Minicíocht Optogenetic Scrambling Ascaluithe Hippocampal Theta Dissociates Aisghabháil Cuimhne Oibre Ó Chóid Spásúlachta Hippocampal Cuid 3

Mar thoradh ar luascadh optogenetic néaróin MS, déantar sioncrónú neamhfhiseolaíochtheta

Is ionadh é gur tháinig laghdú ar fheidhmíocht spreagthaí optogenetic 8 Hz a bhaineann le luascadh ascaluithe téite nuair a cuireadh i bhfeidhm iad le linn ionchódú nó aisghabháil cuimhne eipeasóideach sa tasc NPOR, chomh maith le haisghabháil cuimhne oibre spásúil sa DNMTStask. Chun tuiscint bhreise a fháil ar na héifeachtaí a bhaineann le luascadh téite ar hippocampalfiseolaíocht, rinneamar anailís ar ghlasáil chéim an ascalaithe téite roimh agus le linn spreagthaí optogenetic 8 Hz (Fíor Fhorlíontach 7a) agus fuaireamar amach gur tháinig méadú ar shioncrónú céime trasna tréimhsí spreagtha mar thoradh ar spreagadh dá leithéid (Fíor Forlíontach 7b). Ina theannta sin, rinneamar anailís ar thras-chomhghaolú ascaluithe téite trasna droma CA1 (~ achar 1 mm idir leictreoidí feadh na haise septotemporal (Fíor Fhorlíontach. 7c) agus fuaireamar amach go raibh luascadh rithimí téite ag 8 Hz ag méadú le tras-chomhghaolú méadaithe idir an dá leictreoid sin. Forlíontach Fíor 7d).

Is í an ghéineolaíocht an eolaíocht a dhéanann staidéar ar oidhreacht ghéiniteach agus ar éagsúlacht, agus is gné imní mhór í an chuimhne. Mar sin, cad a chaithfidh géineolaíocht a dhéanamh leis an gcuimhne? Scrúdóidh an t-alt seo saincheisteanna a bhaineann leis an gcuimhne ó pheirspictíocht ghéiniteach.

Ar an gcéad dul síos, tá a fhios againn go bhfuil géinte géiniteacha mar bhunús d'fhorbairt fhisiciúil agus intleachtúil an duine, agus cibé an bhfuil na géinte seo níos fearr beidh tionchar aige ar chuimhne daoine. Léiríonn an taighde is déanaí go bhfuil tionchar ag fachtóirí géiniteacha ar IQ agus cuimhne daoine. Léiríonn taighde go bhfuil ról ríthábhachtach ag géinte géiniteacha san fhaisnéis agus sa chuimhne. Dá bhrí sin, rugadh roinnt daoine le cuimhní cinn níos láidre, agus caithfidh daoine eile oibriú go crua agus oiliúint a dhéanamh chun a gcuimhne a fheabhsú.

Ar an dara dul síos, is fachtóirí tábhachtacha iad fachtóirí comhshaoil ​​freisin maidir le forbairt cuimhne. Ní hamháin go dteastaíonn tacaíocht ó ghéinte géiniteacha uainn ach ní mór dúinn freisin ár gcuimhne a fheabhsú trí oiliúint eolaíoch agus nósanna maireachtála maithe. Mar shampla, is féidir linn a éileamh ar a fheidhmiú gach lá, ag fáil codlata go leor, ag leanúint prionsabail meaitseála béilí, etc, ar féidir leo cabhrú le feabhas a chur ar ár bhfeidhm inchinne agus cuimhne.

Ar deireadh, gnáthdhaoine, ná cuir ró-bhéim ar thionchar fachtóirí géiniteacha ar fhorbairt cuimhne. Toisc nach bhfuil fachtóirí géiniteacha absalóideach, féadann cuimhne agus faisnéis daoine iad féin a fheabhsú fós trína n-iarrachtaí agus a n-oiliúint a fheabhsú. Ba cheart dúinn dearcadh foghlama dearfach agus leanúnach a choinneáil i gcónaí, agus ár n-acmhainneacht chuimhne a iniúchadh agus a fhorbairt i gcónaí. Creidim gur ar an mbealach seo amháin is féidir linn a bheith níos cliste agus tuiscint níos fearr a bheith againn ar éachtaí. Go hachomair, tá an gaol idir géineolaíocht agus cuimhne an-dlúth, ach níor cheart dúinn an iomarca béime a chur ar fhachtóirí géiniteacha, ach ba cheart dúinn ár gcuimhne agus ár n-éirim a fheabhsú i gcónaí trí fhéinfheabhsú agus oiliúint.

Is féidir a fheiceáil go gcaithfimid ár gcuimhne a fheabhsú. Is féidir le Cistanche deserticola feabhas suntasach a chur ar chuimhne toisc gur ábhar íocshláinte traidisiúnta Síneach é Cistanche deserticola le go leor éifeachtaí uathúla, agus is é ceann acu cuimhne a fheabhsú. Tagann éifeachtúlacht na mionfheoil ó na comhábhair ghníomhacha éagsúla atá ann, lena n-áirítear aigéad, polaisiúicrídí, flavonoids, etc. Is féidir leis na comhábhair seo sláinte inchinn a chur chun cinn ar bhealaí éagsúla.

Cliceáil a fhios 10 bealaí chun cuimhne a fheabhsú

Plé

Within the septohippocampal system, the exact causal relationships between (1) MS activity, (2) hippocampal oscillations, (3) hippocampal neuron activity, and (4) behavior, including memory, remain an active area of research. In particular, whether and how the MS supports encoding of place and time in the hippocampus, as well as its specific contribution to memory function, remain unclear. Here, we leveraged more recent techniques that allowed us to record >1000 néaróin agus iad ag déanamh spreagadh optogenetic néaróin MS le fo-réiteach chun rithimí téite a rialú agus a ról i bhfiseolaíocht agus cuimhne hippocampal a mheasúnú. Rud atá tábhachtach, ag baint úsáide as excitatoryopsin agus ceachtar scrofa nó spreagthaí 8 Hz, bhíomar in ann deireadh a chur go comhsheasmhach agus go láidir téite hippocampal nó luas a chur leis, faoi seach.

