Cuid 2: Tá Eifflux Maignéisiam Ó Chealla Drosophila Kenyon ríthábhachtach do Ghnáthchuimhne Fadtéarmach agus Feabhsaithe Aiste Bia

le haghaidh tuilleadh eolais:ali.ma@wecistanche.com

Pls cliceáil uirthi go Cuid 1

Pls cliceáil uirthi go Cuid 3

Cliceáil chunPúdar cistanche tubulosa le haghaidh cuimhne

Ról do uex sna comhlachtaí muisiriún

Chun uex san inchinn a logánú bhaineamar leas ar dtús as cuileoga trasgineacha VT23256-GAL4, ina bhfuil GAL4 á thiomáint ag seicheamh 853 bp ón gcéad intron de uex (Kvon et al., 2014). Nocht UAS-EGFP faoi thiomáint VT slonn srianta i ab KCs le lipéad an-láidir i néaróin ab croí (abc) (Fíor 3A). D'úsáideamar CRISPR freisin chun clib HA-epitope C-críochfort a chur isteach i bhfráma léitheoireachta oscailte uex (Fíor 3 - forlíonadh figiúr 1A). Bhí na cuileoga seo inmharthana mar homozygotes rud a thugann le fios go bhfuil feidhm fós ag an próitéin comhleá UEX ::HA mar thoradh air. Cuileoga imdhíonta ag cothú an uex seo:: Nocht HA lócas le hantasubstaint frith-HA lipéadú feiceálach ar na mór-aicmí KC go léir sa MB, chomh maith le léiriú níos ísle ar fud na hinchinne (Fíor 3B). Tacaíonn anailísí seicheamhaithe aonchealla leis an bpróifíl slonn uex seo freisin (Fíor 3 - forlíonadh figiúr 1B; Croset et al., 2018; Davie et al., 2018). I bhfianaise ról seanbhunaithe ab KCs in LTM olfactory (Pascual and Pre’at, 2001; Yu et al., 2006; Krashes et al., 2007; Krashes agus Waddell, 2008), rinneamar réasúnú go bhféadfadh ról cuimhneach do UEX a bheith i gceist. slonn i KCs.

An chéad uair eile a d'úsáideamar GAL4-sloinneadh treoraithe RNAi chun a thástáil cé acu 24 uair an chloigcuimhnefeidhmíocht de dhíth uex sa MB. Cuileoga ag cur uexRNAi (Perkins et al., 2015) in iúl i ngach ab KC (c739-GAL4; Yang et al., 1995; Perisse et al., 2013) nó in abc KCs (NP7175- amháin) Léirigh GAL4;Tanaka et al., 2008) gnáth láithreachcuimhneach lagaíodh cuimhne 24 uair go suntasach (Fíor 3C). I gcodarsnacht leis sin, slonn uexRNAi in ab surface (abs, 0770-GAL4; Parisse et al., 2013) nó a0 b0 KCs (c305a-GAL4; Krashes et al., 2007) aon athrú suntasach ar fheidhmíocht láithreach nó LTM. Gnáth 24 uair an chloig blastacuimhnemar sin tá an fheidhmíocht an-íogair do léiriú uex i néaróin abc. Chun laghdú a dhéanamh ar an dóchúlacht go n-eascraíonn an locht cuimhne a bhaineann le uexRNAi ó iarmhairt forbartha, chuireamar srian freisin ar léiriú UAS-uexRNAi go haosacht ag baint úsáide as rialú ama trí mheán GAL80ts (McGuire et al., 2003). Ag 18˚C ceadaitheach, ceanglaíonn GAL80ts le GAL4 agus cuireann sé a fheidhm gníomhachtaithe tras-scríobhach faoi chois. Ag 30˚C sriantach, ní féidir le GAL80ts ceangal a thuilleadh le GAL4, rud a shaorann GAL4 chun an trasgene UAS-uexRNAi a léiriú go díreach. Ardaíodh cuileoga trí fhorbairt ag 18˚C agus bhog siad go 30˚C tar éis imfhálú. Trí slonn UAS-uexRNAi a shrianadh chuig ab KCs i gcuileoga aosacha ag baint úsáide as c739-GAL4 le GAL80ts tháirgtear sainiúil 24 uair cosúil leiscuimhnelocht a breathnaíodh nuair a cuireadh in iúl UAS-uexRNAi gan rialú ama (Fíor 3D–F). Rinneamar measúnú ar éifeachtúlacht an leagain UAS-uexRNAi ag baint úsáide as ár lócas clibeáilte uex ::HA. Brains ó uex heitrisigeach::Cuileoga HA ag léiriú uexRNAi sna KCs ab agus g le MB247-GAL4 (Zars et al., 2000) imdhíonta ag baint úsáide as antashubstaint frith-HA. Comparáid a dhéanamh ar dhéine an lipéadaithe imdhíonachta in inchinn ó uex::HA; Tá MB247-GAL4/uexRNAi ar foluain leis sin ó uex::HA; MB247-Léirigh cuileoga GAL4/ móide gur laghdaigh slonn uexRNAi comhartha frith-HA go suntasach sna KCs ab agus g (Fíor 3G agus H). Léiríonn an toradh seo éifeachtacht an trasgene uexRNAi agus áirgiúlacht an CRISPR/Cas9 in eagar uex::HA locus.

