Déan teagmháil le:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Pls cliceáil anseo chun Cuid 1

Pls cliceáil anseo go Cuid 3

Is féidir le Cistanche cuimhne a fheabhsú

Ag cur na dtorthaí seo san áireamh, rinneamar scrúdú ar an gcéad uair eile an bhfuil miR hippocampal miR{0}}f-3p uasrialaithe i lucha ar fhoghlaim spásúil aguscuimhneBhí tionchar freisin ag foirmiú ar mhoirfeolaíocht néarónach in vivo. Go suntasach, fuaireamar amach go raibh meán-dlús spine na néaróin hippocampal de lucha GLN níos airde ná mar a bhí i lucha PLN, mar a léirigh Golgi tuile an phirimide.

Fíor 3. Éifeachtaí athraithe leibhéil slonn hippocampal miR-466f-3p ar fheidhmíocht MWM luch

(A) Amlíne thurgnamhach thasc MWM, anailís ar chaint, nó tomhas leictreafiseolaíocht ar na brains luiche tar éis instealladh lentivirus.

(B) Painéil chlé: léiriú dsRed i hippocampus luiche. Léiriú ionadaíocha íseal agus ardmhéadaithe MÁ íomhánna de hippocampus ó lucha atá ionfhabhtaithe le lentivirus athchuingreach ag léiriú dsRed-amháin mar rialtán (colún ar chlé na n-íomhánna) nó miR-466f-3p móide dsRed (ar dheis colún na n-íomhánna). Méadaítear achair bhosca an dá íomhá is airde agus taispeántar thíos iad. Barraí scála, 100 mm. Léiríonn na línte poncaithe teorainneacha DG. Bhí daite núicléi le DAPI. GCL, ciseal cille granule; ML, ciseal mhóilíneach. Histeagram ar dheis, leibhéil slonn choibhneasta miR-466f-3p sa luch hippocampus atá ionfhabhtaithe le lentivirus rialú slonn nó miR-466f-3p, arna mheas ag RT-qPCR ( n=16 in aghaidh an ghrúpa).

(C) léirithe MWM de lucha atá ionfhabhtaithe le lentivirus athchuingreach éagsúla, pacáistithe le húsáid cúig phlasmid dhifriúla a léiríonn dsRed-amháin, miR-466f-3p, mut-miR-466f{ {5}}p, agus miR/SCR-spúinsí, faoi seach, isteach ina hippocampus (n=13, 26, 16, 19, agus 11 in aghaidh an ghrúpa, faoi seach). Painéal ar chlé: éalaigh latency le linn na hoiliúna. Painéal ar dheis: latency éalaithe aonair ar an 6ú seisiún.

Cuirtear na sonraí a thaispeántar i (B) i láthair mar mheán ± SD, agus cuirtear na sonraí a thaispeántar in (C) i láthair mar mheán ± SEM. Rinneadh measúnú ar thábhacht staitistiúil trí thástáil t neamhphéireáilte (B), ANOVA dhá bhealach le comparáid post hoc Bonferroni (C, painéal ar chlé), nó ANOVA aon-ANOVA le tástáil post hoc Tukey (C, painéal ar dheis). Difríochtaí staidrimh: #p < 0.05,="" **/##p="">< 0.01="" agus="" ****p="">< 0.0001;="" *mir-466f-3p="" i="" gcoinne="" cinn="" eile;="" #mir-spúinse="" i="" gcoinne="">

néaróin sa hippocampus luch GLN agus PLN (Fíor S3). Léiríonn na torthaí seo go gcuireann uasrialáil miR hippocampal-466f-3p fás nórite chun cinn agus foirmiú droma dendritic, atá cosúil leis an ionduchtú dlús spine a breathnaíodh i lucha hippocampal GLN i gcoibhneas le lucha PLN.

miR{0}}f-3p modhnaítear go dearfach foghlaim spásúlachta luiche aguscuimhnefeidhmíocht, chomh maith le plasticity synaptic

