Gníomhaíocht Dhídhathaithe Melanin d'Einsímí Frithocsaídeacha, Glutathione Peroxidase, Thiol Peroxidase, Agus Cataláis

Déan teagmháil le:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Gyeongchan Jeon¹· Chinhan Kim²· An Ríocht Aontaithe Min Cho²· Ee Taek Hwang³· Hyung Seo Hwang⁴· Jiho Min¹

Teibí

Is é melanin an fachtóir is tábhachtaí chun dath craiceann a chinneadh. Tá go leor iarrachtaí taighde á ndéanamh chun na comhdhúile melanin a tháirgtear cheana féin i gcraiceann a dhianscaoileadh ar mhaithe le háilleacht. Rinne an taighde seo imscrúdú ar na héifeachtaí ar laghdú dath melanin de na trí einsím frithocsaídeach, Glutathione peroxidase (GPX), Thiol peroxidase (TPX), agus Catalase, i gcodán lysosomal. Cóireáladh tuaslagán melanin leis na heinsímí agus sárocsaíd hidrigine, ansin imoibríonn sé ar feadh 48 h. Rinne GPX agus TPX melanin dídhathaithe, agus eatarthu, bhí GPX níos éifeachtaí, ach ní raibh Catalase éifeachtach. Chuir GPX bac freisin ar tháirgeadh melanin i gcealla meileanoma B16F10. Tá ról tábhachtach ag GPX, atá i láthair i mbeagnach gach miocrorgánach, sa mheicníocht cosanta ceallacha ag speicis ocsaigin imoibríoch. Ina theannta sin, ní raibh sé citotocsaineach ach bhí sé éifeachtach go suntasach maidir le dath melanin a dhí-dhathú. Dá bhrí sin, sa réimse bitheolaíoch agus micribhitheolaíochta, tá an fhéidearthacht úsáid a bhaint as i gcosmaidí whitening craiceann.

Eochairfhocail Melanin · Glutathione peroxidase (GPX) · Thiol peroxidase (TPX) · Catalase · B16F10 · Lysosome

Is comhábhar craiceann-bhánú é Cistanche.

Réamhrá

Tá aghaidh glan ar cheann de na heilimintí riachtanacha a bhaineann le háilleacht do dhaoine nua-aimseartha, go háirithe tá Asians díograiseach faoi chraiceann bán. Is é cumaisc melanin an fachtóir is tábhachtaí maidir le dath craiceann a chinneadh. Tá sé idirdhealú ó eumelanin a bhfuil dath dubh nó donn, agus pheomelanin, a bhfuil mar thoradh bándearg go dearg lí [1]. Déantar comhdhúil melanin a shintéisiú trí ocsaídiú tyrosine i gcealla melanocyte, atá le fáil i gciseal basal an eipideirm; agus is é príomhról an lí seo sa chraiceann ná an deirm a chosaint trí radaíocht ultraivialait díobhálach a bhacadh [2, 3]. Mar sin féin, má tá an iomarca comhdhúile melanin i láthair i gcraiceann, déanann sé craiceann dorcha agus neamhghlan, agus féadann sé hyperpigmentation a chur faoi deara, cosúil le melasma [4].

Tá go leor staidéar déanta ar chosmaidí cúram craicinn a réitíonn na fadhbanna seo, ach tá feidhm ag an gcuid is mó de na cosmaidí whitening craiceann atá forbartha faoi láthair chun sintéis melanin a chosc trí mheicníochtaí éagsúla, cosúil le bac a chur ar ocsaídiú tyrosine, nó ga UV is féidir a chur chun cinn. sintéis melanin [5]. Glacann na táirgí seo le fada a bheith éifeachtach, agus níl siad éifeachtach le haghaidh comharthaí sonracha, mar shampla hyperpigmentation [6]. Faoi láthair, is modh tipiciúil chun melanin a bhaint atá déanta cheana féin ná cóireáil léasair [7]. Má fhorbraítear ábhair ar féidir leo na fadhbanna seo a réiteach gan nósanna imeachta den sórt sin, beidh an-áisiúlacht acu sa réimse bitheolaíoch agus cosmaideach.