I gcomparáid le cosc ​​MS ag baint úsáide as ceachtar comhdhúile coisctheach opsin orpharmacological (m.sh. muscimol), cuireann ár gcur chuige ar chumas comparáid laistigh-ábhar idir dhá stát freasúra (paced vs abolishedtheta) agus a chothabháil leibhéil gníomhaíochta i MS-PV cealla. Chuireamar le chéile tasc rian líneach a bhí le fios, mar aon le cur chuige teoiriciúil faisnéise, a thug deis dúinn cóid hippocampal spásúla agus ama a dhícheangal. Maolaíonn an modh seo an gá atá le tairseacha treallacha, rud a chumasaíonn cur chuige caighdeánaithe maidir le hanailís íomháithe cailciam. Cé gur léirigh cuid mhór de néaróin phirimideacha CA1 meascán de chóid spásúlachta, dhíríomar ár n-anailísí ar néaróin a bhí dírithe go sonrach ar áit, ar am nó ar an bhfad a taistealaíodh.

Cé go bhfuil imscrúdú cuimsitheach déanta ar chódú spásúlachta in CA1, tá níos mó suime i gcóid ama agus cianda le déanaí. Baineadh cóid ama28,35–37 agus achair37 amach trí leideanna físspásúla a chlampáil nó baineadh iad go hanailíseach ag baint úsáide as samhlacha líneacha ginearálaithe i bparaidímí réaltachta fíorúla26,27,38. Anseo, molaimid cur chuige chun cóid spásúla, ama agus achair a dhícheangal trí úsáid a bhaint as cur chuige teoiriciúil faisnéise a chumasaíonn, in éineacht lenár dtasc cuedalternation, anailís a dhéanamh ar chóid ilphléacsacha spásúlachta san fhíorshaol in ainmhithe a ghluaiseann go saor. Ionchódaíonn líon mór néaróin pirimide CA1 faisnéis ilphléacsáilte maidir le suíomh, fad, agus am mar a tuairiscíodh roimhe seo26,27,38 i dteannta le féinchomharthaí mar luasghéarú, luas, agus treoshuíomh60.

Fuaireamar amach gur chuir scramadh minicíochta agus spreagthaigh optogenetic 8 Hz deireadh go mór le rithimí téite, nó gur luascadh iad, faoi seach, agus gur tháinig laghdú ar ghníomhaíocht fhoriomlán i bhfodhaonra de chealla pirimideacha CA1 gan athruithe suntasacha a dhéanamh ar ghníomhaíocht cille áite, cosúil le tuarascálacha roimhe seo ag baint úsáide as cosc ​​​​cógaseolaíochta36, 46,47 nó luascadh optogenetic9,48 MS nó ionchur seipteach chuig an hippocampus. Toisc go bhfuil a fhios gurb iad néaróin MS an príomh-thiománaí d’ascaluithe hippocampal, bhíomar ag súil go mbainfeadh spreagadh MS le ham nó cianghníomhaíocht cille i gcoinníollacha ina raibh rithimí téite laghdaithe, ach níor tharla aon athruithe nuair a cuireadh deireadh le téite nó nuair a luascadh an téite. Ina theannta sin, níor tháinig athrú ar cháilíocht na gcód spáis a tuairiscíodh roimhe seo9 mar gheall ar luascadh ascaluithe hippocampal go 8 Hz agus níor athraigh sé cóid ama mar a breathnaíodh inár bparaidím iompraíochta.

Cé gur tuairiscíodh go bhféadfadh cealla ama (ach ní áit) a bheith ag brath go díreach ar ionchuir na cortex intreach intreach (MEC)61, tugann fianaise thurgnamhach le déanaí le fios nach n-eascraíonn loit MEC aon athruithe ar fhiseolaíocht na gcealla ama hippocampal62. Go háirithe, fuarthas amach in imscrúdú níos déanaí nár chuir luascadh optogenetic an MS isteach ar chóid spásúlachta na gcealla eangaí san entorhinalcortex63, rud a thugann le tuiscint freisin nach bhfuil baint dhíreach ag gníomhaíocht MS le cóid spásúlachta laistigh den fhoirmiú hippocampal. In éineacht lenár dtorthaí, léiríonn sé seo go bhféadfadh cóid ama a bheith mar thoradh ar ríomhanna MS-spleách laistigh den entorhinalcortex63 (1) nó a bheith ginte go bunúsach laistigh den hippocampusitself (2).

Cé gur aimsigh staidéir luatha go raibh ról ríthábhachtach ag an BS maidir le cealla ama a chothabháil agus tacú le cuimhne oibre36, léiríonn fianaise thurgnamhach le déanaí go bhféadfadh rannchuidiú beacht na gcealla ama le feidhmíocht cuimhne oibre a bheith níos lú ná mar a ceapadh cheana62. Ós rud é gur dócha go gcoimeádann néaróin MS-PV leibhéil ghníomhaíochta suntasacha le linn spreagadh optogenetic scrambling minicíochta (i gcodarsnacht le cur chuige coiscthe), tacaíonn ár dtorthaí go láidir leis an ról atá ag gníomhaíocht seipteach a bhfuil amú beacht léi maidir le tacú le cuimhne oibre, arna luaithiú roimhe seo. Cé gur thugamar faoi deara feidhmíocht cuimhne laghdaithe agus spreagadh optogenetic á úsáid le linn aisghabhála, níor bhain spreagadh le linn chéim ionchódaithe na dtascanna DNMTS le cuimhne laghdaithe sa tasc DNMTS. Mar thoradh ar luascadh na dtaistealaithe ag 8 Hz le linn chéim ionchódaithe nó aisghabhála an taisc NOPR bhí aisghabháil cuimhne lagaithe. Nochtann ár n-anailísí leictreifiseolaíocha freisin go raibh spreagadh dá leithéid ina chúis le réigiúin i bhfad i gcéin dendorsal CA1 a thréigean ag an gcéim chéanna, le glasáil neamh-fhiseolaíoch sa chéim. Cé nach ndearnamar imscrúdú díreach ar an ngaolmhaireacht chúise idir athruithe céime agus feidhmíocht chuimhne, fuarthas amach freisin go raibh baint ag spiketiming, agus réamhtheachtaí céime le feidhm athraithe cuimhne oibre in ainneoin códú na háite a fhágáil slán64. Ina theannta sin, léiríodh roimhe seo gur réamhaithriseoir feidhmíochta cuimhne é glasáil chéimnithe na néaróin phirimideacha chuig an t-ascaluithe65.

