Cothaíonn Comhchruinnithe Ísle Paraquat Gníomhachtú Luath Kinase 1/2 Comhartha Extracellular arna Rialáil, Próitéin Kinase B, agus C-Meitheamh N-críochfort Kinase 1/2 Conairí: Ról C-Meitheamh N-Críochfort Kinase i mBás Cille Paraquat-spreagtha

Teagmháil: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Ríomhphost:audrey.hu@wecistanche.com

Mireia Niso-Santano, Jose´ M. Mora´n, Lourdes Garcı´a-Rubio, Ana Go´mez-Martı´n, Rosa A. Gonza´lez-Polo, Germa´n Soler,§ agus Jose´ M. Fuentes

Coimriú:

Is luibhicíd é Paraquat a bhfuil baol féideartha ann go gcothófaí parkinsonism mar gheall ar a néarthocsaineacht léirithe agus a chosúlacht láidir struchtúrach le 1-meitil-4-phenylpyridinium (MPP plus ), néar-tocsain a bhfuil aithne air a chruthaíonn siondróm cliniciúil comhchosúil. chungalar Parkinson(PD). Faoi láthair, áfach, is beag atá ar eolas faoi na cosáin chomharthaíochta a ghníomhaíonn paraquat in aon chóras cille. Sa staidéar seo, rinneamar imscrúdú ar éifeacht paraquat ar kinases extracellular rialaithe comharthaí 1 agus 2 (ERK1/2), c-Meitheamh N-críochfort kinase (JNK), agus gníomhachtaithe próitéin kinase B (PKB) i gcealla E18. Spreag tiúchan íseal paraquat méaduithe an-luath in ERK1/2, JNK1/2, agus fosfarylation PKB. Coscairí fosfatidylinositol 3-kinase (PI-3K) wortmannin agus LY 294002 (2-(4-morpholinyl)-8-feinil-4H{{ Chuir 19}}benzopyran-4-ceann amháin) bac ar arduithe luatha paraquat-spreagtha i bhfosfarylation PKB. Ina theannta sin, bhí méaduithe luatha paraquat-idirghabhála ar ghníomhachtú ERK1/2 íogair don inhibitor próitéin kinase kinase 1 (MEK1) mitogen-gníomhachtaithe PD 98059(2#-amino-3#-methoxyfllavone), ach bhí freagraí JNK1/2 bactha ag an coscaire JNK1/2 SP 600125 (anthra[1-9-cd]pyrazol-6(2H)-one). Níor chuir réamhchóireáil le wortmannin, LY 294002, nó PD 98059 isteach ar bhás cille paraquat i gcealla E18. I gcodarsnacht leis sin, laghdaigh SP 600125 bás cille paraquat-spreagtha go suntasach i gcealla E18. Mar fhocal scoir, tá sé léirithe againn go spreagann tiúchan íseal paraquat méaduithe láidre an-luath i ERK1/2, JNK1/2, agus fosfarylation PKB i gcealla E18. Ina theannta sin, tugann na sonraí a cuireadh i láthair le fios go gcosnaíonn cosc ​​ar chonair JNK1/2 cealla E18 ó bhás cille de bharr paraquat agus tacaíonn sé leis an bhfíric gur féidir le cosc ​​ar ghníomhachtú luath JNK1/2 a bheith ina straitéis fhéideartha i gcóireáil PD. Eochairfhocail: paraquat; tiúchan íseal; JNK; bás cille; Parkinson.

