Polai- Agus Oligosaccharide Ulva Sp. Codáin Ó Eastóscadh le Cuidiú Einsím a mhodhnú an meitibileacht 2
Aug 31, 2022
Déan teagmháil le do thoiloscar.xiao@wecistanche.comle haghaidh tuilleadh eolais
3. Plé
Is é an príomh-raon feidhme atá againn ná gníomhaíochtaí bitheolaíocha féideartha codáin pola-agus oligosaccharide ó Ulon sp. a fhaightear tar éis próiseas nuálaíoch Eastóscadh le Cuidiú Einsím (EAE), arb eol dó feabhas a chur ar tháirgeacht eastósctha [5] agus go gceadaíonn sé saibhriú codán suntasach i ulbháin i gcomparáid le maothú [36], ar mheitibileacht fibroblasts deirmeach craiceann daonna i cultúr.
Cliceáil anseo le do thoil chun tuilleadh eolais a fháil
Díríodh ar léiriú comhpháirteanna maitrís eischeallacha craiceann (ECM) a bhfuil baint acu leis an gcosán anabalacha (go háirithe collaiginí de chineál I agus Ⅲ, GAGanna agus TIMP-1) agus sa chonair catabólach (MMP-1). ag leibhéil próitéamaíocha agus tras-traipeolaíocha. Sa obair seo, ghlacamar leis mar gheall ar chomhdhéanamh ard carbaihiodráití agus aigéid urónacha na gcodán, go bhfuil baint ag an ngníomhaíocht le comhdhéanamh ulbhán (polai-agus oligosaccharide). Mar sin féin, níor cheart do na húdair faillí a dhéanamh ar an ulbhán polaisiúicríde ón Uloa sp. balla cille nasctha go dlúth le próitéiní, a bhfuil ar eolas freisin a chur chun cinn in vitro táirgeadh collagen iomlán agus aigéad hyaluronic i fibroblasts deirmeach daonna [39]. Mar sin, tugann na húdair le fios go bhféadfadh baint a bheith ag na gníomhaíochtaí seo le sineirgíocht idir ulbháin agus próitéiní, cé go ndírítear ar ulbháin sa lámhscríbhinn seo. 3.1.Gníomh Codáin Ulóa Polai-agus Oligosaccharide ó EAE ar Mhitibileacht Fibroblasts ECM
Tá sé léirithe ag staidéir roimhe seo go bhfuil codáin ó Uloa sp.Sliocht Cistanche Frith-radaíocht(ulbháin amh agus ulbháin ar mheáchan móilíneach íseal) tá an cumas chun gnáth-iomadú fibroblasts deirmeach daonna a mhodhnú [36-38]. Léirigh ár dtorthaí gur spreag codáin il-agus oligosaccharide ó EAE méadú suntasach ar ghníomhaíocht meitibileach fibroblast (suas le móide 68 faoin gcéad). Dheimhnigh na torthaí seo sonraí réamhfhoilsithe na n-údar [36] agus obair roimhe seo ar sliocht Uloa pertusa hidrolyzed ag 250 ug/mL a d'eascair iomadú suntasach fibroblast réamh agus séanasach [38]. Ní raibh méadú ar ghníomhaíocht meitibileach ag gabháil le héifeacht cíteatocsaineachta na gcodán (arna mheasúnú ag measúnacht LDH), rud a chiallaíonn nach bhfuil torthaí bithghníomhaíochta codáin pola- agus oligosaccharide Uloa ó EAE claonta ag éifeacht cíteatocsaineacha i raon na dtiúchan tástála. Tá an toradh atá againn de réir staidéir roimhe seo ag cur béime ar ulbháin mar chomhdhúile neamh-cíteatocsaineacha ar chineálacha éagsúla cille (línte cille macrophage, cealla gut, fibroblasts, cealla ón luch, agus cealla Vero)[13,14,4]
is féidir cistanche frith-aging
Mar a luadh sa réamhrá, idirghníomhaíonn collagens cineál Iand III, agus GAGanna le chéile chun líonra móilíneach a bhunú le haghaidh cóimeála ECM sa deirm. Mar sin, sa staidéar seo, rinneadh imscrúdú ar shintéis próitéine agus ar léiriú leibhéal mRNA ar chomhpháirteanna móra dermis ECM (cineál I agus Ⅲ collaiginí, agus GAGanna sulfáitithe agus neamh-sulfáit) i láthair pola- agus oligosaccharide Ullon sp. codáin ó EAE. Ina theannta sin, rinneadh measúnú freisin ar MMP-1, príomh-einsím a bhfuil baint aici le díghrádú collaigine de chineál I (conair catabólachta ECM) agus a coscaire fíocháin TIMP-1 a bhí bainteach lena rialáil ag leibhéil próitéine agus mRNA.
