Maolaíonn Oligosaccharides Géarghortú Duán Trí Bhraisle Difreála a Mhaolú 44-Freagairtí Imdhíonachta Idirmheánacha i gCealla Tubular Duánach

Coimriú:Géarghortú duáin (AKI)is eipeasóid tobann dedamáiste duáina tharlaíonn go coitianta in othair a ligtear isteach in ospidéil. Go dtí seo, níor forbraíodh aon chóireáil idéalach chun laghdú a dhéanamhAKI déine. Oligo-fucoidan(FC) cur isteach ar bhraisle próitéin dromchla cille tubular duánach de dhifreáil 44 (CD44) chun fiobróis duánach interstitial a chosc; áfach, ní fios fós an tionchar a bhíonn ag olagaishiúicrídí ar AKI. Sa staidéar seo, roghnaíodh FC, galacto-oligosaccharide (GOS), agus fructo-oligosaccharide (FOS) chun imscrúdú a dhéanamh ar thionchar oligosaccharides ar AKI. Tá sé cruthaithe go bhfuil na trí oligosaccharides go léir ionsúite go páirteach ag an intestine. Fuaireamar amach gur laghdaigh dáileog-spleáchas oligosaccharides antigenicity CD44 agus chuir siad faoi chois an slonn spreagtha hypoxia de CD44, phospho-JNK, MCP-1, IL-1, agus TNF- in NRK-52E cealla tubular duánach. Idir an dá linn, laghdaigh aistriú siRNA CD44 agus inhibitor JNK SP600125 an léiriú hypoxia-spreagtha de phospho-JNK agus cytokines. Chuir ligand CD44, hyaluronan, in aghaidh tionchar na n-oligosaccharides ar CD44 agus fospho-JNK. Ag 2 lá tar éis na máinliachta do ghortú ischemia-reperfusion, laghdaigh olagaishiúicrídí athlasadh duáin, creatine serum, MCP-1, IL-1 , agus TNF- i lucha AKI. Ag 7 lá tar éis na máinliachta, cuireadh aisghabháil na duáin chun cinn. Tugann na torthaí seo le fios go gcuireann FC, GOS, agus FOS bac ar easascáid CD44/JNK de bharr hypoxia agus cítocíní i gcealla tubular duánach, rud a chuireann feabhas ar athlasadh AKI agus duáin i lucha AKI. Dá bhrí sin,forlíonadh oligosaccharidestraitéis fhéideartha cúram sláinte d’othair a bhfuil AKI orthu.

Eochairfhocail: gortú duáin géarmhíochaine; braisle difreála 44; fructo-oligosaccharide; galactooligosaccharide; oligo-fucoidan; athlasadh

1. Réamhrá

Gortú duáin géarmhíochaine(AKI) tréithrithe ag laghdú tobann ar an ráta scagacháin glomerular agus méadú iarmhartach ar creatiníne serum. Tá an damáiste seo coitianta in othair a ligtear isteach in ospidéil agus in aonaid dianchúraim, go háirithe daoine scothaosta. Is iad ischemia, sepsis, agus nephrotoxicity na príomhchúiseanna le AKI a bhíonn ann go minic agus, mar sin, diagnóis agus cóireáil casta [1]. Cuireann AKI dian othair a scaoiltear amach i mbaol teagmhais dhíobhálacha, amhail galar duáin ainsealach, teagmhais chardashoithíoch, ailse, agus ionfhabhtuithe [2]. Tá forbairt tapa ag AKI, agus níl aon chóireáil éifeachtach ar fáil chun a dhéine a sheachaint nó a laghdú. Is féidir le hiontógáil cothaithigh shonracha díobháil tubular duánach a laghdú in AKI [3]. Mar sin, cabhróidh staidéar a dhéanamh ar thionchar an chothaithe shonraigh ar AKI chun AKI agus na rioscaí a ghabhann leis a bhíonn roimh othair a scaoiltear amach as a fheabhsú.