Chun imscrúdú a dhéanamh an rialaíonn miR{0}}f-3p foghlaim spásúlachta luiche aguscuimhnefoirmiú, úsáideamar cur chuige athchuingreach ionfhabhtaithe lentivirus chun an miRNA a overexpress sa hippocampus luiche. Rinneadh anailís ar na lucha 7 lá tar éis instealladh lentivirus isteach san DG (Fíor 3A). Ardaíodh íomhánna ionadaíocha de na leibhéil hip-léirithe de miR-466f{-3p go deimhin sa ghrúpa ró-shloinne miR-466f-3p i gcomparáid leis an ngrúpa rialaithe (histeagram ar dheis i bhFíor 3B). Fuaireamar amach gur thaispeáin lucha a raibh ró-eisiúint hippocampal acu ar miR-466f- 3p agus a bhí faoi réir an tasc MWM laonna éalaithe de 88 ± 5 s sa 1ú seisiún agus 19 ± 1 sa 6ú seisiún (dearg líne ponc, Fíor 3C), a bhí níos fearr ná do lucha rialaithe veicteora (líne dhubh) nó lucha rialaithe mutant (líne ciorcail dhearg) agus cosúil leis na laonna éalaithe de lucha GLN a thuairiscítear i bhFíor 1A. Ag an am céanna, rinneamar scrúdú ar an éifeacht a bheadh ​​ag miR-466f-3p{-3p) ar fhoghlaim spásúil aguscuimhnetrí miR{0}}f-3p a chosc le miR-spúinse. Go háirithe, bhí feidhmíocht MWM na lucha inar ghlac an miR-spúinse hippocampal miR-466f-3p cosúil le feidhmíocht lucha PLN, .i. níor fhoghlaim siad an t-ardán a aimsiú fiú trí an seisiún deireanach (líne chearnógach ghlas soladach,

Fíor 3C). Ina theannta sin, níor dealraitheach gur chuir lucha a bhí instealladh le lentivirus isteach ar phlaisteacht homeostatach, ós rud é go raibh roinnt lucha i ngach grúpa foghlamtha nó ar a laghad i mbun foghlama le linn an tseisiúin dheireanach (Fíor 3C, histeagram ceart).

Ós rud é gur chuir ró-léiriú miR-466f-3p-3p i hippocampus lucha lena gcuid foghlama aguscuimhnecumas, rinneamar anailís ar leictreifiseolaíocht chomparáideach na néaróin hippocampal saothraithe a léirigh leibhéil éagsúla miR-466f-3p. Bhí an sruth beag sceithire postsynaptic (mEPSC) ó néaróin hippocampal DIV14 ag cur ró-shásamh ar miR-466f-3p nó mut-miR-466f-3p-3p, miR-spúinse, nó rialaithe taifeadta ag baint úsáide as teanntáin paiste uile-chealla. Cé nach raibh aon difríochtaí suntasacha idir aimplitiúid mEPSC, ardú Tau, nó meath Tau i measc na gceithre thacar samplaí, bhí minicíocht mEPSC na néaróin ag ró-léiriú miR-466f{{-3p) i bhfad níos airde i gcomparáid le grúpaí eile (Fíor 4A), a thugann le fios go raibh na gabhdóirí glutaminergacha postsynaptic i bhfeidhm níos láidre ar ró-eisiúint miR-466f{- 3p).

