Cumasaíonn Réamhfhoghlaim Eagla Comhshamhlú Mear Cuimhní Eagla Nua Go Díreach I Líonraí Cortical Cuid 3

Dearadh turgnamhach

Rinneadh measúnú ar atáirgtheacht sonraí le macasamhla éagsúla (Tábla S1). Rinneadh na chéad turgnaimh díghníomhaithe CNQX i Te2 (Fíor 1A-1C) i líon níos airde macasamhla toisc gurbh iad na chéad turgnaimh a rinneamar agus rinneamar mór-hipitéis ár staidéir a thástáil. Tugadh tosaíocht d'ainmhithe do ghrúpaí iompraíochta éagsúla ar bhealach meáchan-chothromaithe. Sannadh ainmhithe fireanna ón ál céanna go randamach do gach grúpa turgnamhach. Thugamar aghaidh ar an gcéad dul síos ar phríomh-hipitéis ár staidéir, ie, d'fhéadfadh go mbeadh tionchar difriúil ag an díghníomhú cortical ar chomhdhlúthú cuimhne eagla nua i bhfrancaigh a bhí naive go turgnamhach agus in ainmhithe a d'fhoghlaim roimh imeacht eagla.

Tá cuimhní thar a bheith láidir ag ainmhithe fireanna toisc go bhfuil instinct marthanais níos láidre acu agus fonn atáirgeadh. Ní mór d'ainmhithe a mhaireann san fhiáine cuimhneamh ar a lán faisnéise geografach, cineálacha bia, rianta creachadóirí, agus láithreacha baill an ghrúpa chun oiriúnú níos fearr don chomhshaol agus an saol a chosaint.

Mar shampla, ní mór do leoin fireann cuimhneamh ar stádas na críche ar fad, ar chaidrimh bhallraíochta, agus ar shuíomhanna na n-iomaitheoirí chun an chríoch agus a stádas a chosaint. Caithfidh séabra fireanna cuimhneamh ar shuíomh foinsí uisce agus bia ar an bhféarach chun maireachtáil agus atáirgeadh. Rith cuideachta sóide fógra uair amháin ag taispeáint go bhféadfadh béar bán fireann cuimhneamh ar thumadóir agus a bholadh uathúil ionas go bhféadfadh sé é a aithint an chéad uair eile a chonaic siad é.

Mar sin, ní mór cuimhní láidre a bheith ag ainmhithe fireanna maidir lena gcríoch a chosaint, dóthain bia a sholáthar, agus sliocht a atáirgeadh. Déanann sé seo ábhair thábhachtacha dóibh freisin i dtaighde daonna, mar shampla, chun galair cosúil le lagú cuimhne agus galar Alzheimer a fhiosrú.

I saol an duine, is féidir linn inspioráid a ghlacadh freisin ó chuimhne ainmhithe fireanna. Is féidir le nochtadh leanúnach do rudaí nua, foghlaim leanúnach, agus smaointeoireacht ár gcuimhne agus ár n-inoiriúnaitheacht a fheabhsú, agus ár gcaighdeáin mhaireachtála agus ár n-éifeachtúlacht oibre a fheabhsú. Dá bhrí sin, lig dúinn foghlaim ó ainmhithe fireanna, leanúint ar aghaidh ag carnadh eolais agus taithí, tá instincts marthanais láidir agus mianta atáirgthe, agus todhchaí níos fearr a chruthú. Is féidir a fheiceáil go gcaithfimid ár gcuimhne a fheabhsú. Is féidir le Cistanche deserticola feabhas suntasach a chur ar chuimhne toisc gur ábhar íocshláinte traidisiúnta Síneach é Cistanche deserticola le go leor éifeachtaí uathúla, agus is é ceann acu cuimhne a fheabhsú. Tagann éifeachtúlacht na mionfheoil ó na comhábhair ghníomhacha éagsúla atá ann, lena n-áirítear aigéad, polaisiúicrídí, flavonoids, etc. Is féidir leis na comhábhair seo sláinte inchinne a chur chun cinn ar bhealaí éagsúla.

Cliceáil fios bealaí chun feidhm na hinchinne a fheabhsú

I gcás difríochtaí staitistiúla idir na grúpaí seo, rinneamar grúpaí rialaithe breise sa deireadh trí instealladh seile. Cuireadh cur chuige comhchosúil i bhfeidhm maidir leis na turgnaimh optogenetic, nuair a rinneadh an grúpa rialaithe AAV ach amháin tar éis difríochtaí staitistiúla idir francaigh naive agus francaigh a bhí oilte roimhe seo a bhrath. Cheadaigh na sceidil thurgnaimh seo dúinn grúpaí rialaithe neamhriachtanacha agus úsáid ainmhithe neamhriachtanacha a sheachaint, saincheist thábhachtach i reachtaíocht na hEorpa agus na hIodáile ar thurgnamh ainmhithe (prionsabal 3 Rs).

Nósanna imeachta iompair

Rinneadh na turgnaimh go léir le linn chéim éadrom an lae (8 AM go 4 PM). Iompraíodh ainmhithe go haonaránach ón áis go dtí na seomraí turgnamhacha laistigh de bhuicéid bheaga thrédhearcacha éagsúla ag brath ar na héilimh thurgnaimh.