Athlasadh agus earcú leukocyteis príomh-idirghabhálaithe AKI iad. Gineann duáin, go háirithe cealla tubular duánachcytokines athlastachale linn AKI, amhail IL-1, IL-6, próitéin chemoattractant monocyte-1 (MCP-1), agus fachtóir neacróis siadaí- (TNF- ) [4,5] . Cothaíonn na cítocíní seo tuilleadh athlasadh sistéamach agus earcú leoicicítí. Cé go n-imríonn roinnt fo-thacair leukocyte éifeachtaí cosanta ar AKI (cosúil le cealla T-rialála), tá an chuid is mó de neutrophils, monocytes, agus cealla dendritic díobhálach d'aisghabháil AKI [6]. Tá athlasadh sistéamach díobhálach freisin don aisghabháil ó AKI mar gheall ar na leibhéil arda cítocín [7]. I measc na cítocíní a dhéanann an duán a scaoileadh, tá MCP-1 freagrach go príomha as earcú leukocyte, freagraíonn sé cítocíní éagsúla, lena n-áirítear IL-1 agus TNF- [8,9], agus tá ról tábhachtach aige sa phaitigineas. gortuithe duáin éagsúla [10]. I gcealla tubular proximal daonna HK-2, déantar slonn MCP-1 hypoxia-spreagtha ag an cosán críochfoirt c-Jun NH{2- kinase (JNK) [11]. Tá baint ag an gcosán p38 freisin le léiriú MCP -1 albaimin-spreagtha i gcealla epithelial tubular duánach [12]. Mar sin, d’fhéadfadh tionchar a bheith ag rialáil conairí JNK agus p38 ar athlasadh agus ar earcú leukocyte in AKI.

Is polaiméirí saccharide iad olagaishiúicrídí ina bhfuil 3-10 monaisiúicrídí atá do-dhíleáite agus is cuid mhór de na réamhbiotics iomlán atá ar fáil mar bhreiseáin chothaithe [13]. Tá an chuid is mó de na fructo-oligosaccharides (FOSanna) a ionghabháil sa chorp daonna coipthe go hiomlán ag flóra coilíneacha, agus déantar codán beag a aisghabháil sa fual [14]. Is féidir galacto-oligosaccharides (GOSs) a ionsú san fhuil agus ina dhiaidh sin eisfhearadh i bhfual [15]. Baineann an cás céanna le fucoidan in algaí mara donn [16]. Is féidir le olagaishiúicrídí ionsúite tionchar a imirt ar imoibrithe bithcheimiceacha agus ar aithint cille [17]. Nochtann ár staidéar roimhe seo go gcuireann oligo-fucoidan (FC) isteach ar an idirghníomhú idir an próitéin dromchla cille tubular duánach CD44 agus a ligands extracellular, rud a chosc fiobróis interstitial duánach [18]. Cuireann an idirghníomhaíocht idir CD44 agus a ligands extracellular chun cinn cosán comharthaíochta JNK [19]. Mar sin, d'fhéadfadh ionghabháil laethúil olagaishiúicrídí athlasadh duáin a laghdú in othair le AKI. Mar sin féin, tá tionchar na polaiméirí seo ar AKI anaithnid. Rinne an staidéar seo imscrúdú ar éifeacht FC, FOS, agus GOS ar chealla tubular duánach cóireáilte le hypoxia agus lucha AKI le gortú ischemia-reperfusion (IRI). Thaispeáin na torthaí gur chuir na trí olagasiúicrídí CD44-idirghabhálaí imdhíon duánach faoi chois agus gur laghdaigh siad déine iar-AKI. Dá bhrí sin, cuireann úsáid na bpolaiméirí seo mar fhorlíonadh cothaithe straitéis nua cóireála AKI i láthair

2. Ábhair agus Modhanna

2.1. Ábhair

Fuarthas FOS (meánchéim pholaiméirithe < 10), GOS (meánchéim pholaiméirithe < 8), agus FC (meánchéim pholaiméirithe < 5) ó Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA, Cat. Uimh. F8052), Carbosynth (Berkshire, an RA, Cat. Uimh. OG32134), agus Hi-Q Marine Biotech International (Taipei, Taiwan), faoi seach. Rinneadh olagaishiúicrídí a thuaslagadh i H2O driogtha dúbailte agus scagtha ag baint úsáide as scagairí steiriúla 0.22 µm (Merck Millipore, Darmstadt, an Ghearmáin). Fuarthas Hyaluronan (HA) agus gach ceimiceán eile de ghrád imoibrí ó Sigma. Antasubstaintí in aghaidh JNK (sc-7345), phospho-JNK (sc-6254), MCP-1 (sc-52701), IL-1 (sc{{17 }}), agus ceannaíodh TNF- (sc-52746) ó Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA). Fuarthas antasubstaintí i gcoinne p38 (9212) agus phospho-p38 (9211) ó Theicneolaíocht Comharthaíochta Cille (Danvers, MA, SAM). Ceannaíodh antasubstaintí in aghaidh Ly6G (ab25377) agus F4/80 (ab100790) ó Abcam (Cambridge, RA). Ceannaíodh antasubstaintí in aghaidh HIF-1 (NB100-105) ó Novus Biologicals (Centennial, CO, USA).

