Anailís Meitibileach Bhunaithe ar NMR d'Éifeachtaí Forlíonadh - Ketoglutarate Ar Mhíoblasts C2C12 i Stáit Fuinnimh Éagsúla

Cliceáil Anseo Chun Forlíonta Cistanche Frith-aging agus faoiseamh tuirse a fháil

1. Réamhrá

Is é an muscle chnámharlaigh an t-orgán is mó i gcorp an duine agus coinníonn sé gnáthghníomhaíochtaí saoil.Oiliúint aclaíochta fadanó paiteolaíochtal próisis galair chothaíonn damáiste musclenósoláthar fuinnimh muscle neamhleor, ag an am seo, tá athchóiriú neart muscle agus feidhm go háirithe tábhachtach. Tá forlíontaí cothaitheacha éagsúla fostaithe chun hipertróf matáin chnámharlaigh a chur chun cinn agus chun feidhmíocht spóirt a fheabhsú [1]. Mar a dtrasnaíonn an meitibileacht orgánach carbóin agus nítrigine agus ag an am céanna idirmheánach ríthábhachtach sa timthriall TCA, -Ketoglutarate (AKG) léirigh éifeachtaí pleiotropic chun feabhas a chur ar fheidhmíocht muscle i dturgnaimh chliniciúil agus ainmhithe [2-9]. Mar shampla, is féidir le AKG damáiste mucosal stéigeach a laghdú [8] agus athlasadh [9], an galar a mhaolú.forbairt ailse cholaireicteach[4] agus fiobróis ae [5], fás a chur chun cinn [6], agus galracht a laghdú agusmoill ag dul in aois[7]. Léirigh oibreacha roimhe seo gur féidir le forlíonadh AKG caillteanas muscle a mhaolú trí riarachán tuismitheora i múnla tráma d'othair atá ag dul faoi athsholáthar cromáin iomlán [2], agus hipertróf matáin agus sintéis próitéin a chur chun cinn trí chonairí comharthaíochta Akt/mTOR [10,11]. I gcás diostróife mhatánach Duchenne, is féidir le forlíonadh AKG cosc ​​a chur ar atrophy muscle agus mífheidhmiú tríd an gcosán idirghabhála PHD3/ADRB [12]. Léirigh ár n-obair roimhe seo freisin gur féidir le forlíonadh AKG iomadú mióblastaí C2C12 a éascú go mór, agus maolú a dhéanamh ar atrophy na mióitíb C2C12 saothraithe i meán gan glúcóis [13]. Ós rud é gurb é glúcós an príomhfhoinse fuinnimh chun gnáthfheidhmeanna fiseolaíocha muscle chnámharlaigh a chothabháil, tá éifeachtaí forlíonta AKG chun feidhmíocht muscle a fheabhsú ag brath go mór ar an leibhéal glúcóis i matán an chnámharlaigh. Níl na difríochtaí idir na héifeachtaí AKG-spreagtha i matán cnámharlaigh idir stáit fuinnimh éagsúla soiléir.

Glacann AKG páirt i sintéis aimínaigéid, vitimíní, agusaigéid orgánachaagusmeitibileacht fuinnimhsa chorp, a bhaineann le comhshó AKG go glutamáit trí glutamáit dehydrogenase, agus an amóinia a mhaolú ina dhiaidh sin le glutamáit le glutamine synthetase. Soláthraíonn AKG an fuinneamh le haghaidh fás cille tríd an timthriall TCA agus fosfarylation ocsaídiúcháin agus cuireann sé meitibileacht cille agus comharthaíocht chun cinn trí idirghníomhú lena receptor OXGR (gabhdóir próitéine-G) ar an membrane cille [14,15]. Thairis sin, is féidir le AKG meitibileacht ocsaídiúcháin mitochondrial a rialáil agus an stát epigenetic ceadaitheach a chur chun cinn trí idirghabháil a dhéanamh ar aistriú luath-stáit cille suthach agus forbairt ghaiméite [16]. Ina theannta sin, is féidir le AKG a spreagann cleachtadh a receptor OXGR1 a spreagadh sna faireoga adrenal chun teirmegenesis agus miondealú tríghlicrídí i bhfíochán saille a rialú agus éifeachtaí tairbheacha ar mheitibileacht a tháirgeadh [17].

