Conas a Úsáidtear an Cosc Fosphoinositide 3-Alpelisib kinase le haghaidh Siondróm Lowe/Galar Fiaclóireachta?

Athchóiríonn an fosphoinositide 3-inhibitor kinase alpelisib eagraíocht actin agus feabhsaíonn sé mífheidhmiú tubule cóngarach in vitro agus i múnla luiche de shiondróm Lowe agus galar Dent

Déan teagmháil le:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Berquez Mara^1,5, Jonathan R. Gadsby^2,5, Beatrice Paola Festa^1,5, Richard Butler³ , Stephen P. Jackson², Valeria Berno⁴, Alessandro Luciani1 , Olivier Devuyst^1,6agus Jennifer L. Gallop^2,6

EOCHAIRFHOCAL: cítea-chnámharlach; endocytosis; lipidí; tubule proximal; siondróm Fanconi duánach

Sócháin chaillteanais feidhme sa ghéin OCRL, a ionchódaíonn an fosfáit fosfáit [PI] 4,5-fosfáit [PI(4,5)P2] 5-fosfatás OCRL, is cúis le hinidicíteas lochtach agus mífheidhm tubule proximal isteachSiondróm Lowe agus galar Dent2. Tá an locht mar gheall ar leibhéil mhéadaithe PI(4,5)P2 agus polaiméiriú actin aberrant, ag cur bac ar gháinneáil endosomal. Aithníodh PI 3-fosfáit [PI(3)P] le déanaí mar chomhghníomhaitheoir le PI(4,5)P2 sa chonair actin. Anseo, rinneamar tástáil ar an hipitéis sinfosphoinositide 3-kinaseFéadfaidh coscairí (PI3K) an fabht ionocytic a bhaineann le caillteanas OCRL a tharrtháil, trí chomharthaí fosphoinositide a athchothromú chuig an innealra actin. An raon leathan PI3K(fosphoinositide 3-kinase)coscaire copanlisib agus aicme IA p110a PI3K(fosphoinositide 3-kinase) inhibitor alpelisibpolaiméiriú actin aberrant laghdaithe i gcealla duán daonna easnamhach OCRL in vitro. Laghdaíodh leibhéil PI 3,4, 5-trisphosphate, PI(4,5) P2, agus PI(3)P go léir le cóireáil alpelisib, agus leagadh síos siRNA den fho-aonad catalaíoch PI3K p110a feinitíopa an actin. I múnla daonnaithe luch OcrlY/-, laghdaigh alpelisib staining actin endosomal agus ailtireacht snáithíní struis agus leibhéil meigilín ag membrane plasma na gceall feadáin cóngarach a athchóiriú, rud a léirítear ag iontógáil endocytic feabhsaithe de phróitéiní ísealmheáchan móilíneach in vivo. Mar sin, tacaíonn ár dtorthaí leis an nasc idir lipidí fosphoinositide, polaiméiriú actin, agus gáinneáil endocytic sa tubule cóngarach agus is cruthúnas coincheapa iad chun alpelisib a athúsáid i.Siondróm Lowe/galar Dent2.

Ráiteas Aistritheach

Siondróm Lowe agus galar Dent2, de bharr sócháin sa phosphoinositide lipid 5-phosphatase OCRL, léiriú le mífheidhm tubule proximal agus proteinuria íseal-móilíneach-mheáchan gan ach cúram tacaíochta ar fáil. Léiríonn ár dtorthaí go bhfuil anfosphoinositide 3-kinase inhibitor alpelisib, atá faofa faoi láthair le haghaidh teiripe ailse, maolaíonn sé an t-iarmhéid fosfainitítíde aberrant agus feinitíopa actin a bhaineann le caillteanas OCRL, rud a chuireann feabhas suntasach ar an innealra endocytic agus cumas ionsúcháin i gcórais cheallacha agus samhail luch daonnaithe le haghaidh siondróm Lowe/galar Dent 2. Mar gheall ar a phróifíl sábháilteachta dealraitheach, is iarrthóir tuar dóchais inti é Alpelisib le haghaidh athúsáid drugaí iSiondróm Lowe agus galar Dent.

Tá conair éifeachtúil endolysosomal receptor-mediated ag cealla epithelial ar líneáil na feadáin cóngaracha (PTanna) den duán a aisghabhann agus a phróiseálann substaintí riachtanacha a scagadh tríd an glomerulus. Tá neamhoird ó bhroinn a dhéanann difear do endolysosomes ina chúis le mífheidhmiú PT (siondróm Fanconi duánach) le caillteanas fuail i dtuaslagáin agus próitéiní íseal-mheáchan móilíneach (LMW), casta go minic ag deacrachtaí meitibileach agus fáis agus forbairt galar duáin ainsealach.¹Tá baint ag sóchán neamhghníomhachtaithe in OCRL le galar Dent 2 (MIM #300555), neamhord arb iad is sainairíonna é mífheidhmiú PT, clocha duáin, agus teip duánach forásach, agus leis an siondróm oculocerebrorenal Lowe (MIM #309000), a thaispeánann, chomh maith. le mífheidhm PT agus teip duánacha, léirithe sistéamach cosúil le cataracts ó bhroinn, míchumas cognaíocha, agus hypotonia.^2-4Níl na cóireálacha reatha le haghaidh galar Dent 2 agus siondróm Lowe ach tacúil.

Fíor 1|PI3K(fosphoinositide 3-kinase)Coscairí faoiseamh a bhaint as cóimeáil actin aberrant ag endosomes i samhail cille OCRL-easnamhach duán daonna (HK2). (a) Céimeanna tiontaithe lipid fosfainitítíde atá ábhartha don staidéar seo a léiríonn na tiontuithe idir PI(4,5)P2, PI(3,4,5)P2, agus PI(3)P a bhfuil na heinsímí is ábhartha i gcló trom, is ábhartha tiontuithe i línte soladacha, agus cinn eile i línte briste. Tá PI(4,5)P2 ardaithe i siondróm Lowe mar gheall ar an easpa 5-ghníomhaíochta fosfatase ó OCRL agus tá sé déanta as fosfarylation PI ag fosfatidylinositol 4-kinases (PI4Ks) agus PI(4) P 5-kinase (PIP5K). Déantar PI(4,5)P2 a fhosfaralú ag PI3Kanna aicme I chun PI(3,4,5)P3 a tháirgeadh. Is féidir PI(3,4,5)P3 a dhífhosfarú go PI(4,5)P2 le PTEN nó go PI(3,4)P2 trí SH-2 – ina bhfuil inositol 50 polyphosphates (SHIP) 1 agus 2, synaptojanin 1 agus 2, agus OCRL freisin, cé go bhfuil sé seo (ar lean)

Fíor 1|(ar lean) shíl mé a bheith mion. Déantar PI(3,4)P2 a dhífhosfarú go PI(3)P le polaifhosfáit inositol-4-fosphatase cineál IA (INPP4A) agus B. Déantar PI(3)P freisin ag ion-sóim trí fosfarylation PI de réir aicme III. PI3K(fosphoinositide 3-kinase), próitéin sórtáil vacuolar Vps34. (b) Bloic an Iarthair a léiríonn caillteanas slonn OCRL i líne cille HK2 OCRL CRISPR (KO) i gcomparáid le cealla rialaithe HK2 de chineál fiáin (WT) le tubulin mar an rialú luchtaithe. (c–e) micreagraif chomhfhócasacha ionadaíocha Airyscan agus cainníochtú forluí antaiginí indéine 1 (EEA1)/actin luath (arna shloinneadh mar chéatadán d’fheithil iomlán LEE1þ braite) le haghaidh cealla HK2 WT nó OCRL KO atá cóireáilte le ceachtar démheitiolsulfocsaíd (DMSO) (d) nó an t-inhibitor léirithe agus socraithe ag baint úsáide as an socrú formaildéad 4 faoin gcéad. I ngach cás, léiríonn na híomhánna z-slice amháin ó chruach comhfhócasach arna phróiseáil ag Airyscan de chealla atá imdhíon-lipéadaithe le haghaidh EEA1 (buí), phalloidin (actin, magenta), agus 40,{6-diimidino{ {14}}feinilindól (DAPI) (cian). Barraí=5 mm. Sna cainníochtaí, léiríonn na línte an meán ± SEM agus is cill aonair gach pointe sonraí. I ngach turgnamh, cuireadh cóireálacha i bhfeidhm 16 uair an chloig roimh an socrú. I ngach cainníochtú, rinneadh measúnú ar thábhacht staitistiúil ag anailís Kruskal-Wallis (KW) ar an éagsúlacht le tástáil chomparáidí iolracha Dunn. (c) Cealla WT nó KO cóireáilte le ceachtar DMSO nó 100 nM de copanlisib, rud a thaispeánann tarrtháil an fhorluí actin-ionsómach. Tástáil KW: ***P < 0.0{{50}}1,="" comparáidí="" iolracha;="" wt="" dmso="" i="" gcoinne="" ko="" dmso,="" ko="" dmso="" i="" gcoinne="" ko="" copanlisib="" araon="" ***p="">< 0.001,="" wt="" copanlisib="" versus="" ko="" copanlisib="" p="0.44" (níl="" suntasach="" [ns]).="" n="52," 85,="" 67,="" agus="" 63="" cealla="" do="" wt="" dmso,="" wt="" copanlisib,="" ko="" dmso,="" agus="" ko="" copanlisib,="" faoi="" seach.="" (d)="" cealla="" wt="" nó="" ko="" atá="" cóireáilte="" le="" ceachtar="" dmso="" nó="" 10="" mm="" d'alpelisib,="" rud="" a="" thaispeánann="" tarrtháil="" an="" fhorluí="" actin-ionasómach.="" tástáil="" kw:="" ***p="">< 0.001,="" comparáidí="" iolracha;="" wt="" dmso="" i="" gcoinne="" ko="" dmso,="" ko="" dmso="" i="" gcoinne="" ko="" alpelisib="" araon="" ***p=""><0.001, wt="" alpelisib="" versus="" ko="" alpelisib.="" p=""> 0.99 (ns). N=31, 30, 43, agus 41 cill do WT DMSO, WT alpelisib, KO DMSO, agus KO alpelisib, faoi seach. (e) cealla WT nó KO atá cóireáilte le ceachtar DMSO, 10 mM de GSK2636771, nó 10 mM de idelalisib, rud a thaispeánann nach bhfuil ceachtar den dá chomhdhúil in ann an forluí actin-ionsómach a laghdú go suntasach. Tástáil KW: ***P < 0.001,="" comparáidí="" iolracha;="" wt="" dmso="" i="" gcoinne="" ko="" dmso,="" ***p="">< 0.001,="" ko="" dmso="" i="" gcoinne="" ko="" gsk,="" *p="0.04," ko="" dmso="" i="" gcoinne="" ko="" idelalisib,="" p=""> 0.99 (ns). N=159, 130, 203, 122, 131, agus 145 cealla le haghaidh WT DMSO, WT GSK2636771, WT idelalisib, KO DMSO, KO GSK2636771, agus KO idelalisib, faoi seach. Chun breathnú ar an íomhá seo a bharrfheabhsú, féach le do thoil ar an leagan ar líne den alt seo ag www.kidney-international.org

Conas a úsáidtear an 3-coisctheoir kinase kinase alpelisib le haghaidh siondróm Lowe/galar Dent?