Ansin rinneamar tástáil an bhféadfaí trasgene UAS-uex a chur ar ais ar feadh 24 uair an chloig i KCanna sonrachacuimhnecumas cuileoga uexMI01943.Cuimhnefeidhmíocht uexMI{{10}}1943 cuileoga ag léiriú UAS-uex in ab agus g KCs (MB247-GAL4; Zars et al., 2000) nó sna KCanna ab (c{{5) amháin }}GAL4) go mór le hais na gcuileoga uexMI01943 agus bhí sé do-aitheanta go staitistiúil ó rialuithe le lócas uex slán (Fíor 4A). I gcodarsnacht leis sin, níor athchóirigh slonn UAS-uex in a0 b0 , abc , nó abs KCscuimhnefeidhmíocht le cuileoga uexMI01943, agus níor mhéadaigh an ró-léiriú uex in ab KCs de chuileoga den chineál fiáin cuimhne 24 uair (Fíor 4A agus B). Gnáth 24 uair an chloigcuimhned’fhéadfaí feidhmíocht a chur ar ais chuig cuileoga uexMI01943 freisin dá mbeadh slonn UAS-uex teoranta do c739-néaróin GAL4 (gach ab KC) agus iad ina ndaoine fásta ag baint úsáide as rialú ama trí mheán GAL80ts (Fíor 4C agus D). Le chéile, deimhníonn na turgnaimh RNAi caillteanas feidhme agus athchóirithe seo go bhfuil ról tábhachtach ag UEX i ndaoine fásta

Fíor 3. Má chnoctar slonn uex i gcealla ab Kenyon (KCanna) lagaítear LTM. (A) Treoraíonn tionscnóir uex fragment-GAL4 léiriú GFP i KCs abc. Frith-GFP imdhíonta uex-GAL4 (VT23256); Líne UAS-EGFP. (B) Imdhíonacht frith-HA ar inchinn a chothaíonn an CRISPR/Cas9-in eagar uex::HA locus

léiríonn lipéadú láidir UEX i ngach mór-fhorannán de chorp na muisiriún (MB). Barraí scála 20 mm. (C) RNAi leagadh síos uex i ngach ab (c739- GAL4) nó díreach abc (NP{3}}GAL4) KC lagaithe go sonrach 24 uaircuimhne. ní raibh éifeacht ar bith ag slonn abs ({{0}GAL4) nó a0 b0 (c305a-GAL4) KC (lch<0.05, figure="" 3="" continued="" on="" next-figure="" 3="">

ANOVA, n=6–10 le haghaidh láithreach agus n=8–14 ar feadh 24 uaircuimhne). (D) Breathnaíodh LTM lochtach má bhí uexRNAi léiriú teoranta do KCs ab na cuileoga fásta ag baint úsáide as GAL80ts-idirghabhála rialú ama. (E) Ní raibh aon tionchar ar fheidhmíocht LTM dá gcoimeádfaí an uexRNAi faoi chois ar feadh an ama agus (F) rinneadh feidhmíocht LTM a athbhunú go dtí na gnáthleibhéil dá gcuirfí slonn uexRNAi faoi chois ar feadh 3 lá (lch<0.05, anova,="" n="6" for="" immediate="" and="" n="8" for="" 24="" hr="" memory).="" (g)="" immunostaining="" shows="" the="" effectiveness="" of="" uexrnai.="" fluorescence="" intensity="" in="" the="" ab="" and="" globes="" of="" uex::ha="" flies="" decreased="" significantly="" when="" uas-uexrnai="" was="" expressed="" with="" mb247-gal4.="" scale="" bars="" 20="" mm.="" (h)="" quantification="" of="" fluorescence="" intensity="" in="" g=""><0.05, t-test,="" n="6–8)." the="" online="" version="" of="" this="" article="" includes="" the="" following="" figure="" supplement(s)="" for="" figure="">

Forlíonadh ar fhigiúr 1. Scéim tógála don líne uex::HA agus ceapacha tSNE de shloinneadh uex.

ab KCs. Nuair a fhaightear amach go dtáirgeann abc RNAi knockdown of uex acuimhnelocht (Fíor 3C) ach ní sháraíonn léiriú UAS- uex in abc an locht tsóiteáin uexMI01943 (Fíor 4A) go bhfuil feidhm UEX in abc KCs riachtanach le haghaidh LTM appetitive, ach is gá go mbeadh UEX feidhmiúil ag na KCanna abc agus abs araon chun tacú leis. LTM. Ina theannta sin, cuireann cumas UAS-uex feidhmíocht a athbhunú go cuileoga uexMI0194 tacaíocht bhreise ar fáil go bhfuil uex freagrach as ancuimhnelagú i gcuileoga uexMI01943.

tacaíonn slonn uex sa MB le Mg2 plus -enhancedcuimhne

An chéad cheann eile rinneamar imscrúdú an bhféadfaí feabhas a chur ar bheathú Mg2 móide (4 lá le 80 mM MgCl2).cuimhnefeidhmíocht i gcuileoga le feidhm uex i gcontúirt. Níor léirigh cuileoga a iompraíonn an ailléil uexMI01943 (Fíor 4F) nó iad siúd a léirigh UAS-uexRNAi sna ab KCs le c739-GAL4 (Fíor 4E) feabhsaithecuimhnenuair a chothaítear iad le 80 mM MgCl2, i gcomparáid le cuileoga a chothaítear le 1 mM MgCl2. Thairis sin, aisghabhadh an chuimhne Mg2 móide-fheabhsaithe i gcuileoga mutant uexMI01943 nuair a cuireadh slonn uex ar ais chuig na ab KCs (Fíor 4F). Feabhsaíodh go mór gach cuileog rialaithe (c739-GAL4, UAS-uexRNAi, agus UAS-uex) le slonn uex gan cur isteach aircuimhnenuair a bheathú le 80 mM i gcomparáid le 1 mM MgCl2. Níor fheabhsaigh ró-shloinneadh UAS-uex in ab KCs le c739-GAL4 i gcuileoga a bhfuil cúlra géiniteach den chineál fiáin acu 24 uair an chloig rialtacuimhne(Fíor 4B), nó é sin i gcuileoga a chothaítear ar feadh 4 lá le 40 nó 80 mM MgCl2 (Fíor 4G). Rinneamar tástáil freisin ar fheabhsaigh 4 lá d’fhorlíonadh MgCl2 80 mM feidhmíocht cuimhne 24 uair tar éis oiliúint spásála dhírigh. Arís, ancuimhnede chineál fiáin, ach níor léirigh cuileoga mutant uexMI01943 feabhsú (Fíor 4 - forlíonadh figiúr 1). Le chéile léiríonn na torthaí go barrmhaithcuimhneÉilíonn feabhsú le Mg2 móide beathú, agus is féidir tacú go hiomlán leis, feidhm UEX in ab KCs.