Oiliúint éisteachta: An chéad seisiún iompraíochta. Ainmhithe eaglasta cloisteála (CS1-CS2). Sa ghrúpa seo, tógadh na francaigh go réidh óna cage baile agus iompraíodh iad ón seomra tithíochta go dtí an seomra fuaimdhíonach. Nuair a bhí siad ann, cuireadh ainmhithe taobh istigh den ghaireas riochtaithe comhdhéanta de chliabhán dronuilleogach dubh (35 × 40 cm) atá feistithe le greille slata cruach dhosmálta (1 cm ar trastomhas, spásáilte 1.5 cm óna chéile) ceangailte le socrú seachadta turrainge.

Fágadh francaigh gan cur isteach ar feadh 1 nóiméad. Tar éis an ama seo, riaradh 7 spreagadh coinníollaithe (CSs) comhdhéanta de ton íon de 15 kHz minicíochta (15 s fad an ceann, 80 dB, 36 s eatramh trialacha). Péireáladh an 1 s deiridh de gach ton le SAM pianmhar (0.5 mA, 1 s). Ag deireadh an tseisiúin riochtaithe, tugadh francaigh ar ais chuig a gcliabhán tí.

Ainmhithe turrainge amháin (turraing-CS2). Sa ghrúpa seo, cuireadh na francaigh ar an mbealach céanna laistigh den ghaireas aeroiriúnaithe céanna. Díreach ina dhiaidh sin, cuireadh 7-turraingí coise (1 s, 0.5 mA) ar gach francach ceann díreach i ndiaidh a chéile. Ag deireadh an spreagtha, tugadh ainmhithe ar ais chuig a gcliabhán baile. Ba lú ná 9 soicind an buanseasmhacht ama sa chliabhán oiriúnaithe. Léirigh staidéir roimhe seo go gceadaíonn an nós imeachta seo próisis chomhthiomsaitheach a sheachaint idir spreagthaithe pianmhar agus spreagthaigh céadfacha [29,30].

Ainmhithe boladh eagla-oiriúnaithe (boladh-CS2). Sa ghrúpa seo, cuireadh francaigh taobh istigh den chliabhán dronuilleogach dubh céanna a bhí fostaithe sna grúpaí turgnamhacha thuas agus ceangailte le socrú seachadta turrainge. Fágadh francaigh gan cur isteach ar feadh 2 nóiméad. Tar éis an ama seo, riaradh 7 CS ina raibh boladh fanaile (10 s an ceann, eatramh trialach 24 s). Péireáladh an 1 s deiridh de gach boladh le SAM pianmhar (0.5 mA, 1 s). Cuireadh an modúl oiriúnaithe in aice le foinse aerála chun marthanacht na spreagthaí seachadta a sheachaint tar éis iad a fhritháireamh. Cinntíodh an cage le greille uachtarach. Cuireadh bolaithe i láthair ag baint úsáide as olfactometer sreafa-chaolaithe. Díríodh aer glan (1.5 L/nóiméad) chuig comhla solanóideach, a chuir an t-aer ar aghaidh go buidéal 15 ml ar a raibh 10 ml boladh fanaile nuair a oibríodh í.

Ainmhithe ton amháin (Tone-CS2). Cuireadh francaigh sa ghrúpa seo laistigh den chliabhán dubh céanna agus bronnadh an ton 15-kHz orthu (7 spreagadh, 15 s ar fhad, 36 s ITI) a sheachadadh in éagmais SAM.

Ainmhithe réamhnochta (Tone-CS1-CS2). Cuireadh francaigh taobh istigh den chliabhán riochtaithe agus, 1 nóiméad ina dhiaidh sin, bronnadh an ton 15-kHz ina n-aonar orthu 20 uair, agus 24 h ina dhiaidh sin péireáladh an ton céanna agus SAM mar an CS1.

Ainmhithe eagla ar thorann bán (WN-CS2). Sa ghrúpa seo, cuireadh francaigh taobh istigh den chliabhán dronuilleogach dubh agus fágadh gan cur isteach orthu ar feadh 1 nóiméad. Tar éis an ama seo, riaradh 7 CS ar a raibh WN (15 s an ceann, 75 dB, 36 s eatramh trialacha). Péireáladh an 1 s deiridh de gach ton le SAM pianmhar (0.5 mA, 1 s). Ag deireadh an tseisiúin riochtaithe, tugadh francaigh ar ais chuig a gcliabhán tí.

Foghlaim eagla cloisteála: Dara oiliúint iompraíochta. Dhá sheachtain tar éis na nósanna imeachta a bhfuil cur síos orthu sa mhír thuas, cuireadh oiliúint ar ainmhithe i dtasc eile riochtaithe eagla cloisteála. Cuireadh francaigh i mbosca craiceann caighdeánach, mar a bhí inár gcuid oibre roimhe seo [10], agus fágadh gan cur isteach orthu ar feadh 2 nóiméad. Tar éis an ama seo, seachadadh 7 CS ina raibh toin íona de 3 kHz de mhinicíocht (8 s fad an ceann, 80 dB, eatramh idirthrialach 22 s). Péireáladh an 1 s deiridh de gach ton le SAM pianmhar (0.5 mA, 1 s). Ag deireadh an tseisiúin riochtaithe, tugadh francaigh ar ais chuig a gcliabhán tí.