Léirigh na torthaí gur fheabhsaigh codáin il-agus oligosaccharide Ulva ó EAE sintéis iomlán collaigine ag 1000 ug/mL (suas le móide 2 faoin gcéad a ndearnadh measúnú orthu le measúnacht Red sirius agus torthaí suntasacha seachas DEP-AD PP-UE). Tá na torthaí seo difriúil ó staidéar roimhe seo i gcás nach bhfuil aon éifeacht shuntasach ag veaineanna amh agus ulbháin meáchan móilíneach íseal ar shintéis collagen iomlán [37]. Mar sin féin, tá ár dtorthaí de réir na hoibre a rinneadh roimhe seo, a léirigh go spreagann ullmhóidí polaisiúicríde ar mhórán L-rhamnose (ROPs) ó chineálacha niúmóine Klebsiella sintéis collaigine[45]. Go deimhin, tá suíomh lectin ag fibroblasts deirmeach an duine atá in ann -L-rhamnose a aithint [46]. Ar an mbealach seo, is féidir leis an fibroblast deirmeach daonna an moiety rhamnose de chodán ulbhán a aithint agus ansin sintéis collagen a chur chun cinn. Go háirithe, méadaíodh sintéis collaigine cineál I do na codáin uile in ELISA (suntasach do UE agus DS-UE) agus i dtástálacha blotála an Iarthair (NS). Tá an toradh seo i gcomhréir leis an litríocht roimhe seo ar eastóscáin Ulva pertusa hidrealaithe [38] agus galactofucans dípholaiméirithe (<10kda)from saccharina="" longicruris[47]="" which="" respectively="" increased="" the="" synthesis="" of="" type="" i="" pro="" and="" mature="" collagen.="" in="" our="" study,="" steady-state="" levels="" of="" col1al="" and="" col1a2="" were="" reduced="" after="" exposure="" to="" poly-and="" oligosaccharide="" ulva="" fractions(significant="" for="" col1a1="" at="" 1000="" ug/nnl="" for="" all="" fractions).expression="" in="" coordinated="" manner="" of="" col1al="" and="" col1a2="" genes="" complies="" with="" the="" fact="" they="" are="" both="" subunits="" of="" type="" i="" collagen="" protein="" [48].="" regulation="" between="" type="" i="" collagen="" protein="" production="" and="" mrna="" are="" different="" at="" the="" same="" observation="" time="" of="" 48="" h,="" which="" suggests="" a="" different="" potential="" time="" response="" regulation="" between="" protein="" and="" mrna[49].="" nevertheless,="" protein="" is="" the="" functional="" unit="" in="" ecm="" and="" exhibits="" an="" important="" increase="" after="" treatment="" with="" ulvans-derived="" eae="" fractions.="" col3a1="" mrna="" level="" expression="" was="" increased="" (significantly="" for="" ue="" and="" ds-ue="" at="" 1000="" ug/ml)="" and="" correlated="" to="" an="" ns="" increase="" of="" type="" iii="" collagen="" synthesis="" evaluated="" by="" wb.="" moreover,="" the="" results="" showed="" that="" polysaccharide="" uloa="" fractions="" from="" eae="" (ue="" and="" ds-ue)="" boosted="" significantly="" gags(sulfated="" and="" non-sulfated)="" synthesis="" at="" 1000="" ug/ml,="" while="" both="" oligosaccharide="" fractions="" had="" no="" effect.="" our="" observations="" are="" in="" partial="" accordance="" with="" the="" work="" of="" adrien="" etal.="" (2017)="" in="" which="" the="" increase="" in="" hyaluronic="" acid="" production="" in="" fibroblasts="" occurred="" with="" both="" ulvans="" extracts="" (crude="" and="" low="" molecular="" weight="" ulvans)="" [37].="">luibh cistánachGo deimhin, inár staidéar, ní raibh aon éifeacht ag na ulbháin meáchan móilíneach íseal ar tháirgeadh GAGanna (lena n-áirítear aigéad hyaluronic GAG neamh-sulfáit).
Ós rud é go bhfuil aosú craiceann tréithrithe le héagothroime comhpháirteanna ECM (leibhéil laghdaithe de chineál collaigine I agus II, agus GAGanna), codáin pola- agus oligosaccharide a fhaightear ó Uloa sp. tar éis cóireáil EAE tá suim acu i straitéisí frith-aosaithe, toisc go spreagann siad collagens cineál I agus III, agus sintéis GAGs.
Mar sin féin, léirigh ár dtorthaí méadú freisin ar shintéis MP-1, ar ghníomhaíocht, agus ar léiriú géine i láthair codáin il-agus oligosaccharide Uloa EAE-díorthaithe. Comhghaolaíodh an t-ardú i leibhéil MMP-1 mRNA leis an méadú ar shintéis MMP-1 i láthair codáin EAE díorthaithe Ulon agus go suntasach do chodáin pholaisiúicríde (UE agus DS-UE). Ardú MMP Baineann -1 sintéis einsíme le méadú neamhshuntasach ar ghníomhaíocht MMP-1 i láthair na gcodán. Ní hionann an toradh atá againn agus an litríocht roimhe seo toisc gur chuir sleachta Uloa pertusa hidrolyzed bac ar shloinneadh agus ar secretion MMP-1 i fibroblasts senescent[38], nó go gcuireann polaisiúicrídí ina bhfuil fócais (fucoidans ainmnithe) bac ar slonn MMP spreagtha UVB{-1 i fibroblasts craiceann daonna [50]. Mar sin féin, tá ár toradh de réir staidéar FRioux et al. (2013), ós rud é gur mhéadaigh galactafucans amh (638-1529 kDa) an ghníomhaíocht chatalaíoch iomlán MMPanna (lena n-áirítear MMP-1) de fibroblasts cóireáilte ar feadh 6 lá[47]. Aontaíonn ár sonraí ar mhéadú ar leibhéal an MMP freisin