Déanann Cuid a Trí DsbAL-L Idirghníomhú le VDAC1 in Apoptosis Ceall Tubular Mitochondriondrion-mediated Agus Cabhraíonn sé Le Dul Chun Cinn Galar Duán Géar

7. Giniúint lucha PT-VDAC1-KO

Chun ról VDAC1 in AKI a fhiosrú, bhunaíomar múnla luiche a léiríonn an t-amach VDAC1 i bhfeadáin chóngaracha na nduán. Léiríonn Fíor 7a an prótacal pórúcháin a úsáidtear chun PT-VDAC1-KO a ghiniúint. Úsáideadh RT-PCR chun lucha PT- VDAC1-KO a ghéinitíopáil; rinneadh é seo trí bhlúire DNA 416-bp a ailléil flocsaithe agus 370-blúire DNA den ghéin Cre a aimpliú (Fíor 7, b; lánaí 4 agus 6). Bhí an ghéin Cre in easnamh ar lucha den chineál fiáin (PT-VDAC1-WT) (Fíor 7, b, lánaí 2 agus 3). Léirigh anailís imdhíon-imdhíonachta go raibh leibhéil slonn VDAC1 i gcoirticí duánacha na lucha PTVDAC KO níos ísle ná iad siúd i lucha PTVDAC tar éis cóireála ischemic nó seamna (Fíor 7 c agus d). Fíoraíodh é seo a thuilleadh le staining imdhíon-histochemical de VDAC1 (Fíor 7e). D'fhíoraigh na sonraí seo gur éirigh linn múnla luiche PT- VDAC KO a bhunú.

Fíor 7. Cruthú agus tréithe mhúnla luch PT-VDAC1-KO. (a, b) An prótacal pórúcháin chun lucha KO PTVDAC a ghiniúint agus chun an PCR a bhrath ar ghéinitíopa na n-ailéilí de chineál fiáin agus de na floxed ailléil VDAC1 agus PEPCK-Cre. (c) Anailís imdhíonblot ar VDAC1 agus b-tubulin ag baint úsáide as fíocháin cortical duáin de PT-VDAC1-KO agus PT-VDAC1-lucha bruscair WT tar éis gortú IR. (d) Anailís ar an íomhá liathscála eatarthu. (e) smálú imdhíon-hiostaceimiceach de VDAC1 sna fíocháin cortical duáin de chineál fiáin agus lucha VDAC1 tar éis gortú IR. Bunmhéadú x 400. Barra Fearainn:100µM. Rinneadh gach turgnamh(c & e) 6 huaire go neamhspleách le torthaí comhchosúla. Baineadh úsáid as ANOVA aontreo do na comparáidí Ilghrúpa (d). # lch<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus PT-VDAC1-WT with IR group.

Cliceáil anseo chun na sochair Cistanche a fháil amach

8. Feabhsaíodh gortú duánach spreagtha I/R, apoptosis cille feadánacha, agus damáiste miteachondrial i lucha PTVDAC1-KO

Cóireáladh ischemia (28 nóiméad) ar litterms na lucha PT-VDAC1-WT agus PT-VDAC1-KO le ischemia (28 nóiméad) agus gortú reperfusion (48 h). Ansin fuaireamar samplaí fola agus fíocháin duáin le haghaidh tuilleadh scrúdaithe. Fuaireamar amach gur shocht PT-VDAC1-KO go háirithe an t-ingearchló I/R-spreagtha i leibhéil BUN agus creatinín (Fíor 8 a agus b). Ar an dara dul síos, léirigh anailísí histeolaíocha agus TUNEL a thuilleadh gur mhaolaigh PT-VDAC1-KO damáiste fíocháin spreagtha I/R agus apoptosis cille duánach go suntasach (Fíor 8 c, d, f, agus g). Ar an tríú dul síos, fuarthas amach in anailísí EM gur mhaolaigh PT-VDAC1-KO damáiste mitochondrial de bharr I/R-spreagtha go suntasach (Fíor 8 e agus h). Ar deireadh, dheimhnigh imdhíonoblotting gur léirigh na lucha PT-VDAC1-KO leibhéil laghdaithe caspase scoilte-3, carnadh níos ísle Bax sna mitochondria, agus rátaí níos ísle scaoileadh Cyt-c isteach sa chitosól (Fíor 8 I- ó). Léirigh na sonraí seo go ndearna VDAC1 idirghabháil freisin ar an AKI spreagtha I/R.