Eagla coinneáil cuimhne. Rinneadh tástáil ar choinneáil cuimhne eagla cloiste a fuarthas le déanaí don CS2 (3 kHz) 4 lá ina dhiaidh sin. Le haghaidh turgnaimh optogenetics, rinneadh an tástáil chuimhne le déanaí le seachadadh léasair 24 h tar éis an CS2-foghlaim SAM mar analaí leis an eatramh ama ag a rinneamar díghníomhaithe cortical trí riaradh an CNQX (.i, 24 h tar éis). oiliúint). Bhí habituated francaigh le gaireas difriúil ón gceann a úsáidtear le haghaidh aeroiriúnaithe agus a chur i seomra eile a sheachaint iompar eagla coinníollaithe le leideanna comhthéacsúla [10,62].

Is éard a bhí sa ghaireas nua ná cage plaisteach trédhearcach le taobh péinteáilte dubh iata laistigh de bhosca maolaithe fuaime a bhí feistithe le gaothrán sceite, a chuir deireadh le haer boladh ón imfhálú agus a chuir torann cúlra 60 dB ar fáil. Ceadaíodh d'ainmhithe an cage a iniúchadh ar feadh 5 nóiméad sa lá le linn an tseisiúin gnáthaimh. Ar lá na tástála coinneála cuimhne eagla, tar éis 2 nóiméad de thaiscéalaíocht saor in aisce, sheachadamar 4 CS2 de 3 kHz (8 s-22 ITI) gan SAM ar bith ina dhiaidh sin.

Má éilíonn an t-éileamh turgnamhach é, rinneadh tástáil ar francaigh ansin chun cuimhne an chianeagla a choinneáil, a fuarthas 2 sheachtain roimh an dara triail riochtaithe eagla éisteachta. Chun na críche sin, 7 lá tar éis na tástála coinneála cuimhne eagla ar an ton 3-kHz, cuireadh ainmhithe i dtimpeallacht nua (cage stríocach dubh agus bán) agus ansin cuireadh an ton 15-kHz orthu. Cuireadh ceithre ton i láthair i gceann tréimhsí 36s.

Oiliúint chomhthéacsúil: An chéad seisiún iompraíochta. Grúpa riochtaithe eagla comhthéacsúla (CtxA-CtxB). Sa ghrúpa seo, tógadh francaigh go réidh as a gcliabhán tí, cuireadh i mbuicéad iad, agus iompraíodh iad ón seomra tithíochta go dtí an seomra fuaimdhíonach. Nuair a bhí siad ann, cuireadh ainmhithe taobh istigh den ghaireas oiriúnaithe ar a raibh an cage dronuilleogach dubh thuasluaite, atá feistithe leis an eangach slata cruach dhosmálta ceangailte le socrú seachadta turrainge. Fágadh francaigh gan cur isteach ar feadh 1 nóiméad. Tar éis an ama seo, riaradh 5 US (0.5 mA, 1 s) le eatraimh ama 51 s. Ag deireadh an tseisiúin, tugadh na hainmhithe ar ais chuig a gcliabhán baile.

Grúpa turrainge amháin (turraing-CtxB). Fuair ​​francaigh, nuair a cuireadh iad taobh istigh den ghaireas riochtaithe, 5-tuaití coise (1 s, 0.5 mA) díreach i ndiaidh a chéile láithreach. Ba lú ná 7 soicind an buanseasmhacht ama sa chliabhán oiriúnaithe. Léirigh staidéir roimhe seo go gceadaíonn an nós imeachta seo próisis chomhthiomsaitheach a sheachaint idir spreagthaithe pianmhar agus spreagthaigh céadfacha [29,30].

Grúpa turrainge amháin (turraing-CtxB). Fuair ​​francaigh, nuair a cuireadh iad taobh istigh den ghaireas riochtaithe, 5-tuaití coise (1 s, 0.5 mA) díreach i ndiaidh a chéile láithreach. Ba lú ná 7 soicind an buanseasmhacht ama sa chliabhán oiriúnaithe. Léirigh staidéir roimhe seo go gceadaíonn an nós imeachta seo próisis chomhthiomsaitheach a sheachaint idir spreagthaithe pianmhar agus spreagthaigh céadfacha [29,30].

Aerú eagla comhthéacsúil nua agus coinneáil cuimhne eagla le déanaí. Dhá sheachtain tar éis na nósanna imeachta a thuairiscítear sa mhír thuas, cuireadh oiliúint ar gach grúpa chun timpeallacht nua comhthéacsúil (an modúl bosca craiceann, a chuirtear i seomra difriúil) a chomhlachú le SAM pianmhar (0.5 mA, 1 s) . Cuireadh gach ainmhí taobh istigh den seomra nua agus fágadh gan cur isteach ar feadh 2 nóiméad. Ansin, bhí sé faoi lé 5 US scartha le eatraimh de 30 s.

Rinneadh tástáil ar choinneáil cuimhne eagla comhthéacsúil 4 lá tar éis an nós imeachta um riochtú eagla trí francaigh a chur arís i seomra bosca Skinner ar feadh 3 nóiméad. Le haghaidh turgnaimh optogenetics, rinneadh an tástáil chuimhne le déanaí le seachadadh léasair 24 h tar éis foghlaim CtxB-US mar analaí leis an eatramh ama ag a ndearnamar díghníomhú cortical trí riaradh an CNQX (ie, 24 h tar éis oiliúna). Má éilíonn an t-éileamh turgnamhach é, rinneadh tástáil ar francaigh ansin chun cuimhne an chianeagla a choinneáil trí ainmhithe a chur i gcomhthéacs péireáilte le SAM 2 sheachtain roimh an gcomhlachas nua.