Ansin thomhaiseamar potentiation fadtéarmach (LTP) chun ról miR-466f-3p i plaisteacht shionaptach in vivo a chinneadh go díreach. Chuir Weinjected an hippocampus de lucha le comhcheangailte lelentivirus mar a dhéantar cur síos ar Fhíor3agus na LTPinhippocampalslices a d’eascair as sin trí spreagadh teiteanach (trí thraein de spreagadh ard-minicíochta [3xHFS]) de chonair chomhthaobhachta Schaffer. Fuaireamar amach gur spreag ár bprótacal LTP i ngach grúpa, mar is léir ón méadú leanúnach ar fhéidearthachtaí postsynaptic excitatory (fEPSPs) i réigiún cornu amóinis 1 (CA1) (Fíor 4B, painéal ar chlé). Bhí an LTP níos láidre i slisní miR-466f-3p-overexpressing (188 faoin gcéad ± 2 faoin gcéad den bhunlíne ag 40–50 nóiméad tar éis spreagtha, meán ± SEM) i gcomparáid le mutant (169 faoin gcéad ± 1 faoin gcéad). den bhunlíne), spúinse SCR (173 faoin gcéad ± 3 faoin gcéad den bhunlíne), agus slisní rialaithe-ionfhabhtaithe le víreas (159 faoin gcéad ± 2 faoin gcéad den bhunlíne), mar chosc ar miR-466f{-3p le laghdaigh miR-spúinse an LTP (128 faoin gcéad ± 1 faoin gcéad den bhunlíne) i gcoibhneas le rialuithe (Fíor 4B, painéal ar dheis). Thomhaiseamar freisin LTP na ngrúpaí GLN agus PLN tar éis oiliúna. Léirigh na sonraí faoi seach freisin difríochtaí suntasacha i bhfána fEPSP sa réigiún CA1 idir na grúpaí GLN agus PLN (Fíor 4C). Mar sin, cuireann leibhéal ardaithe miR-466f{-3p le LTP agus le plaisteacht shionaptach a d’fhéadfadh, ar a seal, an fhoghlaim aguscuimhnecumas lucha. Le chéile, léiríonn na sonraí a chuirtear i láthair i bhFíoracha 2, 3, agus 4 go bhfuil ról ríthábhachtach dearfach ag miR-466f-3p san fhoghlaim spásúlachta aguscuimhnefoirmiú, is dócha trí fheabhas a chur ar fhoirmiú an spine, LTP, agus neart plasticity synaptic.

Is sprioc rialála é mef2a mRNA de miR-466f-3p

Rinneamar anailís bhithfhaisnéisíochta chun sprioc-mhRNAanna a shainaithint a rialaítear trí miR{0}}f-3p a cheangal lena 30 UTR. I measc na n-iarrthóirí a d'aithin muid bhí an t-ionchódú mRNA Mef2a MEF2A. Is díol suntais é, fuarthas amach roimhe seo go raibh slonn MEF2A íosrialaithe tar éis oiliúint MWM, agus chuir ró-léiriú an fhachtóir seo tionchar diúltach ar fheidhmíocht lucha (Cole et al., 2012). Mar sin, d’úsáideamar measúnacht tuairisceora luciferase chun a scrúdú an rialaíonn miR-466f-3p aistriúchán Mef2a mRNA trína cheangal dá 30 UTR. Chuireamar isteach seichimh Mef2a 30 UTR de chineál fiáin nó mutant le sruth ó SV40-luciferase cDNA (Luc) tionscnóra-tiomáinte, rud a d’fhág go raibh an tuairisceoir plasmid psiCHECK2-MEF2A 30 UTR nó psiCHECK2- mut-MEF2A 30 UTR (Fíor 5A). Mar a léirítear sa histeagram ar chlé i bhFíor 5B, maolaíodh slonn luciferase arna threorú ag Mef2a 30 UTR le comhshloinneadh miR-466f{-3p. Ba chosúil go raibh an éifeacht seo ag brath ar an idirghníomhú idir miR-466f-3p agus Mef2a 30 UTR ó rinneadh claochlú ar cheachtar den suíomh ceangailteach tuartha miR{-466f-3p ar an Mef2a 30 UTR (50-UGU- GUAU-30) nó an réigiún síl de miR-466f-3p ({50-AUACACA-30) ag aithint Mef2a 30 aisghair 30 UTR éifeacht coisctheach miR-466f{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{-3})-3}p-3)gníomhas) gníomhaíocht luciferase (Fíor 5B, histeagram meánach). Ina theannta sin, chuir comhléiriú an miR-spúinse, ach ní an spúinse CR, deireadh le héifeacht choisctheach miR-466f{{-3p{{-3}p{-3}p) ar ghníomhaíocht luciferase (Fíor 5B, histeagram ar dheis). Go háirithe, ní raibh aon tionchar ag ró-eisiúint miR-466f-3p ná miR-spúinse ar leibhéil Mef2a mRNA i néaróin hippocampal bunscoile (Fíor 5C), ach laghdaigh nó mhéadaigh siad, faoi seach, an leibhéal próitéin MEF2A (Fíor 5D). Fuaireamar amach freisin go ndearna ró-léiriú miR-466f{-3p{-3p{-3p{-3p{-3p nó miR-spúinse), faoi seach, an leibhéal mRNA de phróitéin cíteischnámharlaigh a bhaineann le gníomhaíocht-rialaithe (Arc) i néaróin hippocampal bunscoile (Fíor 5C) a íosrialú nó a rialáil. , a bhí ina sprioc iartheachtach ar a dtugtar rialáil dhearfach ag MEF2A (Flavell et al., 2006)