Luibh galar frith-Parkinson:cistéir

RÉAMHRÁ

galar Parkinson (PD)Is neamhord néarmheathlúcháin é arb iad is sainairíonna é bás néaróin dopaminergic san fho-Constantia nigra i gcomhar le cuimsiú intracytoplasmic ar a dtugtar comhlachtaí Lewy (Olanow agus Tatton, 1999). Níl ach 5-10 faoin gcéad d’othair PD a bhfuil foirm teaghlaigh den ghalar seo acu agus modh oidhreachta ceannasach uathsomal (Gasser, 2001). Tá fachtóirí géiniteacha tábhachtach in othair óga, ach ní dócha go mbeidh ról mór acu sa PD treallach is coitianta. I gcodarsnacht leis sin, léiríonn staidéir eipidéimeolaíocha go leor fachtóirí comhshaoil ​​a mhéadaíonn an baol PD a fhorbairt.galar Parkinson). Áiríodh orthu seo lotnaidicídí, luibhicídí, ceimiceáin thionsclaíocha, feirmeoireacht, agus maireachtáil i dtimpeallacht tuaithe (Cory-Slechta et al., 2005; Gasser, 2001; Landrigan et al., 2005; Tanner agus BenShlomo, 1999). Baineann an argóint is diongbháilte a thacaíonn le fachtóir comhshaoil ​​i PD le fáil amach éifeachtaí bitheolaíocha MPTP (1-meitil-4-feanile-1,2,3,6-). tetrarchy-dropyridine). Táirgeann tocsain an lárchórais néaróg seo siondróm atá cosúil go cliniciúil agus go hanatamaíoch le PD (Kopin agus Markey, 1988; Langston et al., 1983). Sa chiall seo, moltar an luibhicíd paraquat a úsáidtear go forleathan (1,1#-dimethyl-4,4#-bypiridinium) mar fhachtóir riosca tuartha bunaithe ar a homalógacht struchtúrach go MPPþ, meitibilít gníomhach MPTP ( Tanner agus Langston, 1990), agus ar thuarascálacha ar pháirceannachas a bhain le nochtadh don ghníomhaire (Hertzman et al., 1990; Hubble et al., 1993; Jimenez-Jimenezet al., 1992; Liou et al., 1997; Wang et al., 1997; Wang et al. al., 1992). Mar sin féin, cé go bhfuil eolas maith ar na bealaí comharthaíochta a bhaineann le bás cille MPPþ (Halvorsen et al., 2002; Gomez-Santos et al., 2002; Gonzalez-Polo et al., 2003), is beag atá ar eolas faoi na cosáin chomharthaíochta a cuireadh i ngníomh le paraquat (Cheng et al., 2003; Chun et al., 2001; Peng et al., 2004) Mar sin féin, níl aon staidéir ar imeachtaí luatha a breathnaíodh tar éis nochtadh do thiúchan íseal paraquat.

Is féidir le roinnt spreagthaí, lena n-áirítear MPPþ agus paraquat, raon cascáidí comharthaíochta intracellular a ghníomhachtú a bhfuil dlúthbhaint acu le bás cille agus cosáin marthanais cille. Mar shampla, gníomhaíonn MPPþ (Gomez-Santos et al., 2002; Halvorsen et al., 2002) baill den teaghlach kinase próitéin mitogen-gníomhachtaithe (MAPK) agus próitéin kinase B (PKB). I measc na mball teaghlaigh TheMAPK atá i ngníomh ag MPPþ nó paraquat áirítear kinases extracellular rialaithe comharthaí 1 agus 2 (ERK1/2), c-Meitheamh N-críochfort kinases (JNK1 agus JNK2), agus p38 MAPKs. Glactar leis go ginearálta go ERK1/2 agus cuireann gníomhachtú PKB maireachtáil cille chun cinn trí bhealaí comharthaíochta frith-apoptotic a ghníomhachtú, ach tá baint ag gníomhachtú JNK1/2 agus p38 MAPK le bás cille néarónach (Harper agus LoGrasso, 2001; Shin et al., 2001; Xia et al., 1995) . Tá gníomhachtú an chosáin phosphatidylinositol 3-kinase (PI{-3K)/PKB) i gceist le maireachtáil néarónach (Shin et al., 2001). Go háirithe, d’fhéadfadh ról ríthábhachtach a bheith ag gníomhachtú an chosáin JNK1/2 i MPPþ agus tocsaineacht paraquat (Cassarino et al., 2000; Halvorsen et al., 2002; Peng et al., 2004) agus mar thoradh air sin sna próisis cheallacha a bhfuil tionchar orthu. PD(galar Parkinson).

Cistanche luibh: Galar frith-Parkinson

ABHAIR AGUS MODHANNA

Líne cille agus cultúr.