Gné chomhsheasmhach is ea proteinuria LMW a breathnaíodh i siondróm Lowe/galar Dent 2, ag nochtadh go mbíonn tionchar ag OCRL ar endocytosis receptor-mediated.⁵Ionchódaíonn OCRL an fosfatidylinositol (PI) 4,5-dosfáit [PI(4,5)P2] 5- fosfáit OCRL,⁶a rialaíonn céannacht lipid sa chonair endolysosomal trí dhíghrádú PI(4,5)P2 (Fíor 1a). Tá díghrádú easnamhach PI(4,5)P2 trí OCRL gafa leis an mainneachtain veiníreacha brataithe le clathrin a dhíchóimeáil i fibroblasts, in éineacht le foirmiú struchtúir "cóiméad" de actin filiméadach polaiméirithe ó na horgánail luatha ion-chónaí a bhíonn mar thoradh air.^7-9I gcineálacha cille eile, go háirithe cealla PT na duán, bíonn struchtúir "ciseán" F-actin timpeall ar orgánailíní endolysosomal aberrant mar thoradh ar easnamh OCRL.¹⁰Cuireann an farasbarr F-actin bac ar gháinneáil membrane tríd an gcosán ionocytic agus endolysosomal, agus moltar laghdú a dhéanamh ar athchúrsáil an receptor multiligand megalin chuig an membrane apical, rud a chuireann leis an locht laistigh den chosán endolysosomal.¹¹I gcomhaontú le príomhról F-actin aberrant, maolaítear an t-iontógáil ionocytic lochtach de bharr sócháin OCRL trí dhíriú ar an innealra actin le latrunculin B, nó trí phróitéiní rialála actin a laghdú chomh maith le trí ídiú idirghabhálaithe beag a chuireann isteach ar RNA (siRNA). de PI(4)P 5-kinase chun sintéis PI(4,5)P2 a choigeartú^7,10(Fíor 1a).

Tuigtear níos mó ná riamh go n-eascraíonn polaiméiriú actin ní hamháin ó PI(4,5)P2 ach freisin ó lipidí fosphoinositide eile. Mar shampla, gníomhaíonn PI(3,4,5)P3 Rho-cineál GTPase Rac, agus gníomhaíonn PI(3)P i gcomhar le PI(4,5)P2 chun polaiméiriú actin a spreagadh le sruth ó GTPase Rho-cineál eile, Cdc42.^12-14Tá idir-chomhshó na bhfosphoinositides seo in éineacht le gluaiseacht lipidí tríd an gcosán ionocytic agus endosomal. Déantar PI(4,5)P2 a fhosfaralú ag fosfatidylinositol aicme I- 30 -kinase (PI3K) go PI(3,4,5)P3 ag an scannán plasma agus de réir a chéile dífhosfaraítear é go PI(3,4)P2 agus PI (3)P nó PI(4,5)P2.^14,15Saibhrítear PI(3)P ag ion-asóim, áit a bhfuil sé riachtanach dá bhfeidhm agus go príomha trí fhosfarylation PI go díreach de réir aicme III PI3K(fosphoinositide 3-kinase), vps34¹⁶(Fíor 1a). I líne chill epithelial líocha reitineach (RPE) easnamhach OCRL, laghdaítear cóiméid actin a ghintear trí chóireáil le PI3K(fosphoinositide 3-kinase)coscairí wortmannin agus Vps34-IN1, i gcomhaontú le staidéir bhithcheimiceacha a thaispeánann croí-rialáil actin trí chomhtharlú PI(3)P agus PI(4,5)P2 araon.¹⁴

Tarrtháil endocytosis a breathnaíodh nuair a bhítear ag díriú ar an innealra actin i gcealla othar OCRL agus cnagadh (KO),^7,10mar aon le rialachán réamhtheachtacha ar actin ag PI3K(fosphoinositide 3-kinase)ghníomhaíocht¹⁴agus nádúr an-idirnasctha an chomhshó PI, cuireann sé féidearthacht shuimiúil ar fáil do aicme I PI3K(fosphoinositide 3-kinase)d’fhéadfadh go mbeadh coscairí úsáideach i siondróm Lowe. Tá coscairí den sórt sin, a forbraíodh le haghaidh teiripe ailse, ceadaithe le haghaidh úsáide cliniciúla¹⁷agus dá bhrí sin d'fhéadfadh go mbeadh siad oiriúnach le haghaidh athúsáid drugaí. Cé go bhfuil comhdhúile den sórt sin mar copanlisib¹⁸a bhfuil sainiúlacht leathan agus fo-iarmhairtí acu, tá rathúlacht le déanaí léirithe maidir le coscairí níos sainiúla. Idealaisib,¹⁹a dhíríonn ar PI3K(fosphoinositide 3-kinase)subunit p110d, ceadaithe le haghaidh liomfóma lymphocytic ainsealach, agus tá alpelisib, a dhíríonn ar p110a, ceadaithe le húsáid in ailse chíche.^20,21Thairis sin, léirigh alpelisib tairbhe chliniciúil i leanaí a bhfuil siondróm PROS/CLOVES orthu,²²siondróm rófhás annamh a eascraíonn as gníomhachtú PIK3A.

Anseo, rinneamar tástáil ar an hipitéis go rang I PI3K(fosphoinositide 3-kinase)féadfaidh coscairí an fabht endocytic a tharrtháil mar gheall ar chailliúint OCRL, ag baint úsáide as samhlacha ceallacha agus luiche seanbhunaithe.^10,11,23Léirímid go bhfuil an cosc ​​ar PI3K(fosphoinositide 3-kinase)laghdaíonn gníomhaíocht trí copanlisib nó alpelisib, nó ídiú siRNA-idirghabhála an fho-aonad catalaíoch alpelisib-sprioc p110a an iomarca polaiméiriú actin i gcealla duáin daonna (HK2) atá easnamhach in OCRL. Ag díriú ar alpelisib mar an cumaisc is sainiúla le haghaidh úsáide cliniciúla, léirímid go laghdaíonn sé polaiméiriú actin agus go bhfeabhsaíonn sé glacadh tríd an gcosán endolysosomal i gcealla PT ó Ocrl daonnaithe^Y/-lucha in vitro. Ina theannta sin, maolaíonn cóireáil alpelisib in vivo proteinuria, laghdaítear mífheidhmiú PT, agus tarrthálann sé leibhéil cheallacha meigilín in Ocrl daonnaithe.^Y/-lucha. Tacaíonn na torthaí seo le alpelisib mar iarrthóir le haghaidh athúsáid drugaí iSiondróm Lowe agus galar Dent 2.

Fíor 2|Tá éifeachtaí Alpelisib ar actin freagrúil ag dáileoga agus athchaipitlithe ag siRNA de PI3K(fosphoinositide 3-kinase)p110a. (a) Micreagraif chomhfhócasacha ionadaíocha Airyscan (socraithe ag baint úsáide as an bhfeisteas formaildéad 4 faoin gcéad agus atá imdhíon-lipéadaithe d’antaigin luath-inendosome 1 [EEA1], buí; actin [phalloidin], magenta; agus 4{{4{0}},{{ 5}}diamidino-2-phenylindole [DAPI], cian; barraí=5 mm) agus cainníochtú cealla de chineál fiáin (WT) nó cnag-amach (KO) duán daonna (HK2) atá cóireáilte le démheitiolsulfocsaíd (DMSO) nó na dáileoga sonraithe d'alpelisib ar feadh 16 uair an chloig, rud a léiríonn tarrtháil dáileog-fhreagrach ar an bhforluí actin-endosomal. I ngach cás, léiríonn na línte meán±SEM agus léiríonn na pointí cealla aonair. N=31, 30, 71, 42, 90, 89, 41, 69, 66, agus 67 cealla le haghaidh rialú WT, WT 10 mM, WT 50 mM, KO DMSO , agus KO 2.5, 5, 10, 15, 25, agus 50 mM alpelisib, faoi seach. Tábhacht staitistiúil measúnaithe ag tástáil Kruskal-Wallis (KW) le tástáil chomparáidí iolracha Dunn: foriomlán ***P < 0.001,="" comparáidí="" iolracha;="" wt="" dmso="" i="" gcoinne="" ko="" dmso,="" ko="" dmso="" in="" aghaidh="" ko="" 5,="" 15,="" 25,="" agus="" 50="" mm="" alpailíb="" go="" léir="" ***p="">< 0.001,="" ko="" dmso="" i="" gcoinne="" ko="" 2.5="" mm="" alpailísib="" *p="0.0131," versus="" ko="" dm="" so="" 1="" mm="" alpelisib="" **p="0.0043," wt="" dmso="" i="" gcoinne="" wt="" 10="" agus="" 50="" mm="" alpelisib="" p=""> 0.9999 (ní suntasach [ns]). (b) Blot iartharach do p110a agus a-tubulin rialaithe luchtaithe cealla WT nó KO atá cóireáilte le scramble (Scram.) nó p110a siRNA. (c) micreagraif chomhfhócasacha ionadaíocha Airyscan (socraithe ag baint úsáide as an socrú formaildéad 4 faoin gcéad agus imdhíonlipéadaithe le haghaidh EEA1, buí; actin [phalloidin], magenta; agus DAPI, cian; barraí=5 mm) agus cainníochtú cealla WT nó KO cóireáilte le scramble (S) nó p110a siRNA, rud a léiríonn laghdú ar fhorluí actin LEE ar ídiú p110a. Tástáil KW le tástáil chomparáidí iolracha Dunn: ***P < 0.001,="" comparáidí="" iolracha;="" scramble="" wt="" versus="" scramble="" ko,="" scramble="" ko="" i="" gcoinne="" ko="" p110a="" sirna="" araon="" ***p="">< 0.001.="" n="79," 108,="" 93,="" agus="" 131="" cill,="" faoi="" seach.="" hk2,="" duáin="" daonna;="" pi3k,="" fosfatidylinositol-30="" -kinase;="" sirna,="" rna="" beag,="" cur="" isteach.="" chun="" breathnú="" ar="" an="" íomhá="" seo="" a="" bharrfheabhsú,="" féach="" le="" do="" thoil="" ar="" an="" leagan="" ar="" líne="" den="" alt="" seo="" ag="">

Fíor 3|Ardaítear leibhéil fosfatidylinositol (PI) 4,5-bifosfáit [PI(4,5)P2] le cnag amach OCRL (KO), agus PI(3,4,5)P3, PI(4,5)P2 , agus PI(3)P faoi chois ag cóireáil alpilisib. Sna turgnaimh go léir, cuireadh na cóireálacha léirithe i bhfeidhm 16 uair an chloig roimh an socrú. Sna cainníochtaí, léiríonn na línte an meán ± SEM, agus eascraíonn gach pointe sonraí ó chill aonair. I ngach cainníochtú, rinneadh measúnú ar thábhacht staitistiúil ag anailís Kruskal-Wallis (KW) ar an éagsúlacht le tástáil chomparáidí iolracha Dunn. Barraí=20mm i ngach íomhá. (a) Micreagraif ionadaíocha ionadaíocha de chealla de chineál fiáin (WT) nó de chealla duán daonna KO (HK2) arna gcóireáil le démheitiolsulfocsaíd (DMSO) nó 10 mM d’alpelisib agus arna bhfostú ansin leis an bhfeabhrán plasma plasma agus lipéadaithe imdhíonach do PI(3,4,5). )P3 (dearg) agus 40,6-diamidino-2-feinilindól (DAPI) (cian), le cainníochtú na meándéine lipéadaithe PI(3,4,5)P3, ag taispeáint éifeachtacht na n-alpelisib cóireáil ar shintéis PI(3,4,5)P3. N=96, 128, agus 109 cealla do WT DMSO, WT alpelisib, KO DMSO, agus KO alpelisib, faoi seach. KW (ar lean)