Mar sin féin, is beag staidéar a rinneadh chun athruithe meitibileach AKG-spreagtha ar mhatán an chnámharlaigh i stáit fuinnimh éagsúla agus na meicníochtaí meitibileach bunúsacha a nochtadh. Le déanaí, úsáideadh anailís mheitibileach chun soiléiriú córasach a dhéanamh ar na meicníochtaí móilíneacha is bun le héifeachtaí tairbhiúla an fhorlíonta chothaithe. D’fhéadfadh go léireodh malartaithe meitibilítí a fheidhmíonn mar tháirgí iartheachtacha trascríobh géine athruithe meitibileach foriomlána go hintuigthe. Mar theicnící atá oiriúnach go háirithe chun athruithe ar leibhéil meitibilíte i mbithsreabháin, fíocháin agus cealla a bhrath go cainníochtúil, cuireadh speictreascópacht ardtaifigh, 1H athshondais mhaighnéadaigh (NMR) i bhfeidhm go forleathan in anailísí meitibileachta. Go suntasach, tá roinnt buntáistí ag próifíliú meitibileach atá bunaithe ar NMR, mar shampla ard-atáirgtheacht, tomhas cainníochtúil gan dochar, agus ullmhúchán samplach áisiúil [18,19]. Roimhe seo, rinneamar anailísí meitibileach bunaithe ar NMR chun éifeachtaí forlíonta creatine ar mhioblastaí C2C12 [20] a shoiléiriú, agus éifeachtaí forlíonadh alanyl-glutamine ar mióblasts gortaithe ag díothacht fuinnimh [21].

2. Torthaí

2.1. Iomadú agus Difreáil Mióblasts C2C12 le Forlíonadh AKG

Rinneadh cealla mióblast C2C12 a shaothraítear i ngnáthmheán fáis le agus gan forlíonadh AKG a ghrúpáil mar Nor-A agus Nor, ach rinneadh iad siúd i meán fáis íseal-glúcóis le forlíonadh AKG nó gan é a ghrúpáil mar Íseal-A agus Íseal. Ag teacht leis an staidéar roimhe seo [10], léirigh cealla Nor-A le forlíonadh AKG ag tiúchan 2 mm inmharthanacht cille feabhsaithe go suntasach i gcomparáid le cealla Nor (Fíor S1).

Mar sin, baineadh úsáid as an tiúchan AKG de 2 mm sna turgnaimh chun measúnú a dhéanamh ar athruithe AKG-spreagtha ar iomadú agus difreáil mióblasts. I gcomparáid le cealla Nor, léirigh cealla Íseal laghdú mór ar ráta iomadú mar gheall ar easnamh fuinnimh (Fíor 1A). Cé nach raibh forlíonadh AKG ina chúis le moirfeolaíocht mioblastaí an-difriúil sa dá stát fuinnimh, ní hamháin gur chuir sé feabhas ar ráta iomadú na gceall Íseal saothraithe i meán glúcóis íseal ach chuir sé feabhas freisin ar ráta iolraithe na gcealla Ísle a shaothraítear i meán glúcóis íseal ach freisin d'fheabhsaigh sé ráta iolraithe na gcealla Norte a shaothraítear i ngnáthmheán i gcomhréir le. staidéir roimhe seo [10,12]. Áiríodh uimhreacha cille in aghaidh achair ar leith do na ceithre ghrúpa mioblasts (n=4 don ghrúpa): Ná, 563.8 ± 10.4; Nor-A, 624.0 ± 10.8; Íseal, 493.8 ± 14.5; Íseal A, 547.0 ± 11.7 (Fíor 1B). Is fiú a thabhairt faoi deara nár léirigh cealla Íseal-A uimhreacha cille a bhí difriúil go staitistiúil ó Ná cealla, rud a thugann le fios go bhféadfadh forlíonadh AKG líon na gcealla do na mióblasts a aisghabháil faoi choinníollacha saothraithe glúcóis íseal (Fíor 1B).