Go háirithe, teorannú amháin ar ár gcur chuige maidir le hairíonna cianchoigeartaithe temporaland a bhunú ná go bhfuil gá le ceithre huaire níos mó samplála ná rian líneach rialta a mhéadaíonn an seans go ndéanfar fóta-thuascadh agus coinníollacha spreagtha á gcur leis an amlíne turgnamhach. Cé go bhfuaireamar amach nár chuir spreagthaí optogenetic isteach ar chóid spásúlachta laistigh den seisiún céanna, d’fhéadfadh crua-earraí íomháithe níos deireanaí a chuimsíonn braiteoirí le híogaireacht mhéadaithe cuidiú le cosc ​​a chur ar fhótableaching agus seisiúin taifeadta níos faide a cheadú, agus mar sin sampláil a dhéanamh ar chealla ama agus chianchill mar aon le spreagthaigh. Fuaireamar amach freisin gur beag an líon néaróin a dhéanann ionchódú go suntasach agus go sonrach ach ar athróg amháin i gcomparáid le líon na néaróin chomhchuingeacha, rud a fhágann go bhfuil ceanglais samplála i bhfad níos airde do na néaróin an-sonracha seo.

Cuirimid fianaise thurgnamhach ar fáil nach n-athraíonn ionramháil MS luas an innill agus, os a choinne sin, go n-ordaíonn luas innill ghluaiste minicíocht téite. Cé gur caomhnaíodh na cóid áite agus ama le linn ár spreagthaigh MS, rinneadh cuid (~6%) de na cealla a mhodhnú go díreach agus d’fhéadfaidís cuntas a thabhairt ar lagú cuimhne a breathnaíodh inár dtástálacha iompraíochta. Tuairiscíodh roimhe seo go bhfuil idirnéaróin PV sa hippocampus mar chuid de mhicrichiorcad riachtanach maidir le comhdhlúthú cuimhne a rialáil66,67, agus d'fhéadfadh ár n-ionramhálacha optogenetic a bheith bainteach le cuid de na cealla seo a chur ina dtost. Ina theannta sin, cé nár thugamar faoi deara athruithe i mbandaí minicíochta seachas téite, ní féidir linn a eisiamh go bhféadfaí uainiú spíc pirimidile néaróin CA1 a athrú go mór nuair a scramblingtheta ascaluithe, cé gur léiríodh nach mbeadh méadú ar ghníomhaíocht hippocampal mar thoradh ar spreagadh 8 Hz18, rud a d’fhéadfadh na héifeachtaí difreálaigh a mhíniú. na patrúin spreagtha sin ar fheidhmíocht cuimhne oibre. Is dócha go raibh na laigí cuimhne a breathnaíodh againn neamhcholinergic: ar an gcéad dul síos, inár dturgnaimh imdhíon-hiisteolaíocha, ní raibh aon léiriú ar ChrimsonR i néaróin ChaT an MS. Ar an dara dul síos, ní raibh baint ag ár spreagthaigh optogenetic le hathruithe ar ripples hippocampal, agus léirigh tuairiscí roimhe seo gur spreagadh na cromáin. Tá baint ag néaróin ChaT le minicíocht laghdaithe ripple45,57. Ní dócha go n-aistrítear ChrimsonR ar néaróin MS VGLUT2 freisin ós rud é go bhfuil baint ag gníomhachtú na néaróin seo le méadú díreach ar ghníomhaíocht innill ghluaiste 68, rud nár thugamar faoi deara.

Cé go bhféadfadh socrú beacht ama na spící pirimideacha CA1 a mhíniú, go páirteach ar a laghad, éifeachtaí spreagtha MS ar an gcuimhne, ba cheart meicníochtaí eile a chur san áireamh. Go háirithe, i dteannta leis an hippocampus agus an cortex entorhinal, cuireann MS PVneurons isteach sa cortex aissplenial3 agus d’fhéadfadh sé a bheith freagrach as cuid de na lagú cuimhne a breathnaíodh anseo.

Go hachomair, ag baint úsáide as íomháú cailciam, optogenetics, agus leictreifiseolaíocht, fuaireamar amach gur féidir rithimí téite a luasú nó deireadh a chur le spreagadh an MS. Lagaíodh spreagadh dá leithéid eipeasóideach chomh maith le haisghabháil cuimhne oibre. Bhí na héifeachtaí seo neamhcholinergic agus níor chuir siad isteach ar ghníomhaíocht ripple hippocampal. Ar deireadh, cé gur fhreagair codán beag de néaróin hippocampal go díreach do spreagadh optogenetic an MS, níor chuir ionramhálacha ascaluithe téite isteach ar chealla áit, am agus achair. Le chéile tugann na torthaí seo le tuiscint, cé go bhfuil ról ríthábhachtach ag ionchur MS chuig an hippocampus i gcuimhne, go bhféadfadh sé nach mbeadh cóid ilphléacsáilte i néaróin pirimideacha CA1 ina bhfoshraith dhíreach le haghaidh feidhmeanna den sórt sin.

Modhanna

Ainmhithe

D'fhormheas Coiste um Chúram Ainmhithe Ollscoil McGill agus Comhairle Cheanada um Chúram Ainmhithe (prótacal 2015-7650) gach nós imeachta. Iomlán n=41 fireannach (n=20) agus baineann (n=21) 8–16 seachtaine d’aois,B6;129P2 lucha PV-Cre (Jackson Laboratory, RRID: IMSR{{ 10}}JAX:017320) a úsáid sa staidéar seo. n=5 baineadh úsáid as lucha chun optogenetics a chomhcheangal le híomháú cailciam; n=3 ionchlannaíodh lucha le haghaidh íomháú cailciam, optogenetics, agus rialuithe leictreifiseolaíocha; n=4 úsáideadh lucha i staidéir leictreifiseolaíocha; n=29 aistríodh lucha agus ionchlannaíodh iad le haghaidh measúnachtaí iompraíochta. Coimeádadh lucha ina n-aonar ar 12-h timthriall éadrom/dorcha ag 22 céim agus taise 40% le libitum bia agus uisce. Rinneadh gach turgnamh le linn na coda solais den timthriall solais/dorcha.