le hobair Andres et al. (2006), ós rud é go n-uasrialaíonn RROPanna (ullmhóidí oligo- agus polaisiúicríde saibhir rhamnose ó Klebsiella niúmóine agus tréithchineálacha K. planticola) slonn MMP [45]Is gnách go laghdaítear laghdú ECM ar shintéis feabhsaithe MMP-1. méid comhpháirteanna ar nós collaigine de chineál I mar gheall ar ghníomhaíocht dhíghrádaithe MMP-1, ach níor cuireadh é seo in iúl inár staidéar, ó tharla méadú ar cholangán typeI. Ina theannta sin, ní raibh aon tionchar ag codáin díorthaithe Uloa EAE (ardú nó laghdú NS) ar leibhéal slonn mRNA agus ar tháirgeadh próitéin TIMP-1, coscaire fíocháin MP-1 (seachas DEP-HD PP-). UE le méadú suntasach ar phróitéin,p<0.05,at 1000="" μg/ml）.it="" appears="" that="" the="" anabolic/catabolic="" balance="" of="" ecm="" could="" be="" in="" favor="" of="" collagen="" synthesis="" despite="" mmp-1="" synthesis="" stimulation="" and="" activity.="" in="" this="" study,="" the="" authors="" thus="" showed="" that="" both="" poly-="" and="" oligosaccharide="" fractions="" derived="" from="" ulloa="" sp.="" after="" eae="" treatment="" are="" promoting="" fibroblast="" metabolism="" activity,="" ecm="" protein="" synthesis,="" and="" skin="" matrix="" renewal="" and="" remodeling,="" which="" is="" of="" interest="" for="" dermo-cosmetic="" applications="" in="" anti-aging="">
3.2.Ról Aimhreas Ulbhán, Comhdhéanamh Sulfáit agus Meáchan Móilíneach i Modhnú Fibroblast ECM
Is eol go mbíonn tionchar ag gné struchtúrach ulbhán a chuimsíonn a mhéid sulfation, patrún sulfation, comhdhéanamh monaisiúicríde, naisc glycosídeacha, méid brainseach, chomh maith lena meáchan móilíneach ar a ghníomhaíocht bhitheolaíoch [10,1,37,40,44,51. ].
Léirigh staidéir roimhe seo gur cosúil go bhfuil meáchan móilíneach comhdhúile bithghníomhacha cosúil le polaisiúicrídí nó próitéin mar phríomhfhachtóir dá éifeacht ar iomadú fibroblast agus modhnú ECM [37,39,47]. Inár staidéar, mhéadaigh codáin pholaisiúicríde, UE agus DS-UE, le meáchain mhóilíneacha arda (Mw> 670 kDa) iomadú fibroblast. Cé go bhfuil codáin oligosaccharide (Mw<10 kda)="" also="" raise="" fibroblast="" proliferation,="" a="" dep-ad="" pp-ue="" fraction="" with="" lower="" molecular="" weight="" (mw="" of="" 1.5="" kda)="" has="" lower="" activity="" than="" dep-hd="" pp-ue="" (mw="" of="" 8="" kda).="" similar="" results="" were="" obtained="" on="" fibroblasts="" treated="" with="" rrops,="" since="" lower="" rrops="" exhibited="" similar="" or="" lower="" proliferation="" activity="" compared="" to="" higher="" mw="" rrops[45].="" polysaccharide="" fractions="" treatment="" also="" enhanced="" gags="" synthesis,="" total="" and="" especially="" type="" i="" and="" iii="" collagen="" synthesis,="" mp-1="" synthesis="" by="" human="" skin="" fibroblasts,="" whereas="" oligosaccharide="" fractions="" (low="" molecular=""><10 kda)="" and="" in="" particular="" dep-ad="" pp-ue="" (1.5="" kda)="" have="" lower="" capacities.="" only="" dep-hdpp-ue="" stimulated="" significatively="" total="" collagen="" synthesis="" and="" mp-1="" synthesis,="" while="" dep-ad="" pp-ue="" with="" lower="" molecular="" weight="" had="" no="" significant="" boost="" effect.="" these="" results="" are="" in="" accordance="" with="" work="" of="" kidgell="" et="" al.="" (2020)="" where="" higher="" molecular="" weight="" ulvan="" fractions="" elicited="" a="" greater="" biological="" activity="" (immunomodulatory="" response)="" compared="" to="" lower="" mw="" van="" fractions[44].="" these="" results="" are="" also="" in="" agreement="" with="" work="" of="" bodin="" et="" al.="" (20),="" since="" enzymatic="" hydrolyzed="" proteins="" from="" uloa="" intestinalis="" did="" not="" stimulate="" ecm="" material="" biosynthesis="" (collagen="" and="" hyaluronic="">
Thug na húdair le fios gur cuireadh an bhithghníomhaíocht níos fearr ar shintéis GAGanna i leith codáin ardmheáchan móilíneacha polaisiúicrídí sulfáitithe saibhrithe in ulbháin amh. D'fhéadfadh sé seo a bheith bainteach le comhdhéanamh intreach ulbhán i sulfáití agus a meáchan móilíneach, ós rud é go bhfuil oligosaccharide Ulva sp. níl aon chumas ag codáin, go páirteach go hiomlán saor ó sulfáití, sintéis GAG a spreagadh.fás bod cistancheStaidéar eile ar Ulku sp. léirigh an tábhacht a bhaineann le céim sulfation ulvan ar ghníomhaíocht bhitheolaíoch ó chodán Alvan sulfáit cheimiceach, dúbailt cion sulfáit ó pholaisiúicríd dhúchais, gníomhaíocht fhrith-theagmhála go láidir [10] Thairis sin, mhéadaigh DS-UE níos mó modhnú ECM maidir le GAGanna, iomlán agus cineál I agus Ⅲ collagen sintéis, i gcomparáid le UE. D'fhéadfaí an bhithghníomhaíocht níos fearr seo a nascadh le flúirse ulbhán níos airde agus níos mó ábhar grúpaí sulfáit i gcodán scagdhealaithe i gcomparáid leis na codáin eile.
