Cuid2: Is Gabhdóir Féideartha é Móilín Díobhála Duán-1 Do SARS-CoV-2

Le haghaidh tuilleadh eolais. teagmháiltina.xiang@wecistanche.com

Léirithe cliniciúla den choróinvíreas

1. Tá an tréimhse goir fada, agus is iad na príomh-airíonna fiabhras, tuirse, scornach tinn, agus casacht. Is féidir fiabhras ard, fiabhras measartha, nó fiabhras íseal a bheith sa fiabhras;

2. Ní bhíonn naíonáin agus daoine scothaosta tipiciúil agus is minic a bhíonn wheezing agus dyspnea ag gabháil leo. I gcásanna tromchúiseacha, d’fhéadfadh damáiste ilchóras tarlú;

3. Tá an casacht tirim sa chéim luath den chuid is mó paroxysmal agus dian, cosúil leis an triuch, a chuireann isteach ar codlata agus gníomhaíochtaí; sa chéim níos déanaí, tá an casacht sputum, tá an sputum fí, uaireanta tá méid beag de fola, agus tá roinnt wheezing ag gabháil leis;

4. Bíonn airíonna éadroma ag roinnt othar agus b'fhéidir nach mbeidh fiabhras orthu. Tá prognóis maith ag formhór na n-othar, agus tá líon beag othar go dona tinn nó fiú bás;

5. Siondróm anacair riospráide géarmhíochaine, turraing seipteach, acidosis meitibileach teasfhulangacha, agus mífheidhm téachtaithe.

Conas an coróinvíreas nua a chosc, is é feabhas a chur ar dhíolúine an duine féin an bealach is éifeachtaí chun an víreas a chomhrac. Tugtar "Cistanche", a úsáideadh mar thaisce cothaitheach ó aimsir ársa.fásachginseng" agus is é rí na díolúine a threisiú. Cistanche - Rí na Díolúine Treisiú

Tá sé cruthaithe ag taighde leighis nua-aimseartha, chomh maith leis na feidhmeanna a bhaineann le cothú agus neartú an chomhlachta, go bhfuil éifeachtaí leigheasacha suntasacha ag Cistanche chun siadaí a chosc, frith-aging, frith-arrhythmia, cosc ​​​​apoptosis, agus díolúine a fheabhsú. fabhar.

Tá anglúcóisídí iomlána na CistancheIs iad na comhpháirteanna gníomhacha de ginseng feidhm imdhíonachta a rialáil, ar féidir leo feidhm imdhíonachta a fheabhsú ní hamháin do dhaoine gnáth ach freisin do dhaoine a bhfuil feidhm imdhíonachta íseal acu.

Dhearbhaigh breathnóireacht chliniciúil go bhfuil éifeacht leigheasach áirithe ag Cistanche ar siadaí urchóideacha, agus tá an éifeacht soiléir aige maidir le leukocytes a mhéadú. Is féidir le ginseng a ghlacadh le linn radaiteiripe agus ceimiteiripe éifeachtaí tocsaineacha agus fo-iarsmaí radaiteiripe agus ceimiteiripe a laghdú, deisiú fíocháin damáiste a luathú, agus leukopenia a chosc;

Plé

Chun troid i gcoinne anPaindéim COVID{0}}, tuiscint dhomhain ar conasSARS-CoV-2invades cealla daonna is gá. Léirigh staidéir ionfhabhtú díreach SARS-CoV-2 snaduánsa bhreis ar an scamhóg (Braun et al., 2020; Farkash et al., 2020). Mar sin féin, is é ACE2 an t-aon ghabhdóir aitheanta go fóill a d’fhéadfadh idirghabháil a dhéanamh ar an ionradh seo. Ina theannta sin, trópaiceacht duánach SARS-CoV-2 agus gaolmhargortú duáinis cosúil nach féidir a mhíniú mar gheall ar an leibhéal laghdaithe réasúnta ACE2 ar ionradh víreasach (Kuba et al., 2005). Anseo, tugann ár staidéar le fios go ndéanann KIM1, bithmharcóir atá uasrialaithe go mór do ghortú duáin (Yang et al., 2015), idirghabháil ar SARS-CoV-2 ionradh duáin mar ghabhdóir.