I dtaighde roimhe seo, rinneamar iarracht bealach a aimsiú chun na comhdhúile melanin a táirgeadh cheana féin a dhídhathú. Bhí tuarascálacha taighde ann maidir le comhghaol líseasóim agus meileanin. Tá sé an-dóchúil go ndíghrádóidh keratinocytes difreáilte go háirithe na meileanóimí eistreacha de réir na gcineál feidhmeanna uathphagacha bunúsacha a rialaíonn méid na n-organelles cheallacha, nó a bhaint as na horgánaigh lochtacha, mar shampla peroxisome [8]. Imríonn an cosán autophagic, ó cíteaplasma go lísisóm, ról suntasach i díghrádú meileanosomes i epidermalkeratinocytes daonna [9]. Soláthraíonn na sonraí seo fianaise go gcuireann einsímí sonracha lysosomal le díghrádú melanin. Roimhe seo, fuaireamar gníomhaíocht laghdaithe datha melanin den einsím i gcodán lysosomal, coimpléasc ina bhfuil hidrealasáití chun dramhábhar agus smionagar ceallacha a bhriseadh síos i sárocsaimóim agus líseasóim [10, 11]. Rinne an páipéar seo staidéar ar éifeachtaí na dtrí einsím roghnaithe, Glutathione peroxidase, Thiol peroxidase, Catalase, i gcodán lysosomal chun dath melanin a laghdú. Gníomhaíonn na sárocsaídí seo chun cosaint a dhéanamh i gcoinne damáiste cille de bharr speiceas ocsaigin imoibríoch (ROS), agus tá siad i láthair i ngach eukaryotes [12].

Déantar speiceas ocsaigin imoibríoch (ROS) a fhoirmiú mar fhotháirge nádúrtha de ghnáth-mheitibileacht ocsaigine i gcealla, agus is féidir iad a mhéadú le strus comhshaoil. Is féidir le ROS ardghinte damáiste a dhéanamh do chealla. Is iad seo a leanas éifeachtaí díobhálacha ROSon na cille [12, 13]: damáiste DNA orRNA, ocsaídiúcháin aigéid shailleacha il-neamhsháithithe i lipidí, ocsaídiúcháin aimínaigéid i bpróitéiní, agus díghníomhú ocsaídiúcháin einsímí sonracha trí ocsaídiú cofactors. Neodraíonn na cealla an ROS trí chóras frithocsaídiúcháin chun damáiste fíocháin den sórt sin a chosc. Sa chóras seo, tá an t-superoxideanion a tháirgtear ag an meitibileacht thar a bheith tubaisteach; cé go ndéantar é a thiontú go sárocsaíd hidrigine le Superoxide dismutase (SOD), tá an sárocsaíd hidrigine fós imoibríoch. Déantar an sárocsaíd hidrigine a chlaochlú go H2O byCatalase, agus ídiú i dtáirgeadh Glutathionedisulfide (GSSG) ó Glutathione trí chatalú GPX. Oibríonn TPX mar an gcéanna le GPX [13].

Rinne an staidéar seo taighde ar éifeacht dídhathaithe melanin trí einsím frithocsaídeach, GPX, TPX, agus Catalase. Mar thoradh air sin, bhí GPX agus TPX éifeachtach chun dath melanin a laghdú. Ina measc, ní raibh aon chiteatocsaineacht ag GPX ag an tiúchan is fearr de ghníomhaíocht dídhathaithe melanin, agus chuir sé bac ar shintéis melanin go héifeachtach. Dá bhrí sin, cuireann sé fianaise ar fáil go bhfuil ról tábhachtach ag GPX i dtéamamacht dídhathú melanin den chodán lysosomal, ní hamháin gníomhaíocht frithocsaídeach, agus cuireann sé an poitéinseal de ghníomhaire cosmaideach whitening nua mar einsím amháin.

Abhair agus modhanna

Measúnacht Ghníomhaíochta Sárocsaídáis agus Peirocsaídáis

Socraíodh tiúchan na dtrí sárocsaídí (Glutathione Peroxidase, Thiol Peroxidase, agus Catalase) trí threalamh (trealamh measúnaithe Peroxidase, D2PD-100, QuantiChromTM) a ceannaíodh ó Bioassay Systems. Ceannaíodh Glutathione peroxidase 2(GPX2, NBP1-78,824, Novus) agus Thiol peroxidase (TPX, NBP1-78,805, Novus) ó Novus, agusCatalase (9001-05-2, Sigma-Aldrich ) a ceannaíodh óSigma-Aldrich.