Léirigh ár sonraí go bhfuil pola-agus oligosaccharide Uloa sp. léirigh codáin gníomhaíochtaí meitibileach éagsúla, a d'fhéadfaí a chur i leith flúirse ulbhán, a chéim sulfation, agus a struchtúr ceimiceach. Chuir an obair seo béim freisin ar ghníomhaíocht níos fearr do veaineanna ardmheáchan móilíneach a thaispeánann grúpaí sulfáit. Is é an fhíric go raibh an éifeacht is mó ag na codáin polaisiúicríde saibhir i ulbháin amh (ie, neamh-dípholaiméirithe) ar mheitibileacht fibroblast ECM oiriúnach le haghaidh staidéir atá le teacht agus a n-iarratas féideartha sa todhchaí i gcúram dermo-chosmaidí, mar a laghdaíonn próiseáil íosta costais táirgthe agus am.
4. Ábhair agus Modhanna
Ábhar 4.1.Macroalgal
Feamainn ghlas, Ulva sp. (Chlorophyta, Ulvales, Ullvaceae), a fuarthas ón trá idirthaoideach Landrezac (47 céim 30 céim 17.9" N céim 2 céim 42 céim 37.1 "O) i Sarzeau (An Bhriotáin, an Fhrainc) an 28 Bealtaine 2018 tráthnóna ag lag trá. Niteadh an t-ábhar le huisce sconna, meilte go trastomhas 3mm, reoite ag -25 céim , reo-triomaithe (Alpha 1-4LSC, Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Osterode am Harz, an Ghearmáin), agus a stóráil sa seomra teocht sa dorchadas.
4.2.Táirgeadh agus Tréithriú Codáin Polai-agus Oligosaccharide
I saothar roimhe seo le Fourniere et al. (2019), rinneadh cur síos mionsonraithe ar tháirgeadh codáin il-agus oligosaccharide ó Eastóscadh le Cuidiú Einsím (EAE) (féach Fíor 9 agus Tábla 3)[36].
Chun achoimre achomair a dhéanamh, baineadh úsáid as endo-protease Protamex[(Novozymes, Bagsverd, an Danmhairg) ag 6 faoin gcéad (w/dw) ar Uloa sp. feamainn. Rinneadh hidrealú einsímeach ar feadh 3 h ag 50 céim. Ansin, rinneadh deascadh eatánólach ar eastóscán uiscí (1:5, v Fisher Scientific, Illkirch, an Fhrainc) ag 4 céim ar feadh 244 h chun an codán a bhfuil saibhir i ulbháin amh (UE) a fháil.
Ansin, táirgeadh codán DS-UE tar éis scagdhealaithe de chodán saibhir in amh Evans (10 mg/mL) ar feadh 7 lá ag 4 céim (scoith 12-14 kDa, Spectra/Por94 Scagdhealaithe Membrane, Spectrum Laboratories,Fisher Scientific ,Illkirch, An Fhrainc).
Rinneadh dhá nós imeachta depolymerization (dípholaiméiriú radacach ag H-OZ agus depolymerization roisín ian-mhalartaithe) ar thuaslagán deascán eatánól ó chodán saibhir i ulbháin amh (25 mg / mL). Le haghaidh depolymerization radacach, sárocsaíd hidrigine (8 faoin gcéad , v/v , Fisher Scientific, Illkirch, An Fhrainc) measctha go dtí an réiteach ar feadh 24 h ag 50 céim , agus rinneadh scagdhealú 48 h ar an táirge ag 4 céim (scoith de 500-1000 Da, Biotech CE Tubing , Spectra/Por@, Fisher Scientific, IIllkirch, An Fhrainc). Le haghaidh dípholaiméirithe aigéadach, meascadh roisín Amberlite" FPC23H (coibhéis 10ml, Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, an Fhrainc) go dtí an tuaslagán ar feadh 24 h ag 80 céim, agus neodaíodh an táirge le NaOH (0.1 agus 1 M) sula ndeachaigh sé faoi 48 h. scagdhealaithe ag 4 chéim (scoith de 500-100 Da, Biotech CE Feadánra, Spectra/Por", Fisher Scientific, Illkirch, An Fhrainc).sochair salsa cistancheMar thoradh ar an dá nós imeachta seo tháinig codáin oligosaccharide ar a dtugtar DEP-HD PP-UE agus DEP-AD PP-UE do H2OZ agus an nós imeachta roisín aigéadach, faoi seach.
Reo-triomaíodh na codáin go léir (Alpha 1-4LSC, Martin Christ Gefriertrocknungsanla-gen GmbH, Osterode am Harz, an Ghearmáin) agus stóráiltear iad ag 4 chéim roimh anailís. Tréithriú na gcodán seo: dáileadh meáchan móilíneach polaisiúicríde de réir crómatagrafaíocht eisiata méid ardbhrú (HPSEC, UHPLC Ultimate 300, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAM), comhdhéanamh bithcheimiceach, comhdhéanamh monaisiúicríde trí chromatagrafaíocht ardfheidhmíochta anion-mhalartaithe le amperometric pulsed braite (HPAEC-PAD, Dionex" ICS-5000* DC, Thermo Fisher Scientific, Illkirch, an Fhrainc) agus ianú dí-asú léasair le cúnamh maitrís-am mais-speictriméadrachta eitilte (MALDI-TOF, Bruker, Billerica, Waltham, MA , USA) freisin i staidéar roimhe seo [36].