Fuaireamar amach freisin go gceanglaíonn SARS-CoV-2-RBD le KIM1 le cleamhnas níos airde ná an cleamhnas atá ag SARS-CoV-RBD agus MERS-COV-RBD, rud is dócha mar bhonn leis an ionfhabhtú SARS-CoV níos láidre-2 (Rabaan et al, 2020); mar sin, is fiú féachaint arís ar ionfhabhtú duánach agus ar róil KIM1 sna galair riospráide tromchúiseacha sin. Go háirithe, tugann ár dtorthaí le fios go bhfuil suíomhanna ceangailteacha ar leith de KIM1 agus ACE2 ar RBD víreasach, mar sin is fiú a fhiosrú an ndéanann agus conas a dhéanann KIM1 agus ACE2 idirghabháil SARS-CoV-2 ionradh sna horgáin seo. Ina theannta sin, ós rud é go bhfuil KIM1 endocytosed trí chonairí clathrin-spleách (Zhao et al., 2016), bheadh ​​sé suimiúil freisin iniúchadh breise a dhéanamh ar an bpróiseas cleithiúnaí KIM tar éis ceangal víreasach leis an gcillscannán.

Is é ACE2 an gabhdóir is dea-staidéar le haghaidh SARS-CoV-2, ach ní sprioc teiripeach idéalach é do COVID-19, toisc go gcuirtear in iúl go forleathan é in orgánaigh iolracha agus go bhfuil róil ríthábhachtacha aige maidir le brú fola a rialú agus gortú croí/duáin a chosc (Imai et al., 2005; Li et al.,2020d). I gcodarsnacht leis sin, tá baint níos láidre ag KIM1 le feidhm na nduán agus cuirtear in iúl go hard é tar éisdíobháil duánach(Kondratowicz et al, 2011; Yuan et al, 2015; Costafreda agus Kaplan, 2018), rud a fhágann gur sprioc theiripeach níos sainiúla agus b’fhéidir níos sábháilte freisin é d’othair COVID-19 a bhfuil galair duáin orthu.

Go hachomair, tugann ár gcuid sonraí le fios go bhfuil ról ríthábhachtach ag KIM1 i dtrópaiceacht duánach SARS-CoV-2 mar ghabhdóir féideartha do SARS-CoV-2. Anseo, molaimid múnla de 'thimthriall fí' arna idirghabháil ag KIM1 agus ACE2 (Fíor 5G), a d'fhéadfadh trópaiceacht duánach SARS-CoV-2 in othair COVID-19 a mhíniú. Le linn na céime tosaigh d’ionradh SARS-CoV-2, fágann an leibhéal fiseolaíoch níos airde (Fíor Forlíontach S1) agus cleamhnas ceangailteach (Tábla Forlíontach S1) ACE2 mar phríomhsprioc, nach bhfuil sainiúil do na duáin. Mar sin féin, tar éis tosú an AKl víreas-spreagtha, cuireann an KIM1 atá uasrialaithe go mór chun cinn go tapa ionfhabhtú víreasach tánaisteach arna idirghabháil ag KIM1 agus ACE2, atá níos sainiúla do na duáin, agus mar thoradh air sin déantar damáiste duáin níos measa i dtimthriall fí (Fíor 5G). D’fhéadfadh cur chuige ar féidir leo an t-idirghníomhú idir SARS-CoV-2 agus KIM1 a bhriseadh, lena n-áirítear antasubstaintí frith-KIM1, coscairí mion-mhóilín, agus peiptídí freasúla díorthaithe KIM, solas a chaitheamh ar COVID-19 cóireáil.

