Modhnú ar an nGlacadóir Hidreacarbóin Aryl Tionchar Conair Comharthaíochta Ar Macasamhlú Víreas Junín Cuid 1

Coimriú:

Is é víreas Junín (JUNV), ball den teaghlach Arenaviridae, gníomhaire etiological fiabhras hemorrhagic na hAirgintíne, galar endemic i réigiún tuaithe na hAirgintíne nach bhfuil ceimiteiripe sonrach ann. Cuirtear gabhdóir hidreacarbóin Aryl (AHR) in iúl i roinnt fíocháin mhamach agus tá sé curtha in iúl mar braiteoir ligands ó fhoinsí athraitheacha agus modulator ar fhreagairt imdhíonachta na cille.

Is víreas annamh é víreas Junin a théann i bhfeidhm ar chóras imdhíonachta an duine agus is cúis le freagairt imdhíonachta dian. Mar sin féin, ní díolúine an t-aon straitéis a theipeann ar an víreas Junin a chomhrac.

Ar dtús, tá sé tábhachtach go leor scíthe agus codlata a fháil chun do chóras imdhíonachta a choinneáil sláintiúil. Le linn codlata, scaoileann an comhlacht substaintí ar a dtugtar cytokines a chabhraíonn leis an gcóras imdhíonachta freagairt níos éifeachtaí ar víris agus bagairtí seachtracha eile.

Ar an dara dul síos, is iad nósanna itheacháin shláintiúla an eochair freisin chun díolúine a fheabhsú. Is féidir le bianna saibhir i vitimíní C agus D, cosúil le torthaí citris agus beacáin, cabhrú le freagairt imdhíonachta do chorp a threisiú.

Ina theannta sin, is féidir le cleachtadh measartha díolúine a fheabhsú freisin. Is féidir le cleachtadh cuí líon na gcealla bána fola sa chorp a mhéadú, rud a chuireann le cumas an chórais imdhíonachta.

Ar deireadh, tá staid mheabhrach maith an-tábhachtach freisin do shláinte an chórais imdhíonachta. Is féidir le strus agus imní cur isteach ar fhreagra imdhíonachta an chomhlachta, mar sin tá sé tábhachtach fanacht suaimhneach agus dearfach.

I mbeagán focal, cé go bhfuil tionchar ag víreas Junin ar an gcóras imdhíonachta, trí fheabhas a chur ar ár stíl mhaireachtála agus dearcadh dearfach a choinneáil, is féidir linn ár n-imdhíonacht a fheabhsú agus ionsaithe víreas a chosc agus a fhreagairt go héifeachtach. Ón taobh sin de, ní mór dúinn ár n-imdhíonacht a fheabhsú. Is féidir le Cistanche díolúine a fheabhsú go suntasach, toisc go bhfuil éagsúlacht de chomhpháirteanna bitheolaíocha gníomhacha ag fuinseog feola, mar shampla polaisiúicrídí, dhá bheacáin, Huang Li, etc. Is féidir leis na comhpháirteanna seo an córas imdhíonachta a spreagadh Cineálacha éagsúla cealla sa chóras, a ngníomhaíocht imdhíonachta a mhéadú.

Cliceáil forlíonadh cistanche deserticola

Is díol suntais é gur tugadh le fios i staidéir a rinneadh le déanaí go bhféadfadh ról a bheith ag gníomhachtú nó ag dúlagar an chonair chomharthaíochta AHR i dtoradh ionfhabhtuithe víreasacha éagsúla daonna. Sa tuarascáil seo, rinneadh anailís ar éifeacht modhnú cógaseolaíochta AHR ar ionfhabhtú in vitro JUNV. Léiríodh le scagthástáil tosaigh micrea-eagar go raibh an cosán AHR ró-bhrú i gcealla hepatic ionfhabhtaithe JUNV.