Fíor 8. Laghdú ar ghortú duánach IR-spreagtha, apoptosis cille feadánacha, damáiste mitochondrion, agus léiriú Bax, Cyt-c, agus caspase3 scoilte i lucha PT-VDAC1-KO. Clampáladh na hartairí déthaobhacha duánacha de lucha bruscair PT-VDAC1-KO agus PT-VDAC1-WT ar feadh 28 nóiméad agus ansin scaoileadh iad ar feadh 48h chun samhail IR a bhunú. (a) BUN. (b) Creatinín serum. (c) Hematocsailín agus staining eóisin. (d) Ranna ionadaíocha de chealla TUNEL-dearfach. (e) Leictreonmhicreascóp a bhrath deilbhíocht na miteachondrón. (f) Scór damáiste feadánach. (g) Líon na gceall TUNEL-dearfach. (h) Scór gortaithe do Mhíteachondria. (i) Déanann na himdhíonbhlótaí anailís ar shloinneadh caspase3 scoilte3, VDAC1, agus DsbA-L chomh maith le slonn BAX agus Cyt-c i gcodáin miteachondrial agus cíteashoithíoch. Baineadh úsáid as b-tubulin agus GAPDH mar lysate iomlán nó rialú luchtaithe citosolic, faoi seach. Baineadh úsáid as COX IV mar rialú luchtaithe mitochondria. (j- p) Anailís ar an íomhá liathscála eatarthu. Formhéadú bunaidh x 400. Scar Barra: 100µM in c&d 20µM in e. Rinneadh gach turgnamh (c- e&i) 6 huaire go neamhspleách le torthaí comhchosúla. Baineadh úsáid as ANOVA aontreo do na comparáidí Ilghrúpa (a, b, f- h&j- p). # lch<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus PT-VDAC1 WT with IR group.

Cistanche tubulosa

9. Maolaíodh an róbhrú ar dhamáiste duánach tromaithe I/R-spreagtha DsbA-L i lucha PT-VDAC1-KO

de DsbA-L le linn díobhála ischemic. Seachtain amháin sular bunaíodh an tsamhail luch de IR, rinneamar an vein eireaball de gach luch a instealladh leis an plasmid DsbA-L (rinneadh an t-instealladh faoi dhó i rith na seachtaine seo). Chuir ró-bhrú DsbA-L isteach ar an ingearchló IR-spreagtha i BUN agus léiriú creatinine, damáiste duánach, agus apoptosis duánach; maolaíodh na héifeachtaí seo i lucha PTVDAC1-KO (Fíor 9 a- d, e, agus f). Léirigh torthaí Immunoblot freisin gur chuir ró-eisiúint DsbA-L leis an méadú IR-spreagtha ar caspase scoilte-3, carnadh Bax sna mitochondria, agus scaoileadh Cyt-c isteach sa chitosól; laghdaíodh na héifeachtaí seo i lucha PT-VDAC1-KO (Fíor 9 g agus h- l). Le chéile, léirigh na torthaí seo a thuilleadh go ndearna VDAC1 idirghabháil ar éifeacht DsbA-L le linn díobhála isceimiceacha.