Fíor 3|(ar leanúint) tástáil: foriomlán ***P < 0.001,="" comparáidí="" iolracha;="" wt="" dmso="" i="" gcoinne="" ko="" dmso,="" wt="" dmso="" i="" gcoinne="" wt="" alpelisib,="" agus="" ko="" dmso="" versus="" ko="" alpelisib="" gach="" ***p="">< 0.0{{70}}1.="" (b)="" micreagraif="" chomhfhócasacha="" ionadaíocha="" de="" chealla="" wt="" nó="" ko="" hk2="" cóireáilte="" le="" dmso,="" 10="" mm-,="" nó="" 50-mm="" alpelisib="" ar="" feadh="" 16="" huaire="" agus="" ansin="" greamaithe="" leis="" an="" bhfearas="" golgi="" agus="" lipéadaithe="" ag="" baint="" úsáide="" as="" an="" m="" ch="" {{10}}="" taiscéalaí="" xfyve="" pi(3)p="" (magenta)="" agus="" dapi="" (cian),="" le="" cainníochtú="" ar="" líon="" na="" bpuncta="" pi(3)p-dearfach="" a="" braitheadh="" ​​i="" gcealla="" atá="" cóireáilte="" le="" raon="" tiúchana="" alpilisib="" ,="" mar="" a="" léirítear,="" a="" thaispeánann="" pi(3)="" laghdaítear="" punctae="" p-positive="" ar="" bhealach="" a="" fhreagraíonn="" do="" dháileog.="" n="280," 254,="" 210,="" 287,="" 324,="" 239,="" 340,="" 250,="" 240,="" agus="" 215="" cealla="" le="" haghaidh="" rialú="" wt,="" wt="" 10="" mm,="" wt="" 50="" mm,="" ko="" dmso,="" agus="" ko="" 2.5,="" 5,="" 10,="" 25,="" agus="" 50="" mm="" alpelisib,="" faoi="" seach.="" tástáil="" kw:="" foriomlán="" ***p="">< 0.001,="" comparáidí="" iolracha;="" wt="" dmso="" i="" gcoinne="" ko="" dmso,="" wt="" dmso="" i="" gcoinne="" wt="" 10="" agus="" 50="" mm="" alpelisib,="" ko="" dmso="" versus="" ko="" 50="" mm="" alpelisib="" gach="" ***p="">< 0.001;="" ko="" dmso="" i="" gcoinne="" ko="" 2.5="" agus="" 5="" mm="" alpelisib="" araon="" p=""> 0.9999 (gan a bheith suntasach [ns]); KO DMSO in aghaidh KO 10 mM alpelisib **P=0.0049; KO DMSO i gcoinne KO 25 mM alpelisib ***P=0.0002. (c) Micreagraif ionadaíocha ionadaíocha de chealla WT nó KO HK2 arna gcóireáil le DMSO nó le 10 mM d'alpelisib agus arna bhfostú ansin leis an bhfeisteas membrane plasma agus lipéadaithe imdhíon-lipéadaithe do PI(4,5)P2 (buí) agus DAPI (cian), le cainníochtú an meándéine lipéadaithe ceallach PI(4,5) P2, ag taispeáint membrane plasma méadaithe PI(4,5)P2 i gcealla KO, a laghdaítear trí chóireáil alpilisib, go háirithe i gcealla KO. N=126, 112, 85, agus 116 cealla le haghaidh WT DMSO, WT alpelisib, KO DMSO, agus KO alpelisib, faoi seach. Tástáil KW: foriomlán ***P < 0.001,="" comparáidí="" iolracha;="" wt="" dmso="" i="" gcoinne="" ko="" dmso="" agus="" ko="" dmso="" i="" gcoinne="" ko="" alpelisib="" araon="" ***p="">< 0.001;="" wt="" dmso="" i="" gcoinne="" wt="" alpelisib="" p="0.4752" (ns).="" (d)="" micreagraif="" ionadaíocha="" ionadaíocha="" de="" chealla="" wt="" nó="" ko="" hk2="" atá="" cóireáilte="" le="" dmso="" nó="" 10="" mm="" d'alpelisib="" agus="" arna="" bhfostú="" ansin="" leis="" an="" bhfostú="" formaildéad="" 4="" faoin="" gcéad="" agus="" lipéadaithe="" imdhíon-lipéadaithe="" do="" pi(4,5)p2="" (buí)="" agus="" dapi="" (cian),="" le="" cainníochtú="" den="" líon="" pi(4,5)p2-puncta="" dearfacha,="" a="" thaispeánann="" méadú="" pi(4,5)p2="" puncta="" i="" gcealla="" ko,="" a="" laghdaítear="" trí="" chóireáil="" alpeilisib,="" go="" háirithe="" i="" gcealla="" ko.="" n="75," 65,="" 52,="" agus="" 69="" cealla="" le="" haghaidh="" wt="" dmso,="" wt="" alpelisib,="" ko="" dmso,="" agus="" ko="" alpelisib,="" faoi="" seach.="" tástáil="" kw:="" foriomlán="" ***p="">< 0.001,="" comparáidí="" iolracha;="" wt="" dmso="" i="" gcoinne="" ko="" dmso="" agus="" ko="" dmso="" i="" gcoinne="" ko="" alpelisib="" araon="" ***p="">< 0.001;="" wt="" dmso="" i="" gcoinne="" wt="" alpailisib="" p=""> 0.99 (ns). au, aonaid treallach. Chun breathnú ar an íomhá seo a bharrfheabhsú, féach le do thoil ar an leagan ar líne den alt seo ag www.kidney-international.org.

Conas a úsáidtear an 3-coisctheoir kinase kinase alpelisib le haghaidh siondróm Lowe/galar Dent?

1. TORTHAÍ

1.1 Laghdaíonn coscairí PI3K Aicme I comhiomlánú actin i gcealla OCRL-KO HK2

D’úsáideamar eagarthóireacht ghéine CRISPR-Cas9 chun OCRL knockout (KO) sa líne chill HK2 chun tástáil a dhéanamh ar rang I PI3K(fosphoinositide 3-kinase)coscairí ar an gcomhiomlánú actin tréith ag urranna endolysosomal.^7,9,10,14D'fhíoraigh blotting an iarthair laghdú 98.0± 0.7 faoin gcéad i slonn OCRL i lysates ó chealla KO HK2 (Fíor 1b). Rinne an OCRL KO athchaipitliú ar fheinitíopa an chiseáin actin i gcealla HK2, mar a léiríodh ag forluí méadaithe idir F-actin agus antaigin endosome luath 1 (EEA1), arna chainníochtú ar z-stacks micreascópachta comhfhócasach Airyscan (Fíor 1c–e). Rinneadh an forluí méadaithe seo a breathnaíodh i gcealla OCRL KO a aisiompú trí chóireáil le copanlisib (C), raon leathan PI3K(fosphoinositide 3-kinase)coscaire a dhíríonn ar p110a agus d agus go pointe níos lú ar na isfhoirmeacha p110b agus g (Fíor 1c). Trí sleachta lánchealla HK2 a bhlotáil san iarthar, fuaireamar amach go raibh an PI3K(fosphoinositide 3-kinase)Bhí fo-aonaid rialála p110 a, b, agus d curtha in iúl go maith i gcealla de chineál fiáin (WT) agus KO, agus gan ach leibhéil rian den isoform p110g i láthair (Fíor Forlíontach S1A).

Rinneamar idirdhealú idir an PI3K(fosphoinositide 3-kinase)sainiúlacht an chosc ar F-actin ag baint úsáide as alpelisib (A), cosc ​​​​roghnach p110a, agus GSK2636771 (G) agus idelalisib (I), coscairí roghnacha p110b agus p110d, faoi seach (Fíor Forlíontach S1A). Cé gur thug cóireáil alpelisib laghdú comhchosúil ar pholaiméiriú actin endosomal i gcomparáid le copanlisib (Fíor 1d), bhí tionchar beag ag GSK2636771 agus idelalisib ar charnadh actin (Fíor 1e). An aicme I PI3K(fosphoinositide 3-kinase)ní raibh aon tocsaineacht mhéadaithe ag coscairí ar OCRL KO i gcoibhneas le cealla neamhathraithe, bunaithe ar an measúnú MTT (Fíor Forlíontach S1B).

1.2 Alpelisib agus p110a knockdown tarrthála an feinitíopa actin i gcealla HK2

Le haghaidh ár gcuid staidéir ina dhiaidh sin, dhíríomar ar alpelisib mar gurb é an PI3K is roghnaíoch agus is lú tocsaineach é.fosphoinositide 3-kinase)forbraíodh coscaire go dtí seo, agus úsáidtear é faoi láthair chun cóireáil a dhéanamh ar róghníomhaíocht mósáic de rang Ia PI3K i leanaí a bhfuil siondróm PROS/CLOVES orthu.²²Laghdaigh Alpelisib na ciseáin actin i gcealla OCRL KO HK2 ar bhealach a fhreagraíonn do dháileog (Fíor 2a). Breathnaíodh na héifeachtaí ag dáileog 10 mM chomh luath agus 4 uair an chloig tar éis cóireála, gan tocsaineacht dealraitheach (Fíor Forlíontach S2). Chun tástáil an bhfuil PI3K(fosphoinositide 3-kinase)Ba é cosc ​​​​alpelisib foinse an staining actin laghdaithe, laghdaigh muid go sonrach a sprioc, an fo-aonad p110a, ag baint úsáide as siRNA (Fíor 2b). I gcomparáid le cóireáil le siRNA rialaithe (scriosta seicheamhach), thug siRNA in aghaidh p110a 78.3 ± 4.8 faoin gcéad agus 68.9 ± 7.7 faoin gcéad ídiú próitéin p110a i gcealla WT agus OCRL KO HK2, faoi seach, léirithe ag laghdú suntasach ar chiseáin actin ( Fíor 2c).