abhair agus modhanna

Ábhair

Recombinant SARS-CoV-2-RBD (T80302) was obtained from Genscript. Antagonist peptide 1 (AP1, SCSLFTCQNGIV, purity >95%) and antagonist peptide 2 (AP2, SCSLFTCQNGGGWF, purity >95 faoin gcéad ( ) a shintéisíodh go ceimiceach le Genscript. Fuarthas antasubstaint frith-luch-lgG (p/n 18-8816-33) agus frithchorp frith-choine-LGG (p/n 18-8817-33) ó Rockland. IgG le SureBeads" Próitéin G coirníní maighnéadacha (J2112LB-02) a ceannaíodh ó Bio-Rad. DAPI (D9542) ó Sigma. Alex Flour 594 lipéadaithe phalloidin (C2205S) ó Beyotimes. Antasubstaintí i gcoinne KIM1 (NBP{{). 15}}, baineadh úsáid as Novus Biologicals), Flag (F1804, Sigma), HA (H6908, Sigma), agus ACE2 (2115-1-AP, Proteintech).

Próifílí slonn KIM1 agus ACE2 a fháil agus a anailísiú

Chun próifílí trasphróitéine agus próitéine KIM1 agus ACE2 d’fhíocháin dhaonna a fháil, bhailigh agus rinneamar anailís ar na sonraí transcriptome agus na próifílí próitéine bunaithe ar imdhíonhistochemistry ó Human Protein Atlas (HPA, https://www.proteinatlas.org), a léirigh an léiriú agus logánú próitéiní daonna ar fud fíocháin agus orgáin, bunaithe ar sheicheamhú domhain RNA (RNA-seq) ó 37 gnáth-fhíochán agus imdhíon-histochemistry ar mhicrea-eagair fíocháin ina bhfuil 44 cineál fíocháin (Uhlen et al., 2015). Taifeadadh fíochán RNA-seq HPA den ghéine códaithe próitéine mar mheán-athscríbhinní códaithe próitéine in aghaidh an mhilliúin (pTPM), a fhreagraíonn do mheánluachanna samplaí ó gach fíochán. Rinneadh anailís de láimh ar leibhéil slonn próitéine bunaithe ar histeolaíocht i gceithre leibhéal (gan braite, íseal, meánach agus ard). I bhFíor Forlíontach S1, liostaítear na 10 leibhéil is airde tras-scríbhinní fíocháin agus leibhéil léirithe próitéine bunaithe ar histeolaíocht de KIM1 agus ACE2, faoi seach, agus déantar achoimre ar phróifíl léirithe forluiteach KIM1 agus ACE2.

Insamhaltaí docking agus dinimic mhóilíneach

Rinneadh na duganna trí Z-Dock (http://zdock. umassmed.edu/). Struchtúir chriostail SARS-CoV-RBD (PBD ID 2AJF), ​​SARS-CoV-2-RBD (PDB ID 6MOJ), MERS-COV-RBD (PDB ID 4L3N), ACE2 (PDB ID 1R42), agus KIM1 Ig Baineadh úsáid as fearann ​​V (PDB ID 5DZO) chun samhlacha ceangailteacha féideartha a lorg. Roghnaíodh na coimpléisc próitéine is fearr a scóráil do na insamhaltaí dinimic mhóilíneacha seo a leanas, a rinne an freastalaí Desmond agus a ndearna Pymol2.3 agus Maestro11.8.012 anailís orthu. Cuireadh an léaráid insamhalta dinimic 50 ns i bhfeidhm chun staidéar a dhéanamh ar pharaiméadair dhinimiciúla na gcoimpléisc próitéine . Ríomhadh fuinneamh saor in aisce ceangailteach MM-GBSA ag HawkDock (Misini lgnjatovic et al., 2016).

Diall cearnach meánach fréimhe (RMSD) agus meánluaineacht chearnógach na fréimhe (RMSF)

Baineadh úsáid as RMSD chun meastachán a dhéanamh ar an meánathrú ar dhíláithriú rogha adamh do fhráma ar leith mar a thuairiscítear (Li et al., 2011). Rinneadh RMSF chun staidéar a dhéanamh ar na hathruithe díláithrithe sa slabhra próitéine (Li et al., 2011). .