Fíor 9. Laghdaíodh an róbhrú ar dhamáiste duánach I/R-spreagtha tromaithe DsbA-L i lucha PT-VDAC1-KO. Cóireáladh na lucha PT-VDAC{{6}KO agus PT-DsbA-L-WT le nó gan plasmid DsbA-L agus bhunaigh siad múnla IR ansin. (a)BUN. (b) Creatinín serum. (c) Hematocsailín agus staining eóisin. (d) Ranna ionadaíocha de chealla TUNEL-dearfach. (e) Scór damáiste feadánach. (f) Líon na gceall TUNEL-dearfach. (g) Rinne na himdhíon-bhlotaí anailís ar shloinneadh caspase3 scoilte, VDAC1, agus DsbA-L chomh maith le slonn BAX agus Cyt-c i gcodáin miteachondrial agus cítosólacha. Baineadh úsáid as b-tubulin agus GAPDH mar lysate iomlán nó rialú luchtaithe citosolic, faoi seach. Baineadh úsáid as COX IV mar rialú luchtaithe mitochondria. (h- n) Anailís ar an íomhá liathscála eatarthu. Formhéadú bunaidh x 400. Barra Scair: 100mm. Rinneadh gach turgnamh(c-e) 6 huaire go neamhspleách le torthaí comhchosúla. Baineadh úsáid as ANOVA aontreo do na comparáidí Ilghrúpa (a, b, agus f- n). # lch<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. ^ P<0.05 versus IR group.* P<0.05 versus IR group.

Forlíonadh cistanche

10. Laghdaíodh an maolú ar dhamáiste duánach de bharr I/R i lucha PTDsbA-L-KO mar gheall ar ró-eisiúint VDAC1

Chun a dheimhniú tuilleadh an raibh damáiste feadánacha DsbA-L-idirghabhála ag brath ar VDAC1, nochtaíodh lucha bruscair lucha PTDsbA-L -WT agus PT- DsbA-L -KO do chóireáil I/R, agus ansin iad a instealladh tríd an vein eireaball. leis an plasmid overexpression VDAC1. Feabhsaíodh an méadú de bharr I/R ar leibhéil BUN agus creatinine i lucha PT- DsbA-L -KO; áfach, cuireadh cosc ​​ar an éifeacht seo trí ró-bhrú VDAC1 (Fíor 10 a agus b). Léirigh staining HE agus TUNEL gur laghdaíodh méideanna coibhneasta damáiste fíocháin duánach IR-spreagtha agus apoptosis cille duánach i lucha PT- DsbAL -KO agus gur chuir ró-bhrú VDAC1 (Fíor 10 c-f) bac ar na héifeachtaí seo. Léirigh Immunoblotting go raibh leibhéil níos ísle caspase scoilte-3 ag lucha PT- DsbA-L -KO, leibhéil níos ísle de charnadh Bax sna mitochondria, agus rátaí níos ísle scaoileadh Cyt-c isteach sa chitosól; áfach, cuireadh deireadh leis na héifeachtaí seo trí ró-bhrú VDAC1 (Fíor 10 g- m). Thacaigh na sonraí seo leis an bhfíric gur chuir DsbA-L díobháil ischemic chun cinn ar bhealach a bhí ag brath ar VDAC1.

Fíor 10. Laghdaíodh gortú duánach lucha IR-spreagtha PT-DsbA-L-KO mar gheall ar ró-eisiúint VDAC1. Cóireáladh na lucha PT-DsbA-L-KO agus PT-DsbA-L-WT le plasmid VDAC1 nó gan iad agus bhunaigh siad múnla IR ansin. (a) BUN. (b) Creatinín serum. (c) Hematocsailín agus staining eóisin. (d) Ranna ionadaíocha de chealla TUNEL-dearfach. (e) Scór damáiste feadánach. (f) Líon na gceall TUNEL-dearfach. (g) Rinne na himdhíon-bhlotaí anailís ar shloinneadh caspase3 scoilte, VDAC1, agus DsbA-L chomh maith le slonn BAX agus Cyt-c i gcodáin miteachondrial agus cítosólacha. Baineadh úsáid as b-tubulin agus GAPDH mar lysate iomlán nó rialú luchtaithe citosolic, faoi seach. Baineadh úsáid as COX IV mar rialú luchtaithe mitochondria. (hm) Anailís ar an íomhá liathscála eatarthu. Formhéadú bunaidh x 400. Barra Scair: 100mm. Rinneadh gach turgnamh(c, d, agus g) 6 huaire go neamhspleách le torthaí comhchosúla. Baineadh úsáid as ANOVA aontreo do na comparáidí Ilghrúpa (a, b, e, f, agus h- m). # lch<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus IR group.