Úsáideann an trealamh measúnachta seo H2O2 agus ruaim deontóra leictreoin a fhoirmíonn resorufin le linn an sárocsaídáis. Rinneadh an mheasúnacht ag teocht an tseomra (RT), agus tomhaiseadh déine an dhath ag 570 nm. Imoibríodh na sárocsaídí leis an dath deontóra leictreoin le 0.6 faoin gcéad sárocsaíd hidrigine ar feadh 10 nóiméad ag RT. Tar éis imoibriúcháin, cuireadh an stop-imoibrí leis, agus tomhaiseadh ionsúiteacht an tsampla trí speictreafótaiméadracht mhicreaphláta. Ríomhadh an ghníomhaíocht mar seo a leanas:

Gníomhaíocht peroxidase=RSAMPLE −RBLANK × [Resorufin](𝜇M) × Imoibriú Vol(𝜇L)RRESORUFIN −RH2 O t(nóim) Sampla Vol(𝜇L)

(U/L). Déanfaidh aonad amháin (U) d'einsím catalú ar fhoirmiú 1 μmole resorufin in aghaidh an nóiméid faoi na coinníollacha measúnaithe. Anseo tá RSAMPLE, RBLANK, RRESORUFIN, agus RH2O mar ionsú ar an Sampla, an Bán Samplach, an Resorufin, agus an Uisce, faoi seach; agus n an fachtóir caolaithe samplach. Is é an [Resorufin] don mheasúnacht seo ná 50 μM. Is é 100μL an Imoibriúchán Vol, agus is é 10 μL an Vol Samplach sa staidéar seo.

Dídhathú melanin le Glutathione Peroxidase (GPX), Thiol Peroxidase (TPX), agus Cataláis

Cuimsíonn an tuaslagán melanin {{0}.1 mM PBS (salainn mhaolánach fosfáite, pH: 7.0) agus púdar melanin (Sintéiseach, Sigma) a ullmhaíodh trí ocsaídiú tyrosine le sárocsaíd hidrigine. Rinneadh an t-ábhar melanin a thomhas ag an ionsúchán ag 450 nm. Chun an tiúchan melanin a chinneadh, ullmhaíodh cuar caighdeánach ó chaighdeán barántúil melanin sintéiseach (R2=0.999, sonraí nach bhfuil léirithe).

Chun dídhathú melanin a fhíorú, imoibríodh RT ag 100 ppm tuaslagán melaninín ina raibh (50 go 1000) μU/L Peroxidases (GPX, TPX, Catalase) le sárocsaíd hidrigine 1 mM, agus tomhaiseadh gach lá é. Cinneadh luach dídhathaithe melanin tríd an tiúchan melanin a dhealú tar éis an imoibrithe, ón luach tosaigh.

Cuireann cistanche bac ar shintéis melanin.

Cultúr na Cille

Ceannaíodh na cealla melanoma lucha B16F10 (KCLB 80008) ó Bhanc Líne Cille na Cóiré (KCLB, Seoul, an Chóiré). Saothraíodh na cealla i Meán-Iolar Athraithe Dulbecco (DMEM) ina raibh 4500 mg/L glúcóis, 4 mM l-glutamine, piriváit sóidiam 1 mM, lenar cuireadh 10 faoin gcéad de shéiream bó féatais (FBS), 20 mM HEPES, 1 faoin gcéad peinicillin, agus gor na cealla i riocht humidified ina raibh 5 faoin gcéad CO2 ag 37 céim. Athraíodh an meán gach 2 lá (d), agus baineadh na cealla trí úsáid a bhaint as tuaslagán trypsin/EDTA.