Chomh maith leis sin rinneamar hibridiú fluaraiseachta in situ (FISH) chun miR-466f-3p a bhrath agus chomhcheangaileamar é le lipéadú IF ar MEF2A i néaróin hippocampal bunscoile DIV14 gan nó le cóireáil forskolin. Is eol go gcothaíonn forskolin LTP ceimiceach agus go ngníomhaíonn sé adenylyl cyclase, rud a ardaíonn leibhéil cAMP incheallach. Thugamar faoi deara comhlárú núicléach MEF2A le miR-466f{- 3p, mar atá léirithe ag na híomhánna ionadaíocha i bhFíor 5E. Tar éis spreagadh forskolin, áfach, mhéadaigh an comhartha miR-466f{-3p{-3p) i soma agus dendrites araon, agus an comhartha MEF2A sa

núicléas laghdaithe, mar atá léirithe ag na hathruithe cómhalartacha ar dhéine na comharthaí MEF2A agus Fast Red, faoi seach, de na cealla néaróin aonair (Fíor 5E). Go hachomair, léiríonn na sonraí i bhFíoracha 5A–5E go rialaíonn miR-466f-3p slonn próitéin MEF2A go diúltach trí cheangal a dhéanamh don 30 UTR de Mef2a mRNA agus dá bharr sin a aistriúchán a bhrú faoi chois.

Ag teacht leis na torthaí thuasluaite, fuaireamar amach go raibh leibhéil hippocampal próitéin MEF2A íosrialaithe i lucha GLN tar éis oiliúint MWM, ach ní i lucha PLN (Fíor 5F). Ina theannta sin, bhí comhghaol contrártha idir leibhéil choibhneasta MEF2A i lucha GLN aonair (poncanna) agus lucha PLN (cearnóga) agus leibhéil miR-466f-3p (R=0.60, Fíor 5G). Mar sin, patrúin ilchineálacha foghlama spásúlachta aguscuimhnedéantar cumas a mhodhnú trí mhéaduithe stochastic de miR hippocampal- 466f-3p i lucha aonair agus laghduithe dá réir ar MEF2A nuair a spreagtar gníomhaíocht néarónach.

Gníomhachtú stochastic CREB hippocampal agus uas-rialú tras-trascríobh dá bharr ar an mbraisle miR- 466-669 le linn oiliúna MWM

Rinneamar imscrúdú ar na meicníochtaí trína bhféadfadh an tasc MWM a bheith uasrialaithe go stoic ag an tasc MWM. f-3p i hippocampus luch Tá trí réamhtheachtaithe miRNA ann a ionchódaíonn miR-466f-3p, agus baineann siad go léir leis an mbraisle miR-466-669 a bhaineann go sonrach le creimirí atá suite in intron 10 dá ghéin óstaigh, mSfmbt2 (Inoue et al ., 2017) (Fíor 6A). Suimiúil go leor, i gcodarsnacht le miR-466f{-3p, ní raibh aon difríocht shuntasach i leibhéil slonn mSfmbt2 idir na Grúpaí GLNandPLN(Fíor6B), rud a thugann le tuiscint go bhféadfadh an braisle miR-466-669 tras-scríbhinn ar leith a ionchódú in ionad a bheith mar chuid den bhunscríbhinn de mSfmbt2. Dá réir sin, dhearamar roinnt tacair primers chun an tras-scríbhinn phríomhúil toimhdiúil de bhraisle miR-466-669 a aithint de réir RT-qPCR. Mar a léirítear i bhfíor 6A, blúire fada PCR (móide 282 go 2,381), mar aon le sraith de bhannaí qPCR forluiteacha, eadhon A (móide 282 go 115), B (131 go 406), C ( 388 go 686), D (662 go 1,028), E ( 1,004 go 1,299), F ( 1,242 go 1,629), G ( 1,605 go 2,029), agus H ( 2,005 go 2,381), d'fhéadfaí a bhrath i hippocampus luiche, ach ní cuid I (2,7) ) (sonraí nach dtaispeántar). Tacaíonn na sonraí seo gur ionchódaigh an bhraisle miR-466-669 tras-scríbhinn fhada gar do thuairim is 2,388 bp in aghaidh an tsrutha ón gcéad réamhtheachtaí miRNA (.i. réamh-mir-466m, sainithe móide 1inFigure6A). Is díol suntais é, cosúil leis an méid a d’aimsigh muid do miR-466f{-3p, bhí meánleibhéal na tras-scríbhinne seo i hippocampus lucha GLN níos airde ná mar a bhí i lucha PLN (Fíor 6C). Mar sin, foghlaim fheabhsaithe aguscuimhnetá cumas lucha GLN mar gheall ar ghníomhachtú tras-aistrithe an bhraisle miR-466-669.