Is iompróir maignéisiam atá caomhnaithe go feidhmiúil é UEX

Mar gheall ar chaomhnú seicheamh láidir UEX le mamaigh CNNM2/4 rinneamar tástáil an bhféadfadh CNNM2 ionadú feidhmiúil a dhéanamh ar UEX agus an locht LTM cuileoga uexMI01943 a athbhunú. Aithníodh roinnt sócháin pointí i CNNM2 in othair dhaonna a bhfuil hypomagnesemia orthu, a bhfuil baint acu le mífhoirmiú inchinne agus míchumas intleachta (Arjona et al., 2014). Na sócháin choibhéiseacha a thabhairt isteach i luch CNNM2 (CNNM2E357K, CNNM2T568I, CNNM2S269W, agus CNNM2E122K) léirigh go gcuireann na loit seo a dhíorthaítear ó othair isteach ar iompar maignéisiam (Arjona et al., 2014). Thógamar cuileoga a iompraíonn cineál fiáin agus an t-athróg mutant UAS-CNNM2 transgenes (Fíor 5A). Léirigh staining le haghaidh clib HA-C-críochfort gaolmhar léiriú soiléir ar gach leagan UAS- CNNM2::HA i néaróin ab nuair a thiomáintear iad le c739-GAL4 (Fíor 5 - forlíonadh figiúr 1). Mar sin féin, níl ach léiriú ar chineál fiáin CNNM2, agus ní foirmeacha pointe-sóiteáin, in ab KCs de uexMI01943

cuileoga mutant athchóirithe 24 uair an chloigcuimhnefeidhmíocht (Fíor 5B).

Rinneamar tástáil freisin an féidir le UEX idirghabháil a dhéanamh ar Mg2 móide easbhrúite. Léirigh UEX arna shloinneadh i gcealla HEK293 logánaithe don membrane plasma agus cealla luchtaithe le Mg2 móide agus an táscaire Mg2 móide Maignéisiam Glas Mg2 móide efflux tapa (Fíor 5 - forlíonadh figiúr 2 agus Físeán 1), i gcomparáid le cealla aistrithe le veicteoir folamh. Bhí Mg2 móide easbhrúite faoi thiomáint ag UEX i bhfad níos lú éifeachtúla ná i gcealla a léirigh CNNM4 Daonna (Fíor 5 - forlíonadh figiúr 2), arb eol go bhfuil éifeachtúlacht cosúil leis le CNNM2 (Hirata et al., 2014). Mar sin féin, níl a fhios againn an bhfuil slonn UEX agus CNNM4 comhionann. Mar sin féin, sainmhíníonn léiriú ar chomhlánú trasspeicis agus gníomhaíocht Mg2 móide eisilte UEX mar homalóg feidhme de chuid mamaigh CNNM2/4.

Fíor 4. An locht LTM i gcuileoga uexMI01943 a tharrtháil. Tarrtháil slonn UAS-uex in ab agus g (MB247-GAL4) nó cealla ab Kenyon (KCs) 24 uaircuimhnefeidhmíocht cuileoga uexMI01943, ach níor tháinig slonn in abc, abs nó a0 b0 KCs (p<0.05, anova="" and="" t-test,="" n="8–12)." (b)="" overexpression="" of="" uas-uex="" in="" ab="" kcs="" did="" not="" enhance="" 24="" hr="">cuimhnefeidhmíocht i gcuileoga de chineál fiáin (ANOVA, n=8–12). (C) Tarrtháil LTM lochtach má bhí slonn UAS-uex teoranta do ab KCs de chuileoga fásta ag baint úsáide as rialú ama idirghabhálaithe GAL80ts (lch<0.05, anova,="" n="6" for="" immediate="" and="" n="8" figure="" 4="" continued="" on="">

ar feadh 24 uaircuimhne) ach d’fhan (D) lochtach mura scaoilfí slonn UAS-uex. (E)Cuimhnetacaíonn UEX in ab KCs le feabhsú Mg2 aiste bia móide. Ní féidir cuimhne na gcuileoga a chuireann UAS-uexRNAi in iúl sna KCanna ab a fheabhsú le Mg2 móide beathú (t-tástáil, n=8). (F) Ní féidir cuimhne na gcuileoga mutant uexMI01943 a fheabhsú le Mg2 móide beathú, ach rinneadh an feabhsúchán a athchóiriú trí UAS-uex a chur in iúl in ab KCs (lch<0.05, t-test,="" n="8–12)." (g)="" the="" memory="" of="" wild-type="" flies="" was="" not="" sensitized="" to="" mg2+="" enhancement="" by="" overexpressing="" uas-uex="" in="" ab="" kcs.="">Cuimhnefeabhsaíodh na cuileoga má tugadh 80 mM MgCl2 do na cuileoga, ach ní le 40 mM MgCl2 suboptimal (lch<0.05, anova,="" n="">

Áiríonn an leagan ar líne den alt seo an forlíontán/na forlíonta figiúir seo a leanas d’fhíor 4:

Forlíonadh ar fhigiúr 1. Mg2 móide LTM feabhsaithe a bheathú tar éis oiliúint spásála naimhdeach i gcuileoga mutant de chineál fiáin ach ní uexMI01943.

Tá fearann ​​CNBH slán ag teastáil le haghaidhcuimhne

I bhfianaise an róil bhunaithe do chomharthaíocht cAMP icuimhne- plaisteacht ábhartha in inveirteabraigh agus mamaigh (Kandel, 2012), rinneamar tástáil ar thábhacht an fhearainn CNBH in UEX. Thógamar cuileoga ag iompar trasgene CNBH UAS-uexR622K pointe-bhóiteáilte (Fíor 6A). Cuireann an t-ionadú aimínaigéad coibhéiseach R622K deireadh le ceangailteach cAMP san fho-aonad rialála de kinase próitéin cAMP-spleách, PKA (Bubis et al., 1988). Má chuirtear UAS-uexR622K in iúl i néaróin ab le c739-Níor athchóirigh sé feidhmíocht chuimhne 24 uair an chloig, ná athraíodh an láithreachcuimhnefeidhmíocht, de chuid cuileoga mutant uexMI01943 (Fíor 6B).