4.3.Cultúr na gCeall
Chuir "Laboratoire Interactions Ep-itheliums Neurones" (LIEN, EA 4685), Brest, an Fhrainc samplaí fibroblast deirmeach daonna ar fáil. Fuarthas samplaí deirmeacha daonna ó bhithóipí craicinn deontóirí sláintiúla a bhí ag dul faoi obráid abdominoplasty. Rinneadh an staidéar de réir Dhearbhú Heilsincí, agus shínigh gach othar foirm chomhaontaithe toilithe feasach. Cloígh bailiúcháin shamplacha leis an gcomhaontú áitiúil comity ("Comite de protection des personnes" Ouest VI) agus tagairt dóibh faoi DC 2016-2833.
Saothraíodh gnáthfhithibríní deirmeacha daonna (NHDF) i meán iolair modhnaithe Dulbecco (DMEM, Lonza, Basel, an Eilvéis) le 10 faoin gcéad (v/v) séiream bó-ainmhithe féatais (FBS, Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, an Fhrainc ), tuaslagán antaibheathach 1 faoin gcéad (v/v)(Penicillin, Streptomycin 10,000 U/mL, Gibco, Fisher Scientific, Ilkirch, An Fhrainc), agus 1 faoin gcéad antifungal (v/v)(Fungizone, amphotericin B, Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, an Fhrainc), i gorlann rialaithe teochta le 5 faoin gcéad CO2 ag 37 céim (Forma Steri-Cyclei160, Thermo Fisher Scientific Langenselbold, an Ghearmáin). Rinneadh cealla a fho-shaothrú trí trypsinization (0.05 faoin gcéad) agus tuaslagán EDTA (aigéad eitile-aimíntetraaicéiteach) ((Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, An Fhrainc) tar éis an cumar a bhaint amach. Rinneadh na turgnaimh go léir idir an 3ú agus an 8ú pasáiste.
Síolaíodh cealla ar 96-mhicrphlátaí toibreacha ag dlús 400 cill/tobar le haghaidh measúnachtaí WST-1 agus LDH (lachtáit díhidrogenase) ar 12-plátaí toibreacha, ag dlús 5{{8 }} cealla/tobar le haghaidh smálú Red Sirius agus Blue Alcian agus measúnacht RT-qPCR, agus ar 6-plátaí tobair ag dlús 200,000 cill/tobar le haghaidh ELISA agus measúnachtaí blotála an Iarthair.
I ngach turgnamh, tar éis comhluadar 80 faoin gcéad a bhaint amach, goraíodh cealla i DMEM le 2 faoin gcéad FBS in éagmais nó láithreacht na gcodán pola- agus oligosaccharide ar feadh 48 h ag 50 agus 1000 ug/mL.
4.4.WST-1 Measúnacht Iomadú Cille
Tá an measúnú WST-1, in vitro, bunaithe ar thiontú salainn tetrazolium WST-1 (4-[3-(4-lodophenyl){{5) }}(4-níotrfeinil)-2H-5-tetrazolio]-1,3-beinséin disulfónáit) isteach in formazan (ruaim oráiste) trí dhíhidrigineasaí miteachondrialacha ceallacha. Tá an t-athrú dath comhréireach go díreach le hinmharthanacht agus iomadú cealla sa chultúr.
Tar éis gor 48 h, baineadh an meán, agus baineadh 100uL de imoibrí WST-1 (WST-1 trealamh iomadú cille, Roche Diagnostics, Meylan, An Fhrainc; caolú 1:40 i DMEM le 2 faoin gcéad FBS) curtha isteach i ngach tobar. Tar éis gor 45 nóiméad ag 37 céim le 5 faoin gcéad CO2, tomhaiseadh ionsúiteacht ag 450 in aghaidh 630 nm le léitheoir microplate (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, An Fhionlainn). 4.5.LDH Measúnacht Cíteatocsaineachta
Tá an measúnú cíteatocsaineachta LDH bunaithe ar thomhas lactate dehydrogenase (LDH), ar einsím cíteashoithíoch chobhsaí í a scaoiltear ar lysis cille. Déantar LDH a scaoiltear i súiteáin chultúir a thomhas trí shalann tetrazolium (iodonitrotetrazolium violet) a thiontú ina tháirge dearg formazan.cistanche tubulosa dosage redditTá an méid formazan dearg a thomhaistear comhréireach le líon na gcealla lysed.
Rinneadh measúnacht LDH (CytoTox96@, Promega, Madison, WI, USA) de réir threoracha an tsoláthraí. Rinneadh rialú dearfach (uasscaoileadh LDH) trí 10 uL de thuaslagán lysis 10×(Triton X-100 ag 0.8 faoin gcéad) a chur leis ar feadh 45 nóiméad sula gcuirtear an t-imoibrí CytoTox969 leis. Tar éis gortha, aistríodh 50 μL de shúchán saothrán cille go micreaphláta tobair nua (neamh-steiriúil). Ansin, cuireadh 50 μL d'imoibrí CytoTox96 céim. Goradh an microplate ar feadh 30 nóiméad ag teocht an tseomra sa dorchadas. Ansin, cuireadh stop leis an imoibriú trí 50 μL de "réiteach stad" a chur leis. Rinneadh scaoileadh LDH a thomhas trí chainníochtú ionsúcháin le léitheoir microplate ag 490 nm (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, An Fhionlainn).