2.2. Cultúr na Cille

Ceannaíodh cealla feadánacha duánacha duánacha francacha (NRK-52E) agus líne macraphage luiche RAW264.7 ón Institiúid Taighde agus Forbartha Tionscail Bia (Hsinchu, Taiwan); saothraithe i DMEM arna fhorlíonadh le tuaslagán antaibheathach/antifungal agus séiream lao féatais 10%; agus coimeádtar ag 37 ◦C agus taise 95% i gorlann CO2. Tar éis cumar 70% a bhaint amach, saothraíodh na cealla i meán saor ó shéiream agus goraíodh iad thar oíche roimh an turgnamh. Don turgnamh hypoxia, taisceadh cealla NRK{-52E agus Anaero Pack (Mitsubishi Gas Chemical America, Nua Eabhrac, NY, SAM) i prócaí dronuilleogacha (Mitsubishi Gas Chemical America), agus cuireadh an socrú iomlán i 37 ◦C gorlainne ar feadh 4 h. Saothraíodh na cealla ansin thar oíche faoi ghnáthchoinníollacha.

2.3. Anailís Blot an Iarthair

Go hachomair, cuireadh 15 µg de NRK lysate próitéin E i bhfeidhm ar gach lána, agus rinne blot an Iarthair anailís ar na torthaí. Rinneadh leibhéil choibhneasta banda próitéine a chainníochtú ó chúig thurgnamh neamhspleácha ag bogearraí Quantiscan ó Biosoft (Cambridge, RA).

2.4. Gearr-chur isteach (si)RNA Traschur CD44

Ceannaíodh Rat CD44 siRNA (4390771) ó Thermo Scientific (Waltham, MA, SAM). Tar éis fás go cumar 70%, aistríodh na cealla le siRNA ag baint úsáide as imoibrí aistrithe Lipofectamine 2000 (Thermo Scientific) de réir threoracha an déantóra.

2.5. Measúnacht Iomadú Cille

Tar éis NRK hypoxic{0}}Cealla E a shaothraíodh ar feadh 24 h, baineadh úsáid as an meán céanna chun cealla RAW264.7 a shaothrú i 96-phláta tobair (2000 cill/tobar). Tar éis 24 h goir, rinneadh anailís ar iomadú cealla RAW264.7 trí úsáid a bhaint as Kit Measúnaithe SRB (Abcam, Cat. Uimh. ab235935) de réir threoracha an mhonaróra.

2.6. CD44 Tástálacha Antigenicity

Fuarthas francach athchuingreach CD44 ó R&D Systems (Minneapolis, MN, SAM, Cat. Uimh. 6577-CD) agus fostaíodh é chun imoibriú ceangailteach le HA a tháirgeadh de réir threoracha an déantóra. Go hachomair, meascadh francach athchuingreach 20 ng/mL CD44 le tiúchain éagsúla FC, FOS, nó GOS ar feadh 10 nóiméad chun imscrúdú a dhéanamh ar thionchar olagaishiúicrídí ar antaigineacht CD44. Rinneadh anailís ar na meascáin ag baint úsáide as trealamh CD44 ELISA (Abcam, Cat. Uimh. ab213928) de réir threoracha an mhonaróra.

2.7. Ainmhithe Turgnamhach agus IRI Duánach

Ceannaíodh lucha fireann ocht seachtaine d'aois 129S1/SvImJ ó Lasco Technology (Taipei, Taiwan). D'fhormheas Coiste um Chúram agus Úsáid Ainmhithe Turgnamhach Ollscoil Leighis Taipei (faomhadh Uimh. LAC-2019-0511) na turgnaimh ainmhithe go léir agus bhunaigh Treoir NIH um Chúram agus Úsáid Ainmhithe Saotharlainne iad. Le haghaidh ionduchtaithe IRI, cuireadh lucha (meáchan 21-23 g) faoi chlampáil déthaobhach pedicle duánach ar feadh 30 min trí incision cliathánach a dhéanamh [20]. Rinneadh ainéistéise ionanálaigh ar lucha le hisaflurane roimh ré. Rinneadh oibríocht chomhchosúil ar lucha a oibrítear le seamanna, ach amháin i gcás clampáil pedicíní duánacha. Cothaíodh gach lucha le oligosaccharides trí thomhas béil ó 1 lá roimh go dtí 2 lá tar éis máinliacht IRI. Roinneadh na lucha turgnamhacha sna cúig ghrúpa seo a leanas le n=8 le haghaidh na dtorthaí ar lá 3 agus lá7: (1) grúpa sham; (2) grúpa AKI; (3) grúpa AKI arna bheathú le FC (10 mg/kg/lá); (4) grúpa AKI arna bheathú le FOS (10 mg/kg/lá); agus (5) grúpa AKI arna bheathú le GOS (10 mg/kg/lá). Rinneadh lucha a íobairt 3 nó 7 lá tar éis na máinliachta, agus bailíodh agus rinneadh anailís ar fhuil ag baint úsáide as anailísí bithcheimiceach agus feisteáin ELISA. Rinneadh anailís ar leibhéal creatinine serum gach luiche chun forbairt AKI a mheas. Scrúdaíodh moirfeolaíocht na nduán trí smálú tréimhsiúil aigéad-Schiff (PAS) agus staining imdhíon-histocheimic (IHC) i gcodanna pairifín 2 µm fosaithe go foirmiúil.