Ag an am céanna, cuireadh bac suntasach ar ionfhabhtú cealla Vero agus Huh leis na tréithchineálacha JUNV IV4454 agus Candid#1 ar bhealach a bhí ag brath ar dháileog trí chóireáil le CH223191, antagonist AHR ar leith, mar a braitheadh ​​​​ag measúnachtaí ionfhabhtaíochta, fíor- am RT-PCR agus inmunofluorescence a bhrath próitéiní víreasacha. Ina theannta sin, is cosúil go bhfuil ról pro-viral AHR in ionfhabhtú JUNV neamhspleách ar chonair IFN-I. Tacaíonn ár dtorthaí leis na peirspictíochtaí dóchasacha a bhaineann le modhnú cógaseolaíochta AHR mar sprioc ionchasach chun AHF a rialú.

Eochairfhocail:

Gabhdóir hidreacarbóin Aryl; víreas Junín; réimse víreas; fiabhras hemorrhagic na hAirgintíne; sprioc teiripeach óstach.

1. Réamhrá

Faoi láthair, tá fianaise ag méadú a thacaíonn go bhfuil an receptor hidreacarbóin airile (AHR) ina mhodhnóir tábhachtach ar fhreagra imdhíonachta an óstaigh agus cuireann an ghné seo le torthaí cliniciúla difreálach ionfhabhtuithe ag leibhéal an duine aonair agus an daonra [1,2]. Is gabhdóir cíteaplasma é AHR a chuirtear in iúl go uileláithreach i bhfíocháin mhamach, ag obair mar bhraiteoir ar raon leathan de ligands ingenous agus exogenous le bunús éagsúla cosúil le truailleáin, aiste bia, micribhithóim, agus meitibileacht óstach [3-5].

Go deimhin, tá sé molta go láidir go bhfuil tionchar mór ag AHR ar an idirghníomhú idir fachtóirí comhshaoil ​​​​agus ionfhabhtuithe víreasacha [1,2]. Chomh luath agus a aithníonn AHR móilín ligand, aistrítear é go dtí an núicléas áit a ndéanann sé heitrisiméiriú leis an tras-locator núicléach receptor hidreacarbóin aryl agus rialaíonn sé léiriú na ngéinte meitibileachta xenobiotic (CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1).

Is féidir le AHR idirghníomhú freisin le fachtóirí trascríobh eile, mar shampla NF-kB, chun raon leathan de bhealaí comharthaíochta a mhodhnú, lena n-áirítear iad siúd a bhfuil baint acu leis an bhfreagairt imdhíonachta [6-8]. Is féidir le AHR léiriú na ngéinte imdhíonrialaithe a mhodhnú agus cosáin difreála na gcealla dendritic athlastacha agus na gcealla T a athrú [9-11].

Léiríodh i staidéir le déanaí a rinne ár ngrúpa taighde go bhfuil ról pro-víreasach ag gníomhachtú chonair chomharthaíochta AHR le linn Zika (ZIKV), dengue (DENV), [12] agus coróinvíreas siondróm riospráide géar géar 2 (SARS-CoV{{). 4}}) ionfhabhtuithe [13]. Tabhair faoi deara, deimhníodh gur tháinig laghdú ar mhacasamhlú víreasach de bharr coisc AHR sna samhlacha víreasacha seo, rud a thaispeánann go léiríonn AHR straitéis fhrithvíreasach a bhfuil gealladh fúthu.

Is víreas genome RNA deighilte clúdaithe é víreas Junín (JUNV) ón teaghlach Arenaviridae [14]. Ionchódaíonn gach teascán RNA dhá phróitéin i dtreonna contrártha. Ar thaobh amháin, ionchódaíonn an teascán mór (L RNA) don RNA-spleách RNA polymerase (L) agus an próitéin maitrís (Z).

Ar an láimh eile, ionchódaíonn an deighleog bheag (S RNA) don nucleoprotein (NP) agus don réamhtheachtaithe glycoprotein (GPC), atá scoilte ag proteases chun trí fho-aonaid (GP1, GP2, agus an peptide comhartha SSP) a tháirgeadh. coinnithe le chéile chun an coimpléasc glycoprotein a fhoirmiú [14].