4.6.Staining Gorm Alcian do Chainníochtú Glycosaminoglycans
Is modh dathúcháin é staining gorm Alcian a cheadaíonn dhá chineál glycosaminoglycans (GAGanna) a chainníochtú): sulfáit (sulfáit heparan, sulfáit keratan, sulfáit chondroitin, agus sulfáit dermatan) agus neamh-sulfáit (aigéad hyaluronic). Dathanna tuaslagán gorm alcian ag pH 1 GAGanna sulfated, agus dathanna ag pH2.5 GAGanna neamh-sulfáit.
Ag deireadh an goir, baineadh an meán cultúir, agus rinsíodh cealla faoi dhó le PBS 1X (Fisher Scientific, Ilkirch, Irance). Ansin, rinsíodh cealla ar feadh 5 nóiméad le 0.1N HCl(pH1, Fisher Scientific, Illkirch, An Fhrainc) nó le haigéad aicéiteach 3M (pH2.5, Fisher Scientific, Illkirch, An Fhrainc) chun pH a laghdú agus nochtann glycosaminoglycans sulfated agus neamh-sulfated, faoi seach. Ansin, dathaíodh cealla le 1 faoin gcéad Alcian Blue (8GX, Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, an Fhrainc) i dtuaslagán HC10.1N (pH1) nó i dtuaslagán d'aigéad aicéiteach 3 faoin gcéad (pH2.5) ar feadh 30 nóiméad. Nodh cealla faoi dhó le huisce sconna ar feadh 5 nóiméad, triomaíodh iad faoin gcochall, agus rinsíodh iad le huisce driogtha ar feadh 5 nóiméad. Ansin, rinneadh an dath faoi cheangal a thuaslagadh le tuaslagán hidreaclóiríd Guanidine 6M (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, An Fhrainc) ar feadh 5 nóiméad faoi chorraíl ag teocht an tseomra. Aistríodh an tuaslagán daite go dtí micreaphláta tobair nua 96-, agus rinneadh léamh ionsúcháin ag 600 nm (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, an Fhionlainn).
4.7.Staining Dearg Sirius do Chainníochtú Collagen Iomlán
Ceadaíonn nós imeachta staining Red Sirius cainníochtú collagen iomlán. Picrosirius dearg, dath anionic líneach láidir a chuimsíonn sé ghrúpa sulfónáit, comhlachaithe feadh snáithíní collaigine cationic.
Tar éis goir, baineadh an meán cultúir, agus rinsíodh cealla faoi dhó le PBS 1X (Fisher Scientific, Illkirch, an Fhrainc). Ansin, cuireadh 1 ml de thuaslagán Bouin Gigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, An Fhrainc) i ngach tobar, agus dathaíodh cealla ar feadh 1 h ag teocht an tseomra. Ansin, rinsíodh cealla faoi dhó le huisce driogtha agus triomaíodh iad faoin gcochall. Rinneadh na cealla a dhathú le 1 ml de thuaslagán Red Sirius (Sirius Red 80 i dtuaslagán d'aigéad picreach sáithithe uiscí, Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, An Fhrainc) ar feadh 1 h. Tar éis staining, baineadh an tuaslagán, agus rinsíodh cealla i ndiaidh a chéile le huisce driogtha agus HC10.01N chun dath neamhcheangailte a bhaint. Intuaslagtha ar ruaim cheangailte le NaOH0.1N ar feadh 30 nóiméad. Aistríodh tuaslagán daite go dtí micreaphláta tobair nua 96-, agus rinneadh léamh ionsúcháin ag 550 nm (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, an Fhionlainn). 4.8.Cineál I Collagen agus MMP-1 ELISAs
Tar éis goir, nite cealla faoi dhó le PBS 1X (Fisher Scientific, Illkirch, An Fhrainc). Rinneadh fibroblasts a liostáil i maolán RIPA (measúnacht raidió-imdhíonachta) (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, an Fhrainc) arna fhorlíonadh le cocktail coscaire protease (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, An Fhrainc) ag 4 céim ar feadh 1 h. Scríobadh cealla, agus vortexed samplaí ar feadh 30 nóiméad agus lártheifneoirithe (12,00xg ar feadh 30 nóiméad ag 4 céim ). Bailíodh súithíní ina raibh próitéiní incheallacha agus ansin stóráiltear iad ag céim-80 go dtí go ndéantar anailís orthu chun próitéin a chinneadh agus chun anailís a dhéanamh ar bhloic an Iarthair. Chinn an Measúnú Próitéin Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAM) tiúchan próitéine ag baint úsáide as Buaibheach Serum Albumin (BSA) mar chaighdeán.
Bailíodh agus lártheifneoirí saothrán cille chun smionagar cille a bhaint (200 × g ar feadh 10 nóiméad ag 4 céim ) agus a stóráil ag -80 céim go dtí an anailís.