Is céim ríthábhachtach é CREB núicléach a ghníomhachtú trí fhosfarylation le linn tascanna MWM nó i bhfoirmeacha eile foghlama chun an gearrthéarmach a thiontú go fadtéarmach.cuimhne(Lisman et al., 2018; Roger- son et al., 2014). Dá bhrí sin, rinneamar imscrúdú an bhféadfadh na leibhéil éagsúla miR-466f{-3p i measc lucha aonair a rinne an tasc MWM a chomhghaolú le stádas gníomhachtúcháin CREB. Chun an smaoineamh seo a iniúchadh, ar dtús rinneamar scrúdú ar na leibhéil fosfarylation de CREB hippocampal i lucha aonair. Mar a léirítear i bhFíor 6D, feabhsaíodh gníomhachtú CREB (trí fosfarylation ag iarmhar S-133) i lucha GLN i gcomparáid le lucha PLN agus HC. Dhearbhaíomar freisin go ndearnadh miR{7}}f-3p go deimhin a chomhléiriú le pCREB i néaróin trí miRNA ISH a dhéanamh in éineacht le staining IF ar pCREB agus MAP2 i néaróin hippocampal príomhúla (Fíor S2A). Ina theannta sin, bhí comhghaolú dearfach idir na príomhleibhéil tras-scríbhinní de bhraisle miR- 466-669 agus pCREB i lucha GLN (R=0.52), cé go raibh sé comhghaolaithe go diúltach le pCREB i lucha PLN (R {- .71) (Fíor 6E). Rinneamar seiceáil le haghaidh comhghaol idir leibhéil fachtóir gníomhach eile, kinase rialaithe comharthaí phospho-extracellular (pERK), agus leibhéil tras-scríbhinne príomhúla an bhraisle miR-466-669. Fuaireamar amach gur léirigh an dá chineál lucha oilte MWM comhghaolta dearfacha idir comhartha braisle miR-466-669 agus pERK (R=0.59 agus 0.48, faoi seach; Fíor S4A), agus ní raibh aon difríocht i pERK/ tErK slonn idir an dá ghrúpa sin (Fíor S4B). Chun an tionchar a bhíonn ag gníomhachtú CREB ar thrascríobh-uasrialú na mbraislí agus na braislí seo a shoiléiriú tuilleadh, mar sin,,

ionduchtúmiR-466f-3p,weusedaspecficCREBinhibitor,666- 15 (Xie et al., 2015), i gcomhcheangal le cóireáil forskolin ar néaróin hippocampal príomhúla DIV14. Is eol go ngníomhaíonn forskolin fosfarú CREB (Malhotra et al., 2015). Fuaireamar amach gur chuir réamhchóireáil néaróin hippocampal príomhúla le 666-15 bac ar ghníomhachtú CREB spreagtha ag forskolin (Fíor 6F) agus gur laghdaigh sé na leibhéil miR-466f-3p{10}}p agus miR{-3} tras-scríbhinn (Fíoracha 6G agus 6H). Ag an am céanna, laghdaíodh leibhéil mRNA de na spriocghéinte pCREB aitheanta nurr1 agus homer1a (Bridi et al., 2017; Jensen et al., 2017) ar chóireáil 666-15 freisin (Fíor 6H). Le chéile, léiríonn Fíor 6 go spreagann gníomhachtú stochastic CREB sa hippocampus de fhodhaonra lucha inbred atá faoi thasc MWM tras-scríobh an bhraisle miR-466-669 agus, dá réir sin, ionduchtú miR-466f{23 }}p, ag cur lena gcuid foghlama spásúlachta aguscuimhnecumas feidhmiú níos fearr sa tasc.