D’úsáideamar CRISPR freisin chun iarracht a dhéanamh an sóchán R622K a thabhairt isteach i CNBH an lócas dúchais uex (Bassett et al., 2013; Gratz et al., 2013; Yu et al., 2013). Gan choinne, níor thug an cur chuige seo isteach an ionadú R622K ach ina ionad sin chuir sé NRR in ionad T626 sa CNBH. Ar an dea-uair, bhí cuileoga homozygoous don ailléil uexT626NRR seo inmharthana mar dhaoine fásta, murab ionann agus na cinn homozygoous do uexD, rud a thugann le tuiscint go bhfuil feidhm fós ag an UEX ionchódaithe uexT626NRR. Mar sin féin, léirigh cuileoga homozygous le haghaidh cuileoga uexT626NRR nó heitrisigeach uexT626NRR/ uexMI01943 24 uair an chloig láidircuimhnelocht (Fíor 6C). Láithreachcuimhnelagaíodh freisin i gcuileoga homozygous uexT626NRR, murab ionann agus cuileoga a iompraíonn gach teaglaim eile d’ailéilí uex. Ina theannta sin, tá ancuimhneníorbh fhéidir cuileoga uexT626NRR a fheabhsú le Mg2 móide beathú (Fíor 6D). Dá bhrí sin, díchúplálann an sóchán uexT626NRR an bunriachtanach

Fíor 5. Ionchódaíonn uex iompróir Mg2 móide a chaomhnaítear go héabhlóideach. (A) Samhail de struchtúr próitéin CNNM2 a thaispeánann sócháin phointe atá ábhartha go cliniciúil.

Arna oiriúnú agus modhnaithe ó Arjona et al., 2014. (B) Ró-léiriú ar chineál fiáin, ach ní mutant, CNNM2 i gcealla ab Kenyon tarrtháil ancuimhnelocht ar chuileoga mutant uexMI01943 (lch<0.05, anova,="" n="6–8" for="" immediate="" and="" n="8–12" for="" 24="" hr="">

Áiríonn an leagan ar líne den alt seo an forlíontán/na forlíonta figiúirí seo a leanas d’fhíor 5:

Forlíonadh ar fhigiúr 1. Léiriú trasgenach ar leaganacha mutant de CNNM2.

Forlíonadh figiúr 2. UEX-spleách Mg2 móide efflux i gcealla HEK293.

ról le haghaidh uex ó fheidhm icuimhneagus molann sé go bhfuil gníomhaíocht chiorclach rialáilte núicléitíde ríthábhachtach do UEX chun tacú le gnáth agus Mg2 móide - feabhsaithecuimhne. Cé gur dheimhnigh muid trí úsáid a bhaint as blotáil an iarthair go gcuirtear próitéin lán-fhad in iúl i gcuileoga uexT622NRR (Fíor 6E), níor cheadaigh ár n-antasubstaint dúinn a fhíorú go logántaíonn próitéin UEXT626NRR go cuí san inchinn. Tá gá le tuilleadh oibre mar sin chun logánú ceallacha, ceangailteach cAMP, agus Mg2 móide feidhm iompair na próitéine atá ionchódaithe ag an ailléil serendipitous uexT626NRR seo a ghníomhú.

Athraíonn ionramháil ainsealach cAMP logánú UEX i KCanna

Thástáil muid an bhféadfadh cAMP gníomhaíocht UEX a athrú go géar trí fhorskolin a chur i bhfeidhm ar chealla UEX- expressing HEK293. Mar sin féin, níor breathnaíodh aon athrú soiléir ar an dinimic Mg2 móide efflux atá ag brath ar UEX (níor léirítear na sonraí). Dá bhrí sin rinneamar tástáil ar cibé acu ar athraíodh léiriú KC ar UEX:: HA i gcuileoga le hathruithe ainsealacha ar

meitibileacht cAMP, trí shócháin a bhaineann le hábhar foghlama a thabhairt isteach sa chioclás adenylate spreagtha, atá ionchódaithe le rutabaga, nó sa phosphodiesterase cAMP-sonrach atá ionchódaithe le dunce. Imdhíonadh frith-HA brains ó rut2080; uex::HA agus dnc1; uex ::Nocht cuileoga HA athrú suntasach ar logánú UEX (Fíor 7A agus B agus Físeáin 2-4). De bharr an méid a aimsítear UEX::HA de ghnáth i lobes na KC go léir ag leibhéal comhionann go garbh i gcuileoga de chineál fiáin, bhí an lipéadú níos ísle sa lobe MB g agus níos suntasaí sna KCs abc i rut2080 agus cúlraí mutant dnc1 (Fíor 7C) , cé go bhfuil an slonn iomlán MB de UEX::HA comhchosúil idir cuileoga de chineál fiáin agus cuileoga mutant (Fíor 7D). Ina theannta sin, níor léirigh anailísí blot an iarthair ar phróitéin a bhaintear as cinn na gcuileoga seo difríocht shuntasach i leibhéil slonn iomlán UEX::HA (níl sonraí ar taispeáint). Mar sin tá na sonraí seo comhsheasmhach le cAMP a rialaíonn feidhm UEX agus b'fhéidir a logánú ceallach i KCanna.