Samhlacha luch AKI agus qPCR

Rinneadh gortú I/R ar lucha C57BL/6 mar a chuireamar síos roimhe seo (Chen et al, 2015, 2017). I gcás AKI arna spreagadh le cisplatin, rinneadh cisplatin meáchain choirp 30 mg/kg a instealladh go hinimirceach i 8-lucha fireanna seachtaine d’aois, agus íobraíodh lucha 3 lá ina dhiaidh sin. Bailíodh samplaí fola agus duáin le haghaidh tuilleadh anailíse, le n=4 do gach grúpa ainmhithe turgnamhacha. Rinne RNAiso Plus (TaKaRa) an RNA iomlán a leithlisiú ó na duáin agus tras-scríofa droim ar ais go cDNA ag baint úsáide as an gcóras sintéise céad-snáithe M-MLV (Invitrogen). Rinne qPCR measúnú ar raidhse tras-scríbhinní géine ar leith. Cuirtear priméir a úsáideadh sa staidéar ar fáil (Tábla Forlíontach S4).

Tógann

Plasmaidí slonn mamaigh do KIM1 daonna, KIM1 Ig V (iarmhair KIM1 aa 20-127), KIM1 △lg V (teasctha KIM1 gan iarmhair aa 20-127), KIM1-CFP, KIM1 lg V-CFP, ACE2, SARS-CoV-2-RBD(SARS-CoV-2-iarmhair S  aa 319-541), SARS-CoV-2-S, SARS-CoV{{20} }}Tógadh RBD-YFP, agus TIM4-YFP. Rinneadh táirgí aimplithe PCR de na blúirí cDNA comhfhreagracha a chlónáil isteach i veicteoir pRK bunaithe ar thionscnóir ina raibh clib HA nó FLAG. Bronntanais chineálta ón Dr. PHWang in Ollscoil Shandong ba ea na plasmaidí a bhain le SARS-CoV.

Cultúr cille agus aistriú

Saothraíodh líne chill tubular duánach daonna HK-2 (a fuarthas ó Lárionad na Síne le haghaidh Bailiúchán Cineál Cultúir) i meáin DMEM/F12 (Hioclón) ina raibh glúcós 17.5 mM agus 10 faoin gcéad de shéiream bó féatais. Chun tionchar SARS-CoV-2 ar chealla a mheas, aistríodh cealla HK-2 le SARS-CoV-2-S agus SARS-CoV-2-plasmidanna RBD agus ansin bailíodh iad le haghaidh tuilleadh braite.

Comh-IP

Cuireadh cealla HK-2/HEK293T (1×10) le fios i maolán réamh-lysis 1 ml (25 mM Tris-HCl, pH7.4,150mM NaCl, 1 faoin gcéad NP-40, 1mM EDTA, 5 faoin gcéad gliocról), atá foirmlithe do thástálacha tarraingt anuas agus IP agus mar mhaolán níocháin le haghaidh coirníní. I gcás IP, rinneadh imdhíon-réamhshamhlú cille leis an antashubstaint léirithe nó gG faoi seach le coirníní maighnéadacha SureBeadsTM Protein G thar oíche ag 4C. Tar éis níocháin le maolán réamh-lysis ina raibh 500 mM NaCl, bhí na coirníní bruite i maolán luchtaithe agus faoi réir imdhíonoblotting (Wan et al., 2017).