1.3 Leibhéil laghdaithe PI(3,4,5)P3, PI(4,5)P2, agus PI(3)P i gcealla HK2 cóireáilte alpilisib

Chun scrúdú a dhéanamh ar an gcaoi a mbíonn tionchar ag OCRL KO agus cóireáil alpelisib ar lipidí fosphoinositide, rinneamar cealla HK2 a dhaite le antasubstaintí nó fearainn próitéine i gcoinne PI(3,4,5) P3, PI(3)P, agus PI(4,5)P2, ag baint úsáide as coinníollacha optamaithe socraithe don scannán plasma nó do smálú incheallach.^24,25Tá logánú idirleata ag PI(3,4,5)P3 chuig an scannán plasma, agus d’eascair laghdú láidir ar staining PI(3,4,5)P3 i gcealla WT agus OCRL KO araon de bharr cóireáil alpaisib (10 mM), mar táthar ag súil óna meicníocht gníomhaíochta agus óna shainiúlacht d'aicme IA PI3K(fosphoinositide 3-kinase)p110a (Fíor 3a). Táthar ag súil go ndéanfar PI(3,4,5)P3 a dhífhosfarú de réir a chéile de réir mar a dhéantar ionicítí a dhéanamh ar na seicní agus mar a ndéantar gáinneáil orthu ina n-ionasóim.^14,26,27Trí chealla a shocrú ionas go gcaomhnaítear PI(3)P infhéitheach,²⁵fuaireamar amach gur laghdaíodh PI(3)P punctae freisin le cóireáil alpelisib (ar bhealach a fhreagraíonn do dháileog a léiríodh ó thiúchan chomh híseal le 10 mm don 16-uair an chloig cóireála) i gcealla WT agus OCRL KO (Fíor 3b). agus Figiúr Forlíontach S2C). Mar a bheifí ag súil leis, chothaigh KO an OCRL i gcealla HK2 méadú suntasach ar leibhéil PI(4,5)P2 ag an scannán plasma (Fíor 3c) agus laistigh de chealla (Fíor 3d), i gcomparáid le cealla WT.^10,28Laghdaigh cóireáil le alpelisib go suntasach an t-ingearchló PI(4,5)P2 ginte ag OCRL KO sa dá urrann, ach ní raibh aon éifeacht aige i gcealla WT (Fíor 3c agus d). Tuairiscítear go gcuireann Alpelisib bac ar PI 4-kinase b le tiúchan coisctheach 5{{{{}} faoin gcéad de 0.5 mM,¹⁹atá ina fhoinse fhéideartha den laghdú ar PI(4,5)P2. I dteannta a chéile, mhol ár gcuid sonraí go gcuireann alpelisib cosc ​​ar thionól actin ar ion-sóim OCRL KO trí éifeacht déspecific ar na leibhéil PI(4,5)P2 agus PI(3)P.

Fíor 4|Maolaíonn Alpelisib lochtanna actin den Bhéal in Ocrl daonnaithe saothraithe^Y/-luch PTCs (m PTCs). (a) uasdéine ionadaíoch Z-teilgean micreagraif chomhfhócasacha de OcrlY/þ nó Ocrl^Y/-m PTCanna atá cóireáilte le démheitiolsulfocsaíd (DMSO) nó 10 mM d'alpelisib ar feadh 16 huaire agus ansin socraithe leis an bhféidearthacht formaildéad 4 faoin gcéad agus imdhíonlipéadaithe le haghaidh actin (phalloidin) (bán) agus 40,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (gorm), le cainníochtú ar an méid atá snáithíní struis i láthair i ngach coinníoll, ag taispeáint go bhfuil snáithíní struis caillte in Ocrl^Y/-m Déantar PTCanna a tharrtháil trí chóireáil alpilisib. Léiríonn na línte modhanna ±SEM, agus léiríonn na pointí sonraí gach réigiún íomháithe: N=5 réigiúin íomháithe in aghaidh an choinníll (tá thart ar 15–20 cill i ngach ceann acu). Rinneadh measúnú ar an tábhacht trí anailís ghnáthathraitheas 1-bhealach (ANOVA) le triail chomparáide iolrach Holm-Sidak, **P=0.001, comparáidí iolracha; Ocrl Y/þ DMSO i gcoinne Ocrl^Y/-DMSO**

P{0}}.002, Ocrl^Y/-DMSO i gcoinne Ocrl^Y/-alpelisib **P=0.004, OcrlY/þ DMSO in aghaidh Ocrl^Y/- alpelisib P=0.50 (gan a bheith suntasach [ns]). Barraí=20mm. (b) Rindreálacha dromchla 3D ard-mhéadúcháin ionadaíocha Ocrl m PTCanna arna gcóireáil le DMSO nó 10 mM d'alpelisib ar feadh 16 huaire agus ansin socraithe leis an bhfeabhrán formaildéad 4 faoin gcéad agus atá imdhíon-lipéadaithe le haghaidh antaigin ion-inideach luath 1 (EEA1) (corcra), actin ( phalloidin, buí), agus DAPI (gorm), agus cainníochtú a léiríonn tarrtháil an fhorluí actin-endosomal ag alpelisib. Amharcanna méadaithe níos ísle a léiríonn forbhreathnú ar (ar lean)

Fíor 4|(ar lean) taispeántar na réigiúin seo i bhFíor Forlíontach S4B agus Scannáin Forlíontacha S1–S3. Léiríonn línte meán±SEM. N=42, 47, agus 45 réimse roghnaithe go randamach le haghaidh OcrlY/þ þ DMSO, Ocrl^Y/-þ DMSO, agus Ocrl^Y/-þ coinníollacha alpelisib, faoi seach, i ngach cás comhthiomsaithe ó 4 duán luiche in aghaidh an choinníll. Rinne Kruskal-Wallis (KW) ANOVA tástáil ar shuntasacht le tástáil chomparáidí iolracha Dunn: foriomlán ***P < 0.001,="" comparáidí="" iolracha;="" ocrly/þ="" dmso="" i="" gcoinne="">^Y/-DMSO agus Ocrl^Y/-DMSO i gcoinne Ocrl^Y/-alpilisib ***P < 0.001;="" ocrly/þ="" dmso="" i="" gcoinne="">^Y/-alpilisib P > 0.99 (ns). Barraí=1 mm. (c) Micreagraif chomhfhócasacha ionadaíocha OcrlY/þ nó Ocrl^Y/-m PTCanna cóireáilte le DMSO nó 10-mM alpelisib agus ansin greamaithe leis an deisiú Golgi agus lipéadaithe ag baint úsáide as an m Ch{{1}xFYVE PI(3)P probe (magenta) agus DAPI (cian), le cainníochtú líon na bpuncta PI(3)P-dearfach a braitheadh ​​i gcealla. N=188, 177, 246, agus 206 cill ó OcrlY/þ þ DMSO, OcrlY/þ þ alpelisib, Ocrl^Y/-þ DMSO, agus Ocrl^Y/-þ alpilisib, faoi seach; comhthiomsaíodh cealla ó 3 duáin ó bhéal in aghaidh an ghrúpa. Tástáil KW: foriomlán ***P < 0.001,="" comparáidí="" iolracha;="" ocrly/þ="" dmso="" i="" gcoinne="">^Y/-DMSO, OcrlY/þ DMSO in aghaidh OcrlY/þ alpelisib, agus Ocrl^Y/-DMSO i gcoinne Ocrl^Y/-alpilisib, gach ***P < 0.001.="" barraí="20" mm.="" (d)="" micreagraif="" chomhfhócasacha="" ionadaíocha="" ocrly/þ="" nó="">^Y/-m PTCanna atá cóireáilte le DMSO nó 10 mM d’alpelisib ar feadh 16 uair an chloig socraithe ansin leis an bhfeisteas formaildéad 4 faoin gcéad agus lipéadaithe imdhíon-lipéadaithe le haghaidh fosfatidylinositol (PI) 4,5-biphosphate [PI(4,5) P2] (buí) agus DAPI (cian), le cainníochtú ar líon na PI(4,5)P2-puncta dearfach, ag taispeáint PI(4,5)P2 puncta méadaithe in Ocrl^Y/-cealla, a laghdaítear trí chóireáil alpilisib. N=477, 444, 423, agus 494 ó OcrlY/þ þ DMSO, OcrlY/þ þ alpelisib, Ocrl^Y/-þ DMSO, agus Ocrl^Y/-þ alpilisib, faoi seach; comhthiomsaíodh cealla ó 3 duáin ó bhéal in aghaidh an ghrúpa. Tástáil KW: foriomlán ***P < 0.001,="" comparáidí="" iolracha;="" ocrly/þ="" dmso="" i="" gcoinne="">^Y/-DMSO, OcrlY/þ DMSO in aghaidh OcrlY/þ alpelisib, agus Ocrl^Y/-DMSO i gcoinne Ocrl^Y/-alpilisib, gach ***P < 0.001.="" barraí="20" mm.="" chun="" breathnú="" ar="" an="" íomhá="" seo="" a="" bharrfheabhsú,="" féach="" le="" do="" thoil="" ar="" an="" leagan="" ar="" líne="" den="" alt="" seo="" ag="">

1.4 Laghdaíonn Alpelisib fosfainicítíde intracellular agus maolaíonn sé lochtanna cítea-chnámharlaigh in Ocrl^Y/-m PTCanna

Rinneamar tástáil arís an raibh na héifeachtaí céanna ag alpelisib i gcealla príomhúla de chealla PT a dhíorthaítear ón tsamhail luch Ocrldefificient daonnaithe (Ocrl^Y/-), a athchaipeann an polaiméiriú actin neamhghnácha agus an locht endocytic a breathnaíodh i gcealla díorthaithe othar.^10,11Sloinntear na PTCanna luiche (m PTCanna) cosúil le haicme I PI3K(fosphoinositide 3-kinase) fo-aonaid rialála chuig cealla HK2 in WT agus in Ocrl araon^Y/-lucha agus léirigh siad próifíl tocsaineachta comhchosúil i dtreo alpelisib nuair a mheasúnaíodh iad le measúnachtaí MTT (Fíor Forlíontach S3). Nocht íomháú le micreascópacht chomhfhócasach go raibh cur isteach suntasach ar ghnáth-ailtireacht snáithíní struis F-actin i m PTCanna ó Ocrl^Y/-i gcomparáid le lucha OcrlY/þ, is dócha mar gheall ar athlonnú na bpróitéiní rialála actin óna ngnáthshuímh cheallacha go hionsóim, toisc go bhfuil comhthionóil mhóra actin timpeall ar na horgánaigh seo agus go meastar gurb iad bunús na fabhtanna gáinneála.^10,29Cóireáil Ocrl^Y/- m PTCanna le alpelisib (10 mM) athchóiriú ar an ailtireacht snáithíní struis (Fíor 4a).

Conas a úsáidtear an 3-coisctheoir kinase kinase alpelisib le haghaidh siondróm Lowe/galar Dent?

Mar an fhadhb is mó iSiondróm Lowe agus galar Dent2 ná gáinneáil endosomal laghdaithe agus díghrádú megalin dá bharr, rinneamar iarracht idirdhealú a dhéanamh idir actin endosomal ó na snáithíní struis. Bhailíomar cruacha comhfhócasacha scanadh léasair ar fud na gceall, d’athchruthaigh muid an patrún staining i rindreáil dromchla 3D, agus d’úsáideamar cruth/paraiméadair méide chun struchtúir actin punctate a aithint agus an méid a forluí le struchtúir endosomal (Fíor Forlíontach S4 agus Scannáin S1). –S3). Léirigh an anailís seo gur laghdaigh cóireáil le alpelisib polaiméiriú neamhbhríoch F-actin ag endosomes dhaite le EEA1, difriúil ón ailtireacht snáithíní struis (Fíor 4b). Na m PTCs díorthaithe ó Ocrl^Y/-léirigh lucha athruithe suntasacha i staining intracellular do PI(3)P (laghdaithe) agus PI(4,5)P2 (méadaithe), i gcomparáid le m PTCs ó WT OcrlY/þ lucha (Fíor 4c agus d). Cóireáil m PTCanna ó Ocrl^Y/- mar thoradh ar lucha le alpelisib tháinig laghdú suntasach ar staining intracellular PI(3)P agus PI(4,5)P2 (Fíor 4c agus d).