Éilítear ar UEX luaineach [Mg2 móide ]i a choinneáil in ab KCs

Cé gur féidir le MagFRET tuairisc a thabhairt ar [Mg2 móide ] ní fhreagraíonn sé tapa go leor chun comharthaí spreagtha a thaifeadadh. Dá bhrí sin, thógamar cuileoga ag cothú UAS-transgenes le haghaidh dhá braiteoir Mg2 móide ionchódaithe níos nuaí, MagIC (neamh-FRET bunaithe; Koldenkova et al., 2015) agus MARIO (FRET bunaithe; Maeshima et al., 2018). Níorbh fhéidir linn slonn UAS-MARIO a bhrath san inchinn eitilt agus mar sin níorbh fhéidir linn ach UAS-MagIC a úsáid. Tuairiscíodh gurb é MagIC a thug freagra ba láidre ar Mg2 plus ach freisin go pointe níos lú ar Ca2 plus (Koldenkova et al., 2015). Dá bhrí sin, d'fhíoraíomar sainiúlacht na bhfreagraí MagIC ar dtús in ullmhúchán inchinn eitilte ex vivo tréscaoilteach cille. Baineadh brains as cuileoga a léirigh UAS-MagIC in ab KCs le c739-GAL4 (Fíor 8A), gortha i mias le salanda (Barnstedt et al., 2016) agus rinneadh monatóireacht ar athruithe ar fhluaraiseacht roimh agus tar éis feidhmchlár folctha. - ceimiceán. Cé gur léirigh feidhmiú MgCl2 méadú dáileog-spleách ar an bhfreagra MagIC, tháirg chelation Mg2 móide le EDTA laghdú dáileog-spleách (Fíor 8B agus Vidés 5 agus 6). I gcomparáid leis sin, níor chláraigh CaCl2 ach méadú beag ag na tiúchain ab airde ach is beag éifeacht a bhí ag an gceilitheoir Ca2 móide-roghnach níos mó EGTA (Fíor 8B). Léiríonn na torthaí seo gur féidir le UAS-MagIC monatóireacht a dhéanamh ar [Mg2 móide ]i sna KCanna ab san inchinn eitilt.

Tá sé léirithe go n-eascraíonn méadú ar an cAMP incheallach Mg2 móide flosc ó chealla mhamach (Romani agus Scarpa, 2000; Vormann agus Gu¨nther, 1987; Jakob et al., 1989; Romani agus Scarpa, 1990b; Romani agus Scarpa, 1990a; Gu¨nther, 1987; Gu¨nther et al., 1990; Howarth et al., 1994). Ós rud é gur léirigh ár dturgnaimh freisin go bhféadfadh cAMP UEX a rialáil, rinneamar tástáil ar an gcéad dul síos an bhféadfadh spreagadh shintéis cAMP le forskolin (FSK) comharthaí MagIC a athrú in ab.

Fíor 6. Tá fearann ​​hoimeolaíochta ceangailteach núicléitíde (CNBH) de chuid UEX ag teastáil don chuimhne. (A) Scéimreach a thaispeánann sonraí seichimh an fhearainn CNBH in UEX, agus na hathruithe aimínaigéad a rinneadh in uexR622K agus uexT626NRR. (B) Níor tharrtháil trasghéin UAS-uexR622K i gcealla ab Kenyon an locht LTM ar chuileoga mutant uexMI01943 (lch<0.05, anova,="" n="8)." immediate="" memory="" was="" also="" unaffected.="" (c)="" flies="" homozygous="" for="" uext626nrr="" have="" defective="" short-="" and="" long-term="" memory,="" while="" trans-heterozygous="" uext626nrr/uexmi01943="" flies="" only="" exhibit="" impaired="" ltm=""><0.05, anova,="" n="8)." figure="" 6="" continued="" on="" next="">

Lean Figiúr 6 ar aghaidh

(D) Níor chuir Dietary Mg2 plus le cuimhne na gcuileoga homaisigeacha uexT626NRR/ uexT626NRR (lch<0.05, t-test,="" n="8)." (e)="" western="" blot="" analysis="" of="" uex="" protein="" expression="" in="" fly="" head="" extracts.="" genotype="" from="" left="" to="" right:="" wild-type,="" uext626nrr/uext626nrr,="" uext626nrr/+,="" uext626nrr/uexmi01943,="" uexmi01943/+.="" the="" blot="" was="" first="" probed="" with="" anti-uex="" antibody="" (upper="" panel),="" and="" then="" stripped="" and="" re-probed="" with="" anti-tubulin="" antibody="" (lower="" panel)="" as="" a="" loading="">

KCs. Le haghaidh na dturgnaimh seo d'úsáideamar ullmhúchán inchinne ex vivo arís ach an uair seo níor cuireadh na cealla tréscaoilteach. Tá sé léirithe go n-eascraíonn 30 mM FSK buaicmhéadú ar cAMP i KCanna atá comhionann leis an méid a breathnaíodh tar éis riochtú blasta (Louis et al., 2018). 30 mM FSK a chur i bhfeidhm ar c739-GAL4; Léirigh brains UAS-MagIC dinimic chomhsheasmhach i bhfluaraiseacht MagIC. Tar éis ardú géar tosaigh, tháinig meath ar fhreagraí go mall ar ais i dtreo na bunlíne sular tháinig siad suas go mall arís go pointe ar thosaigh an comhartha ag luainiú. (Fíor 8C agus D agus Físeán 7). Níor taifeadadh príomhshínithe an fhreagra seo ach sa chomhartha Mg2 móide-íogair Véineas (Fíor 8D). I gcodarsnacht leis sin níor tháinig aon athrú ar fhluaraiseacht mCherry ach tháinig laghdú seasta air thar thréimhse ama an taifeadta (toradh ar thuaradh grianghraf is dócha), rud a léirigh nach déantúsán gluaiseachta é an luaineacht sa chomhartha Véineas (Fíor 8E). Rud atá tábhachtach, bhí freagraí MagIC spreagtha ag FSK níos airde ná iad siúd tar éis salainn a chur i bhfeidhm (Fíor 8 - forlíonadh figiúr 1A). Mar sin féin, d'fhorbair freagairt luaineach freisin tar éis feidhmchláir salanda (Fíor 8 - forlíonadh figiúr 1B) a thabharfadh le tuiscint go bhféadfadh an comhartha rithimeach MagIC a bheith ina fhreagra ginearálta ar mhéadú [Mg2 móide ]i a leanann suaitheadh ​​ceallacha.