Measúnacht Inmharthanachta Cille (MTT)

Deimhníodh éifeacht thocsaineach glutathione peroxidase ar chill mela-noma B16F10 le measúnacht MTT, modh ginearálta a úsáidtear chun éifeacht samplach ar inmharthanacht cille greamaitheacha a chinneadh. Úsáideann an measúnacht seo 3-(4,5-démheitiol-thiazol-2-il)-2,5-bróimíd tetrazolium défheinile (MTT) ar féidir a laghdú go formasan trí mhiotachondrial einsím i viablecell. Síolaíodh na 3 × 103 cill in aghaidh an tobair i 96-phláta tobair, agus goraíodh iad ar feadh 24 u. Ansin cuireadh sampla toeach go maith, agus gor ar feadh 72 h. Tar éis sin, malartaíodh an meán go ceann ina raibh 0.5 mg/mL de MTT, agus gor ar feadh 2 h. Ansin, baineadh an t-imoibrí lí MTT, agus tuaslagadh an formazan ginte ag DMSO ar feadh 30 nóiméad. Mar fhocal scoir, rinneadh tiúchain formazan a thomhas ag 570 nm ag baint úsáide as speictrophotometry micreaphláta. Ríomhadh inmharthanacht na cille mar seo a leanas: inmharthanacht cille ( faoin gcéad ) { { 20 }} (Asample − folamh)/(Acontrol − bán)*100.

cistanche i Hiondúis

Melanin Contentsay

Síolaíodh na cealla 3 × 105 B16F10 in aghaidh an tobair i 6-phláta tobair, agus goraíodh iad ar feadh 24 h chun cloí leo. Malartaíodh meán gach tobair le ceann ina raibh tiúchan éagsúla einsím agus 10 nM -MSH, agus ansin gortha ar feadh 72 u. Ina dhiaidh sin, nite na toibreacha go léir le maolán DPBS, agus baineadh úsáid as tuaslagán trypsin/EDTA 0.5 faoin gcéad. Rinneadh na millíní cealla a fuarthas trí lártheifneoiriú a líseáil le 200 μL de 1 N NaOH ina raibh 10 faoin gcéad DMSO ar feadh 1 h ag 80 céim . Ar deireadh, tomhaiseadh an t-ábhar melanin lysed ag an ionsúiteacht ag 450 nm. Socraíodh éifeachtúlacht coiscthe táirgeadh melanin na heinsíme i gcomparáid le rialú dearfach ag baint úsáide as 100 mg/ml de arbutin.

Torthaí

Gníomhaíocht Peroxidase de Glutathione Peroxidase (GPX), Thiol Peroxidase (TPX), agus Catalase

Is taighde leathnaithe é an staidéar seo ar chur i bhfeidhm cóireála codáin lys-osómach chun comhphunt melanin in vitro agus in vivo a dhídhathú. I staidéar roimhe seo, fuair muid amach go bhfuil an éifeacht ag codán lysosomal scoite amach ó chealla Hela, S. cerevisiae, ubh na gcearc laghdú dath melanin, agus anBhain éifeachtúlacht dídhathú melanin le gníomhaíocht peroxidase an codán lysosomal neamh-membrane codánach microsomal, lena n-áirítear lysosomes agus per- oxisomes. Chun éifeacht laghdaithe dath melanin sárocsaídeas a dhearbhú, roghnaíodh trí peroxidases, Glutathione peroxidase (GPX), Thiol peroxidase (TPX), agus Catalase. Tá ról tábhachtach ag na heinsímí seo maidir le strus ocsaídiúcháin de bharr speiceas ocsaigin imoibríoch i gcealla a laghdú [14].

Socraíodh gníomhaíocht na n-einsímí seo trí threalamh measúnachta (trealamh measúnachta Peroxidase, D2PD-100, QuantiChrom™). Bhí an modh seo bunaithe ar ocsaídiú lí deontóra leictreon a fhoirmíonn dath bándearg le linn an imoibrithe peroxidase [15]. Léiríodh an ghníomhaíocht sárocsaídáis ag baint úsáide as na haonaid seo a leanas: 1 Aonad=1 U=foirmiú 1 µmól resorufin in aghaidh an nóiméid faoi na coinníollacha measúnaithe. Déanann Tábla 1 achoimre ar ghníomhaíocht agus ar thiúchan na dtrí sárocsaíd, GPX, TPX, agus Catalase.