Iompraíodh ainmhithe i 2 bhuicéad éagsúla chuig na seomraí riochtaithe de réir na nósanna imeachta comhthéacsúla éagsúla.

Tomhas reo. I ngach nós imeachta turgnamhach, socraíodh an measúnú ar choinneáil cuimhne eagla mar fhreagra reo [10], arna anailísiú mar easpa iomlán soghluaisteachta sómach ach amháin i gcás gluaiseachtaí riospráide. I gcás gach ainmhí, tomhaiseadh an méid ama (i soicindí) a chaitear ar reo as líne ag 2 bhreathnadóir neamhspleácha a bhí dall ar na grúpaí ainmhithe.

Nósanna imeachta máinliachta

Chun na substaintí roghnaithe a riaradh sna spriocshuímh, rinneadh ainéistéitic ar fhrancaigh le isaflurane: Rinneadh an ionduchtú ag 4% [toirt/toirt] in aer leighis 2 L/nóiméad agus leathnaíodh é chuig nochtadh leanúnach ag 2% [toirt/toirt]) nuair a bhí na francaigh suite sa ghaireas steiréatachtach.

Rinneadh incision den cloigeann, agus druileáladh poill bheaga burr le ligean do shnáthaid insileadh 28-tomhsaire dul isteach. Úsáideadh steallaire Hamilton 10-ul a bhí suite ar chaidéal insileadh chun substaintí a sheachadadh. Tar éis insiltí, fágadh an tsnáthaid i bhfeidhm ar feadh 3 nóiméad breise. Dúnadh an incision ansin le gearrthóga créachta déanta as cruach dhosmálta, agus tugadh instealladh subcutaneous den ketoprofen analgesic / frith-athlastach (meáchan coirp 2 mg / kg) don ainmhí, agus coinníodh an t-ainmhí te agus faoi bhreathnóireacht go dtí gur tháinig sé air féin ó ainéistéise.

Mar a tharla i staidéir roimhe seo [10,32-34], ní raibh gá le cannulation ainmhithe, agus na comhdhúile gníomhacha á riaradh go díreach go stereotacsach. Tá an nós imeachta seo buntáisteach toisc go seachnaítear tráma máinliachta is gné dhílis den nós imeachta buan-cannúcháin, rud a chuireann srian ar thráma do dhul i bhfód le snáthaid amháin [10,32-34]. Go deimhin, ní chuireann ainéistéise ginearálta isteach go mór ar chomhdhlúthú cuimhne [10,32-34]. Chun a chinntiú go raibh uainiú riarachán comhdhúile a bhaineann leis an triail foghlama cruinn ionas go bhfuair francaigh na comhdhúile roghnaithe thart ar 1 h agus thart ar 1 lá tar éis oiliúna, ionduchtaíodh ainéistéise isoflurane 5 nóiméad roimh am an insteallta pleanáilte, m.sh., ag 55. min i bhfrancaigh cóireáilte 60 nóiméad tar éis oiliúna agus 23 h agus 55 min in ainmhithe a instealladh ag 24 h tar éis oiliúna. Cuireadh riocht ar gach francach agus ansin oibríodh ar leithligh é. Rinneadh ainmhithe a bhain leis na grúpaí iompraíochta éagsúla a ionramháil ar bhealach idirdhuilleach.

Coisctheoir roghnach gabhdóirí glutamáit AMPA/kainate CNQX ({{{0}}Cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione) (Tocris, 10 ng /ul) [20,21] a thuaslagadh i dtuaslagán salanda steiriúla (NaCl, 0.9%) agus coigeartaíodh é go pH 7.4 le HCl. Rinneadh an t-inisomycin inhibitor sintéise próitéine (Merck, 125 ug/ul) a thuaslagadh i HCl equimolar, caolaithe le saline steiriúil, agus a choigeartú go pH 7.4 le NaOH. Baineadh úsáid as saline steiriúil (0.9% NaCl) mar rialú feithicle. Rinneadh na substaintí seo a instealladh go déthaobhach ag ráta 0.1 ul/min agus toirt 0.5 ul in aghaidh an tsuímh ag na comhordanáidí steiréatacsacha seo a leanas a tógadh ó atlas Paxinos agus Watson [26], le réimse cortical Te2 arna tharchur chuig atlas Zilles [25]:

Cortex éisteachta tánaisteach (Te2): 1) AP: −5,8 L: ±7,2 DV: −6. 2) AP: -6,8 L: ±7,2 DV: −6.

Cortex cingulate anterior (ACC): 1) AP: +2,5 L: ±0,6 DV: −2,2. 2) AP: +3,7 L: ±0,6 DV: −2,2.

Roghnaíodh méid an insteallta (0.5 ul in aghaidh an tsuímh) bunaithe ar staidéir roimhe seo ina ndearnadh comhdhúile gníomhacha a instealladh i Te2 [10,34] agus ACC [55,63] i francaigh fásta.

Chun an hippocampus droma a dhíghníomhachtú, cuireadh comhdhúile gníomhacha instealladh ag toirt 0.6 ul in aghaidh an tsuímh ag na comhordanáidí steiréatacsacha seo a leanas:

Hippocampus droma: 1) AP: −2,8 L: ±1,6 DV: −3,3. 2) AP: −4,2 L: ±2,6 DV: −3.