Tuairiscíodh roimhe seo go dtaispeánann an Drosophila MB ca2 mall (0.004 Hz) móide ascalaithe in inchinn ex vivo ach go bhfuil ascalaithe 20 Hz i bhfad níos tapúla á dtaispeáint ag bolaithe sa locust MB (Laurent agus Naraghi, 1994; Rosay et al., 2001). Cé gur léirigh ár dtréithriú tosaigh ar MagIC san inchinn eitilt freagra tosaíochta ar Mg2 plus (Fíor 8B), mar sin féin rinneamar tástáil shoiléir ar cibé acu an raibh luaineacht spreagtha FSK sna [Ca2 plus ]i de ab KCs, ag baint úsáide as léiriú UAS-GCaMP6f (Chen et al., 2013). Spreag FSK méadú moillithe ar fhreagra GCaMP ach níor tugadh faoi deara aon ghníomhaíocht ascalach soiléir (Fíor 8 - forlíonadh figiúr 1C–E).

Ar deireadh, rinneamar tástáil cibé an raibh na freagraí MagIC a breathnaíodh íogair do stádas na géine uex. Ghineamar cuileoga uexMI01943 a chothaigh c379-GAL4 agus UAS-MagIC freisin agus a rinne comparáid idir a gcuid freagraí MagIC FSK- agus salainn-spreagtha leo siúd a bhaineann le cuileoga le lócas uex de chineál fiáin. Léirigh na cuileoga mutant uexMI01943 freagairt FSK méadaithe ar an méid a bhí ag cuileoga de chineál fiáin, ach ní raibh na freagraí a léirigh seile inaitheanta (Fíor 8F agus G). Bhí freagraí a léirigh an t-analóg FSK neamhghníomhach, ddFSK, neamhíogair freisin maidir le stádas uex (Fíor 8 - forlíonadh figiúr 1F). Dá bhrí sin méadaíonn sóchán uex go roghnaíoch freagairtí MagIC a spreagtar ag FSK.

Thugamar faoi deara freisin nár léirigh rianta MagIC ó chuileoga mutant uex comhartha luaineach (Fíor 8H agus Fíor 8 - forlíonadh figiúr 1G). Chun an difríocht seo a chainníochtú, rinneamar meándlús speictreach cumhachta (PSD) na rianta ó uexMI01943 agus cuileoga de chineál fiáin a chóireáiltear le FSK nó seile a ríomh. Sa dá choinníoll aistríodh an meán PSD go suntasach i dtreo minicíochtaí níos ísle sna mutants uexMI01943 i gcomparáid leis na rialuithe de chineál fiáin (Fíor 8I). Bhí i bhfad níos mó gníomhaíochta ascalach dírithe ar 0.015 Hz ar brains eitilt de chineál fiáin ná iad siúd ó mutants uexMI01943. Tugann na sonraí seo le tuiscint mar sin go bhfuil UEX ag teastáil chun cothabháil rithimeach mall KC [Mg2 móide ]i. Go tábhachtach, nuair a aimsítear go bhfuil comharthaí MagIC ardaithe agus athraithe i mutants uex deimhnítear go bhfuil na freagraí MagIC breathnaithe Mg2 móide-spleách. Thairis sin, tugann siad le fios gur léirigh an KC teorainneacha UEX Mg2 móide carnadh, i gcomhréir le ról in easbhrúite.

Plé

Thugamar faoi deara feabhas ar fheidhmíocht olfactory LTM nuair a chothaíodh cuileoga ar feadh 4 lá roimh oiliúint le bia arna fhorlíonadh le 80 mM [Mg2 móide ]. Tá an toradh seo cosúil leis an méid a tuairiscíodh i bhfrancaigh, cé go raibh gá le tréimhsí beathaithe níos faide chun an inchinn [Mg2 móide ] a ardú go leibhéil feabhsaithe cuimhne (Slutsky et al., 2010). D’fhéadfadh go léireodh difríocht san am beathú barrmhaith méid an ainmhí agus b’fhéidir an bith-infhaighteacht níos mó de Mg2 móide chothaithe i Drosophila. Cé go raibh Mg2 plus -L-threonate (MgT) ina mhodh níos éifeachtaí chun Mg2 móide a sheachadadh ná clóiríd mhaignéisiam i bhfrancaigh (Slutsky et al., 2010), thugamar faoi deara feabhas comhchosúil ar fheidhmíocht cuimhne nuair a chothaíodh cuileoga le clóiríd maignéisiam. , sulfáit mhaignéisiam, nó MgT (sonraí nach bhfuil léirithe).

Fíor 7. Athraítear slonn uex cille Kenyon (KC) i rutabaga agus cuileoga mutant dunce. (A) Nochtann brains dhaite frith-HA UEX::Déantar logánú próitéin HA a athrú i rut2080; uex::HA agus dnc1; uex::HA cuileoga, ag éirí níos suntasaí i abc KCs (saigheada). Barraí scála 20 mm. (B) Íomhánna méadaithe de na comhlachtaí muisiriún (MBanna) ag cur béime ar abairt abc KC i gcuileoga mutant rut2080 agus dnc1, i gcomparáid le cuileoga fiáin de chineál uex::HA. Barraí scála 20 mm. (C) Cainníochtú déine fluaraiseachta. Ar chlé, micreagraf le líne tomhais tríd an rinn lobe agus ROI dronuilleogach don lobe g agus limistéar rialaithe. Léiríonn próifílí déine fluaraiseachta meánacha ar fud an rinn lobe comhartha i bhfad níos airde i gcuileoga mutant rut2080 agus dnc1 sa lár-réigiún áitithe ag na KCs ab croí (*p<0.05, anova,="" n="6–10)." right,="" the="" relative="" intensity="" in="" the="" g="" lobe="" was="" significantly="" lower="" in="" rut2080="" and="" dnc1="" mutant="" flies,="" as="" compared="" to="" wild-type="" controls=""><0.05, anova,="" n="6–10)." scale="" bars="" 10="" mm.="" (d)="" left,="" micrograph="" showing="" circular="" rois.="" right,="" figure="" 7="" continued="" on="" quantification.="" total="" intensity="" over="" all="" six="" rois="" on="" the="" mbs="" was="" not="" significantly="" different="" between="" the="" rut2080,="" dnc1,="" and="" wild-type="" brains="" (p="">0.13; ANOVA, n=6–10).