Rinneadh meastóireacht ar thomhais collagen de Chineál I agus MMP-1 sna meáin chultúir le feisteáin Abcam (ab210966 Human Pro-Collagen I alpha 1 Kit ELISA SimpleStep agus ab215083 Human MMP1 SimpleStep ELISA Kit, Cambridge, MA, USA) de réir threoracha an déantóra . Tomhaiseadh ionsú ag 450 nm le léitheoir microplate (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, an Fhionlainn). Rinneadh na torthaí a normalú le tiúchain próitéine cille a cinneadh roimhe seo. 4.9.Bloit ThiarRinneadh cur síos ar eastóscadh samplaí próitéine i Roinn 4.8 roimhe seo. Boilíodh samplaí próitéin le maolán Laemmli (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, an Fhrainc) 5 nóiméad ag 95 céim agus ansin lártheifneoiríodh iad ag 16,000 × g ar feadh 1 nóiméad. Lódáladh méideanna comhionann próitéine (10 ug) isteach i toibreacha de 7.5 faoin gcéad nó 4-15 faoin gcéad Glóthach Stain-Free TGX (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, An Fhrainc), chomh maith le Precision Plus Próitéin "Próitéin Neamhshainithe caighdeánach (Bith-Rad, Marnes-La-Coquette, An Fhrainc) Ritheadh an glóthach ag 200 V ar feadh 30 nóiméad (PowerPac"Bun le Córas Mini-PROTEAN Tetra, Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, An Fhrainc). Rinneadh aistriú próitéine ó fhoirmiú go mion-bhileán PVDF (fluairíd pholaivinilideéin) (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, an Fhrainc) le Córas Aistrithe Turbo Tras-Blot (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, An Fhrainc). ).Cuireadh bac ar an scannán le 3 faoin gcéad BSA Gigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, An Fhrainc) nó 5 faoin gcéad bainne tirim neamh-saille i TBST (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, An Fhrainc) ar feadh 1 h ag teocht an tseomra agus nite le TBST. Scrúdaíodh an membrane le collaigine de chineál I (Novotec, Reuver, An Ísiltír), collaigine de chineál III (Novotec, Reuver, An Ísiltír), MMP-1 (EnoGene, Nua-Eabhrac, NY, SAM), nó TIMP{{43} }} antasubstaintí (RayBiotech, Peachtree Corners, GA, SAM); ansin, nite arís agus arís eile é le TBST agus goradh for1h ag teocht an tseomra le antasubstaintí tánaisteacha peroxidase-chomhchuingeach (Jackson ImmunoResearch, Ely, RA). Ansin, soiléireacht an Iarthair ECL substráit (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, An Fhrainc) iarratas ar seicní ar feadh 5 nóiméad agus rinneadh nochtadh ag baint úsáide as ChemiDoc XRS móide Íomháóir Móilíneach (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, an Fhrainc). Rinneadh leibhéal próitéine a chainníochtú trí úsáid a bhaint as bogearraí ImageLab v6.01.1.
4.10.Zymography
Rinneadh zymography chun anailís a dhéanamh ar fhoirm ghníomhach MMP-1 collagenase de réir Inanc et al. (2017) modh oiriúnaithe[52].
Comhpholaiméiríodh glóthacha SDS-PAGE (10 faoin gcéad polyacrylamide, Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, An Fhrainc) le 1 mg/mL de chineál I eireaball francach collaigine Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, An Fhrainc). meascadh samplaí (5 ug) le maolán sampla neamh-laghdaithe (62.5 mM Tris HCl pH 6.8,2 0 faoin gcéad gliocról, 4 faoin gcéad SDS, 0.01 faoin gcéad bromophenol gorm), lártheifneoirithe 1 min ag 4 céim , luchtaithe isteach i toibreacha den fhoirmiú, in éineacht le Precision Plus Protein" Gach Caighdeán Gorm (Bith-Rad, Marnes-La-Coquette, An Fhrainc), agus ansin leictreafóiréis ag 110 V ag 4 céim ar feadh2h Nigh an glóthach faoi dhó i 2.5 faoin gcéad Triton X{{26 }} (v/v) ar feadh 15 nóiméad gach uair chun SDS a bhaint.Ansin, goradh an glóthach i Maolán Forbartha Zymogram (Bith-Rad, Marnes-La-Coquette, An Fhrainc) ar feadh 48 h ag 37 céim. , dathaíodh an glóthach ar feadh 1h le tuaslagán 0.5 faoin gcéad Coomassie Blue R-250 (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, An Fhrainc) (w/v) agus ansin coinníodh é i meatánól 40 faoin gcéad agus 10 faoin gcéad d'aigéad aicéiteach oighreach réiteach (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, An Fhrainc).Braitheadh gníomhaíocht MMP{-1 mar bhanda soiléir i gcoinne chúlra glóthach dhaite Coomassie Blue. Rinneadh an chainníochtú ar ChemiDoc XRS a rinneadh agus ar Mhóilíneach Imager (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, An Fhrainc) le bogearraí Image Lab leagan 6.01.1 (Bio-Rad). 4.11.RNA Aonrú agus Fíor-Ama RT-PCR
Tar éis gor 48 h, asbhaineadh RNA iomlán le TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, SAM) agus clóraform (Acros Organics, Fisher Scientific, Ilkirch, an Fhrainc), deasctha le isopropanol (Fisher Scientific, Illkirch, An Fhrainc), nite le eatánól 75 faoin gcéad , triomaithe faoin gcochall roimh athfhriotú in uisce cóireáilte DEPC (diethylpyrocarbonate) (Fisher Scientific, IIlkirch, An Fhrainc). Measadh cainníocht agus leibhéal íonachta RNA (idir 1.8 agus 2.0) le tomhas ionsúcháin ar léitheoir microplate (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, an Fhionlainn) ag 260 agus 280 nm ag baint úsáide as titim TM Plate (Thermo Fisher Eolaíochta, Waltham, MA, USA).