1.5 Feabhsaíonn Alpelisib iontógáil endocytic in Ocrl^Y/-m PTCanna

An chéad uair eile rinneamar measúnú ar cibé an raibh athruithe ar an gcumas glactha ionocytic mar thoradh ar éifeacht na n-alpelisib ar na lochtanna cítea-chnámharlaigh agus soithíoch a breathnaíodh i m PTCanna. Chun éifeacht alpelisib ar cheangail agus/nó inmheánú an ligand a dhifreáil, rinneadh m PTCanna a ghoradh ar dtús le halbaimin séiream buaibheach lipéadaithe (BSA), chun ceangal an taiscéalaí a chothú leis na gabhdóirí ionocytic, agus ansin gortha iad le meán fáis, chun leanúint le hinmheánú albaimin (Fíor 5a). An Ocrl^Y/-léirigh cealla membrane plasma níos ísle ceangailteach d'albaimin serum bó-Alex 488-mar aon le hinmheánú lagaithe albaimin i gcomparáid le cealla OcrlY/þ. Tarrtháil cóireáil le halpelisib an ceangal agus an glacadh albaimin san Ocrl^Y/-cealla, le tarrtháil foriomlán 50 faoin gcéad ar iontógáil endocytic (Fíor 5b agus c). Tacaíodh leis na sonraí seo trí úsáid iomlán an albaimin a thomhas (Fíoracha Forlíontacha S5a agus b). Thugamar faoi deara gur fhan an cóimheas idir na coinníollacha éagsúla (Fíor 5d) sa chóimheas inmheánach/ceangailte Alexa séiream buaibheach, rud a thugann le tuiscint gur lagú ceangailteach seachas próiseas inmheánachaithe lochtach is mó is cúis leis an laghdú ar albaimin.

1.6 Feabhsaíonn Alpelisib mífheidhmiú PT agus endocytosis receptor-mediated in Ocrl^Y/- lucha

Rinneamar tástáil ar an éifeacht theiripeach a d'fhéadfadh a bheith ag alpelisib ar mhífheidhm PT in vivo. Riaradh lucha béil le ceachtar feithicle nó alpelisib (50 mg/kg meáchan coirp in aghaidh an lae) le gavage ó bhéal ar feadh 6 seachtaine (Fíor 6a). Roghnaíodh an réimeas seo de réir staidéir in vivo roimhe seo a léirigh éifeachtúlacht agus sábháilteacht.^22,30I gcomhréir leis an riarachán alpilisib is eol go bhfuil sé ina chúis le friotaíocht inslin agus hyperglycemia,²²mar thoradh ar chóireáil alpelisib tháinig méadú suntasach ar glycosuria in Ocrl Y/þ agus sa Bhéal^Y/-lucha, a d’fhéadfaí a mheas mar bhithmharcóir le haghaidh dáileoga drugaí (Tábla Forlíontach S1). Tar éis 6 seachtaine de chóireáil alpilisib, beidh an Ocrl^Y/-léirigh lucha laghdú suntasach ar eisfhearadh fuail na bpróitéiní LMW CC16 (-34 faoin gcéad ) agus an albaimin (-38 faoin gcéad ), i gcomparáid le rialtáin cóireáilte le feithiclí (Fíor 6b agus c), cé go raibh toirt an níor cuireadh isteach ar fhual ná ar pharaiméadair eile (Tábla Forlíontach S1). Léirigh lucha cóireáilte Alpelisib an dá ghéinitíopa laghdú comhchosúil ar ráta fáis i gcomparáid le lucha rialaithe, mar a thuairiscítear roimhe seo.²²Mar sin féin, ghnóthaigh lucha feithicle agus lucha cóireáilte meáchan coirp, rud a thugann le fios nach gcuireann an druga isteach go mór ar fhorbairt iarbhreithe (Fíor 6d agus Tábla Forlíontach S1).

Chun a thástáil cibé an léirigh éifeacht alpelisib ar phróitéiniúir LMW aisghabháil endocytosis receptor-mediated i gcealla PT, leanamar an glacadh in vivo de Cy5-b-lactoglobulin lipéadaithe i duáin luiche. Ocrl cóireáilte Alpelisib^Y/-léirigh lucha tarrtháil shuntasach ó iontógáil Cy5-lipéadaithe b-lachta-ghlóbailin, gar do mhéid an inmheánaithe a breathnaíodh i lucha OcrlY/þ atá cóireáilte le feithiclí (Fíor 6e). Léiríodh é seo le tarrtháil shuntasach i léiriú an ghabhdóra endocytic megalin i gcealla PT, mar a breathnaíodh ag imdhíon-lipéadú agus blotting iarthar na lysates duánach Ocrl cóireáilte le alpilisib.^Y/-lucha; tabhair faoi deara nach raibh aon athrú ar shloinneadh an mharcóra PT AQP1 (Fíor 6f agus g agus Fíor Forlíontach S5C agus D). Léiríonn na sonraí seo go bhfuil an PI3K(fosphoinositide 3-kinase)inhibitor alpelisibspreagann sé feabhas suntasach ar an innealra endocytic PT agus laghdaíonn sé próitéin LMW i múnla luch daonnaithe do shiondróm Lowe.

Fíor 5|Feabhsaíonn Alpelisib iontógáil endocytic Ocrl daonnaithe^Y/-luch PTCs (m PTCs). (a) Scéimreach a léiríonn an turgnamh bíog-lorg a úsáideadh chun scrúdú a dhéanamh ar cheangal agus ar inmheánú Alexa 488-albaimin séiream buaibheach (BSA) ina m PTCanna. Nochtadh cealla do Alexa 488-BSA (0.2 mg/ml) ar feadh 1 uair ag 4 chéim chun ligean do BSA ceangal a dhéanamh le gabhdóirí dromchla cille (pulse) agus ansin téamh go 37 céim i meán cille ar feadh 20 nóiméad roimh an socrú chun inmheánú ligand (sealg) a cheadú. (b) Micreagraif chomhfhócasacha ionadaíocha OcrlY/þ nó Ocrl^Y/-m PTCanna cóireáilte le démheitiolsulfocsaíd (DMSO) nó 10 mM d’alpelisib ar feadh 16 huaire agus iad faoi réir thurgnamh bíog-chuais Alexa 488-BSA (glas) sular socraíodh iad agus lipéadaítear iad le haghaidh 40,6-diamidino{ {6}}feinilindól (DAPI) (gorm). Taispeántar céim chuisle an turgnaimh sa phainéal uachtarach do gach riocht, agus an chase thíos. Barraí=20 mm. (c) Cainníochtú dhromchla cille Alexa 488-BSA (i) agus Alexa inmheánaithe 488-BSA (ii), arna luacháil mar mheán-déine fhluaraiseachta FL in aghaidh na cille. Tarrtháil Alpelisib an ceangal BSA tarrtháilte agus inmheánú a breathnaíodh in Ocrl^Y/-cealla. N=209, 228, 186, agus 196 cill le haghaidh OcrlY/þ DMSO, OcrlY/þ alpelisib, OcrlY/ DMSO, agus Ocrl^Y/-coinníollacha alpelisib, faoi seach in (i) agus N=203, 183, 199, agus 233 cill do OcrlY/þ DMSO, OcrlY/þ alpelisib, Ocrl^Y/-DMSO, agus Ocrl^Y/-coinníollacha alpelisib, faoi seach in (ii), i ngach cás comhthiomsaithe ó 2 duán luiche in aghaidh an choinníll; Léiríonn gach pointe sonraí an mheándéine fhluaraiseachta FL i gcill aonair. Thástáil anailís Kruskal-Wallis (KW) ar athraitheas (ANOVA) suntasacht le tástáil chomparáidí iolracha Dunn: le haghaidh (i) dromchla cille BSA, foriomlán ***P < 0.001,="" comparáidí="" iolracha:="" ocrly/þ="" dmso="" i="" gcoinne="">^Y/-DMSO agus Ocrl^Y/-DMSO i gcoinne Ocrl^Y/-alpilisib ***P < {{0}}.001;="" ocrly/þ="" dmso="" versus="" ocrly/þ="" alpelisib="" p="0.60" (gan="" a="" bheith="" suntasach="" [ns]);="" le="" haghaidh="" (ii)="" bsa="" inmheánach,="" foriomlán="" ***p="">< 0.001,="" comparáidí="" iolracha:="" ocrly/þ="" dmso="" versus="">^Y/-DMSO agus Ocrl^Y/-DMSO i gcoinne Ocrl^Y/-alpilisib ***P < 0.001;="" ocrly/þ="" dmso="" i="" gcoinne="" ocrly/þ="" alpelisib="" p="0.66" (ns).="" (d)="" cainníochtú="" an="" chóimheas="" idir="" an="" dromchla="" cille="" alexa="" 488-="" bsa="" agus="" na="" déine="" fluaraiseachta="" inmheánaithe="" alexa="" 488-bsa="" fl,="" ag="" taispeáint="" aon="" difríochtaí="" suntasacha="" i="" gcóimheasa="" idir="" gach="" riocht.="" léiríonn="" gach="" pointe="" meán="" an="" chóimheas="" i="" réimse="" ina="" bhfuil="" tuairim="" is="" 15–20="" cill="" (n="13," 13,="" 10,="" agus="" 11="" réimse="" roghnaithe="" go="" randamach="" le="" haghaidh="" ocrly/þ="" dmso,="" ocrly/þ="" alpelisib,="">^Y/-DMSO, agus Ocrl^Y/-coinníollacha alpilisib, faoi seach, i ngach cás comhthiomsaithe ó 2 duáin luiche in aghaidh an choinníll). Rinne KW ANOVA tástáil ar shuntasacht le tástálacha comparáide iolracha Dunn: P=0.46 (ns), comparáidí iolracha: OcrlY/þ DMSO versus Ocrl^Y/-DMSO agus Ocrl^Y/-DMSO i gcoinne Ocrl^Y/-alpilisib P > 0.99 (ns); OcrlY/þ DMSO i gcoinne OcrlY/þ alpelisib P=0.84 (ns). Chun breathnú ar an íomhá seo a bharrfheabhsú, féach le do thoil ar an leagan ar líne den alt seo ag www.kidney-international.org.