PLÉ

Tá iniúchadh déanta againn ar an ról a d'fhéadfadh a bheith ag miRNAs maidir le hacmhainneacht éagsúil na foghlama spásúlachta a mhodhnú aguscuimhnei measc lucha inbred C57BL/6J. Molaimid go n-áireofar le gníomhachtú stochastic CREB agus uas-rialú miR-466f-3p hippocampal don fhoghlaim spásúlachta níos mó agus.cuimhnecumas foghrúpa dár lucha tástála, is dócha de bharr miR-466f-3p idirghabhála cosc ​​aistritheach ar Mef2a mRNA a ionchódaíonn ancuimhnerialtóir diúltach MEF2A. Soláthraíonn ár gcuid torthaí cás a léiríonn ról feidhmiúil agus éabhlóideach miRNA ar leith maidir le cognaíocht a rialáil trí ionduchtú stocastic d'ais CREB-pCREB-miR-466f-3p-MEF2A de réir spreagthaigh chomhshaoil.

Baineadh úsáid go forleathan as tasc MWM chun scrúdú a dhéanamh ar chumas éagsúil na foghlama spásúlachta aguscuimhnele haghaidh creimirí. Faoi ghnáthchoinníollacha, úsáideann creimirí leideanna distal chun iad féin a threorú, rud a ligeann dóibh suíomh an ardáin i bhfolach sa tasc a fhoghlaim agus a mheabhrú. Thaispeáin an chuid is mó dár lucha C57BL/6J inbred (62 faoin gcéad) gnáthphatrún de fhoighne éalaithe, ag aimsiú an ardáin laistigh de 30 s i ndiaidh seisiúin 3ú-6(Fíor 1A, GLN). I gcodarsnacht leis sin, níor fhoghlaim grúpa lucha (38 faoin gcéad) an tasc fiú faoin 6ú seisiún ( PLN ). Go háirithe, tá dhá thástáil aitheantais eile curtha faoi na lucha againn freisin. Ba é an chéad cheann an tástáil aitheantais oibiachta núíosaigh (NOR), ar triail aonair í atá bunaithe ar thaiscéalaíocht dhúchasach gan atreisiú nó strus chun iompar a spreagadh (Leger et al., 2{013). Is bocht an comhghaol idir na tascanna NOR agus MWM i dtéarmaí feidhmíochta luiche (R {{1{{20}}}.13), rud atá cosúil leis an gcomhghaol idir léirithe NOR agus na leibhéil slonn hippocampal de miR-466f-3p (R=0.01; sonraí gan taispeáint). Níor léirigh an tástáil NOR freisin aon difríochtaí san innéacs idirdhealaithe idir na grúpaí MWM GLN agus PLN (0.36 ± 0.25 i gcoinne 0.29 ± 0.18; Fíor S1B). An fhoghlaim spásúil eile aguscuimhne-spleách ar an tasc atá curtha i bhfeidhm againn ná an gcathair ghríobháin Barnes (BM), atá cosúil leis an MWM. Tá sé bunaithe ar an mbonn tuisceana gur cheart go bhfoghlaimeodh creimirí a chuirtear isteach i dtimpeallacht ghéarchúiseach agus go gcuimhneoidís ar shuíomh an bhosca éalaithe atá suite faoi dhromchla an ardáin. Mar a léirítear i bhFíor S1C, tá sé faighte amach againn go bhfuil comhghaol dearfach freisin idir feidhmíochtaí luiche sna trialacha taiscéalaithe BM agus leibhéil slonn hippocampal miR-466f-3p. Mar sin, ionduchtú na hais CREB-pCREB-miR-466f-3p-MEF2A sa hippocampus le linn foghlama aguscuimhnetá an fhoirmiú ag brath ar chomhthéacs spásúil.