Herba Cistanche

11. Laghdaíodh gortú duánach de bharr CLP i lucha PT-DsbA-LKO nó PT-VDAC1-KO

Cúis choitianta eile le AKI i gcleachtas cliniciúil is ea AKI de bharr sepsis. Cuireadh litterms an PT-DsbA-L nó VDAC-WT agus PT-DsbA-L nó VDAC1-KO faoi réir na samhla CLP agus ansin rinneadh eotanúchán ar 18 h tar éis na máinliachta. Léirigh na torthaí gur laghdaigh lucha PT-DsbA-L nó VDAC1- KO go suntasach na harduithe spreagtha CLP i leibhéil BUN agus creatinine, agus na leibhéil mhéadaithe damáiste fíocháin duánach agus apoptosis cille duánach (Figiúirí S1 agus S2 a- f ). Dhearbhaigh Immunoblotting gur léirigh lucha PTDsbA-L nó VDAC1-KO leibhéil laghdaithe caspase scoilte-3, leibhéil níos ísle de charnadh Bax sna mitochondria, agus rátaí níos ísle scaoileadh Cyt-c isteach sa chitosól (Figiúirí S1 agus S2 g- n). Le chéile, léirigh na sonraí seo go ndearna DsbA-L agus VDAC1 araon idirghabháil ar dhul chun cinn AKI seipteach.

12. Laghdaíodh gortú duánach de bharr VAN i lucha PT-DsbAL-KO nó PT-VDAC1-KO

Múnla tábhachtach freisin do AKI é AKI de bharr Vancomycin (VAN). Instealladh VAN (600mg/kg) go hinimirceach do na bruscair PT-DsbA-L nó VDAC1-WT agus PT-DsbA-L nó VDAC1-KO ar feadh 7 lá as a chéile. Léirigh na torthaí gur laghdaigh lucha PT-DsbA-L nó VDAC1-KO go suntasach an t-ingearchló de bharr VAN de leibhéil BUN agus creatinine, damáiste fíocháin duánach, agus apoptosis cille duánach (Figiúirí S3 agus S4 an-f). Dheimhnigh anailísí Immunoblot tuilleadh gur léirigh lucha PTDsbA-L nó VDAC1-KO leibhéil laghdaithe caspase scoilte-3, méid níos ísle de charnadh Bax sna mitochondria, agus rátaí níos ísle scaoileadh Cyt-c isteach sa cítosól (Figiúirí S3 agus S4 g- m). Go hachomair, léirigh na sonraí seo go ndearna DsbA-L agus VDAC1 araon idirghabháil ar AKI de bharr VAN.

Sliocht Cistanche

13. Bhí baint ag apoptosis cealla I/R HK-2 idirghabhála DsbA-L le VDAC1

Fuair ​​​​an toradh thuas go raibh baint ag DsbA-L le apoptosis cealla BUMPT, áfach, níl feidhm DsbA i gcealla tubular duánach daonna soiléir fós. Aistríodh siRNA DsbA-L isteach i gcealla HK2 agus ansin nochtaíodh é d’ídiú ATP ar feadh 2 h agus aisghabháil ar feadh 2 h. Léirigh na torthaí immunoblot gur mhaolaigh siRNA DsbA-L go háirithe an méadú de bharr I/R-spreagtha i slonn caspase scoilte-3 agus VDAC1, carnadh méadaithe Bax sna mitochondria, agus táirgeadh méadaithe Cyt-c isteach sa chitosól ( Fíor S5 an- h). Thug na sonraí le fios freisin go raibh baint ag ról DsbA-L in apoptosis cille HK2 leis an VDAC1 le linn cóireála I/R.