Ba chúis le loit do-aisiompaithe an hippocampal droma trí NMDA (Tocris, 18 ug/ul, a thuaslagadh i dtuaslagán salanda steiriúla, 0,4 ul in aghaidh an tsuímh) a riar ag ráta 0.1 ul/ nóim ag pointí ag na comhordanáidí thuasluaite. Baineadh úsáid as na comhordanáidí céanna le haghaidh rialuithe salanda-insteallta agus ainmhithe a oibrítear le seamanna.

Instealladh Retrobeads Dearg (Lumafluor, caolú 1:2 i saline, 0.6 ul) i BLA de réir na gcomhordanáidí seo a leanas: AP: -2.8; L: ±5.4; Dv: −8.3.

Ag deireadh an turgnaimh, rinneadh na rianta snáthaide i gcás CNQX, anisomycin, nó instealltaí saline nó síneadh na loit i gcás instealltaí NMDA a fhíorú go histolaíochta. Rinneadh ainéistéiseach doimhin ar francaigh agus cuireadh 4% formaildéad orthu go hioncairdiach. Roinneadh a n-inchinn ag 30 μm ar chriiostat. Ullmhaíodh rannóga sraitheach dhaite Nissl ag baint úsáide as an ngnáthnós imeachta agus fíoraíodh na hailt go hineolaíoch faoi mhicreascóp méadaithe ag 2.5 ×.

Turgnaimh optogenetic

Instealladh víreas. Fuarthas an víreas adeno-ghaolmhar AAV5:CaMKII ::eNpHR3.0-silíní agus an veicteoir rialaithe AAV5:CaMKII -cherry ó Ollscoil North Carolina Vector Core (Chapel Hill, Carolina Thuaidh, Stáit Aontaithe Mheiriceá). Ba é an titer Viraliter5:8 ná 5.8 × 10^12 vg/ml don dá víreas. Trí úsáid a bhaint as tionscnóir CaMKII is féidir léiriú trasgene i bhfabhar néaróin phirimideacha. Coinníodh víris i reoiteoir −8{{0˚C. Rinneadh insiltí víreasacha a dhírigh ar an Te2 nó ar an ACC ag na comhordanáidí steiréatacsacha thuas ag méideanna 0.5 ul do gach poll. Instealladh an víreas ag ráta 0.1 ul/nóiméad, agus fágadh an tsnáthaid ina áit ar feadh 5 nóiméad breise. Rinneadh instealltaí víreasacha 4 seachtaine roimh thurgnaimh optogenetics.

Soilsiú.

Ionchlannaíodh na snáithíní snáthoptaice (Plexon, croí 200/230 μm; fad 10 mm) go déthaobhach sa BLA (AP=−2.8, L=± 5.4, V=−8.2 mm ó bregma). Fuarthas cosc ​​optogenetic ar réamh-mheastacháin Te2 go BLA nó ar réamh-mheastacháin ACC go BLA trí úsáid a bhaint as an gCóras Spreagtha Optogenetic PlexBright in éineacht le dé-óid léasair (Laserglow Technologies). Gintear solas buí (589 nm) agus seoltar trí shnáithín optúil é. Ba é an dlús cumhachta a measadh ag barr an tsnáithín snáthoptaice ná 10 go 15 mW chun láithreáin teilgin a soilsiú. Le linn coinneáil cuimhne eagla, tionscnaíodh astú solais 4 s sular thosaigh an ton, lean sé ar feadh an toin, agus cuireadh stop leis 4 s tar éis an ton a fhritháireamh. Fuair ​​​​ainmhithe a bhaineann le grúpaí aeroiriúnaithe eagla comhthéacsúla spreagadh éadrom le linn na taiscéalaíochta comhthéacs iomlán (3 min). Cuireadh na francaigh ar an eolas faoin gcorda paiste ar feadh 2 lá roimh an triail coinneála cuimhne.

Imdhíon-cheimic. Nuair a críochnaíodh na turgnaimh optogenetics, rinneadh ainéistéitic dhomhain ar na francaigh agus rinneadh iad a phlúchadh go hioncairdiach le 4% PAF chun idirleathadh an víris a scrúdú. Rinneadh na brains a scaradh, a stóráil thar oíche ag 4˚C, agus ar deireadh aistríodh go 30% siúcrós. Gearradh ailt corónach (30 μm) ar cryostat agus bailíodh iad i PBS. Goradh codanna saorshnámhphointe i dtuaslagán blocála ar feadh 1 h ag RT. Ansin, goradh iad i mCherry antashubstaint luch monaclónach príomhúil (caolú 1:500, Abcam) sa réiteach blocála thar oíche ag RT. Ina dhiaidh sin, nitear na hailt le PBS agus goraíodh iad ar feadh 1 h ag RT le antashubstaint fhrith-luiche AlexaFluor -568 tánaisteach tánaisteach (1:600, Invitrogen) caolaithe i PBS. Nitear codanna i PBS, gléasadh iad le meáin gléasta ina raibh DAPI (Veicteoir), agus clúdaíodh an clúdach.

Bailíodh mar an gcéanna brains na bhfrancach a ndearnadh instealltaí NMDA orthu. Goradh rannóga saorshnámh, tar éis roinnt sruthlaithe, le antashubstaint phríomhúil mhonaclónach luiche frith-Neun (1:1,000 caolú, Merck) sa tuaslagán blocála thar oíche ag teocht an tseomra. Ina dhiaidh sin, nitear na codanna le PBS agus goraíodh iad ar feadh 1 h ag teocht an tseomra le hantasubstaint frith-luiche biotinylated capall (1:200 caolú, Veicteoir). Cuireadh an casta avidin-biotin (coimpléasc ABC 1:100, Veicteoir, 2 h agus leath de goir) le diaminobenzidine (0.03%, Merck) chun Neun a stainse. Ansin sruthaíodh na codanna i PBS agus aistríodh iad chuig sleamhnáin atá brataithe le geilitín, díhiodráitíodh iad agus clúdaíodh iad le clúdach-duillín.