Veicteoirí víreasacha a bhaineann le adeno

Baineadh úsáid as víreas adeno-ghaolmhar AAV5.CamKII.GCaMP6f.WPRE.SV40 (Addgene # 100834, a fuarthas ó Ollscoil Pennsylvania Vector Core) i ngach turgnamh íomháithe cailciam. Víreas adeno-ghaolmhar (AAV) de séiritíopa dj (capsid hibrideach cruthaithe as ocht gcinn de AAVserotypes éagsúla) Fuarthas AAVdj-hSyn-ChrimsonR-tdTomato ón Vector Core Áis ag Ollscoil Sláinte agus Eolaíochta Oregon i Portland, Oregon. Cé gur géine coimeád tí é, níor thugamar faoi deara aistriú i gcealla cholinergic (féach "Torthaí" agus Fíor 2b-e). Baineadh úsáid as tógáil eYFP gan an t-ord ChrimsonR mar acontrol (ar a dtugtar rialú YFP sa lámhscríbhinn seo).

Nósanna imeachta máinliachta

Rinneadh ainéistéitic ar lucha le isoflurane (ionduchtú 5%, 0.5–1 % cothabhála) agus cuireadh i bhfráma steiréatachtach (David Kopf Instruments). Coinníodh teocht an choirp le ceap téimh, hiodráitíodh súile le glóthach (Optixcare). , agus Carprofen (10 ml/kg) go subcutaneously. Glanadh an cloigeann go hiomlán de gach fíochán nascach agus rinneadh craniotomies beaga ag baint úsáide as druil fiacla le haghaidh instealladh nó ionchlannú ina dhiaidh sin.

Instealladh víreasach. Rinneadh gach instealladh víreasach ag baint úsáide as pípéad gloine ceangailte le instealladh Nanoject III (Drummond). Seachadadh 500 nl AAVdjhSyn-ChrimsonR-tdTomato (nó rialú eYFP) isteach sa MS ag ráta 1 nL/s, ag na comhordanáidí seo a leanas bunaithe ar atlas steiréatacsach luiche tagartha69 (achar ó Bregma i mm): anteroposterior (AP) 0.85, meánthaobhach (ML) 0, dorsoventral (DV) -4.50 ag baint úsáide as uillinn 5 céim san eitleán ML. Tar éis máinliachta, rinneadh monatóireacht ar ainmhithe go dtí go n-aisghabhadh iad.

Ionchlannán snáthoptaice. Dhá sheachtain tar éis an insteallta, rinneadh ainéistéisiú ar lucha le haghaidh ionchlannú tar éis an nós imeachta máinliachta céanna. Rinneadh snáthoptaice snáithíní trastomhas A200 μm le ferrule ceirmeach (Thorlabs) a ionchlannú ag na comhordanáidí céanna. Daingníodh ionchlannáin in placeusing C&B-Metabond® (Patterson fiaclóireachta). Cuireadh snas ingne dubh ar an stroighin fiaclóireachta chun astú solais a chosc le linn spreagadh optogenetic.

Ionchlannáin leictreoid. Íslíodh sraith de 7 micrileictreoidí tungstain (~ 1 MΩimpedance) sa droma CA1 a chuimsíonn trí stratumpyramidale (pyr), strataim radiatum (rad), agus strataim lacunosummoleculare (lm). Bhí scriúnna a cuireadh sa chnámh os cionn an cortex agus an cerebellum tosaigh mar thalamh agus mar thagairt, faoi seach. Tar éis socrúchán leictreoid, talaimh agus tagartha, cuireadh stroighin fiaclóireachta i bhfeidhm chun an t-ionchlannán a dhaingniú go buan don cloigeann.

Ionchlannú le haghaidh íomháithe cailciam. Instealladh againn an AAV5.CamKII.GCaMP6fvirus (200 nL ag 1 nl s−1) in hippocampal CA1 ag baint úsáide as na comhordanáidí seo a leanas: anteroposterior (AP) − 1.86 mm ó bregma, meánthaobhach (ML) 1.5 mm, dorsoventral (DV) 1.5 mm. Coicís tar éis an insteallta, rinneadh ainéistéisiú ar lucha le hiseagflurane agus glanadh an cloigeann. A<2 mm diameter craniotomy was performed in the skull above the injection site. An anchor screw was placed on the posterior plate above the cerebellum. The dura was removed, and the portion of the cortex above the injection site was aspirated using a vacuum pump until the corpus callosum was visible. These fiber bundles were then gently aspirated without applying pressure on the underlying hippocampus, and a 1.8 mm diameter gradient index (GRIN; Edmund Optics) lens was lowered at the following coordinates: AP − 1.86 mm from bregma, ML 1.5 mm, DV 1.2 mm. The GRIN lens was permanently attached to the skull using C&B-Metabond (Patterson Dental), and Kwik-Sil (World Precision Instruments) silicone adhesive was placed on the GRIN to protect it. Four weeks later, the silicone cap was removed and CA1 was imaged using a miniscope mounted with an aluminum base plate while mice were under light anesthesia (<0.5% isoflurane) to allow the visualization of cell activity. When a satisfying field of view was found (large neuronal assembly, visible landmarks), the base plate was cemented above the GRIN lens, the mini scope was removed, and a plastic cap was placed on the base plate to protect the GRIN lens.