Baineadh úsáid as neuroblasts inchinn francach neamhbhásaithe go spontáineach, cealla E18, sa staidéar seo. Fuarthas an líne chill E18 trí neamhbhású spontáineach ó chultúir de 18-cortices cerebral francach féatais lá d’aois agus chuir an Dr. A. Mun˜oz (Instituto de InvestigacionesBiome’dicas, CSIC, Maidrid, an Spáinn) ar fáil í. . Is ionann cealla E18 agus neuroblasts primitive a chuireann in iúl NF 68 agus an marcóir néarónach primitive nestin ach nach bhfuil an marcóir astrocyte, próitéin aigéadach fibrillary glial acu. Tar éis ionduchtú páirt-dhifreála le dibutyryl-cAMP, cuireann na cealla marcóirí néaróineacha breise in iúl mar NF 145, NF 220, agus enolase néaróin-shonrach (Mun˜oz, cumarsáid phearsanta). Fásadh cealla i Hanks 'F-12 (Hioclone, Brevieres, an Fhrainc) agus forlíonta iad le 10 faoin gcéad FCS (Hioclone), streiptimícin (100 mg/ml), agus peinicillin (100 U/ml). Síolaíodh cealla ag 5 3 10 5 i 75-fleascán saothraithe fíocháin cm2 (TPP, Trasadingen, an Eilvéis) agus goraíodh iad ag 37 C faoi atmaisféar aeir 5 faoin gcéad CO2/95 faoin gcéad. Cuireadh cultúir ar aghaidh uair sa tseachtain trí trypsinization ag baint úsáide as tuaslagán trypsin-EDTA (Hioclón).

Cóireálacha cille.

Trypsinaíodh cealla comhlíonta (~ 80 faoin gcéad ) i 75-cm2 fhleascáin shaothraithe fíocháin agus cuireadh síol iad i miasa saothraithe fíocháin ag tiúchan de 5 3104 cealla/cm2. Fiche ceithre huaire an chloig ina dhiaidh sin, rinneadh asú an mheán agus cuireadh meán úr ina ionad ina raibh na tiúchain paraquat sonraithe. I dturgnaimh bhreise, tá tiúchan éagsúla coscairí kinase (LY 294002, wortmannin, SP 600125, agus PD(galar Parkinson)98059, ar fad ó Tocris, Bristol, An Ríocht Aontaithe) 30 nóiméad roimh an nochtadh paraquat. De réir mar a tuaslagadh coscairí kinase i sulfocsaíd démheitiol, rinneadh rialuithe leis an tiúchan is airde a úsáideadh (0.2 faoin gcéad toirte / toirte). Ní dhearna suimiú démheitile sulfocsaíde difear do luachanna inmharthanachta plátaí rialaithe.

Measúnú inmharthanachta cille.

Cinneadh inmharthanacht na gceall ag an measúnacht dathmhéadrachMTT (Mosmann, 1983). I gcealla inmharthana, is féidir leis an einsím mitochondrial succinate dehydrogenase MTT a mheitibiliú isteach i dath formazan a ionsúnn solas ag 570 nm. Do na turgnaimh seo, 24-úsáideadh plátaí tástála tobair. Ag deireadh gach cóireála, cuireadh 100 ll de MTT a ullmhaíodh ag tiúchan 5 mg/ml i PBS le gach pláta. Tar éis 3 h goir, scinceáladh an meán, agus tuaslagadh na deascáin formazan le isopropanol aigéadach (0.04-0.1 N HCl in absalóideach isopropanol). Tomhaiseadh ionsúcht an ruaim thiontuithe ag tonnfhad 570 nm agus dealú cúlra ag 630–690 nm. Socraíodh ionsúiteacht na gcultúr neamhchóireáilte ag 100 faoin gcéad.

Chun na torthaí a fuair an measúnú MTT a dhearbhú, rinneadh measúnú freisin ar bhás cille trí scaoileadh na heinsíme cítosólacha lactate dehydrogenase (LDH) chuig an meán cultúir a thomhas ag baint úsáide as trealamh measúnaithe LDH dathmhéadrach (Roche, Indianapolis, IN) de réir threoracha an mhonaróra. . Sainmhíníodh sceitheadh ​​LDH mar an cóimheas idir gníomhaíocht LDH sa mheán cultúir agus an ghníomhaíocht iomlán in aghaidh an tobair (3100). Fuarthas sonraí inchomparáide ag baint úsáide as an dá mhodh.