2.8. Staining Immunohistochemistry

Socraíodh fíocháin duáin le paraformaildéad maolánach 4%, leabaithe i pairifín, agus gearrtha i gcodanna 2 µm le haghaidh staining le trealamh DAB UltraVision Quanto Braite HRP (Thermo Scientific, Fremont, CA, USA) agus hibridiú leis an bpríomh-antasubstaint le treoracha an mhonaróra. .

2.9. Staining PAS

Rinneadh na hailt duán a dhaite le Kit Stain PAS (Abcam, Cat. Uimh. ab150680) de réir threoracha an mhonaróra.

2. 10. Measúnú ELISA

Bailíodh meán saothraithe na gcealla NRK-52E agus samplaí séiream na lucha turgnamhacha agus rinneadh anailís orthu trí úsáid a bhaint as trealamh ELISA MCP-1 (Abcam, Cat. Uimh. ab208979) agus IL-1 Kit ELISA (Abcam, Cat. Uimh. ab197742). Rinneadh anailís ar na samplaí séiream freisin agus úsáid á baint as trealamh TNF-ELISA (Córais T&F, Cat. Uimh. MTA00B) agus trealamh ELISA (Córais T&D, Cat. Uimh. MLCN20) agus lipocalin a bhaineann le neodrófail geilitín (NGAL) ag treoracha an mhonaróra.

2. 11. Tástálacha Staidrimh

Cinneadh difríochtaí suntasacha idir an dá ghrúpa trí úsáid a bhaint as t-thástáil an Mhic Léinn. Measadh go raibh difríochtaí suntasacha maidir le luachanna p<0.05

3. Torthaí

3.1. Cosc ar Oligosaccharides an Méadú ar CD44 agus ar Chítocíní i gCealla NRK Hypocsacha-52E

Slonn CD44 i NRK-52Rinneadh monatóireacht ar chealla E ar cuireadh cóireáil orthu le FC, FOS, agus GOS ar dtús chun tionchar oligosaccharides ar chealla tubular duánach a mheas. Chuir na trí olagaishiúicrídí sa raon 0.05–0.5 mg/mL) bac ar slonn CD44 arna spreagadh le hipocsia (Fíor 1A). Mar sin, baineadh úsáid as an dáileog oligosaccharide de 0.1 mg/mL sna turgnaimh cille seo a leanas. Sa chóras ullmhaithe, d'eascair go mór le cóireáil hypoxia léiriú marcóir hypoxia HIF-1 i gcealla NRK{-52E, rud a thugann le fios go raibh na cealla i staid hypoxia (Fíor 1B). Rinne Hypoxia leibhéil fosfarlaithe JNK, MCP-1, IL-1 , agus TNF- ach ní sna cealla cóireáilte le olagaishiúicrídí (Fíor 1B, C). Mhéadaigh léiriú JNK i gcealla hypoxic ach ní i gcealla cóireáilte FC nó FOS-cóireáilte. Níor chuir GOS isteach ar léiriú JNK i gcealla hypoxic ach chuir sé an t-uasrialú JNK fosfarlaithe faoi chois. Mar sin, is féidir le olagaishiúicrídí bac a chur ar thrasuíomh comharthaíochta JNK de bharr hipocsa agus léiriú citocín i gcealla tubular duánach. Cé go ndearna FC agus GOS upregulated phos phorylated p38 i gcealla hypoxic, níor tháinig méadú ar léiriú an phróitéin seo i gcealla hypoxic. Tugann an toradh seo le fios nach bhfuil ról lárnach ag p38 i bhfreagraí a spreagtar le hipocsa i gcealla NRK{-52E.