Íomháú cailciam comhuaineach agus taifeadtaí leictreifiseolaíocha. Chun éifeachtaí ionchlannáin GRIN ar thetaas hippocampal a rialú chomh maith le traschaint idir mion-scóip agus soilse excitations optogenetic, cheangail muid micrea-leictreoidí tungstain le lionsaí GRIN. Chuige sin, chuireamar lionsaí GRIN go cothrománach faoi mhicreascóp ísealmhéadúcháin i dtimpeallacht saor ó dheannach. Micrileictreamhaighnéad tungstain a chuirtear go réidh ar imeall barr an lionsa GRIN ag baint úsáide as micrea-manipulator. D’úsáideamar trastomhas aithnid an lionsa GRIN mar aonad tagartha chun protrusion inmhianaithe an leictreoid (~50 µm a mheas, arna mheasúnú tuilleadh go digiteach tar éis micreaghótagraf den ullmhúchán a thógáil) ag ár gcomhordanáidí ionchlannú pleanáilte. Taisceadh méideanna beaga (~50 µL) superglue ar imeall barr an lionsa GRIN leis an leictreoid i bhfeidhm agus fágadh é a thriomú ar feadh ~10 nóiméad, sula gcuirfí an chéad sraith eile gliú i bhfeidhm. Baineadh úsáid as cúig shraith tanaí chun an leictreoid a bhí ceangailte leis an lionsa GRIN a choinneáil. Tar éis na cóimeálacha GRIN-leictreoid seo a inchur ag baint úsáide as an bprótacal a bhfuil cur síos air thuas, lúbadh na sreanga sáite go réidh agus i bhfolach faoi chaipín cosanta (1–1.5 cm ar airde) a fuarthas ón bpiorra de phípéad súchán láimhe in ionad Kwik-Sil.

Nósanna imeachta iompraíochta in vivo

Nós. Láimhseáladh lucha go réidh ar feadh ~ 5 nóim thar aon seachtain amháin, le gnáthú forásach ar an nós imeachta plugála (snáithín snáthoptaice, miniscope, agus réamh-aimplithe leictrifiseolaíocha). Ansin cuireadh ainmhithe ar uisce (rochtain 2 h in aghaidh an lae).

Taifid miniscope. Cuireadh mionscóip (V3) le chéile ag baint úsáide as treoracha foinse oscailte (miniscope.org). Fuarthas sonraí íomháithe trí úsáid a bhaint as braiteoir íomháithe CMOS (Aptina, MT9V032) agus ilphléacsáladh trí chábla comhaiseach éadrom. Fuarthas sonraí trí úsáid a bhaint as bosca fála sonraí (DAQ) ceangailte trí rialaitheoir óstaigh USB (Cypress, CYUSB3013). Taifeadadh iompar ainmhithe trí úsáid a bhaint as ceamara gréasáin de ghrád tomhaltóra (Logitech) a bhí suite os cionn an chomhshaoil. Taifeadadh cailciam agus sonraí iompraíochta ag baint úsáide as miniscope.org, foinse bogearraí saincheaptha DAQ. Fuair ​​an DAQ sruthanna íomháithe iompraíochta agus ceallacha ag 30 Hz ag an am céanna mar chomhaid neamh-chomhbhrúite.avi de 1000 fráma le haghaidh seisiúin taifeadta 15-nóiméad, mar aon le stampaí ama comhfhreagracha chun ailíniú ama beacht a dhéanamh ar shonraí íomháithe iompraíochta agus cailciam.

Taifid leictreifiseolaíocha in vivo. Tar éis seachtain amháin de théarnamh iarmháinliachta agus seachtain amháin de nós imeachta go dtí an socrú ceangailteach, taifeadadh LFP ó lucha ionchlannaithe. Rinneadh na comharthaí taifeadta ar fad ó leictreoidí ionchlannaithe a aimpliú ag an réamh-aimplitheoir tether sular digitíodh iad ag 22 kHz ag baint úsáide as córas taifeadta digiteach (Neuralynx, SAM). Sábháladh taifeadtaí de gach comhartha cainéil mar aon le fístaifeadtaí agus comharthaí TTL ón Laser Diode le haghaidh anailíse ina dhiaidh sin.

Spreagadh optogenetic. Seachadadh spreagadh léasair trí chorda snáthoptaice afiber (trastomhas 200 μm) ag baint úsáide as foinse solais snáithín dé-óid léasair (Lionsaí Doric). Rinneadh déine solais a chalabrú agus an tonnfhad a cheartú ag baint úsáide as Beart an Mhéadair Chumhachta leis an PM100D Consoleand S130C Slim Photodiode Sensorlight (Thorlabs). Rinneadh gach spreagadh luascadh (lena n-áirítear 8 Hz) ag baint úsáide as bíoga cearnacha 5 ms. Chun spreagadh solais scrofa a chur i bhfeidhm, d'úsáideamar microcontroller Arduino chun comhartha ascalaithe torainn bán a ghiniúint a chuirtear go díreach isteach i ionchur analógach an tiománaí dé-óid léasair. Chun spreagadh minicíochta a roghnaíodh go randamach a dhéanamh, d'úsáideamar prótacal caighdeánach 5 s ON, 5 s OFF, ach le haghaidh gach aga spreagtha, d'úsáideamar microcontroller Arduino go randamach chun minicíocht spreagtha a roghnú sa bhanna téite. Agus spreagadh optogenetic á chur i bhfeidhm le linn iompair, feistíodh feadán crapadh teasa píosa scaoilte timpeall an acomhal idir an patchcord agus an ionchlannán ferrule luiche chun teorainn a chur le hastú solais infheicthe. Cuirtear déine solais in iúl mar chumhacht ainmniúil, arna thomhas ag barr an chomhthionóil chorda ionchlannáin snáthoptaice (roimh socrú máinliachta), agus ceartaithe don tonnfhad cuí.