Is é JUNV gníomhaire etiological fiabhras hemorrhagic na hAirgintíne (AHF) [15], galar endemic a dhéanann difear don daonra oibrithe tuaithe i réigiún tais Pampa na hAirgintíne. Tabhair faoi deara, is gné shainiúil de AHF an raon leathan comharthaí cliniciúla a chuireann othair ionfhabhtaithe i láthair. Tarlaíonn galar asymptomatic nó éadrom, le hairíonna cosúil le fliú, i 70-80 faoin gcéad de na hionfhabhtuithe. Mar sin féin, baineann cásanna tromchúiseacha le deacrachtaí hemorrhagic agus néareolaíocha le ráta mortlaíochta idir 20 agus 30 faoin gcéad in othair ospidéil [15].

Is é an rud is tábhachtaí ná go bhfuil sé cruthaithe go bhfuil vacsaín beo mhaolaithe darb ainm Candid#1 an-éifeachtach chun cásanna tromchúiseacha AHF a chosc [15,16]. Mar sin féin, is é an t-aon chóireáil atá ar fáil i gcoinne an ghalair ná plasma imdhíonachta a riaradh ó othair téarnaimh; teiripe a léiríodh chun líon na gcásanna marfach a laghdú ach amháin má riartar laistigh de 8 lá tar éis na chéad chomharthaí a thosú [17].

Cé gur bailíodh go leor píosaí fianaise le blianta beaga anuas ar éifeacht AHR le linn ionfhabhtuithe, níl aon fhianaise shoiléir ann go fóill ar a ról le linn ionfhabhtuithe arenaivíris [2].

Toisc go bhfuil daonra na tuaithe i gcónaí faoi lé ligands AHR, mar thruailleáin ón tionscal talmhaíochta mar agrochemicals, lotnaidicídí, agus seachtháirgí dócháin breosla iontaise [18], rinneamar measúnú san obair seo ar thionchar modhnú cógaseolaíochta in vitro AHR ar an. freagairt cheallacha ar ionfhabhtú JUNV agus úsáid fhéideartha AHR mar sprioc iarrthóra le haghaidh idirghabháil theiripeach i ngalar AHF.

2. Ábhair agus Modhanna

2.1. Línte Cille

Úsáideadh na línte cille seo a leanas: Huh-7 (JCRB Cell Bank #0403) agus HepG-2 ATCC HB8065, dhá líne chill charcanóma díorthaithe heipiticítí daonna; Vero ATCC CCL-81, líne cille epithelial duánach díorthaithe ó mhoncaí. Saothraíodh gach líne cille in Íosmhéid Meán Riachtanach Eagle (MEM) (Gibco, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, SAM) arna chomhlánú le serum lao nuabheirthe 5 faoin gcéad (NBCS) (Gibco, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, SAM) agus forlíonta le 50 µg/mL gentamycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAM), piorúvate sóidiam 1 mM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAM), 2 mM L-glutamine (Gibco, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, SAM), agus maolánaithe le HCl/NaHCO3. Rinneadh na línte cille a chothú agus a chothabháil ag 37 ◦C le atmaisféar 5 faoin gcéad CO2.

2.2. Amhrán víreasach

Baineadh úsáid as na tréithchineálacha víreasacha seo a leanas: an brú IV4454 arna mhaolú go nádúrtha a fuarthas ó chás daonna éadrom de AHF [19] agus an brú Candid#1 arna mhaolú ag vacsaín [20]. Baineadh úsáid as cealla Vero chun stoic víreas a ghiniúint agus chun toirtmheascadh víris trí mheasúnú plaic caighdeánach.

Rinneadh an obair ar fad le gníomhairí ionfhabhtaíocha in áiseanna Bithshábháilteachta Leibhéal 2 agus cheadaigh an Oifig um Shláinte agus Shábháilteacht Chomhshaoil ​​i Scoil na nEolaíochtaí, Ollscoil Buenos Aires í. Rinneadh vacsaíniú ar gach pearsanra a raibh baint acu le nósanna imeachta ionfhabhtaithe le Candid-1 arna sholáthar ag Instituto Nacional de Enfermedades Virales Humanas an Dr. JI Maiztegui (Pergamino, Buenos Aires, an Airgintín).