3.2. Imríonn CD44 agus JNK Ról Criticiúil i Méadú Cíteicne ar NRK Hypoxic-52E Cealla

Bhí tionchar ag olagaishiúicrídí ar léiriú CD44, JNK fosfarlaithe, agus cítocíní i gcealla feadánacha duánach, ach tá a gcomhlachas fós le soiléiriú. Chun imscrúdú a dhéanamh ar ról CD44 in aistriú comharthaíochta JNK agus léiriú cítocine i gcealla hipocsacha, aistríodh cealla NRK-52E le dáileoga éagsúla de siRNA CD44. Chuir siRNA CD44 ag 50 agus 100 PM bac go héifeachtach ar léiriú CD44 a mhéadaigh hypoxia agus chuir sé bac suntasach ar mhéadú spreagtha hypoxia i leibhéil JNK, MCP{10}}, IL44, agus TNF- (Fíor 2A). Bhí baint ag tionchar blocála CD44 ar léiriú JNK le dáileoga siRNA. Spreagadh siRNA CD44 ag 50 pm slonn JNK i gcealla hypoxic ach cuireadh cosc ​​air ag 100 pm. Chuir an dá dháileog an t-uasrialú JNK fosfarlaithe faoi chois. Laghdaigh an coscaire roghnach do JNK, SP600125, go mór slonn MCP-1, IL-1 , agus TNF- i gcealla hypoxic NRK-52E (Fíor 2B). Tugann na torthaí seo le fios go gcuirtear an éifeacht coisctheach a bhaineann le haistriú siRNA CD44 ar chitocíní spreagtha hypoxia i leith laghdú ar JNK fosfarlaithe.

Fíor 1. Éifeacht choisctheach oligosaccharides ar aistriú comhartha CD44 i gcealla NRK hypoxic-52E. Rinneadh na cealla a réamhchóireáil le FC, FOS, nó GOS ar feadh 30 nóiméid agus ansin cuireadh faoi réir cultúir hipocsaineacha. Rinneadh anailís ar léiriú próitéine ag blotáil an Iarthair. (A) Éifeachtaí dáileog-spleách oligosaccharides ar léiriú CD44. (B) Éifeacht olagaishiúicrídí ar chomharthaí a bhaineann le CD. Socraíodh tiúchan oligosaccharide mar 0.1 mg/mL. Cuirtear méaduithe coibhneasta i mbandaí próitéine i láthair freisin i bhfoirm bharrachairt (C). Cuirtear torthaí in iúl mar mheán ± SD (n=4).

Fíor 2. Ról CD44 agus JNK i bhfreagairtí athlastacha spreagtha hypoxia i gcealla NRK-52E. Rinneadh anailís ar léiriú próitéine ag blot an Iarthair. (A) Éifeacht choisctheach ar aistriú siRNA CD44 ar JNK fosfarlaithe agus cytokines. (B) Éifeacht choisctheach SP600125 ar chitocíní. Rinneadh na cealla a réamhchóireáil le 20 µM SP600125 le haghaidh cóireála 30 nóim pforhypoxia. Cuirtear méaduithe coibhneasta i mbandaí próitéine i láthair freisin i bhfoirm bharrachairt. Cuirtear torthaí in iúl mar mheán ± SD (n=4).

3.3. Cothaíonn Rún Cíteicne de bharr Hypoxia i gCealla Tubular Duánach Iomadú Macrophage

Is idirghabhálaí díobhála duánach é an t-athlasadh in AKI. Dá bhrí sin, scrúdaíodh tionchar turais oligosaccha ar leukocytes. Léiríonn Fíor 3A nach raibh tionchar ag FC, FOS, agus GOS ar iomadú cealla macrophage RAW264.7. Cuireadh iomadú cealla RAW264.7 chun cinn tríd an 24-mheán saothraithe uair an chloig le haghaidh cealla NRK hipocsacha-52E (Fíor 3B) ach níor cuireadh chun cinn é trí mheán na gcealla NRK hipocsacha-52Cealla E arna chóireáil le olagaishiúicrídí. Bhí leibhéil MCP-1 agus IL{-1 níos airde ag an gcéad cheann ná mar a bhí ag an gceann deiridh (Fíor 3C, D). Laghdaigh na trí olagasiúicrídí go suntasach MCP-1 agus IL{{-1 i meán saothraithe na gcealla NRK hipocsacha E. Mar sin, is féidir le FC, FOS, agus GOS léiriú agus secretion cytokines i gcealla tubular duánach hypoxic a laghdú agus, dá bhrí sin, athlasadh de bharr cealla tubular duánach gortaithe a laghdú.