Mar thoradh ar ardú [Mg2 móide ]e san inchinn francach, déantar upregulation cúiteach ar léiriú an fho-aonad NR2B den NMDAR agus mar sin méadú ar an gcion de NMDARanna postsynaptic ina bhfuil NR2B. Tá am oscailte níos faide ag an aicme seo de NMDARanna (Chen et al., 1999; Erreger et al., 2005) ag tabhairt le fios go léiríonn an t-athrú seo i gcomhdhéanamh fo-aonad meicníocht plaistigh homeostatach (Turrigiano, 2008) chun freastal ar an mbloc NMDAR méadaithe a fhorchuirtear le ag méadú [Mg2 móide ]e. Ina theannta sin, is féidir le ró-léiriú NR2B i forebrain na luiche éascú agus foghlaim synaptic a fheabhsú aguscuimhnefeidhmíocht (Tang et al., 1999), ag tacú le méadú ar NR2B mar fhachtóir tábhachtach i Mg2 móide -feabhsaithecuimhne. Mar sin féin, fiú amháin sa bhunstaidéar in vitro ar Mg2 móide-plaisteachacht shionaptach feabhsaithe (Slutsky et al., 2004), tugadh faoi deara nach raibh sruthanna NMDAR leordhóthanach chun na hathruithe a breathnaíodh a mhíniú go hiomlán.

Níor chuir ár gcuid staidéir ar chaillteanas feidhme fo-aonad NMDAR sna KCanna Drosophila isteach ar ghnáth-nó Mg2 móide - feabhsaithecuimhne. Ina theannta sin, níor bhraitheamar athrú soiléir ar leibhéil léiriú na hinchinne ar fho-aonaid gabhdóirí glutamáit i gcuileoga Mg2 móide-chothaithe. Cé go raibh baint ag gníomhaíocht NMDAR le olfactory Drosophila roimhe seocuimhne, is mó a cuireadh na héifeachtaí chun feidhme lasmuigh den MB (Xia et al., 2005; Wu et al., 2007). Ina theannta sin, níor athraigh STM nó LTM trí ró-léiriú Nmdar1 i ngach néaróin, nó go sonrach i ngach KC. Ró-léiriú ectopic i MB de leagan NMDARN631Q, nach féidir a bhlocáil le Mg2 móide , LTM lagaithe (Miyashita et al., 2012). Mar sin féin, ceadaíonn an sóchán seo iontráil Ca2 móide ligand-gated, gan gá le dípolarú néarónach comhghaolaithe, rud a d'fhéadfadh cur isteach ar fheidhmiú KC ar bhealaí gan choinne. Is fiú a lua, b’fhéidir, gur féidir dúlagar synaptic a bhaineann le foghlaim sa MB a thiomáint ag comharthaí teagaisc dopaminergacha a sheachadtar chuig sinapses aschuir cholinergic ó KCanna a fhreagraíonn do bholadh go MBONanna ar leith (Claridge-Chang et al., 2009; Aso et al., 2012 ; Burke et al., 2012; Liu et al., 2012; Owald et al., 2015; Hige et al., 2015; Barnstedt et al., 2016; Parisse et al., 2016; Aso et al., 2016; Owald agus Wad- dell, 2015; Handler et al., 2019). D’fhéadfaí a shamhlú go bhfaigheann KCanna glutamáit, ó fhoinse atá fós le haithint, ach faoi láthair níl aon áit soiléir sa líonra MB le haghaidh plaisteacht atá ag brath ar NMDAR. Tugann an fhianaise le fios mar sin go bhfuil Drosophila LTM gnáth agus Mg2 móide - feabhsaithe neamhspleách ar chomharthaíocht NMDAR i KCanna. Ina theannta sin, léiríonn ár dtomhais MagFRET go méadaíonn Mg2 móide beathú freisin [Mg2 móide ]i de ab KCs de thart ar-

mately 50 mm.

D’aithníomar ról do uex, ortaológ eitilt aonair an teaghlaigh de chineál CNNM Mg2 móide iompróirí eisilteach a chaomhnaíodh go héabhlóideach (Ishii et al., 2016). Tá ceithre ghéinte ar leith CNNM i lucha agus i ndaoine, cúig cinn i C. elegans, agus dhá cheann i zebrafish (Ishii et al., 2016; Arjona et al., 2013). Táirgeann an lócas uex ceithre athscríbhinn mRNA atá splicáilte go malartach, ach ionchódaíonn siad go léir an próitéin 834 aa céanna. Tá ról beacht próitéiní CNNM in iompar Mg2 móide beagán conspóideach (Funato et al., 2018a; Arjona agus de Baaij, 2018; Funato et al., 2018b; Gime’nez-Mascarell et al., 2019). Molann cuid acu gur iompróirí díreacha Mg2 móide iad próitéiní CNNM, ach tá daoine eile i bhfabhar go bhfeidhmíonn siad mar bhraiteoirí ar Mg2 intracellular móide tiúchan [Mg2 móide ]i agus/nó rialtóirí iompróirí Mg2 móide eile. Fuaireamar amach go gcuireann léiriú ectopic Drosophila UEX le Mg2 móide eisreabhadh i gcealla HEK293 agus go gcuireann teorainn le UEX endogenous [Mg2 móide ]i in ab KCs san inchinn eitilt. Dá bhrí sin, mura bhfuil UEX ann féin ina iompróir Mg2 móide, caithfidh sé a bheith

in ann idirghníomhú go héifeachtach le hiompróirí eisilteach Mg2 móide daonna agus tionchar a imirt ar Mg2 móide easbhrúite i Drosophila. Ós rud é gurb é UEX an t-aon phróitéin CNNM san eitilt, féadfaidh sé freastal ar róil uile na gceithre CNNM mamaigh aonair. Mar sin féin, cumas luch CNNM2 a chur ar aiscuimhnetoilleadh chun cuileoga mutant uex le fios go bhfuil ancuimhne-is féidir feidhm UEX ábhartha a chur in ionad feidhm CNNM2.