Figiúr 1, Iomadú agus cumas difreála myoblasts C2C12 faoi choinníollacha cultúir gnáth agus íseal. cultúr glúcóis. (A) moirfeolaíochtaí mioblasts. (B) Uimhreacha cille a fhreagraíonn do phainéal A (n=4). (C) Inmharthanacht cille i gcoibhneas le Ná cealla arna anailísiú ag measúnacht iomadú ceall MTS (n=5). (D) Sloinn MyoD1 i mioblasts arna anailísiú ag blot an iarthair. Baineadh úsáid as an antashubstaint frith-GAPDH chun an méid próitéine i ngach lána a chaighdeánú. (E) Anailís staitistiúil a fhreagraíonn do na painéil (D) (n=4). * p < 0.{{10}}5,** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001.

Ina theannta sin, rinneadh an measúnacht MTS chun comparáid chainníochtúil a dhéanamh ar rátaí iomadú na gceithre ghrúpa cealla (Fíor 1C). Bhí laghdú suntasach ar ráta iomadú cealla íseal i gcomparáid le cealla Nor, rud a thugann le fios gur chuir meán glúcóis íseal isteach ar iomadú ceall. Go suntasach, chuir forlíonadh AKG feabhas ar rátaí iomadú cealla Nor-A agus Íseal-A i gcomparáid le cealla Nor agus Íseal, faoi seach. Tabhair faoi deara gur léirigh cealla Íseal-A cumas iomadú níos ísle ná na cealla Nor, rud a thugann le tuiscint nach ndearna forlíonadh AKG ach go páirteach athchóiriú ar iomadú cealla saothraithe i meán glúcóis íseal

.Is gnách go n-úsáidtear an abairt de phróitéin difreálaithe mióigineach 1 (MyoD1) chun cumas difreála na gceall a thréithriú. Mar sin rinneamar comparáid chainníochtúil ar na habairtí de MyoD1 idir na ceithre ghrúpa cealla (Fíor 1D). Léirigh cealla ísle cumas difreála an-laghdaithe i gcomparáid le cealla Nor. Go suntasach, tá cumas difreála uas-rialaithe AKGsupplementation na gceall saothraithe i meánmhéid gnáth agus i meán glúcóis íseal, mar atá léirithe ag thart ar ardú 30 faoin gcéad de MyoD1expression i Nor-A agus Íseal-A cealla. Go háirithe, níor léirigh cealla Íseal-A slonn MyoD1 a bhí an-difriúil go staitistiúil ó Ná cealla, rud a thugann le tuiscint ardéifeachtúlacht an fhorlíonta AKG chun cumas difreála na gceall a shaothraítear i meán glúcóis íseal a athbhunú.

Ina theannta sin, rinneamar anailís ar chumais dhifreála miotób do na ceithre ghrúpa de mhioblastaí C2C12. Cruthaíodh miotóbanna trí chomhleá mióblastaí a shaothraítear i ngnáthmheáin idirdhealú glúcóis agus íseal-glúcóis le nó gan fhorlíonadh AKGFigure S3). Léirigh moirfeolaíochtaí na mióitíb C2C12 go ndearna an cultúr íseal-glúcóis lagú ar chumas difreála myotube na gcealla, agus go bhféadfadh forlíonadh AKG idirdhealú miótóib a chur chun cinn i mióblastaí saothraithe i ngnáthmheán agus i meán glúcóis bó.