Measúnachtaí iompraíochta

Rian líneach ton seicheamhach. Bhí uisce-sceidealaithe ag lucha agus ní raibh siad in ann rochtain a fháil ar uisce ach ar feadh 2 uair in aghaidh an lae ó 6-8 pm Chun cóid spáis, ama agus achair a dhícheangal, tógaimid rian líneach 134 cm ar fad ag baint úsáide as brící mheán liath Lego®, a cheadaíonn modhnuithe agus cur i bhfeidhm éasca gan an. gá a mhodhnú go buan ar an struchtúr an gcathair ghríobháin. Cuireadh braiteoirí pirealeictreacha ag gach ceann den rian líneach agus ceanglaíodh iad le micrea-rialtóir Arduino. Spreag gach braite ton nua in ord, rud a léirigh an dul chun cinn i dtreo seachadadh. Úsáideadh agus seachadadh na toin seo a leanas ag baint úsáide as cainteoir apiezo: 1 s bíp ag 2000 Hz, bíp 250 ms ag 3000 Hz, agus ton leanúnach ag 4000 Hz. Nuair a tarraingíodh an ton leanúnach deireanach, seachadadh luach saothair (10% siúcrós in uisce) ag tús an rian líneach i gcaipín feadáin Falcon 15 mL. Measadh gur earráidí iad na hathruithe a tháinig ar an treo sular cuireadh tús leis an gcéad ton eile agus níor spreag siad seachadadh luaíochta. Rinneadh feidhmíocht a thomhas mar líon na dtrialacha cearta (gan aon earráid) roinnte ar líon na dtrialacha iomlána.

Aithint áite réad nua. Ar an gcéad lá, bhí cead ag lucha páirc oscailte liath dorcha 45 × 45 cm a iniúchadh go saor in aisce ina raibh radharcanna (grátaí móra bána cothrománacha agus ingearacha) ar a ballaí ar feadh 10 nóiméad. Ar an dara lá, cuireadh dhá rud chomhionanna (bonn láimhe cabhrach) i láthair ar feadh 10 nóiméad. Ar an tríú lá, ceadaíodh do lucha an pháirc oscailte chéanna a iniúchadh agus díláithríodh suíomh ceann amháin den dá rud. Chun rialú a dhéanamh le haghaidh tosaíochtaí spásúla féideartha, rinneadh randamach idir an suíomh tosaigh, chomh maith le suíomh díláithrithe rudaí. Tá ordú tástála randamach curtha i leith lucha a coinníodh mar an gcéanna le linn na dtrí lá tástála. Taifeadadh an t-iompar le ceamara físe (Logitech) agus rinneadh anailís air as líne. Rinneadh anailís iompraíochta dall ar an ngéinitíopa agus cóireáil. Sainmhíníodh taiscéalaíochtaí réad mar epochs ina bhfuil srón lucha laistigh de 1 cm de rud. Ríomhadh RI mar seo a leanas:

Neamhmheaitseáil uathoibrithe le tasc samplach. Rinneadh sceidealú uisce ar lucha agus cuireadh oiliúint orthu i gcathair ghríobháin T leanúnach chun tasc samplach neamh-mheaitseála moillithe. Go hachomair, roinneadh gach triail ina dhá chéim: sampláil agus tástáil. Sa chéim shamplach, cuireadh bac ar lámh amháin agus b'éigean do lucha an lámh eile a iniúchadh, áit a bhfuair siad luach saothair 50 µL de 10% uisce shiúcrós. Tar éis an chéim shamplach a chríochnú, bhí lucha faoi réir moille (10 s) san urrann tosaigh. Ansin, le linn na céime tástála, d’fhéadfaí an dá lámh a iniúchadh, ach níor bhaoiteadh ach an lámh eile (gan iniúchadh) ionas go raibh ar lucha láithreacha malartacha idir na céimeanna samplacha agus tástála. Cuireadh lucha faoi 10 dtrialacha (tástáil samplach +) in aghaidh an lae, ar feadh 10 lá as a chéile, agus ríomhadh an ráta ratha laethúil mar líon na dtrialacha cearta roinnte ar líon iomlán na dtrialacha.

Anailísí histolaíochta iarbháis

Tar éis an tástáil iompraíochta a chríochnú, rinneadh ainéistéitic do lucha go domhain le meascán de ketamine / xylazine / acpromazine (100, 16, 3 mg / kg, faoi seach, instealladh intraperitoneal) agus perfused transcardially le 4% paraformaldehyde (PFA) i PBS. Baineadh brains amach agus postsocraíodh iad thar oíche i PFA ag 4 céim agus ina dhiaidh sin nite i PBS ar feadh 24 h breise ag 4 chéim. Rinneadh crióchosaint ar brains agus ar ailt i dtuaslagán 30% glycol eitiléine, 30% gliocról, agus 40% PBS go dtí go n-úsáidtear é. Roinneadh gach inchinn ag 50 µm ag baint úsáide as vibratome: bailíodh gach cuid go seicheamhach i 4 feadáin 1.5 ml éagsúla chun anailísí éagsúla a cheadú (suíomh leictreoid, immunohistochemistry).

Imdhíon-hiisteolaíocht. Ag baint úsáide as feadán amháin de chodanna inchinn bailithe (sampláil 25%) le haghaidh gach anailíse, nitear na hailt ar feadh 3 × 5 nóiméad i PBS chun an tuaslagán cryoprotective a bhaint. Goradh codanna thar oíche le PGT (0.45% Geilitín agus 0.25% Triton i PBS) ag 4 chéim .Ar aghaidh, goradh slisní le príomhantasubstaintí: ceachtar 1:200 gabhaanti-choilín-aicéitil -aistriú ó Millipore nó 1:500 luch frith-PVmonoclonal IgG1 ó Sigma-Aldrich i PGT ag teocht an tseomra ar feadh 48 h nó 2 h faoi seach. Tar éis nite 10, 20, agus 30 min, goraíodh na hailt ansin le antasubstaintí tánaisteacha [1:2000 asal frith-ghobhar i dteannta le Alexa 488 nó frith-luch gabhar 1:500 IgG1 i dteannta le Alexa 488 (Teicneolaíochtaí Beatha)] i PGT do 45 nóim. Tar éis níocháin 10,20, agus 30 nóim i PBS, cuireadh codanna ansin ar shleamhnáin ghloine agus clúdaíodh iad go buan le meán gléasta Fluoromount ina raibh DAPI. Ní raibh san áireamh sa staidéar seo ach lucha a raibh socrúchán ionchlannán deimhnithe go hineolaíoch acu. Maidir le GRINlenses, b'éigean dromchla an lionsa a bheith<100 µm above stratum pyramidale, and GCaMP6f expression was validated using fluorescence microscopy. Electrophysiological implants had to include at least one microelectrode in CA1 stratum radiatum or stratum pyramidale. Finally, the tips of fiber optics had to be within 100 µm of the MS region, and proper construct expression was assessed using fluorescence microscopy.