2.3. Anailís Microarray

San iomlán de 5 × 10 Cuireadh síolú cealla 5 HepG2 i bhfleascáin saothraithe 25 cm2 agus ionfhabhtaithe le JUNV IV4454 ag iliomad ionfhabhtaithe (MOI) de 1 nó bréige-ionfhabhtaithe. Baineadh RNA agus íonú ag baint úsáide as RNAeasy (Qiagen, Hilden, an Ghearmáin) ag 24 agus 48 h iar-ionfhabhtú (pi). Rinneadh tiúchan RNA a thomhas ag baint úsáide as Nanodrop. Sainaithníodh próifílí slonn géine de chealla HepG2 ag baint úsáide as anailís microarray (Affymetrix Human U133 Plus 2.0 GeneChips) chun géinte óstaigh a rialaítear go tras-aistrithe ag ionfhabhtú a aithint.

Ríomhadh líon iomlán na ngéinte óstaigh arna rialú go suntasach ag ionfhabhtú le haghaidh gach pointe ama trí ghéinte a shainaithint a léirigh, ar a laghad, athrú slonn 1.6-agus dóchúlacht 95 faoin gcéad de bheith curtha in iúl go difreálach (p {{). 3}}.05).

Úsáideadh na bogearraí WebGestalt (http://www.webgestalt.org, ar tugadh rochtain air an 3 Iúil 2020), a úsáideann bunachar sonraí Wikipathways le haghaidh Ontology Géine agus anailísí ar róionadaíocht chosáin. Rinneadh turgnaimh mhacasamhail ar laethanta éagsúla (n=3 thurgnaimh neamhspleácha in aghaidh an choinníll).

2.4. Comhdhúile Beaga Móilín

An t-antagonist iomaíoch AHR-shonrach sintéiseach CH223191, 1-Meitile-N-[2-meitil4-[2-(2-meitil feinil)dé-aséinil]feinil]{ {9}}H-pyrazole-5-carboxamide (Tocris Bioscience, Bristol, An Ríocht Aontaithe), a thuaslagadh i sulfocsaíd démheitil (DMSO) agus úsáideadh ag tiúchan 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40, agus 80 µM.

Ba é an meitibilít tryptophan L-kynurenine, (2S)-2-Aimín-4-(2-aminophenyl)-4-aigéad ocsabútánóic (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAM) intuaslagtha in DMSO agus in úsáid ag tiúchan 2.5, 5, 10, 20, 40, 80, 160, agus 320 µM.

Rinneadh na cóireálacha go léir in éagmais solais, ós rud é go gcuireann na comhdhúile fóta-íogaireacht i láthair.

2.5. Measúnachtaí Inmharthanachta Cille

Ar mhaithe le hinmharthanacht cille a chinneadh, fásadh monaiteoirí cille Huh-7 agus Vero i 96 pláta tobair ar feadh 24 h i MEM 5 faoin gcéad NBCS. Cóireáladh monaiteoirí cille ag comhluadar 90 faoin gcéad le tiúchain éagsúla CH223191 (1.25 µM go 80 µM) agus kynurenine (5 µM go 320 µM) ar feadh 72 h. Cóireáladh bréige leis an tiúchan céanna DMSO leis an dáileog is airde de chóireáil ligand agus measadh é mar 100 faoin gcéad d'inmharthanacht na gceall.

Rinneadh na cóireálacha go léir i gceathairdhúblach. Rinneadh inmharthanacht na gceall a mheas leis an 3-(4,5-démheitilthiazol-2-il)-2,5-bróimíd défheinile tetrazolium (MTT) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAM) measúnacht. Tomhaiseadh ionsú ag 570 nm i léitheoir microplate FLUOstar OPTIMA. Socraíodh faoin gcéad inmharthanacht cille trí thorthaí ionsúcháin cóireála a choibhneasú ag baint úsáide as luachanna ionsúcháin Bréige.