2.2. NMR Spectra of Aqueous Extracts of C2C12 Myoblasts

Taifeadadh speictrim NMR tipiciúla 850 MHz 1H ar eastóscáin uiscí díorthaithe ó na grúpaí Nor, Nor-A, Íseal agus Íseal-A de mhioblastaí C2C12 (Fíor 2A). Sannadh 34 meitibilít san iomlán agus rinneadh achoimre orthu i dTábla S1. Deimhníodh sannacháin athshondais na meitibilítí trí úsáid a bhaint as speictream 2D ​​1H-13C HSOC agus 1H-H TOCSY (Figiúirí S4 agus S5). Léirigh iniúchadh amhairc ar an speictream NMR go raibh carnuithe suntasacha de intracellularAKG i gcealla Nor-A agus Íseal-A (Fíor 2B) mar thoradh ar mióblasts a shaothrú le forlíonadh AKG.

Figiúr 2, Meán 850 MHz lH speictrim athshondais mhaighnéadaigh núicléach (NMR) arna thaifeadadh ar eastóscáin uiscí díorthaithe ó na grúpaí Nor, Nor-A, Íseal agus Íseal-A de mhioblastaí C2C12. (A) Comparáid idir meánspeictream NMR na gceithre ghrúpa. Coinníodh na scálaí ingearach tairiseach i ngach speictream lH NMR. Baineadh an réigiún uisce (4.7-5.2 ppm) (B) Réigiúin áitiúla aimplithe de bhuaiceanna a- Ketoglutarate (AKG). Líne ghorm/uaine/buí/dearg: réigiúin speictreach ó na grúpaí Nor/Nor-A/Íseal/Íseal-A. AKG, a-ketoglutarate; PC, O-fosfachailín; GPC, sn-glycero-3-fosphocholineUDP-glúcós, glúcós défhosfáit Úraidín: CTP, sn-glicearó-3-fosfaicilín; NAD móide , dé-núicléitíd aindín nicotinamide AXP monai adenine /di /trífhosfáit.

2.3. Anailís Sonraí Ilathróg chun Próifílí Meitibileach Ceallacha a Iniúchadh

Rinneamar tuilleadh anailíse sonraí ilathraithe ar shonraí speictreach an NMR le haghaidh próifíliú meitibileach na gceithre ghrúpa de mhioblastaí C2C12. Bhunaíomar trí mhúnla PCA gan mhaoirseacht ar dtús leis an gcéad dá chomhpháirt (PC1, PC2) chun forbhreathnú a dhéanamh ar na treochtaí grúpála agus chun difríochtaí meitibileach a nochtadh idir na grúpaí mióblasts. Léiríonn na ceapacha scór ThePCA go raibh próifíl meitibileach na gceall saothraithe i meán íseal-glúcóis idirdhealú go soiléir ón gceann saothraithe i meán gnáth (Fíor 3A), agus d’athraigh AKCsupplementation go suntasach patrúin meitibileach na gceall saothraithe i meán gnáth agus i meán glúcóis íseal (Fíor 3B, C). Mar sin féin, bhí an difríocht meitibileach idir na grúpaí Nor-A agus Nor níos mó ná an difríocht idir na grúpaí Íseal-A agus Íseal, rud a thugann le tuiscint go mbraitheann éifeachtaí forlíonadh AKG ar phróifíl meitibileach mióblasts go mór ar staid fuinnimh na gcealla.

Fíor 3. Taifeadadh anailísí ilathraitheacha do 'speictrim HNMR ar eastóscáin uiscí a díorthaíodh ó mhioblastaí C2C12 de na grúpaí Nor, Nor-A, Low, agus Low-A. (AC) scóir PCA ceapacha de na grúpaí Íseal agus Nor, na grúpaí Íseal agus Íseal na grúpaí Nor-A agus Nor; (DF) Scórálann OPIS-DA ceapacha na ngrúpaí Ísle agus Nor (R2: 0.999, 02: 0.996), na ngrúpaí Íseal agus Íseal (R2: 0.918: 02: 0.761), na grúpaí Nor-A agus Nor (R2: 0.927: 02: 0.838). Léiríonn na héilips an teorainn muiníne 95 faoin gcéad.