Gníomhaíocht Dídhathaithe Melanin de Glutathione Peroxidase (GPX), Thiol Peroxidase (TPX), agus Catalase

Chun éifeacht dídhathaithe melanin na sárocsaídí a dhearbhú, déileáladh le tuaslagán melanin 100 ppm le sárocsaíd hidrigine 1 mM agus (50 go 1000) tiúchan µU/L de gach sárocsaídeas. Rinneadh imoibriú ar na samplaí ar feadh 2 lá ag RT, ansin i gcomparáid leis an tiúchan tosaigh. Léiríonn Figiúr 1 an laghdú melanin tar éis 48 h. Léiríonn Fíor 1 an fhianaise go bhfuil gníomhaíocht dídhathaithe melanin ag TPX agus GPX. Ní raibh aon éifeacht ag an gcataláis maidir le dath melanin a laghdú (Fíor 1a). Bhí an TPX éifeachtach ag dídhathú comhdhúile melanin, agus b'fhearr an éifeachtúlacht nuair a chóireáiltear é ag tiúchan 1 µU/mL (Fíor 1b). Bhí gníomhaíocht laghdaithe datha melanin ag an GPX freisin, a bhí níos fearr ag tiúchan 0.2 µU/mL, agus laghdaigh sé de réir a chéile ag tiúchan níos airde (Fíor 1c). Léiríonn an luach seo 175 faoin gcéad feabhsaithe dath melanin, i gcomparáid leis an rialú cóireáilte le sárocsaíd hidrigine amháin. Bhí an GPX níos éifeachtaí i dtéarmaí gníomhaíochta tiúchana agus peroxidase, i gcomparáid le TPX. Cóireáil 0.2 µU/mL GPX agus sárocsaíd hidrigine 1 mM godídhathaigh tuaslagán melanin 13 faoin gcéad de 100 ppm melanin for4 d (Fíor.2). Mar sin féin, níor léirigh GPX ná TPX aon éifeacht laghdaithe datha in éagmais sárocsaíd hidrigine (ní thaispeántar na sonraí).

Tábla 1 Sonraí sonracha na n-einsímí, Glutathione Peroxidase 2, Thiol Peroxidase agus Catalase

Éifeacht Inmharthanachta Cille Glutathione Peroxidase (GPX) agus H2O2on B16F10

Deimhníodh éifeacht GPX ar inmharthanacht melanomacells B16F10 le measúnacht MTT, roimh an tástáil um chosc ar sintéis melanin. Chun an tiúchan ceart sárocsaíd hidrigine a fháil le cóireáil, rinneadh measúnú ar Chitotocsaineacht trí chóireáil le sárocsaíd hidrigine ar feadh 72 h ag tiúchan éagsúla. Faoin tiúchan de 0.1 mM, ní raibh aon tocsaineacht cille ag H2O2 do na cealla ar feadh 72 h, agus ag tiúchan os cionn 1 mM, breathnaíodh tocsaineacht mhór. (Fíor 3a). Rinneadh measúnú ansin ar éifeacht GPX ar mharthanas cille i láthair 0.1 mM sárocsaíd hidrigine, nach raibh citotocsaineach. Ní raibh aon chiteatocsaineacht ag an GPX do chealla B16F10 faoi bhun an chomhchruinnithe de 0.5 μU/mL, a bhí éifeachtach i staidéir melaninde dhathaithe (Fíor 3b).

Fíor 1An laghdú coibhneasta dath melanin i gcomparáid le cóireáil ach sárocsaíd hidrigine.

Éifeacht Glutathione Peroxidase (GPX) agus Sintéis Melanin H2O2on i gCealla Meileanoma B16F10

Rinneamar taighde ar éifeacht GPX, a bhí an-éifeachtach maidir le dídhathú melanin, ar shintéis melanin i meil-ainicítí. Taispeánann Figiúr 4 an t-ábhar melanin i gcealla meileanóma B16F1{0 cóireáilte le gach sampla ar feadh 72 h. Ba é an chóireáil le 0.05 μU/mL de GPX agus 0.1 mM H2O2 ba chúis leis an gcosc ba mhó ar mheileanogenesis 43 faoin gcéad i gcomparáid le rialú (cóireáil le -MSH amháin). Bhí sé seo 153 faoin gcéad níos airde ná an rialú dearfach (cóireáil le Arbutin agus -MSH), agus 22 faoin gcéad níos airde ná sin le sárocsaíd hidrigine gan einsím, cé nár léirigh cóireáil GPX laghdú drámatúil melanin in éagmais sárocsaíd hidrigine mar sin tacaíonn sé leis an tuairim seo. (sonraí gan taispeánta). Mar thoradh air sin, chuir GPX bac ar tháirgeadh comhdhúile melanin, ach bhí tionchar níos mó ag sárocsaíd hidrigine ag GPX ar mhelaninsintéis i gcealla.