Measúnacht FRET

Braitheadh ​​idirghníomhaíocht intracellular idir KIM1 agus SARS-CoV-2-RBD le measúnacht chaighdeánach bunaithe ar FRET (Karpova agus McNally, 2006) ag úsáid KIM{5}}CFP agus SARS-CoV-2-RBD-YFP . Go hachomair, rinneadh plasmid slonn mamaigh a léirigh KIM1-CFP nó KIM1 Alg V-CFP a chomhaistriú le SARS-CoV-2-RBD-YFP i-293cealla T. Le haghaidh braite speictrifhótaiméadar fluaraiseachta-bhunaithe, bailíodh agus cuireadh cealla 24 uair an chloig tar éis aistrithe, agus aimsíodh an lysate le Speictreafótaiméadar Fluaraiseachta F-2700 (Hitachi) trí scanadh tonnfhaid (500-600nm) agus scanadh ama (435 /527 nm, excitation/astú). Le haghaidh braite comhfhócasach, rinneadh íomhá de chealla le micreascóp comhfhócasach Leica TCS SP8 faoi lionsa cuspóir ardchumhachta (40×)(cainéal CFP:435/485 nm, excitation/astaíocht; cainéal YFP : 485/527nm, excitation / astú; cainéal FRET: 435/527 nm, excitation / astaíocht) (Li et al, 2020b). Áiríodh comhaistriú CFP neamhchomhchuingeach agus YFP mar rialú diúltach mar a thuairiscítear (Karpova agus McNally, 2006). Braitheadh ​​idirghníomhaíocht idir KIM1 agus a ligand TIM4 le measúnacht FRET mar rialú dearfach (Rong et al, 2011).

Rinne CRISPR-Cas9-breacadh amach KIM1

Baineadh úsáid as na prótacail bunaithe ar CRISPR-Cas le haghaidh innealtóireacht ghéanóim mar a thuairiscítear (Zhang et al., 2017). Soláthraítear seichimh sprice RNA treorach do KIM1 (Tábla Forlíontach S4).

Lipéadú FITC agus micreascópacht chomhfhócasach

Rinneadh lipéad FITC mar a chuireamar síos roimhe seo (Li et al, 2020b; Zhang et al., 2020). Go hachomair, goradh SARS-CoV-2-RBD le FITC (cóimheas molar 1:5) thar oíche, agus ansin cuireadh NHCl 5 mM leis chun an t-imoibriú a stopadh agus an FITC neamh-imoibrithe a scor. Dialyzed an tuaslagán faoi dhó agus lyophilized le haghaidh tuilleadh úsáide.

Goradh cealla HEK293T (5×1{09)nó cealla HK-2 (1×107) le FITC saor in aisce nó FITC-SARS-CoV{8}}RBD (100ug/ml le haghaidh 2). Le haghaidh measúnachtaí inmheánaithe bunaithe ar pheptíd, cuireadh AP1 nó AP2 (50μM) le FITC-SARS-CoV-2-RBD (100 ug/m) leis. Tar éis socrú le formaildéad 4 faoin gcéad (w / v), dathaíodh seicní cille le phalloidin lipéadaithe Alex Flour 594 （2ug/ml）, agus rinneadh na núicléis a dhaite le DAPI (1ug/m）), agus ansin íomháíodh iad le Leica TCS. micreascóp comhfhócasach SP8. I gcás gach grúpa, cuireadh ar a laghad 100 cill ó chúig réimse faoi lionsa cuspóir ardchumhachta (64 ×) san áireamh sa mheasúnú. Cuireadh íomhánna ionadaíocha i láthair. Rinne ImageJ1.8.0 na híomhánna a chainníochtú.

Measúnachtaí inmharthanachta cille

Plátáladh cealla ag 3000-4000 cealla in aghaidh an tobair i 96-phlátaí tobair. Ag cumar 80 faoin gcéad, déileáladh le cealla atá gortha le SARS-CoV-2-RBD （100 ug/ml） le nó gan AP1 nó AP2 (10,50,100 μM）. Ina dhiaidh sin, cuireadh 10ul MTT (5 mg/ml le gach ceann acu).

go maith le haghaidh 4h, baineadh an meán, agus cuireadh DMSO leis. Normalaíodh ionsú a thomhaistear ag 490nm don ghrúpa rialaithe faoi seach.

Anailís staitistiúil

Cuireadh sonraí in iúl mar mheán±SD. Rinneadh difríochtaí suntasacha a mheas le triail Dhalta dé-earbaill. P-luach dhá thaobh<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" analyses="" were="" performed="" with="" excel="" 2017="" and="" graphpad="" prism="">