Anailís sonraí

Except for analyses of SWRs and the explicit impact of locomotion on physiological recordings, electrophysiological and calcium imaging analyses were performed only on periods of locomotion (>2 cm s−1 in the open field; >5 cm s−1 ar an rian líneach).

Rianú uathoibrithe ar iompar. Chun faisnéis a bhaint as suíomh, treoluas, agus treo chinn na lucha, d’úsáideamarDeepLabCut70,71. Go hachomair, chuireamar oiliúint ar mhúnla chun cluasa, srón, corp agus bonn eireaball lucha a bhrath. Measadh treo an chinn agus úsáid á baint as an uillinn idir gach cluas nó an srón agus an corp, ag brath ar infhaighteacht tomhais. Rinneadh sonraí suímh a idirshuíomh le minicíocht shamplála íomháithe cailciam ag baint úsáide as idirshuíomh líneach. Baineadh treoluas trí ríomh Δd/Δt áit arb é d an t-achar agus an t-am t agus ina dhiaidh sin réitigh sé an toradh trí scagaire Gaussach le sigma=33 ms a chur i bhfeidhm chun artifacts braite a bhaint. Baineadh úsáid as comharthaí treoluas chun tréimhsí gníomhaíochta inneall gluaiste a aithint agus chun áit, am, agus modhnú achair gníomhaíochta a ríomh go sonrach do na tréimhsí sin.

Anailís íomháithe cailciam. Rinneadh anailís ar shonraí íomháithe cailciam trí úsáid a bhaint as MATLAB 2020a agus Python 3.8.4. Rinneadh anailís ar fhístaifeadtaí ag baint úsáide as an bpíblíne Anailíse Miniscope (https://github.com/etterguillaume/MiniscopeAnalysis). Go hachomair, cuireadh ceartú tairiscint dolúbtha (uainíocht agus aistriú) i bhfeidhm ag baint úsáide as NoRMCorre72, agus rinneadh físeáin a íos-shampláil go spásúil (3×) roimh chomhchatúnáil. Baineadh rianta cailciam le CNMFe51 ag baint úsáide as na paraiméadair seo a leanas: gSig=3 picteilín (leithead na heithne Gaussach), gSiz=20 picteilín (trastomhas néaróin gar), cúlra_múnla {{10} 'fáinne', spásúil_algartam='hals', nóim_corr=0.8 (íosmhéid comhghaolmhaireachta picteilín), nóim_PNR {{17 }} (tairsí cóimheas buaic-go-torainn íosta).

Scagadh rianta cailciam amh chun luaineachtaí ard-minicíochta a bhaint agus binarized: Go hachomair, measadh go raibh néaróin gníomhach nuair a sháraigh aimplitiúid comhartha cailciam normalaithe dhá dhiall caighdeánach, agus bhí an díorthach céad-ordú os cionn 0 (féach tag. 52 le haghaidh sonraí breise ar an modheolaíocht52). Chun néaróin a bhaint as tiúnáil athróga ar leith, ceanglaíodh suíomh, am agus fad (suíomh: boscaí bruscair 3 cm; am: boscaí bruscair 1 s; fad: boscaí bruscair 3 cm). Ó chomharthaí dénártha, ríomhamar an dóchúlacht imeallach go mbeadh cealla gníomhach P Að Þ a úsáideann muid mar sheachvótálaí do ghníomhaíocht néarónach. Níos tábhachtaí fós, déanaimid ansin dóchúlacht díorthachta nó an 'dóchúlacht a bheith gníomhach i bhfianaise staid na hathróg' PA j Si ag baint úsáide as athróga binnáilte:

nuair is é M an líon iomlán riochtaí féideartha iompraíochta, agus gurb é P(Si∩Aj) an dóchúlacht chomhpháirteach go mbeidh an t-ainmhí in araid I i gcomhthráth le leibhéal gníomhaíochta j (0 nó 1). Chun measúnú a dhéanamh ar thábhacht an MIvalue a fuarthas, ghineamar ansin 1000 ionadaí shuffled ag baint úsáide as iomalartaithe ciorclach randamach. Roghnaigh muid iomalartaithe ciorclach toisc go mbaineann siad an gaol ama idir gníomhaíocht agus iompar néarónach, agus fós ag caomhnú struchtúr ama na n-aistrithe cailciam agus mar sin bíonn torthaí níos coimeádaí mar thoradh orthu (seachas randamachú iomlán a dhéanamh ar gach pointe sonraí, a ardaíonn luach suntasachta na dtorthaí). Toisc nár dáileadh normalach córasach ar ionaid ionaid shuffled, d’úsáideamar cur chuige neamh-pharaiméadrach nuair a chomhfhreagraíonn an p-luach (pN) do líon na bpointí sonraí ón dáileadh comhshuite atá níos mó ná na sonraí iarbhír do gach araid, arna roinnt ar líon na dtréimhsí52, 73.

Chun modhnú na gceall a chinneadh trí spreagthaigh optogenetic, d'úsáideamar cur chuige comhchosúil ach ríomhamar an MI idir gníomhaíocht néaróin agus na comharthaí spreagtha dénártha (mar sin cóireáilte mar staid iompraíochta). Baineadh úsáid as an nós imeachta um shuffling ciorclach céanna chun suntas staitistiúil a bhaint amach.

where P(S|A) is the posterior probability distribution of states given neuronal activity. Using only epochs with velocity >5 cm s−1, gineadh tacar sonraí oiliúna ag úsáid 90% de na sonraí. Úsáideadh an 10% eile de na sonraí le haghaidh tástála. Ríomhadh earráid díchódaithe ag baint úsáide as ionaid ionaid 50bootstrapped agus linn de 160 cill ag baint úsáide as pointí sonraí a roghnaíodh go randamach le hathsholáthar. Glactar leis go bhfuil gach néaróin neamhspleách ar a chéile, rud nach amhlaidh a bhíonn i ndáiríre agus go n-eascraíonn earráidí atógála níos mó, ach a laghdaíonn an t-am ríomhaireachta.

