairí pearsanta le nó gan 400 uM MPTP ar feadh 2 lá (10 mbaisceanna éisc/grúpa). Socraíodh larbhaí le paraformaildéad 4 faoin gcéad i PBS ar feadh 30 nóiméad. Tar éis an tsocraithe, cuireadh cóireáil orthu le haghaidh imdhíonta uile-fheistithe de TH [67]. Ag teocht an tseomra, cuireadh bac ar 2 faoin gcéad (v/o) séiream uaineoil agus 0.1 faoin gcéad (w/ø) albaimin séiream buaibheach (BSA) i tween salanda maolánach fosfáit-20(PBST) ar feadh 1 h. Bhí siad faoi lé ansin sa maolán blocála chun frithtyrosineantashubstaint hidroxylase (1:200 caolaithe, Proteintech) ar feadh 2 h, agus ansin sruthlaigh sé huaire le PBST. Rinneadh an chéim imdhíonta iomlán deiridh chun maolán a smálú le 488 frithrabít gabhar (1:500) ar feadh 1 h agus nite arís le PBST. Tar éis dóthain forbartha ar dhath, bhí an t-iasc zebra suite cothrom le 3.5 faoin gcéadmeitilceallalósagus íomháithe ag baint úsáide as micreascóp comhfhócasach scanadh léasair Olympus.

4.13. Anailís staitistiúil

Baineadh úsáid as anailís aontreo ar athraitheas (ANOVA) agus triail chomparáid iolrach Tukey ina dhiaidh sin chun modhanna grúpaí éagsúla a chur i gcomparáid. Baineadh úsáid as Graphpad Prism v6.01(GraphPad Software, San Diego, CA, SAM) le haghaidh anailís staitistiúil agus chun na graif a bhreacadh.

5. Conclúidí

Mar fhocal scoir, léiríonn ár dtorthaí go n-imríonn ríomhairí pearsanta éifeachtaí neuroprotective trí ghníomhachtú an chosáin Nrf2/ARE agus a chuid iartheachtacha.díthocsainitheagusfrithocsaídeach einsímí. Le chéile, tugann na léargais seo le tuiscint go bhféadfadh ríomhairí pearsanta a bheith úsáideach chun PD a chóireáil.

Baintear an t-alt seo as Molecules 2021, 26, 5558. https://doi.org/10.3390/molecules26185558 https://www.mdpi.com/journal/molecules