14. Tá apoptosis cealla I/R HK-2 idirghabhála DsbA-L ag brath ar an VDAC1

Chun a fhíorú tuilleadh an bhfuil ról DsbA-L in apoptosis cille HK2 ag brath ar VDAC1. Ar dtús, rinneadh cealla HK2 a chomh-aistriú le DsbA-L siRNA móide le plasmid VDAC1 nó gan é agus ansin nochtadh d’ídiú ATP ar feadh 2 h agus aisghabháil ar feadh 2 h. Léirigh na torthaí inmunoblot gur mhaolaigh siRNA DsbA-L go suntasach méadú de bharr I/R-spreagtha i slonn caspase scoilte-3 agus VDAC1, carnadh méadaithe Bax sna mitochondria, agus táirgeadh méadaithe Cyt-c isteach sa chitosól, aisiompaíodh an éifeacht seo trí ró-bhrú VDAC1 plasmid (Fíor S6a- h). Ar an dara dul síos, comh-aistrithe cealla HK2 leis an siRNA VDAC1 móide le nó gan DsbA-L plasmid agus ansin faoi lé I (2 h) / R (2 h). Léirigh na torthaí inmunoblot gur mhaolaigh VDAC1 siRNA go háirithe méadú de bharr I/R-spreagtha i slonn caspase cleaved-3 agus VDAC1, carnadh méadaithe Bax sna mitochondria, agus táirgeadh méadaithe Cyt-c isteach sa chitosól, an éifeacht seo. níor cuireadh feabhas ar an ró-bhrú DsbA-L plasmid (Fíor S7a- h). Deimhníodh go soiléir sna sonraí go ndearna VDAC1 idirghabháil ar ról pro-apoptosis DsbA-L i gcealla HK-2 le linn cóireála I/R.

Xiaozhou Li,a,b,1 Jian Pan,a,b,1 Huiling Li,c Guangdi Li,g Bohao Liu,a,b Xianming Tang,a,b Xiangfeng Liu,f Zhibiao He,a,b Zhenyu Peng,a ,b Hongliang Zhang,a,b Luxiang Wang,a,b Yijian Li,d Xudong Xiang,a,b Xiangping Chai,a,b Yunchang Yuan,e Peilin Zheng,h agus Dongshan Zhang a,b *

Roinn Míochaine Éigeandála, Daon-Phoblacht na Síne

b Institiúid Leigheas Éigeandála agus Galair Deacra, Dara Ospidéal Xiangya, Ollscoil Láir Theas, Changsha, Hunan 410011, Daon-Phoblacht na Síne

c An Roinn Oftailmeolaíochta, Daon-Phoblacht na Síne

d An Roinn Máinliacht Urinary, Daon-Phoblacht na Síne

e An Roinn Máinliacht Chliabhraigh, Daon-Phoblacht na Síne

f An Roinn Máinliachta Ginearálta, Dara Ospidéal Xiangya, Daon-Phoblacht na Síne

g An Roinn Sláinte Poiblí, Ollscoil Láir Theas, Changsha, Hunan, Daon-Phoblacht na Síne

h An Roinn Inchríneolaíochta, Ospidéal na nDaoine Shenzhen, An Dara Coláiste Leighis Cliniciúil Ollscoil Jinan, An Chéad Ospidéal Cleamhnaithe in Ollscoil Eolaíochta agus Teicneolaíochta an Deiscirt, Shenzhen, Daon-Phoblacht na Síne

1 Chuir Xiaozhou Li agus Jian Pan go cothrom leis an staidéar seo