Cóireáladh micreagram amháin de RNA iomlán le DNaseI (iScript Dnase Master Mix, Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, An Fhrainc) ar feadh 5 nóiméad ag 25 céim chun éillithe DNA a bhaint. Díghníomhaíodh an einsím ar feadh 5 nóiméad ag 75 céim.
Rinneadh tras-scríobh droim ar ais ar 1 ug de RNA iomlán, a cóireáladh roimhe seo le DNase I, ag baint úsáide as iScript Trascríobh Droim ar ais (RT) Supermix (Bio-rad, Marnes-La-Coquette, An Fhrainc). , 20 nóiméad ag 46 céim, agus 1 nóiméad ag 95 céim.
Áiríodh rialuithe ar neamhtheimpléad i dturgnaimh PCR. Rinneadh qPCR i 96-plátaí tobair le haghaidh toirt iomlán 20 μL ina raibh 1 uL de 1∶15 sampla cDNA caolaithe ó RT, 1 μL de primer (féach Tábla 4, Bio-Rad, Marnes -La-Coquette, An Fhrainc）,10 μL de iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, An Fhrainc), agus 8μL d'uisce saor ó núicléas. Ba iad na coinníollacha aimplithe ná 2 nóiméad ag 95 céim agus ina dhiaidh sin 40 timthriall de 5 ag 95 céim agus 30í ag 60 céim, agus deireadh le 5 ag 95 céim agus 5s ag 65 céim roimh phrótacal don chuar leá: méadú 0.5 céim ó 65 céim go dtí 95 céim . Rinneadh turgnaimh PCR ar chóras CFX 96 (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, an Fhrainc), agus bailíodh torthaí ó bhogearraí Bio-Rad CFX Manager v3.1 (Marnes-La-Coquette, An Fhrainc). Normalaíodh na méideanna mRNA go RPL13A mRNA, agus ríomhadh anailís ar shloinneadh géine coibhneasta ag baint úsáide as an modh 2-AACt.
4.12. Anailís staitistiúil
Cuireadh na luachanna go léir in iúl mar mheán na n turgnamh ± earráid chaighdeánach (SE).
Rinneadh anailís staitistiúil ag baint úsáide as Addinsoft (2020). Rinneadh measúnú ar ghnáthdháileadh na sonraí ag baint úsáide as tástáil Shapiro-Wilk. Rinneadh anailís ar dhifríochtaí suntasacha idir samplaí rialaithe agus trialacha ag Student's-t (neamhspleách, dhá thaobh), nuair a tharla dáileadh normalach, agus trí thástáil Mann-Whitney, nuair a diúltaíodh don ghnáthdháileadh. Léirítear difríochtaí suntasacha i gcomparáid le rialú de réir tástála staidrimh le réiltíní (*p<><0.01 and=""><0.001). differences="" that="" are="" not="" statistically="" significant="" are="" named="" "ns"="" in="" the="" text="" and="" are="" characterized="" by="" the="" absence="" of="" asterisks="" on="" the="">
5. Conclúidí
Léiríonn an saothar seo go mbíonn tionchar ag codáin pola-agus oligosaccharide, a shaibhrítear in ulbháin, tar éis teicneolaíocht úrnua glas EAE ón bhfeamainn ghlas Uloa sp., iomadú fibroblast, sintéis próitéin ECM, athnuachan maitrís, agus athmhúnlú. D'fhéadfadh cur i bhfeidhm féideartha i straitéisí frith-aosaithe cosmaideacha teacht chun cinn ós rud é go bhfuil laghdú ar shintéis collagen mar shaintréith ag dul in aois craiceann. Dá bhrí sin, tá athnuachan maitrís craiceann tairbheach sa chomhthéacs seo. Mar sin, ulbháin, ó Ulva sp. codáin a fhaightear tar éis EAE, atá gníomhach go bitheolaíoch ar mheitibileacht fibroblasts craiceann deirmeach an duine. Tugann na húdair le fios go bhfuil an ghníomhaíocht seo mar fheidhm ag raidhse ulbhán, comhdhéanamh sulfáit, agus meáchan móilíneach na gcodán. tuairimíonn na húdair go bhfreagraíonn na móilíní rhamnose-saibhir seo do mhóilíní comharthaíochta, a aithnítear trí shuíomhanna lectin de na fibroblasts membrane agus ina dhiaidh sin spreagann siad a ngníomhaíocht meitibileach ag pointí anabalacha agus catabólacha araon. Mar sin féin, tá gá le himscrúduithe breise chun measúnú domhain a dhéanamh ar an meicníocht mhóilíneach arna ghníomhachtú ag pola-agus oligosaccharide Ulou sp. codáin ag leibhéal na bhfachtóirí trascríobh, cumas treá ulbháin meáchan móilíneach ard agus íseal i múnlaí explant craiceann 3D nó ex vivo, agus deimhnigh na torthaí seo de mhodhnú ECM le codáin díorthaithe Uloa EAE sna samhlacha seo le haghaidh sprioc frith-aosaithe.
Baintear an t-alt seo as Mar. Drugs 2021, 19, 156. https://doi.org/10.3390/md19030156 https://www.mdpi.com/journal/marinedrugs