Rinneadh gor ar chodanna Te2 de fhrancaigh retro-instealladh coirníní le hantasubstaint frith-Fos coinín polyclónach príomhúil (1:2,000, Comharthaíocht Cille) sa réiteach blocála thar oíche ag RT. Ina dhiaidh sin, nite slisní le PBS agus gor ar feadh 1 h ag RT le frith-coinín Alexa 488 (1:1,000, Invitrogen, i PBS). Ar deireadh, nite ailt imdhíon-lipéadaithe i PBS, gléasta ar shleamhnáin a bhí brataithe le geilitín, agus clúdaíodh iad le meán gléasta arna fhorlíonadh le DAPI.

Micreascóip

Scrúdaíodh lipéadú mCherry trí úsáid a bhaint as micreascóp comhfhócasach Zeiss Airyscan: Úsáideadh dhá léasair (405 agus 561 nm), gach ceann ag freagairt don bhuaicspeictream astaithe do DAPI (stain Nissl do núicléis cille) agus Alexa 568 (mCherry ), faoi seach. Chun idirleathadh an víris ag na láithreacha insteallta a anailísiú, fuarthas micreagraif de Te2 agus ACC mar íomhánna mósáic (fuarthas gach singil trí úsáid a bhaint as cuspóir 10 ×). Rinneadh anailís ar chríochfoirt Axon isteach i BLA trí úsáid a bhaint as cuspóir 40 × mar z-stack de 10 rannóg, spásáilte 1 μm óna chéile (cearnóg 159 μm; codán súmáil, 1.0).

Maidir le hainmhithe retrobeads-insteallta a ndearnadh lipéadú imdhíonachta cFos orthu, fuarthas íomhánna ag formhéadú 40× (cearnóg 159 μm; codán súmáil, 1.0) le 3 léasair dhifriúla, a fhreagraíonn don bhuaicspeictream astaíochta le haghaidh DAPI (Nissl stain le haghaidh núicléis cille), AlexaFluor 488 (cFos), agus Texas Red (Retrobeads), faoi seach. Fuarthas codanna de 0.7 μm feadh 10-μm z-stack. Rinneadh líon na núicléis a léirigh cFos, lipéadaithe coirníní, agus dúbailte-dearfach (cFos + coirníní lipéadaithe) a chainníochtú do gach ainmhí sa réigiún Te2 ag na comhordanáidí anteroposterior ó 6.7 go 7.3 mm ón bregma [10]. Rinneadh meán na sonraí ansin chun meán gach ainmhí a tháirgeadh agus rinneadh comparáid staitistiúil ar na torthaí. Rinneadh anailís ar íomhánna de chodanna le staining DAB de Neun ag baint úsáide as bogearraí Neurolucida ceangailte le micreascóp trí cheamara dath CCD [10].

Anailís sonraí agus critéir eisiaimh

Bunaíodh an n do gach grúpa a priori de réir ár staidéir roimhe seo [10,16,17], saothair a foilsíodh roimhe seo sa réimse (féach mar thagairtí do ACC [6,22,55] agus Te2 [10,59]), agus trí mheastacháin G-chumhachta, de réir an tábla seo a leanas (Tábla 1):

Le haghaidh gach anailíse, rinneamar meastachán ar mheánlíon deiridh de 8 go 10 n-ainmhí do gach grúpa. Reáchtáladh grúpaí le rialuithe inmheánacha sa seisiún turgnamhach céanna (Tábla S1). Mar gheall ar éagsúlacht na nósanna imeachta máinliachta agus iompraíochta, chuireamar san áireamh a priori líon níos mó ábhar turgnamhach (suas le 15% níos mó) i gcásanna áirithe a chomhlíon na critéir thurgnamhach agus a áiríodh, rud a sheachain eisiamh treallach. I gcás staidéir hippocampal, chun measúnú a dhéanamh ar éifeachtaí instealltaí NMDA agus CNQX ag eatraimh ama ar leith, rinneamar cothromú ar líon iomlán na n-ainmhithe rialaithe idir francaigh feithicle agus francaigh a oibrítear le seamanna i measc na ngrúpaí éagsúla.

Rinneadh anailís iompraíochta, iniúchtaí histeolaíochta, agus comhaireamh ceall go dall. Eisíodh ainmhithe nach raibh logánú leordhóthanach ar an rian snáthaide nó an lot i gcás loit do-aisiompaithe NMDA ón anailís sonraí (Tábla S1). I staidéir chógaseolaíochta, chuireamar 57 ainmhí as an áireamh thar 465 ainmhí san iomlán mar gheall ar shocrú mícheart snáthaidí (22/255 i gcás Te2, 31/179 i gcás ACC, agus 4/31 i gcás hippocampus). I staidéir rianaithe, ar 21 ainmhí, chuireamar deireadh le 3 ábhar inar chaill an t-instealladh de retrobeads an BLA. I staidéir optogenetics Te2, os cionn 30 ainmhí san iomlán, d’eisiaíomar 1 francach toisc nach raibh socrúchán na snáithíní snáthoptaice os cionn an sprioc-réigiúin, 1 francach. Tar éis an tsaoil, bhí an víreas as láthair i Te2, agus 2 francach toisc go raibh idirleathadh an víris faoi seach níos lú ná 4.7% agus 5.3% de limistéar Te2 ag na suíomhanna insteallta. I bhfrancaigh a bhí san áireamh san anailís staitistiúil, b'ionann an idirleathadh víreas íosta agus 39.6% ag an gcomhordanáid steiréatacsach níos roimhe sin agus 50.2% ag an gcomhordanáid steiréatachtach níos déanaí.