Ullmhú na sleachta cille agus anailís blot an Iarthair.

Tar éis cóireálacha turgnamhacha, rinsíodh na cealla (saothraithe i 60-miasa mm) faoi dhó le PBS fuar agus baineadh iad trí scrapadh agus ansin lártheifneoiríodh iad ag 900 3 g ar feadh 5 nóiméad ag 4 C. Rinneadh na cealla a liostáil i maolán ina bhfuil 50mM HEPES, pH 7.5, 300mMNaCl, 1 faoin gcéad Triton X-100, 2mM EDTA, 5mM MgCl2, 25mM NaF, 1mMNa3VO4, agus Protease Cocktail Inhibitor (Sigma, St Louis, MO). Rinneadh cealla a lártheifneoiriú ag 13,000 3 g ar feadh 5 nóiméad ag 4 C. Stóráladh súithíní ag 80 C go dtí go ndearnadh anailís orthu ag blot an Iarthair. Tomhaiseadh tiúchan próitéine de réir Bradford (1976) agus úsáid á baint as BSA mar chaighdeán.

Réitíodh méideanna comhionann próitéiní (10 LG in aghaidh an choinníll) i leictreafóiréis glóthach SDS 12 faoin gcéad agus aistríodh iad chuig seicní PVDF de réir modhanna comhathraithe traidisiúnta (Fuentes et al., 2000). Go hachomair, aistríodh próitéiní (250 mA ar feadh 60 nóiméad) chuig seicní PVDF ag baint úsáide as gaireas Mini Trans-Blot Cell (Bio-Rad, Hercules, CA). Áirítear leis an nós imeachta um bhrath imdhíonta aistriú agus blocáil an scannáin (60 nóiméad ag teocht an tseomra) le TTBS (10mM Tris/HCl, pH 7.5, 150mM NaCl, agus 0.2 faoin gcéad Tween-20) ina bhfuil 10 faoin gcéad de bhainne triomaithe gan saill. Ansin goradh scannáin ar feadh 60 nóiméad ag teocht an tseomra le hantasubstaintí príomhúla polyclonal coinín (go léir ó Cell Signalling, Beverly, MA, caolaithe 1:1000) i TTBS þ 10 faoin gcéad bainne triomaithe neamh-saille nó 5 faoin gcéad BSA. Tar éis níocháin (ar feadh dhá 2000tréimhse nóiméid le TTBS), goradh na seicní (60 nóiméad ag teocht an tseomra) le antasubstaintí tánaisteacha frith-choinín comhchuingeach peroxidase (1:5000 in TTBS le 10 faoin gcéad de bhainne triomaithe gan saill). Tar éis níocháin (ar feadh dhá 5-tréimhse nóim agus 10-tréimhse amháin), léiríodh braite antasubstaintí ceangailte trí chemiluminescence ag baint úsáide as an imoibrí ECL-plus (Amersham Biosciences, Orsay, France) agus rinneadh anailís air de réir Cainníocht Bogearraí amháin (Bith-Rad). Rinneadh anailís ar ábhar Actin mar rialú ag baint úsáide as antashubstaint polyclonal coinín (ó Sigma) caolaithe 1:2500 i TTBS le 10 faoin gcéad bainne triomaithe nonfat).

Anailís staitistiúil.

Rinneadh gach turgnamh arís trí huaire ar a laghad le comhghaol sásúil idir torthaí turgnaimh aonair. Is iad na sonraí a thaispeántar iad siúd de chuid turgnamh ionadaíoch; bhí meán de thrí nó ceithre miasa cultúir i ngach grúpa. Sloinntear na sonraí go léir mar an meán ±SEM. Rinne ANOVA anailís ar na torthaí. Measadh go raibh na luachanna p níos lú ná 0.05 suntasach.