Ina theannta sin, bhunaíomar trí mhúnla maoirsithe OPLS-DA chun deighiltí meitibileach idir na ceithre ghrúpa mióblasts a léiriú (Fíor 3D-F). De réir mar a bhíothas ag súil leis, rinne samhlacha OPLSDA uasmhéadú ar na hidirdhealú meitibileach idir na ceithre ghrúpa tríd an bhfaisnéis athróg orthogonal chomhghaolaithe a choinneáil agus faisnéis athróg orthogonal neamh-chomhghaolaithe a scagadh amach. Ina theannta sin, rinneamar tástálacha iomalartaithe randamach (n=200) chun iontaofacht na samhlacha OPLS-DA (Fíor S6) a mheas, a léiríonn bailíocht na múnlaí OPLS-DA bunaithe.

2.4. Aitheantais Meitibilítí Difreálacha agus Tábhachtacha

Chun comparáid chainníochtúil a dhéanamh ar leibhéil meitibilíte idir na ceithre ghrúpa de mhioblastaí C2C12, rinneamar leibhéil choibhneasta na meitibilítí aitheanta a ríomh bunaithe ar a n-iomláine choibhneasta (Tábla S2). Mhéadaigh forlíonadh AKG go suntasach leibhéil intracellularAKG sna grúpaí Nor-A agus Íseal-A ach níor athraigh sé go mór iad siúd sa ghrúpa Nor-A agus Íseal. Rinneamar t-tástáil an Mhic Léinn chun meitibilítí difreálacha a aithint a raibh critéar p < 0.05 orthu (Fíor 4). D'aithin an chomparáid idir Nor vs. Low 29 meitibilít dhifreálach (Fíor 4A), lena n-áirítear 18 meitibilít feabhsaithe (leucine, isoleucine, valine, aicéatáit, glutamáit, glutamine, methionine, aspartate, lísín, creatine, PC (O-fosphocholine) taurine, tyrosine). , feiniolalainín, histidine, NAD móide , formate, AXP), agus 11 dhiúltaigh Metabo. lítear (glutathione, pyroglutamate, phosphocreatine, beta-alanine, GPC, glúcós, glicín, aicéatáit, threonine, GTP, UDP-glúcóis). Laghdaigh comparáid idir meitibilítí difreálach Íseal-A vs Íseal (Fíor 4B), lena n-áirítear 7 meitibilítí méadaithe (eatánól, AKGbeta-alanín, PC, taurine, glicín, agus GTP) agus 3 meitibilítí (glutamine, lísín agus myoinositol). D’aithin an chomparáid idir Nor-A agus Nor 18 meitibilít dhifreálach (Fíor 4C), lena n-áirítear 6 mheitibilít suas-rialaithe (AKG, pyroglutamate, glutamine, lísín, glúcós, lachtáit), agus 12 meitibilít ís-rialaithe (alanín, aicéatáit, glutathione). meitiainín, phosphocreatine, PC, myoinositol, glicín, threonine, GTP, UDP-glúcóis, agus AXP).

Fíor 4. Aithníodh déine coibhneasta meitibilítí difreálach ó chomparáidí péireáilte idir na ceithre ghrúpa mióblastaí C2C12. (A) Íseal vs Nor; (B) Íseal-A vs Íseal; (C) Nor-A vs Nor. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001.n { {13}} do gach grúpa.

Ina theannta sin, d'úsáideamar na samhlacha OPLS-DA chun meitibilítí tábhachtacha a aithint le critéar VIP > 1 (Fíor 5). Go hiomlán, aithníodh 12, 10, agus 10 meitibilítí tábhachtacha ó mhúnlaí OPLS-DA Nor-A vs Nor, Nor vs Low, Low-A vs.