Mar an gcéanna, i dturgnaimh optogenetics ACC, níos mó ná 32 ainmhí san iomlán, cuireadh deireadh le 2 francach toisc nach raibh socrúchán snáithíní snáthoptaice os cionn an sprioc-réigiúin. Eisiatar dhá francach toisc go raibh an víreas in ACC as láthair, ainmhí amháin toisc go raibh an víreas isteach sa cortex mótair tánaisteach in aice láimhe, agus 1 francach toisc go raibh idirleathadh an víris níos lú ná 2.3% de limistéar ACC ag na láithreacha insteallta. Sna francaigh a bhí fágtha, b'ionann an idirleathadh víreas íosta agus 33.3% ag an gcomhordanáid steiréatacsach níos sine agus 42.2% ag an gcomhordanáid níos déanaí.

I staidéir ar loit an NMDA, dhírigh loit go príomha ar an réigiún CA1 den hippocampus droma. Ba é an síneadh íosta (dearg) agus an síneadh uasta (bándearg) de loit hippocampal thar limistéar iomlán an hippocampus droma ná 23.2% agus 53,5% faoi seach ag an gcomhordanáid steiréatacsach níos faide roimhe agus 28.3% agus 62.3% ag an gcomhordanáid níos déanaí. Níos mó ná 73 ainmhí san iomlán, cuireadh deireadh le 4 francach toisc go raibh an lot as láthair, agus caitheadh ​​suas 3 ainmhí breise toisc go raibh síneadh na loit níos lú ná 5.0% (is é sin 4.8%, 4.3%, 3.1 %) maidir leis an limistéar hippocampal ag an 2 chomhordanáid.

Rinneadh anailís chomhrianach achair trí amharc-iniúchadh agus cainníochtú láimhe trí úsáid a bhaint as uirlis réigiún-chomhrianta bogearraí ZEN 3.0. Ansin normalaíodh luachanna achair ar achar iomlán an réigiúin. Bhí comhordanáidí stereotaxic de Te2, ACC, agus hippocampus bunaithe ar an atlas Paxinos [26] agus, i gcás Te2, le réimse cortical arna tagairt do Zilles atlas [25].

Anailís staitistiúil

Cuirtear na sonraí go léir i láthair mar mheán ± SEM. D'éirigh leis na sonraí go léir tástáil Levene ar chomhionannas athraithis. Mar sin, úsáideadh staitisticí paraiméadracha le linn na dturgnaimh go léir. Rinneadh comparáid idir sonraí ó 2 ghrúpa trí úsáid a bhaint as 2-t-thástáil Mic Léinn gan péireáilte. Rinneadh comparáidí ilghrúpaí a mheas trí úsáid a bhaint as tástáil 1-bhealach ANOVA le tástáil post hoc Tukey. Chun dul i ngleic leis na difríochtaí idir grúpaí agus laistigh díobh, ríomhamar samhail ANOVA de dhearadh measctha 3 × 2 le grúpa (CS1-CS2, Tone-CS1-CS2, WN-CS2) mar an idir- ábhar athraitheach agus riocht (roimh agus tar éis riochtú + instealladh le déanaí) mar an athróg laistigh de na hábhair. Nuair a bhí an t-idirghníomhú riocht grúpa × suntasach, rinneamar anailís shimplí ar phríomhéifeachtaí agus choigeartaíomar gach p-luach le ceartú Bonferroni. I gcás gach múnla measctha ANOVA, rinneamar measúnú ar thoimhde Sphericity trí Thástáil Sféarúlacht Mauchly.

Tuairiscítear na paraiméadair staidrimh (.i. luach cruinn n do gach grúpa, SEM, an tástáil staidrimh, méid na héifeachta, agus an p-luach beacht) sna finscéalta. Maidir le méideanna samplacha comhionanna, socraíodh méideanna éifeacht le haghaidh t-thástálacha neamhphéireáilte trí Cohen's d nó Glass's d a ríomh de réir chosúlachtaí SDanna agus, i gcás méideanna samplacha éagsúla, Hedges'g. Ríomhadh comhghaolta idir comhaireamh ceall agus reo trí úsáid a bhaint as comhéifeacht Pearson. Chun a chinneadh ar chomhlíon na sonraí boinn tuisceana an chur chuige staidrimh, dhiúltaigh muid don hipitéis nialasach ag an leibhéal P < {{ }} .05. Baineadh úsáid as Staidreamh SPSS 22 (IBM) ar gach anailís staitistiúil.