Cealla a rianú thar laethanta iomadúla. Rianaíodh néaróin thar laethanta iomadúla ag baint úsáide as CellReg74: https://github.com/zivlab/CellReg (v1.5.3). Go hachomair, rinneadh lorganna spáis a ailíniú trí úsáid a bhaint as ailíniú docht chun rothlú agus aistriúcháin a cheartú. Tar éis ailíniú, mheasamar go raibh tacair iarrthóirí de chealla mar an gcéanna néaróin dá mba é an t-achar uasta a bhí acu<12 µm, and used the modeled spatial correlation threshold (usually in the range 0.6–0.8) to determine the identity of cell pairs across days. Finally, we assessed the stability of the spatial representation using pairwise field correlation (Pearson correlation of tuning curves).

Anailís leictrifiseolaíoch. Rinneadh anailís ar shonraí leictreifiseolaíocha trí úsáid a bhaint as MATLAB 2020a ag baint úsáide as an bpróiseáil comhartha chomh maith leis an mbosca uirlisí tonnchreatha. Cuireadh convolution Wavelet i bhfeidhm ar LFPsignals ag baint úsáide as tonnlets casta Morlet ('cmor1-1.5' i MATLAB) nuair a bhí gá le cruinneas ama agus minicíocht-fearainn. Baineadh úsáid as Movingwindow Fourier convolution (2 s fuinneog sa bhanna téa, 5 s fuinneog sa bhanna gáma, céimeanna gluaiseachta 10 ms) nuair a bhí cruinneas fearainn minicíocht phribhléid thar am-fearainn cruinneas (m.sh., minicíocht toplot ceannasach nuair a luascadh ag baint úsáide as optogenetics). Rinneadh anailís ar dhlúis speictreach cumhachta nuair a bhí lucha ag rith ag 5 cm s−1 nó os a chionn mura gcuirtear síos ar a mhalairt.

Neart ascalaithe. Ríomhadh OS mar an cóimheas idir an dlús speictreach cumhachta carnach timpeall na buaic-minicíochta ascalaithe ± 1 Hz go dtí an banna cumhachta carnach sa bhanda theta (4-12 Hz). Éiríonn an méadrach seo 1 nuair a thiteann an dlús speictreach cumhachta ar fad laistigh den bhuaicmhinicíocht ascalaithe (m.sh. 8 Hz má tá sé á spreagadh ag an minicíocht sin).

SWRanna a bhrath agus a anailísiú. Chun monatóireacht a dhéanamh ar SWRanna, bhí cead ag lucha páirc oscailte a iniúchadh ar feadh 10 nóiméad agus iad ag taifeadadh. Rinneadh spreagthaí (scrambled nó 8 Hz) le paraidím 5 s AR, 5 s Off.Níor measadh ach tréimhsí suaimhneas ciúin le haghaidh anailíse. Chuige sin, rinneamar an cóimheas z-scór de chumhacht theta/delta a ríomh tar éis scagadh a dhéanamh ar gach banda minicíochta, claochlú Hilbert a dhéanamh, agus níor mheasamar ach tréimhsí ina raibh an luach mar thoradh air faoi bhun 0. Chun SWRanna a bhrath, rinneamar comharthaí LFP a scagadh sna 150-250 banda minicíochta Hz agus scór z ina dhiaidh sin. Braitheadh ​​ripples ag baint úsáide as an fheidhm findpeaks in MATLAB, leis na paraiméadair seo a leanas: tairseach=4 sd,minpeakwidth=0 s, mionfhadfhad=0.03 s.

Tagairtí

1. Colgin, LL Rhythms an líonra hippocampal. Nát. An tUrr Neurosci. 17, 239–249 (2016).

2. Tóth, K., Freund, TF & Miles, R. Díchumadh cealla hippocampalpyramidal francach ag aifidí GABAergic ón septum. J. Fisiol.500, 463–474 (1997).

3. Unal, G., Joshi, A., Viney, TJ, Kis, V. & Somogyi, P. Spriocanna Synaptic de réamh-mheastacháin seipteacha medial sa hippocampus agus cortices extrahippocampal na luiche. J. Neurosci. 35,15812–15826 (2015).

4. Simon, AP, Poindessous-Jazat, F., Dutar, P., Epelbaum, J. & Bassant, M.-H. Airíonna lámhaigh néaróin a aithníodh go hanatamaíoch i septum medial na néaróin ainéistéisithe agus gan ainéistéisiú. J. Neurosci. 26, 9038–9046 (2006).

5. Scotty, F. et al. Airíonna leictreafiseolaíocha ar leith de néaróin seiptehippocampal francach glutamatergic, cholinergic agus GABAergic: impleachtaí úra do rithimiúlacht hippocampal. J. Fisiol. 551,927–943 (2003).

6. Manseau, F., Danik, M. & Williams, S. Líonra glutamatergicneuron feidhmiúil sa septum medial agus limistéar banna trasnánach. J. Fisiol. 566, 865–884 (2005).

7. Amilhon, B. et al. Idirnéaróin parvalbumin de ghníomhaíocht tunepopulation hippocampus ag minicíocht téite. Néaróin 86, 1277–1289(2015).

8. Etter, G. et al. Tarrthálann spreagadh gáma optogenetic laigí cuimhne i múnla luiche galar Alzheimer. Nát. Cumann. 10, 1–11 (2019).

9. Zutshi, I. et al. Freagraíonn ciorcaid néaracha hippocampal do luascadh optogenetic ar mhinicíochtaí téite trí mhinicíochtaí ascalaithe luathaithe a ghiniúint. Curr. Biol. 28, 1179–1188.e3 (2018).

10. Bender, F. et al. Rialaíonn ascaluithe téite luas an locomotion trí chonair sheptum hippocampus go cliathánach. Nát. Cumann. 6,8521 (2015).

For more information:1950477648nn@gmail.com