Fíor 6|Feabhsaíonn Alpelisib feidhm tubule cóngarach (PT) na lucha OcrlY/L, ag athbhunú glacadh ligand agus slonn megalin. (a) Socrú turgnamhach. Cuireadh cóireáil ar lucha béil ar feadh 6 seachtaine le dáileog laethúil de cheachtar de carboxymethylcellulose 1 faoin gcéad (feithicil) nó alpelisib (50 mg/kg meáchan coirp). Ar lá deiridh na cóireála, cuireadh lucha instealladh le Cy5-lipéad b-lactoglobulin (N=6 Ocrl^Y/-, nó 8 Ocrl^Y/-lucha in aghaidh an ghrúpa). (b–d) Léiríonn na luachanna D a thaispeántar an meánathrú ó BL go D42 don riocht ±SEM. (b) Próitéin Chlarachill 16 (CC16), (c) aschur fuail albaimin (an dá cheann laistigh de 15 uair an chloig), agus (d) tomhaiseadh mais choirp in OcrlY/- lucha a cóireáladh le feithicil nó le halpelisib ag an bpointe ama sonraithe. Léiríonn gach ponc 1 luch. Rinneadh measúnú ar an tábhacht le 2-t-thástáil phéireáilte an Mhic Léinn; in (b) CC16 (ar lean)

Fíor 6|(ar lean) athrú aschuir i gcoibhneas leis an mbunlíne; þ feithicil, P=0.9802 (níl suntasach [ns]), þ alpelisib, *P=0.0334; in (c) athrú ar aschur albaimin i gcoibhneas leis an mbunlíne; þ feithicil, P=0.0502 (ns), þ alpilisib, ***P ¼ 0.0006; in (d) athrú ar mhais coirp i gcoibhneas leis an mbunlíne; þ feithicil, ***P < 0.0001,="" þ="" alpilisib,="" **p="0.0083." (e)="" micreagraif="" chomhfhócasacha="" ionadaíocha="" a="" thaispeánann="" cy5-lipéadaithe="" b-lactoglobulin="" (magenta)="" 15="" nóiméad="" tar="" éis="" instealladh="" féitheacha="" eireaball="" agus="" lipéadaithe="" le="" haghaidh="" 40,6-diamidino{-2-phenylindole(dapi)="" (cian),="" móide="" cainníochtú="" na="" gcomharthaí="" fluaraiseacha="" fl="" comhfhreagracha="" ó="" duáin="" luiche="" ocrl="" (n="412," 500,="" agus="" 588="" feadán,="" faoi="" seach,="" le="" haghaidh="" feithicle="" ocrly/þþ,="">^Y/-þ feithicil, agus Ocrl^Y/-þ alpelisib) le haghaidh 3 lucha in aghaidh an ghrúpa cóireála. b-Tá glacadh lactoglobulin tarrtháil trí chóireáil alpelisib. Barraí ¼ 20 mm. Sna cainníochtaí, is ionann gach ponc agus déine fluaraiseachta FL arna normalú de réir achair feadáin; léiríonn sonraí breactha an meán±SEM. Rinneadh measúnú ar an tábhacht ag tástáil Kruskal-Wallis (KW) agus triail chomparáid iolrach Dunn ina dhiaidh sin; ***P < 0.001,="" comparáidí="" iolracha;="" ocrly/þþ="" feithicil="" in="" aghaidh="">^Y/-þ feithicil agus Ocrl^Y/-þ feithicil i gcoinne Ocrl^Y/-þ alpilisib, an dá ***P < 0.001.="" (f)="" anailís="" slóite="" agus="" dlúisiméadrachta="" an="" iarthair="" ar="" leibhéil="" mheigilín="" i="" lísáití="" duánacha="" iomlána="" ó="" lucha="" béil.="" baineadh="" úsáid="" as="" a-tubulin="" mar="" rialú="" luchtaithe.="" an="" slonn="" laghdaithe="" megalin="" in="">^Y/-is tarrthála ag alpelisib. I gcainníochtú na hanailíse densitiméadrachta, seasann gach ponc do 1 luch (N=4 OcrlY/þþ feithicil agus Ocrl^Y/-þ feithicil agus N{0}} Ocrl^Y/-þ lucha alpilisib); léiríonn línte meán±SEM. Rinneadh measúnú ar an tábhacht ag 2-tástálacha an mhic léinn gan péireáilte: OcrlY/þþ feithicil versus Ocrl^Y/-þ feithicil; **P ¼ 0.0057, Ocrl^Y/-þ feithicil i gcoinne Ocrl^Y/- þ aipilis, *P=0.0246. (g) Lipéadaíodh micreagraif chomhfhócasacha ionadaíocha le hionchuir ardmhéadúcháin agus cainníochtú déine meigilín (buí) in AQP1þ PTs (magenta) ó na duáin ó bhéal le haghaidh DAPI (cian) a léirigh tarrtháil leibhéil meigilín tar éis cóireála alpilisib. Barraí=20 mm. Sna cainníochtaí, is ionann gach ponc agus déine fluaraiseachta FL arna normalú de réir achair feadáin; léiríonn sonraí breactha an meán±SEM; N=142, 191, agus 266 feadán, faoi seach, le haghaidh feithicle OcrlY/þþ, Ocrl^Y/-þ feithicil, agus Ocrl^Y/-þ alpelisib le haghaidh 3 lucha in aghaidh an ghrúpa cóireála. Rinneadh measúnú ar an tábhacht a bhain le hanailís KW ar athraithis agus ansin tástáil iolrachchomparáide Dunn; foriomlán ***P < 0.001,="" comparáidí="" iolracha;="" ocrly/þþ="" feithicil="" in="" aghaidh="">^Y/-þ feithicil agus Ocrl^Y/-þ feithicil i gcoinne Ocrl^Y/-þ alpilisib, an dá ***P < 0.001.="" chun="" breathnú="" ar="" an="" íomhá="" seo="" a="" bharrfheabhsú,="" féach="" le="" do="" thoil="" ar="" an="" leagan="" ar="" líne="" den="" alt="" seo="" ag="">

Conas a úsáidtear an 3-coisctheoir kinase kinase alpelisib le haghaidh siondróm Lowe/galar Dent?

2. PLÉ

Faoi láthair níl aon chóireáil ann chun an endocytosis lochtach is cúis le mífheidhmiú PT a mhaolúSiondróm Lowe agus galar Dent2. Léiríonn ár dtorthaí go maolaíonn alpelisib feinitíopa aberrant actin trí leibhéil PI(4,5)P2 agus PI(3)P a laghdú, rud a chuireann feabhas suntasach ar an innealra endocytic agus ar chumas ionsúcháin i gcórais cheallacha agus samhail luch daonnaithe do Siondróm Lowe/galar Fiaclóireachta 2. Tacaíonn na torthaí seo leis an nasc idir lipidí fosphoinositide, polaiméiriú actin, agus gáinneáil ionocytic, le hábhar láithreach do chealla epithelial an-ghníomhach a bhfuil baint acu le próisis hoiméastatacha ríthábhachtacha (Fíor 7). Mar gheall ar an easpa teiripí éifeachtacha agus sábháilteacht dealraitheach na haicme seo de PI3K(fosphoinositide 3-kinase)coscairí, is iarrthóir tuar dóchais inti é alpilisib le haghaidh athúsáid drugaí iSiondróm Lowe agus galar Dent.

Is é LMW proteinuria an ghné is comhsheasmhach a bhíonn in othair leSiondróm Lowe agus galar Dent2 de bharr sócháin a dhíghníomhachtú in OCRL.⁴Is féidir na próitéiní LMW seo a bhrath agus a chainníochtú go héasca, ag tairiscint bithmharcóir dílis de endocytosis receptor-idirghabhála lochtach i gcealla PT.1 Tá proteinuria LMW thar a bheith ábhartha, toisc go n-aimsítear é níos comhsheasmhaí agus go minic níos luaithe ná tuaslagáit eile (m.sh., glúcós, fosfáit, aimínaigéid) mar chuid den "siondróm Fanconi duánach" clasaiceach - ar a laghad i neamhoird ó bhroinn ar an gcosán endolysosomal.¹Anseo, léirímid go sábhálann alpelisib cumas glactha endocytic apical cealla PT in vitro agus in vivo, mar gheall ar leibhéil athchóirithe an ghabhdóra megalin ag an membrane plasma. Léirítear an éifeacht seo ag laghduithe suntasacha ar chaillteanas fuail próitéiní LMW (CC16 agus albaimin) in Ocrl^Y/-lucha cóireáilte le alpelisib ar feadh 6 seachtaine. Breathnaíodh na héifeachtaí seo de alpelisib i m PTCanna, a choinníonn a n-idirdhealú apical agus a oireann go háirithe chun endocytosis receptor-mediated i fiseolaíocht agus galair a imscrúdú.⁹ Go háirithe, fuaireamar m PTCanna ó mhúnla luch daonnaithe a léirigh INPP5B daonna in Ocrl^Y/-; Ipp5b^-/-cúlra, a ligeann dúinn imscrúdú a dhéanamh ar na hiarmhairtí sonracha a bhaineann le caillteanas gníomhaíochta OCRL.^11,23

Mínítear tarrthála endocytosis ag alpelisib trína éifeacht ar innealra actin, atá le feiceáil go soiléir i gcealla OCRL KO HK2 agus m PTCs. Mar sin deimhníonn agus leathnaíonn ár dtuairimí staidéir roimhe seo a thaispeánann an nasc idir rialú ar an gcothromaíocht fosphoinositide agus F-actin sa chonair endosomal luath in othair OCRL agus cealla KO.^7,10Cuireann caillteanas feidhme ghníomhaíocht OCRL isteach ar dhíghrádú PI(4,5)P2, rud a fhágann, dá bharr sin, teip ar fheithiclí atá brataithe le clathrin a dhíchóimeáil, rud a fhágann go mbíonn orgánailéil endosomacha aberrant i gcineálacha cille éagsúla lena n-áirítear na cealla PT.^7-10Léirigh muid le déanaí go laghdaíonn an farasbarr F-actin athchúrsáil an receptor multiligand megalin chuig an membrane apical de chealla PT, is cúis le endocytosis lochtach agus LMW proteinuria.¹¹

Tugann ár sonraí le fios go n-eascraíonn meicníocht gníomhaíochta alpelisib ar actin endosomal as éifeacht déshonrach de chosc ar alpelisib: ar dtús ar tháirgeadh PI(3,4,5)P3 agus a chomhshó go PI(3)P, agus sa dara háit ar an táirgeadh PI(4,5)P2. Téann an laghdú ar leibhéil PI(4,5)P2 go díreach i gcoinne an easnamh OCRL agus comhaontaíonn sé le hobair roimhe seo chun an iomarca actin a mhaolú agus a mhéadaíonn eisreabhadh ionocytic trí laghdú ar leibhéil fosfatidylinositol 4-fosfáit 5-kinase , einsím a ghineann PI(4,5)P2.¹⁰Tá tiúchan coisctheach 50 faoin gcéad de 0.5 mM ag Alpelisib ar an PI(4,5)P2 a ghineann kinase PI4Kb, a d'fhéadfadh a bheith freagrach, nó d'fhéadfadh sé a bheith mar thoradh ar éifeachtaí níos ginearálta ar chothromaíocht fosfainítíde de bharr an teaglaim de OCRL Cóireáil KO agus alpilisib. Tá an aicme sin IA PI3K(fosphoinositide 3-kinase)tá cosc ​​​​alpelisib ábhartha maidir le cosc ​​actin toisc go gcuireann ídiú p110a trí mheán siRNA bac ar charnadh actin ar an gcaoi chéanna le cóireáil alpelisib agus copanlisib (nach dtuairiscítear go gcuireann sé bac ar PI4Ks). I gcealla RPE thugamar faoi deara roimhe seo go gcuireann siRNA de INPP4A, a athraíonn PI(3,4)P2 go PI(3)P, cosc ​​ar chomhthionól actin i gcealla OCRL KO, ag soláthar conair ó chosc ar PI(3,4,5). Táirgeacht P3 go dtí laghdú ar PI(3)P endosomal. Thaispeáin muid go bhfuil roinnt PI(3)P fós ann, is dócha gurb é an linn a tháirgtear go luath san endosóim de réir aicme III PI3K, Vps34 toisc go bhfuaireamar amach go gcuirtear feabhas ar gháinneáil endosomal seachas faoi chois ag cóireáil alpilisib. Leagadh béim freisin ar chroírialáil chasta mheitibileacht PI agus a ábharthacht do dhíghníomhú OCRL i staidéar le déanaí ina ngníomhaíonn feidhmeanna neamhcatalytic de phosphoinositide 3- phosphatase PTEN díghrádú PI(4,5)P2 trí PLCXD, ag maolú feinitíopaí ceallacha agus ionsú. ligands i múnla zebrafish.³¹