Eolas tacaíochta

S1 Fíor. Méadú ar na rianta snáthaidí de Te2 (A) agus cortex ACC (B) a instealladh le CNQX, roghnaithe mar shamplaí. (C) Nuair a léirítear iad leis an gcomhthéacs céanna 2 sheachtain tar éis an nós imeachta, léirigh ainmhithe turrainge amháin freagairt d’eagla íseal, rud a léirigh nár tharraing an nós imeachta reo coinníollach sa chomhthéacs inar seachadadh an turraing. (D) Fuarthas torthaí comhchosúla mar atá i bhFíor 1 trí fhrithchothromú a dhéanamh ar an 2 toin a úsáidtear mar CSs (CS1, 3 kHz agus CS2, 15 kHz) (Tástáil t Mac Léinn, t(14)=3.44, p {{ 13}}.0040, Glass's d=4.14). (E) Sna francaigh oiriúnaithe boladh-CS bhí reo don bholadh, 2 sheachtain tar éis riochtú, ard fiú má thástáiltear é i dtimpeallacht eile maidir leis an gcomhthéacs aeroiriúnaithe, rud a thaispeánann go raibh baint shonrach ag eagla leis an seachadadh ciúna seo. Barraí scála, 300 μm. ��P < 0.01. Is meán agus SEM iad na sonraí go léir. Tá na sonraí achoimre le haghaidh S1 Fíor le fáil san fhaisnéis tacaíochta sa chomhad darb ainm Sonraí Figiúr Tacaíochta S1. (TIF)

S2 Fíor. Chuir instealladh CNQX bac ar choinneáil na gcuimhní cloisteála a tharla le déanaí i bhfrancaigh nuair a laghdaíodh ginearálú eagla trí réamhnochtadh ton amháin nó trí thón bán torainn a úsáid mar CS1. ANOVA dearadh measctha 3 × 2 (príomhéifeacht an ghrúpa: F(2,42)=6.478, p {{10}}.00 4, η2=0.236, príomhéifeacht an choinníll: F(1,42)=0.161, p=0.691, η2=0.004, grúpa × léirigh idirghníomhaíocht riocht F(2,42)=3.942, p=0.027, η2=0.158) go raibh an reo don ton 3 kHz sular bhain sé le SAM níos ísle in ainmhithe a fuair an réamh-nochtadh ton 15 kHz roimh an bpéireáil 15 kHz-US (n=10, p=0.001) nó i bhfrancaigh a bhfuil torann bán orthu (n=13). , p=0.008) i gcomparáid le hainmhithe CS1-CS2 (n {= 22) a léirigh freagairt athraitheach ginearálaithe eagla. Mar sin féin, tar éis foghlaim CS-US agus instealltaí cnqx sa cortex Te2, lagaíodh cuimhne eagla le déanaí i ngach grúpa (p> 0.05). Príomhéifeacht shimplí laistigh de ghrúpaí (roimh agus tar éis foghlaim CS-SAM agus instealladh cnqx ina dhiaidh): CS1-CS2, p=0.025; Ton-CS1-CS2, p=0.189; WN-CS2, p=0.347) �P < 0.05, ��P < 0.01. Is meán agus SEM iad na sonraí go léir. Tá na sonraí achoimre le haghaidh S2 Fíor le fáil in Faisnéis tacaíochta sa chomhad darb ainm S1 Supporting Figure Data. (TIF)

S3 Fíor (A) Sampla randamach d'instealladh frithchrónáin ag díriú ar BLA. (B agus C) Samplaí de shocrúcháin snáithíní optúla os cionn an BLA d’ainmhithe a instealladh le veicteoirí AAV i Te2 (B) agus cortex ACC (C). Barraí scála, 500 μm.

Buíochas

Gabhaimid buíochas leis an Dr. E. Manassero as a dtacaíocht agus a gcomhairle leanúnach.

Ranníocaíochtaí Údair

Coincheapú: Giulia Concina, Annamaria Renna, Benedetto Sacchetti.

Coimeád sonraí: Giulia Concina, Luisella Milano, Benedetto Sacchetti.

Anailís fhoirmiúil: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Maoiniú a fháil: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Imscrúdú: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Modheolaíocht: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Maoirseacht: Benedetto Sacchetti.

Bailíochtú: Benedetto Sacchetti.

Scríbhneoireacht – dréacht bunaidh: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Scríbhneoireacht – léirmheas & eagarthóireacht: Annamaria Renna, Luisella Milano.

Tagairtí
1. Frankland PW, Bontempi B. Eagrú na gcuimhní cinn le déanaí agus iargúlta. Nat Rev Neurosci. 2005; 6:119-130. https://doi.org/10.1038/nrn1607 PMID: 15685217

2. Dudai Y. Néarbhitheolaíocht na gcomhdhlúthuithe, nó, cé chomh cobhsaí is atá an engram? Síceolaíocht Annu Rev. 2004; 55:51–86. https://doi.org/10.1146/annurev.psych.55.090902.142050 PMID: 14744210

3. Squire ó dheas, Genzel L, Wixted JT, Morris RG. Comhdhlúthú cuimhne. Fuar Spring Harb Perspect Biol. 2015; 3:7. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a021766 PMID: 26238360

4. Alvarez P, Squire ó chlé. Comhdhlúthú cuimhne agus an lobe ama medial: samhail líonra shimplí. Proc Natl Acad Sci US A. 1994; 91:7041–7045. https://doi.org/10.1073/pnas.91.15.7041 PMID: 8041742

5. McClelland JL, McNaughton BL, O'Reilly RC. An fáth a bhfuil córais chomhlántacha foghlama sa hippocampus agus sa neocortex: léargais ó rath agus teip samhlacha nascacha foghlama agus cuimhne. Síceolaíocht Ath. 1995; 102:419–457.

For more information:1950477648nn@gmail.com