Díol spéise é, ní raibh aon cheann de na leaganacha CNNM2 a bhain le galair in ann ancuimhnelocht cuileoga tsóiteáin uex. Cuirtear aimínaigéad amháin in ionad an leagain CNNM2 T568I sa dara fearann ​​CBS (Arjona et al., 2014). Ceanglaíonn fosfatas tyrosine próitéine oncogenic an teaghlaigh PRL (fosfatase an ae athghiniúna) le fearainn CBS CNNM2 agus CNNM3 agus is féidir leo bac a chur ar a bhfeidhm iompair Mg2 móide (Hardy et al., 2015; Gime´nez-Mascarell et al., 2017 ; Zhang et al., 2017). Beidh sé spéisiúil, mar sin, ról fearainn CBS UEX a thástáil agus an rialaíonn eitilt PRL gníomhaíocht UEX.

Nochtann anailís RNA-seq go gcuirtear uex in iúl go láidir i gconair díleáite an larbha agus na n-eitiltí fásta agus na córais néarógacha, chomh maith leis na hubhagán (Gelbart agus Emmert, 2010; Croset et al., 2018; Davie et al., 2018) ag moladh go beidh go leor sócháin uex pleiotropic. Mar thoradh ar ár n-ailléil uexD, a scriosann 272 aimínaigéid (lena n-áirítear cuid den dara CBS agus an fearann ​​CNBH iomlán) ó C-críochfort UEX, bíonn marfacht forbartha nuair a bhíonn sé homozygous, rud a léiríonn gur géine riachtanach é uex. Tá mamaigh CNNM4 logánta chuig an membrane basolateral de chealla epithelial intestinal (Yamazaki et al., 2013). Creidtear go bhfeidhmíonn sé in iompar trascheallacha Mg2 móide ansin trí Mg2 móide intracellular a mhalartú le haghaidh Na plus extracellular tar éis dul isteach apical trí bhealaí TRPM7. Mar sin d’fhéadfadh marfach i Drosophila eascairt as neamhábaltacht dóthain Mg2 móide a ionsú tríd an putóg larbha. Mar sin féin, tá marfacht larbha mar thoradh ar léiriú srianta néarónach ar uexRNAiwith elav-GAL4 (sonraí nach bhfuil léirithe), rud a thugann le tuiscint go bhfuil ról breise ag UEX i bhforbairt luath an néarchóras, cosúil le CNNM2 i ndaoine agus zebrafish (Arjona et al., 2014; Accogli et al., 2019). Is ionadh é, b’fhéidir, go bhfuil goile lochtach agus seachránach ag cuileoga a iompraíonn teaglaim homaisigeach nó tras-heitrisigeach de roinnt ailléilí uex hipomorphacha.cuimhnefeidhmíocht, ach is cosúil nach bhfuil aon tionchar orthu ar shlí eile.

Thug innealtóireacht ghéiniteach an lócas uex chun clib HA C-críochfort a chur leis an bpróitéin UEX deis dúinn a léiriú san inchinn a logánú. Tá an lipéadú an-fheiceálach i ngach mór-aicme KCanna. Le srianadh slonn uex a shrianadh do gach ab KC de chuid cuileoga fásta, nó fiú go díreach an fo-thacar abc d’atáirgeadh an locht LTM. Ba léir an lagú LTM má shloinneadh uexRNAi in ab néaróin

Fíor 8. Cuireann UEX teorainn le méadú ar [Mg2 móide ]i agus tacaíonn sé le ascalú mall i gcealla ab Kenyon (KCs). (A) Mínigh inchinn eitilt ag léiriú UAS-MagIC arna thiomáint ag c739-GAL4. Painéal uachtair, radharc codarsnachta chéim leathan-réimse; painéil lár, radhairc fhluaraiseachta ar Véineas agus cainéil mCherry; painéal íochtair, cuid comhfhócasach ag leibhéal na somata KC a thaispeánann cainéil Véineas agus mCherry. Barraí scála 20 mm. (B) Freagraíonn MagIC go roghnach d'athruithe ar [Mg2 móide ]i i KCanna. Rianta cóimheas MagIC tar éis 10, 20, nó 40 mM MgCl2 nó CaCl2 a chur i bhfeidhm i folctha; 5, 10, nó 20 mM EDTA nó EGTA. (C) Leanadh ar aghaidh le lorg ionadaíoch ar Fhíor 8 an chéad cheann eile -Fíor 8 ar lean

Léiríonn cóimheas MagIC tar éis chur i bhfeidhm FSK tonn tosaigh agus ina dhiaidh sin ardú de réir a chéile agus forbairt ascalaithe mall. (D) Tagann na príomhfhreagairtí as athruithe ar an gcomhartha Véineas Mg2 móide-íogair. (E) Léiríonn comhartha mCherry meath seasta. (F) Is mó freagraí MagIC a spreagtar ag FSK i gcuileoga mutant Uex. Léiríonn meánfhreagairtí MagIC gur spreag FSK méadú i bhfad níos mó ar uexMI0sóiteáin 1943 ná mar atá i gcuileoga de chineál fiáin. (G). Níor athraíodh meánfhreagairtí MagIC a spreag seile i gcuileoga mutant uex. (H) Léiríonn rianta cainéal Véineas Aonair (glas) agus mCherry (dearg) nach bhfuil an ascalaithe mall le feiceáil ach amháin i gcainéal Véineas de chineál fiáin, ach ní uex mutant, cuileoga. (I) Léiríonn anailís ar dhlús speictreach cumhachta (PSD) ar an tsraith ama ó 200 go 900 s de na sonraí go léir go bhfuil gníomhaíocht ascalach i bhfad níos mó ag rianta ó chuileoga de chineál fiáin, dírithe ar 0.015 Hz, ná iad siúd ó chuileoga mutant uex.

Áiríonn an leagan ar líne den alt seo an forlíontán/na forlíonta figiúirí seo a leanas d’fhíor 8:

Forlíonadh ar fhigiúr 1. Rianta aonair don íomháú MagIC agus GCaMP.