Plé

Sa staidéar seo, fuair ár dtaighdeoirí an tiúchan is fearr agus an éifeacht GPX, TPX, agus Catalase, einsímí frithocsaídeacha a laghdaíonn strus ocsaídiúcháin i gcealla, ar dhídhathú comhdhúile melanin. Mar thoradh ar thurgnaimh extracellular ag baint úsáide as comhdhúile melanin sintéiseithe, tá éifeacht melanin-dídhathúcháin ag GPXand TPX, ach níl Catalasedoes. Tá tuairiscí ann gur féidir le heinsímí díghrádaithe lignin i roinnt fungais, cosúil le lása, lignin peroxidase, melanin a mhiondealú i láthair sárocsaíd hidrigine [16-18]. Tríd an staidéar seo, deimhníodh go bhfuil na heinsímí frithocsaídeacha, atá i ngach eukaryotes agus ní einsímí lignin-díghrádaithe, tá gníomhaíocht melanin-decolorizing. Cé go bhféadfadh GPX agus TPX dath melanin a laghdú freisin i láthair sárocsaíd hidrigine, tá an fhéidearthacht ag na heinsímí seo gníomhú mar phríomh-chomhpháirt de mheicníocht dídhathaithe melanin an codán lysosomal.

Cuireadh cóireáil ar GPX, a bhí an-éifeachtach chun melanin colorin vitro a laghdú, le cealla melanoma B16F10 chun a éifeacht ar shintéis melanin a chinneadh. I melanomacells B16F10, ní raibh GPX citotocsaineach ag tiúchain a bhí éifeachtach maidir le dídhathú comhdhúile melanin, agus ba é an tiúchan sárocsaíd hidrigine cóireáilte le chéile ná 0.1 mM, gan aon tocsaineacht. Chuir cóireáil sárocsaíd hidrigine bac mór ar shintéis melanin, agus nuair a bhí sé ag obair le GPX, bhí an éifeachtúlacht níos fearr, cé nach raibh aon spleáchas tiúchan ar an druga. Ós rud é go n-ídíonn einsímí sárocsaíd hidrigine go tapa, is féidir a léirmhíniú dá airde an tiúchan einsím atá le cóireáil, is ea is ísle an cosc ​​ar shintéis melanin trí hidrigineach sárocsaíd. Tacaíonn an fhíric nár léirigh cóireáil GPX laghdú suntasach melanin in éagmais sárocsaíde hidrigine leis an tuairim seo (níor léirítear sonraí). Mar thoradh air sin, chuir GPX bac ar tháirgeadh comhdhúile melanin, ach bhí tionchar níos mó ag sárocsaíd hidrigine ag GPX ar mhelaninsintéis i gcealla. Tugann na torthaí seo le fios go n-eascraíonn einsímí frithocsaídeacha díghrádú melanin i meicníochtaí autophagy a dhíolann melanosóim.

táibléad cistanche

Le haghaidh tuilleadh eolais, cliceáil anseo le do thoil.

Conclúid

Léiríonn ár staidéar go gcuireann Glutathione peroxidase (GPX) agus Thiol peroxidase (TPX) le dídhathú melanin, agus chuir GPX bac ar shintéis melanin go héifeachtach. Tacaíonn na torthaí leis an hipitéis go n-eascraíonn einsímí frithocsaídeacha díghrádú melanin i meicníochtaí uathphagy a dhíleá melanosóim. Chun teacht ar chonclúid cinnte, d'fhéadfadh go mbeadh gá le staidéar a dhéanamh ar théamaiciúlacht an díleá meileanosome i gcealla craiceann, keratinocyte, agus melanocyte.