Ina theannta sin, rinneadh staidéar ar chumas fáis agus ar mhoirfeolaíocht cealla cóireáilte faoi mhicreascóp solais. Tógadh pictiúir ag 72 h le micreascóp Nikon Eclipse TS100; formhéadú: 100 ×; NA: 0.25.

2.6. Cóireálacha agus Ionfhabhtuithe Víreasacha

Réamhchóiríodh monaiteoirí cille Vero agus Huh{{{0}} le CH223191 agus caolaíodh kynurenine i MEM 1.5 faoin gcéad NBCS ar feadh 1 h nó 24 h, faoi seach, ag 37 ◦C. Baineadh úsáid as CH223191 ag comhchruinnithe idir 1.25 agus 20 µM, agus baineadh úsáid as cicinnéinín ag comhchruinnithe idir 5 agus 80 µM. Ansin, rinneadh ionfhabhtú víreasach le brú IV4454 nó Candid#1 ag MOI de 0.5. Tar éis 1 h, baineadh an ionacula agus nochtadh na cealla don dá chomhdhúil ar feadh 48 h ag na tiúchain a luaitear. Ag 48 h pi bailíodh súithíní le haghaidh measúnacht plaic agus próiseáladh monaiteoirí cille le haghaidh imdhíonfhluaraiseacht indíreach nó RT-qPCR.

2.7. Imdhíonfluaraiseacht Indíreach

Socraíodh monolayers Huh-7 cóireáilte le CH223191 nó kynurenine agus ionfhabhtaithe le JUNV mar a luadh thuas ag 48 h pi le meatánól ar feadh 10 nóiméad ag −20 ◦C, nite trí huaire le PBS, agus stóráil i PBS úr ag 4 ◦C go dtí an phróiseáil.

Baineadh úsáid as na hantasubstaintí seo a leanas: antasubstaintí frith-NP mhonaclónacha príomhúla luiche (1:200) (NA05-AG12) [21] agus antashubstaintí gabhair frith-luiche comhchuingeacha tánaisteacha Alexa Fluor 488 (1:200) (A{{ 10}}) (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, SAM). Rinneadh núicléis cille a dhathú le 40,6-diamidino{-2- feinilindól (DAPI) (1:1000) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAM). Fuarthas sonraí micreascópachta agus grianghrafadóireachta ag baint úsáide as micreascóp fluaraiseachta Olympus IX71 le ceamara QImaging Exi-Aqua ceangailte (méid picteilín: 6.45 µm; limistéar fóta-bhrathaire: 1392 × 1040 picteilín2 ).

Rinneadh cainníochtú sonraí fluaraiseachta ag baint úsáide as bogearraí Fidsí (leagan 1.53v) (Institiúidí Náisiúnta Sláinte, Bethesda, MD, SAM). Rinneadh cainníochtú láimhe ar núicléas daite DAPI agus ar chealla NP-dearfach de láimh tríd an breiseán cuntar cille atá san áireamh i mbogearraí Fidsí (leagan 1.53v). Measadh go raibh cealla dearfach dá bhféadfaí staining antigen víreasach NP a bhrath. Cuireadh an céatadán de chealla NP-dearfach in iúl mar an cóimheas idir cealla NP-dearfach agus cealla iomlána i ngach réimse agus ansin rinneadh an meánchéatadán a chinneadh agus a chur i láthair.

Fuarthas déine fluaraiseachta na gcealla NP-dearfach trí mheánluach liath cealla aonair a thomhas agus fluaraiseacht chúlra a dhealú. Cuireadh teorainn le fócais víreasacha trí bhreithniú a dhéanamh ar ghrúpaí de chealla NP-dearfach timpeallaithe ag cealla diúltacha NP. Áiríodh fócais víreasacha ar 3 íomhá dhifriúla ó 3 réimse éagsúil a roghnaíodh go randamach agus shocraigh líon na gceall a chruthaigh iad an meánmhéid fócais.