Aontaíonn maolú feinitíopa actin trí leibhéil laghdaithe PI(4,5)P2 agus PI(3)P trí chóireáil alpelisib le gníomh sineirgisteacha PI(4,5)P2 agus PI(3)P chun SNX9 a earcú chun a ghníomhachtú. an t-innealra actin ag endosomes Ocrl,¹⁴ag moladh meaitseáil an-éifeachtach de shainiúlacht alpilisib chun rialáil mhóilíneach gníomhachtaithe actin ag endosomes a ionramháil. Ina dhiaidh sin, mar a léiríodh roimhe seo, mar thoradh ar thionól laghdaithe actin endosomal, ar a seal, tá feabhas ar endocytosis PT i gcealla easnamhach OCRL.¹⁰Beidh gá le tuilleadh tréithrithe chun tuiscint níos fearr a fháil ar cé acu an é rialáil actin trí mheitibileacht fosphoinositide fíorfhoinse na héifeachta teiripeacha a bhreathnaímid le halpelisib san Ocrl.^Y/-samhail luch. Toisc aicme I PI3K(fosphoinositide 3-kinase)cosáin a rialaíonn fás cille, iomadú, maireachtáil, meitibileacht, agus uathphagaíocht,³²ní féidir linn a eisiamh go bhfuil an tarrthála endocytic mar gheall ar éifeachtaí ar PI(3,4,5) P3 go díreach agus an éifeacht chomhcheangailte ar bhealaí eile modhnaithe ag aicme I PI3K. Tá gá le tuilleadh oibre freisin chun a thástáil an bhfuil PI3K(fosphoinositide 3-kinase)d'fhéadfadh coscairí freisin léiriú néareolaíoch agus léirithe cliniciúla eile othar a bhfuil sócháin OCRL á gcothú acu a mhaolú.⁴

Tugann an taithí a fuarthas le déanaí ar alpilisib in othair phéidiatraiceacha a bhfuil siondróm PROS/CLOVES orthu le fios go bhfuil an poitéinseal ann glacadh leis an druga go maith. Tógtar Alpelisib ó bhéal, dírítear go roghnach ar isoform PI3K(fosphoinositide 3-kinase)aicme I, agus taispeánann sé próifíl mhion-thocsaineachta i gcomparáid le coscairí pan-PI3K. Toisc nach gcuireann alpilisib bac iomlán ar PI3K(fosphoinositide 3-kinase)gníomhaíocht, agus mar sin feidhmeanna an chosáin chomharthaíochta a chothabháil, d'fhéadfadh sé a bheith oiriúnach go háirithe le húsáid fhadtéarmach. Is díol spéise é, d’fhéadfadh go bhféadfaí an hyperglycemia a eascraíonn as úsáid alpelisib a bhainistiú trí athruithe aiste bia.²²Toisc gurb é mífheidhm PT an chéad léiriú ar ghalar duáin a breathnaíodh i naíonáin óga ar a bhfuil galar Dent 2 agus siondróm Lowe, d’fhéadfadh cóireáil luath a dhéanamh ar mhífheidhm PT den sórt sin, as a dtiocfaidh feabhsuithe ar an bpróifíl meitibileach agus ar an bhfás, moill ar dhul chun cinn go dtí galar duáin ainsealach agus mar sin de. tionchar suntasach ar shaolré agus ar cháilíocht na beatha.³³Cé go bhfuil na cineálacha galair a bhaineann le sóchán OCRL thar a bheith leathan, níor léir ó staidéir a rinneadh le déanaí ar chohóirt mhóra othar géinitíopaithe le siondróm Lowe de ghalar Dent 2 go raibh tionchar suntasach ag an gcineál sóchán nó suíomh an tsócháin ar mharthanas duánach.³⁴I dteannta a chéile, leagann ár sonraí béim ar an bpoitéinseal atá ann chun alpelisib a athúsáid chun mífheidhm PT a chóireáil i siondróm Lowe/galar Dent 2, rud a chuireann bonn ar fáil d’imscaradh tapa agus cost-éifeachtach i dtrialacha cliniciúla daonna.

3. MODHANNA

3.1 Tá sonraí iomlána le fáil sna Modhanna Forlíontacha.

Cóireáladh cealla HK2 le copanlisib, alpelisib, GSK2636771, nó idelalisib ag tiúchan sonraithe ar feadh 16 huaire mura luaitear a mhalairt. Baineadh próitéiní as úsáid modhanna caighdeánacha ó chealla nó fíocháin duáin agus rinneadh blotáil an iarthair ag baint úsáide as antasubstaintí foilsithe nó atá ar fáil ar bhonn tráchtála. Rinneadh leagadh siRNA ag baint úsáide as 2 aistriú 72 agus 24 uair an chloig roimh anailís. D'úsáideamar OcrlY/þ a bhí comhoiriúnaithe le haois agus inscne; Ipp5b^{- /-}; agus Ocrl^Y/-; Ipp5b^-/- lucht bruscair luiche ag cothú slonn BAC-INPP5B. Gineadh cultúir phríomha m PTCanna ó na duáin a bhaintear as lucha Ocrl 8 seachtaine d’aois agus rinneadh measúnú ar thoilleadh endocytic m PTCanna Béil trí ghlacadh le halbaimin a thomhas. Bhí cóireálacha Alpelisib 10 mM ar feadh 16 uair an chloig mura luaitear a mhalairt. Rinneadh measúnú ar ghlacadh albaimin i m PTCanna trí úsáid a bhaint as prótacal “pulse-chase” chun ceangal apical agus glacadh dá bharr a mheas. m PTCs dathaíodh thar oíche leis an antashubstaint phríomhúil chuí agus ar feadh 45 nóiméad le antasubstaintí tánaisteacha fluarafór-chomhchuingeach FL oiriúnach agus/nó Alexa-488 Phalloidin. Rinneadh staining PI(3)P ar m PTCanna ag baint úsáide as an taiscéalaí fearainn FYVE. Rinneadh anailís íomhá le CellProfifiler, ag úsáid píblínte saincheaptha chun forluí actin/ EEA1 agus líon na bpuncta a thomhas, agus le ImageJ chun déine imfhluaraiseacht a thomhas agus imill braite chun scór snáithíní struis a ríomh. Cuireadh sonraí cainníochtúla in iúl mar acmhainn±earráid chaighdeánach an mheáin. Le haghaidh na dturgnaimh in vivo, déileáladh le lucha 6 seachtaine d'aois le meáchan coirp feithicle nó alpelisib 50 mg/kg. Bailíodh fual gach 14 lá agus íobairt ainmhithe tar éis 42 lá de chóireáil, le fuil agus duáin bainte. Scrúdaíodh cumas endocytic PT lucha Béil trí iontógáil b-lactoglobulin a thomhas.

4. NOCHTADH

Tá maoiniú ag JLG ó AstraZeneca le haghaidh scoláireacht ina saotharlann. Tá SPJ ar na boird chomhairleacha agus tá úinéireacht chothromais aige ar Mission Therapeutics, Carrick Therapeutics, agus Adrestia Therapeutics, agus is Comhpháirtí Eolaíochta é do Ahren Innovation Capital. Níor dhearbhaigh na húdair eile go léir aon leasanna iomaíocha.

5. BUÍOCHAS

Fuair ​​an obair seo tacaíocht ó Dheontas 281971 ón gComhairle Eorpach um Thaighde, Comhaltacht um Fhorbairt Ghairme Taighde WT095829AIA, Comhaltacht Taighde Shinsearach Wellcome 219482/Z/19/Z, Ciste Forbraíochta Coincheapa Iontaobhais Wellcome 209749/Z/17/Z, Deontas Taighde Iontaobhas Isaac Newton 18.23 (j) chuig JLG, agus Dámhachtain Imscrúdaitheora Wellcome 206388/Z/17/Z do SPJ, agus admhaímid maoiniú Institiúid Gurdon ón Wellcome Trust (092096) agus CRUK (C6946/A14492). Táimid buíoch den Fhondúireacht Taighde Cystinosis (Irvine, CA), Fondúireacht Eolaíochta Náisiúnta na hEilvéise (deontas tionscadail 310030_189044), an clár tosaíochta taighde cliniciúil (KFSP) RADIZ (Tionscnamh Galar Uathúla Zurich) de chuid UZH, na hEilvéise.

Lárionad Náisiúnta Inniúlachta i dTaighde (NCCR) Rialú Duán ar Hoiméastáis (Kidney.CH) le haghaidh tacaíochta, agus an NIDDK/NIH agus an Lowe Syndrome Trust/UK chun tacú le forbairt na lucha Béil. Admhaímid Robert L. Nussbaum (Invitae Corporation agus UCSF, San Francisco, CA) agus Maria Antonietta De Matteis (Institiúid Géineolaíocht agus Leigheas Telethon, Ollscoil Federico II Napoli, Napoli, an Iodáil) as na bunaitheoirí a sholáthar don choilíneacht Luch Béil;

agus Eric Olinger (UZH, Zurich) le haghaidh plé torthúil. Gabhaimid buíochas le Nadine Näegele agus Daniela Nieri as cúnamh teicniúil a sholáthar le linn bailiú agus anailísiú fual; Guillaume Canaud (Hôpital Necker-Enfants Malades, Páras) as an bprótacal mionsonraithe maidir le Alpelisib a ullmhú don chóireáil in vivo a roinnt linn; agus Renata Kozyraki agus Pierre Verroust as imoibrithe a sholáthar. Gabhaimid buíochas freisin leis an Ionad um Mhicreascóip agus Anailís Íomhánna de chuid Ollscoil Zurich (Zurich, an Eilvéis) agus saoráid fiseolaíocht chomhtháite creimirí Zurich (ZIRP) as an trealamh a sholáthar le haghaidh sealbhú íomháithe agus tacaíocht theicniúil le linn na dturgnaimh in vivo.

Conas a úsáidtear an 3-coisctheoir kinase kinase alpelisib le haghaidh siondróm Lowe/galar Dent?

6. ÁBHAR FORLÍONTACH

Comhad Forlíontach (PDF)

Modhanna agus Tagairtí Forlíontacha.

Tábla S1. Meáchan coirp, fual, agus paraiméadair fola le himeacht ama i lucha Béil cóireáilte le halpelisib nó feithicle.

Fíor S1. Léiriú isoform p110 agus measúnachtaí cíteatocsaineachta dáileog-fhreagra drugaí i gcealla HK2.

Fíor 2. PI3Kinhibitor alpelisibathchóiríonn sé forluí actin-endosomal agus laghdaítear leibhéil PI(3)P ar bhealach a fhreagraíonn do dháileog 4 huaire tar éis cóireála drugaí i gcealla HK2.

Fíor S3. slonn isoform p110 agus tocsaineacht alpilisib i mPTCanna Ocrl.

Fíor S4. Sreabhadh oibre anailís forluí EEA1/actin i mPTCanna Ocrl.