Fíor 5. Aithníodh scóir VIP de mheitibilítí tábhachtacha ó chomparáidí péirewise idir na ceithre ghrúpa mioblasts C2C12. (A) Íseal vs Nor; (B) Íseal-A vs Íseal; (C) Nor-A vs Nor. Ciallaíonn cló Dearg/Gorm leibhéil mhéadaithe/laghdaithe an mheitibilíte.

Thug an meascán de na meitibilítí tábhachtacha aitheanta agus na meitibilítí difreálach meitibilítí tréithiúla (Tábla 1). D'aithin comparáidí péirewise Íseal vs Nor, Íseal-A vs Íseal, agus Nor-A vs Nor 10, 6, agus 10 meitibilítí tréithiúla, faoi seach, rud a léiríonn go raibh dlúthbhaint ag éifeachtaí forlíonta AKG ar mhioblastaí leis an bhfuinneamh. staid na gceall.

2.5. Meitibileach a Athraíodh go Suntasach a Aithint

Conairí Rinneamar anailís ar chonairí meitibileach chun cosáin mheitibileach a athraíodh go suntasach (cosáin shuntasacha) a aithint bunaithe ar leibhéil na meitibilítí a aithníodh ó na comparáidí pairwise idir na ceithre ghrúpa mióblastaí C1C12 (Fíor S7; Tábla 2 agus Tábla S3). D'aithin an anailís ar Nor vs. Low 11 chonair shuntasacha: (1) meitibileacht alanine, aspartate, agus glutamáit; (2) Glicine, serine, agus meitibileacht threonine; (3) meitibileacht Glutathione; (4) meitibileacht D-Glutamine agus D-glutamate; (5) meitibileacht stáirse agus siúcrós; (6) meitibileacht béite-Alanine; (7) meitibileacht taurine agus hypotaurine; (8) meitibileacht feiniolalainín; (9) biosintéis feiniolalainín, tyrosine agus tryptophan; (10) Meitibileacht Nicitínáit agus nicotinamide; (11) Meitibileacht histidine. Bhí baint ag an gcosán suntasach seo le meitibileacht fuinnimh, strus ocsaídiúcháin, agus flflux anaplerotic timthriall TCA.

Níor sainaithníodh san anailís ar Nor-A vs Nor ach na chéad chúig chonair shuntasacha 1–5 gan na sé chonair eile 6–11 a áireamh. Go héagsúil, níor aithníodh san anailís ar Íseal-A vs. Íseal ach sé chonair shuntasacha: na chéad cheithre chonair 1-4 roinnte ag comparáidí Íseal vs Nor, Nor-A vs Nor; dhá chonair 6-7 roinnte ag an gcomparáid Íseal vs Nor. Tabhair faoi deara nár athraigh forlíonadh AKG go suntasach cosán 5 (meitibileacht stáirse agus siúcrós) i gcealla saothraithe i meán glúcóis íseal, ach chuir sé isteach ar dhá chonair eile (meitibileacht béite-Alanine agus meitibileacht taurine agus hypotaurine). Chun athruithe AKG-spreagtha i meitibilítí sainiúla a shamhlú, rinneamar na meitibilítí seo a theilgean ar léarscáil meitibileach bunaithe ar bhunachar sonraí Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (Fíor 6). Baineadh leas forleathan as KEGG mar cheann de na príomh-acmhainní sonraí chun líonraí meitibileach a athchruthú agus leagann sé béim ar bhealaí suntasacha meitibileach. Soláthraíonn na meitibilítí saintréitheacha athraithe agus na cosáin mheitibileach atá athraithe go suntasach araon léargais nua ar na meicníochtaí móilíneacha is bun le héifeachtaí forlíonta AKG ar mhioblastaí C2C12.