2.8. Brath Aigéad Núicléach Víreasach

Rinneadh eastóscadh aigéid núicléigh ó mhonaiteoirí cille ionfhabhtaithe trí úsáid a bhaint as trealamh Highway ADN/ARN PuriPrep-VIRUS K1501 (Inbio Highway, Buenos Aires, an Airgintín), de réir threoracha an mhonaróra. Rinne RT-qPCR cainníochtú ualach víreasach RNA JUNV agus tras-scríbhinní ceallacha. Rinneadh tras-scríobh droim ar ais ag baint úsáide as priméirí randamacha agus transcriptase droim ar ais víreas leoicéime Moloney murine (M-MLV RT).

Le haghaidh aimpliú blúirí, úsáideadh na primers seo a leanas: JUNV-np (Ar Aghaidh: 5 0 -GGC ATC CTT CAG AAC ATC-30, Droim ar ais: 50 -CGC ACA GTG GAT CCT AGGC{{4} } ), ahr (Ar Aghaidh: 50 -ATC CTT CCA AGC GGC ATA GAG ACC-30; Droim ar ais: 50 -CAA AGA AGC TCT TGG CTC TCA GG-30 ), cyp1a1 ( Ar Aghaidh: 50 -TTCCGACACTCTTCCTTCGT-30; Droim ar ais: 50 -ATGGTTAGCCCCATAGATGGG-30 ), -actin (Ar Aghaidh: 50 -TTA GTT GCG TTA CAC CCT TTC TTG{{17} }}; Droim ar ais: 50 -TCA CCT TCA CCG TTC CAG TTT-30 ). Seo a leanas sonraí an timthrialla PCR: dínádúrú tosaigh 2 nóiméad ag 95 ◦C; 45 timthriall aimpliúcháin comhdhéanta de 30 soicind ag 95 ◦C, 1 nóiméad ag 58 ◦C, agus 1 nóiméad ag 72 ◦C; timthriall deiridh 5 nóiméad ag 72 ◦C; ar deireadh, rinneadh curves leá. Rinneadh an bhrath ag baint úsáide as trealamh MyiQ2 (Saotharlanna Bith-Rad, Hercules, CA, SAM). Tuairiscíodh na torthaí mar 2−∆∆Ct (Fillte athrú) agus normalaithe ag baint úsáide as -actin mar ghéin coimeád tí.

2.9. Measúnacht Plaic

Socraíodh táirgeacht víreasach trí mheasúnú plaic caighdeánach. Bailíodh forlíonta cille agus ullmhaíodh caoluithe sraitheach chun monaiteoirí cille Vero a ionfhabhtú ar feadh 1 h ag 37 ◦C. Tar éis asaithe víreasach, baineadh an ionacula, cuireadh MEM 5 faoin gcéad NBCS arna fhorlíonadh le 0.7 faoin gcéad methylcellulose agus goraíodh cealla ar feadh seachtaine 1 ag 37 ◦C i gorlann 5 faoin gcéad CO2. Ina dhiaidh sin, socraíodh monolayers cille le 10 faoin gcéad formaildéad, nite, agus dhaite le criostail Violet. Ríomhadh titer víreasach tar éis cainníochtú aonad foirmithe plaic (PFU).

2. 10. Anailís staitistiúil

Rinneadh anailís staitistiúil Microarray trí úsáid a bhaint as bogearraí WebGestalt (http://www.webgestalt.org/, ar rochtain air an 3 Iúil 2020). Déantar cur síos ar shonraí mar mheán ± SD One-Way ANOVA le tástáil post hoc Dunnett ag GraphPad Prism 8 (leagan 8.0.1) do Windows 11 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) chun tábhacht staitistiúil a mheas. p Measadh níos lú ná nó cothrom le 0.05 a bheith suntasach go staitistiúil.

For more information:1950477648nn@gmail.com