Fíor S5. Athchóiríonn Alpelisib glacadh albaimin in Ocrl^Y/-mPTCanna. Níl aon tionchar ag slonn Aqp1. Comhad Forlíontach (Scannáin)

Scannán S1. Rindreáil Imaris 3D forluí EEA1/actin in OcrlY/þ mPTCanna cóireáilte le DMSO. Rindreáil dromchla 3D ionadaíoch ar chruach comhfhócasach de OcrlY/þ mPTCs cóireáilte le DMSO ar feadh 16 uair an chloig agus ansin socraithe leis an bhfeisteas formaildéad 4 faoin gcéad agus lipéadaithe imdhíon-lipéadaithe do EEA1 (corcra), actin (phalloidin; buí), agus DAPI (gorm), rud a léiríonn beagán comhlachas actin/endosomal. Barra=5 mm.

Scannán S2. Rindreáil 3D Imaris forluí EEA1/actin in Ocrl^Y/-mPTCanna cóireáilte le DMSO. Rindreáil dromchla 3D ionadaíoch ar chruach comhfhócasach de OcrlY/– mPTCanna a cóireáladh le DMSO ar feadh 16 huaire agus ansin socraithe leis an bhfeisteas formaildéad 4 faoin gcéad agus lipéadaithe imdhíonta do EEA1 (corcra), actin (phalloidin; buí), agus DAPI (gorm), ag léiriú poncaíochta actin associating in aice le struchtúir endosomal. Barra=5mm.

Scannán S3. Rindreáil 3D Imaris forluí EEA1/actin in Ocrl^Y/- mPTCanna cóireáilte le halpelisib. Rindreáil dromchla 3D ionadaíoch ar chruach comhfhócasach de OcrlY/- mPTCanna cóireáilte le 10 mM d'alpelisib ar feadh 16 huaire agus ansin socraithe leis an bhfeisteas formaildéad 4 faoin gcéad agus lipéadaithe imdhíon-lipéadaithe do EEA1 (corcra), actin (phalloidin; buí), agus DAPI (gorm). , ag léiriú tarrtháil struchtúir actin punctate timpeall na n-inchinn. Barra=5 mm.

TAGAIRTÍ

1. van der Wijst J, Belge H, Bindels RJM, Devuyst O. Ag foghlaim fiseolaíocht ó neamhoird duáin oidhreachta. Fisiol Ath. 2019; 99:1575–1653.

2. siondróm Loi M. Lowe. Dílleachtlann J Rare Dis. 2006; 1:16.

3. Lewis RA, Nussbaum RL, Brewer ED. Siondróm Lowe. In: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al., eag. GeneReviews® [idirlíon]. Seattle (WA): Ollscoil Washington, Seattle; 1993-2020. Ar fáil ag: HTTPS:// www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1480/ . Arna fhoilsiú 24 Iúil, 2001; Nuashonraithe 18 Aibreán, 2019. Ar rochtain 8 Lúnasa, 2019.

4. De Matteis MA, Staiano L, Emma F, Devuyst O. An 5-fosphatase OCRL iSiondróm Lowe agus galar Dent2. Nat Rev Nephrol. 2017;13:455–470.

5. Devuyst O, Luciani A. Iompróirí clóiríd agus endocytosis receptor-mediated sa tubule proximal duánach. J Fisiol. 2015; 593: 4151-4164.

6. Zhang X, Jefferson AB, Auethavekiat V, Majerus PW. Is é an próitéin atá easnamhach i siondróm Lowe ná fosfatidylinositol-4,5-fosfáit 5- fosfáit. Proc Natl Acad Sci US A. 1995; 92:4853–4856.

7. Nández R, Balkin DM, Messa M, et al. Ról OCRL i ndinimic chlathrin-brataithe pit agus neamhbhrataithe arna nochtadh ag staidéir ar chealla siondróm Lowe. eSaoil. 2014; 3:e02975.

8. Mehta ZB, Pietka G, Lowe M. Feidhmeanna ceallacha agus fiseolaíocha próitéin siondróm Lowe OCRL1. Trácht. 2014; 15:471–487.

9. De Leo MG, Staiano L, Vicinanza M, et al. Spreagann comhleá autophagosome-lysosome freagra líseasómach idirghabhála ag TLR9 agus á rialú ag OCRL. Nat Cell Biol. 2016; 18:839–850.

10. Vicinanza M, Di Campli A, Polishchuk E, et al. Déanann OCRL rialú ar gháinneáil trí mheán-endosóim luatha trí PtdIns4,5P(2) a rialáil atá ag brath ar ghníomhartha endosomal. EMBO J. 2011; 30:4970–4985.

11. Festa BP, Borquez M, Gassama A, et al. lagaíonn easnamh OCRL feidhm endolysosomal i múnla luch daonnaithe doSiondróm Lowe agus galar Dent. Hum Mol Genet. 2019; 28: 1931-1946.

12. Welch HC, Coldwell WJ, CD Ellson, et al. P-Rex1, fachtóir malartaithe guainín-núicléitíd rialaithe PtdIns(3,4,5)P3- agus Gbetagamma-rialaithe le haghaidh Rac. cill. 2002; 108:809–821.

13. Gallop JL, Walrant A, Cantley LC, Kirschner MW. Aistríonn fosphoinositides agus cuar membrane an modh polaiméirithe actin trí earcaíocht roghnaíoch Toca-1 agus Snx9. Proc Natl Acad Sci US A. 2013; 110:7193–7198.

14. Daste F, Barántas A, Holst MR, et al. Rialú ar pholaiméiriú actin trí chomhtharlú na bhfosphoinositides agus cuaire ardscéime. J Cill Biol. 2017; 216: 3745-3765.

15. Malek M, Kielkowska A, Chessa T, et al. Rialaíonn PTEN comharthaíocht PI(3,4)P2 le sruth ó aicme I PI3K(fosphoinositide 3-kinase). Cill Mol. 2017; 68:566–580.e510.

16. Gillooly DJ, Morrow IC, Lindsay M, et al. Logánú fosfatidylinositol 3-fosfáit i gcealla giosta agus mamaigh. EMBO J. 2000; 19:4577–4588.

17. Fruman DA, Chiu H, Hopkins BD, et al. an PI3K(fosphoinositide 3-kinase)cosán i ngalar daonna. cill. 2017; 170:605–635.

18. Liu N, Rowley BR, Bull CO, et al. Is PI3K infhéitheach an-roghnach é BAY 80-6946(fosphoinositide 3-kinase)inhibitor le gníomhaíochtaí potent p110alpha agus p110delta i línte cille meall agus samhlacha xenograft. Mol Ailse Ther. 2013; 12: 2319-2330.

19. Fritsch C, Huang A, Chatenay-Rivauday C, et al. Tréithriú an úrscéil agus PI3K sonrach(fosphoinositide 3-kinase)alpha inhibitor NVP-BYL719 agus forbairt ar straitéis srathaithe othar le haghaidh trialacha cliniciúla. Mol Ailse Ther. 2014; 13:1117–1129.

20. Furet P, Guagnano V, Fairhurst RA, et al. NVP-BYL719 a fhionnadh coscaire kinase alfa phosphatidylinositol atá cumasach agus roghnaitheach le haghaidh meastóireacht chliniciúil. Bioorg Med Chem Lett. 2013; 23:3741–3748.

21. Andre F, Ciruelos E, Rubovszky G, et al. Alpelisib le haghaidh ailse chíche chun cinn PIK3CA-mutated, receptor hormone-dearfach. N Béarla J Med. 2019; 380: 1929-1940.

22. Venot Q, Blanc T, Rabia SH, et al. Teiripe spriocdhírithe in othair le siondróm rófhás a bhaineann le PIK3CA. Dúlra. 2018; 558: 540-546.

23. Bothwell SP, Chan E, Bernardini IM, et al. Múnla luiche le haghaidh siondróm Lowe/Galar Fiaclóireachta 2 tubulopathy duánach. J Am Soc Nephrol. 2011;22:443–448.

24. Chen R, Kang VH, Chen J, et al. Antashubstaint mhonaclónach chun PtdIns(3,4,5)P(3) a shamhlú i gcealla. J Histochem Cytochem. 2002; 50:697–708.

25. Hammond GR, Schiavo G, Irvine RF. Nochtann teicníochtaí imdhíon-cheimiceacha linnte cealla iolracha ar leith de PtdIns4P agus PtdIns(4,5)P(2). Bithcheimic J. 2009; 422:23-35.

26. He K, Marsland R III, Upadhyayula S, et al. Dinimic comhshó fosphoinositide i dtrácht endocytic clathrin-idirghabhála. Dúlra. 2017; 552: 410-414.

27. Bilanges B, Poor Y, Vanhaesebroeck B. PI3K(fosphoinositide 3-kinase)isfhoirmeacha i gcomharthaíocht cille agus gáinneáil ar bheicíní. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019; 20:515–534.

28. Montjean R, Aoidi R, Desbois P, et al. Léiríonn fibreblastaí OCRL-shóite ó othair le galar Dent-2 inathraitheacht feinitíopach INPP5B-neamhspleách i gcomparáid le cealla siondróm Lowe. Hum Mol Genet. 2015; 24: 994–1006.

29. Suchy SF, Nussbaum RL. Cuireann easnamh fosfatase PIP i siondróm Lowe isteach ar pholaiméiriú actin. Am J Hum Genet. 2002; 71: 1420- 1427.

30. Mizrachi A, Shamay Y, Shah J, et al. PI3K meall-shonrach(fosphoinositide 3-kinase)cosc trí sheachadadh spriocdhírithe nanacháithníní i carcanóma cille squamous ceann agus muineál. Cumann Nat. 2017; 8:14292.

31. Mondin VE, Ben El Kadhi K, Cauvin C, et al. Laghdaíonn PTEN PtdIns(4,5)P2 endosomal ar bhealach neamhspleách ar fhosfatás trí chonair PLC. J Cill Biol. 2019; 218: 2198-2214.

32. Jean S, Kiger AA. Comhordú idir RAB GTPase agus rialúchán agus feidhmeanna fosfainicítíde. Nat Rev Mol Cell Biol. 2012;13:463–470. 33. Devuyst O, Knoers NV, Remuzzi G, et al. Galair duáin neamhchoitianta le hoidhreacht: dúshláin, deiseanna agus peirspictíochtaí. Lancet. 2014; 383: 1844–1859. 34. Zanies M, Bokenkamp A, Kolb M, et al. Toradh duánach fadtéarmach i leanaí a bhfuil sócháin OCRL orthu: anailís siarghabhálach ar chohórt mór idirnáisiúnta. Trasphlandú Dial Nephrol. 2018; 33:85–94.

Ó: Kidney International (2020) 98, 883–896; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2020.05.040

Cóipcheart ª 2020, Cumann Idirnáisiúnta na Neifreolaíochta. Arna fhoilsiú ag Elsevier Inc. Is alt rochtana oscailte é seo faoin gceadúnas CC BY (HTTP:// creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

Institiúid, Ollscoil Cambridge, Tennis Court Road, Cambridge CB2 1QN, RA. R-phost: j.gallop@gurdon.cam.ac.uk; nó Olivier Devuyst, Institiúid na Fiseolaíochta, Ollscoil Zurich, Zurich, an Eilvéis. R-phost: olivier.devuyst@uzh.ch⁵ Chuir na húdair seo go cothrom leis an saothar seo.⁶Rinne na húdair seo an staidéar a chomhstiúradh. Arna fháil 8 Lúnasa 2019; athbhreithnithe 1 Bealtaine 2020; glacadh leis an 15 Bealtaine 2020; foilsithe ar líne 9 Meán Fómhair 2020