Galar frith-Parkinson:Sliocht Cistanche

TORTHAÍ

Éifeachtaí Citotocsaineacha Paraquat i gCealla E18

Mar a tuairiscíodh roimhe seo (Cappelletti et al., 1998; Chun et al., 2001; Gonzalez-Polo et al., 2004), tá roinnt línte cille íogair d’airíonna tocsaineacha paraquat. Ba é ba chúis leis an nochtadh do paraquat ná laghdú dáileog-spleách ar inmharthanacht na gceall. (Fíor 1.) Sa staidéar seo, léirigh cealla E18 cóireáilte le 25lM paraquat for24 h caillteanas 50 faoin gcéad ar inmharthanacht cille. Rinneadh inmharthanacht na gceall a mheas tríd an gclaochlú go MTT a thomhas go dath formazan a ionsúnn solas ag 570 nm. Úsáidtear an measúnú seo go forleathan chun monatóireacht a dhéanamh ar bhás cille i roinnt línte cille, lena n-áirítear cealla E18 (Donaire et al., 2005; Garcia-Roman et al., 2001), agus maslaí éagsúla, lena n-áirítear paraquat (Chun et al., 2001; Gonzalez -Polo et al., 2004).

Gníomhachtú ERK1/2 de bharr Paraquat i gCealla E18

Rinneadh monatóireacht ar mhéaduithe ar ghníomhachtú ERK1/2 i gcealla E18 a ndearnadh cóireáil orthu le paraquat trí blotting an Iarthair ag baint úsáide as antashubstaint phosphospecific ERK1/2 (Thr202/Tyr204). Mar thoradh ar nochtadh cealla E18neuroblasts le 25lM paraquat tháinig méadú suntasach ar stádas fosfarylation (Thr202/Tyr204) ERK1/2 (44/42 kDa) ( Fíor. 2 A). Tharla na méaduithe is mó sa phosphorylation tar éis 5 nóiméad, agus ina dhiaidh sin laghdaítear leibhéil phosphorylation go mall go dtí na leibhéil basal gar. Ina theannta sin, ní raibh na méaduithe i fosfarylation ERK1/2 a tharlódh de bharr paraquat ag brath ar thiúchan (Fíor 2 B). Réamhchóireáil leis an inhibitor theMEK1, PD(galar Parkinson)98059 (50lM; Dudley et al., 1995) go hiomlán bac ar mhéaduithe paraquat-spreagtha i ERK1/2fosphorylation (Fíor 3).

Gníomhachtú PKB de bharr Paraquat i gCealla E18

Braitheadh ​​gníomhachtú PKB i gcealla E18 le blotting an Iarthair ag baint úsáide as antashubstaint fosfa-shonrach (Ser473). Spreagadh cealla E18 le paraquat 25lM méadú suntasach i PKB phosphorylation (Fíor 4 A). Tarlaíonn an méadú seo tar éis 20 nóiméad, inchomparáide leis sin de ERK1/2 phosphorylation tar éis leibhéil phosphorylation laghdú go mall go dtí leibhéil in aice le basal (Fíor 4 A). Ina theannta sin, bhí méaduithe paraquat-idirghabhála i phosphorylation PKB tiúchan-spleách le huasmhéid ag 25lM de paraquat (Fig. 4 A). Toisc go bhfuil PI-3K ag teastáil le haghaidh gníomhachtú PKB, rinneadh iniúchadh, mar sin, ar ról PI-3K i ngníomhachtú PKB paraquat-spreagtha i gcealla E18 trí úsáid a bhaint as an PI-3coscairí K wortmannin agus LY 294002.

Cuireadh bac iomlán ar mhéaduithe paraquat-idirghabhála i bhfosfarylation PKB tar éis réamhchóireáil (30 min) de E18cells le 100nM wortmannin agus 30lM LY 294002 (Fig. 5). Léiríonn na breathnuithe seo go ndéanann conair PI-3K-chleithiúnach idirghabháil ar mhéaduithe paraquat-spreagtha i bhfosfarylation PKB i gcealla E18.

Gníomhachtaithe Paraquat-spreagtha ar JNK1/2 i gCealla E18

Léirigh staidéir roimhe seo go ngníomhaíonn paraquat néaróin JNK1/2in (Chun et al., 2001; Peng et al., 2004) agus cealla neamhneuronal (Bennett et al., 2001; Cheng et al., 2003). Mar sin féin, tá na tiúchain a úsáidtear go mór níos airde ná iad siúd atá fostaithe san obair seo. Ina theannta sin, tá na hamanna a roghnaíodh chun gníomhachtú JNK1/2 a shamhlú níos faide freisin. Braitheadh ​​gníomhachtú JNK1/2 i gcealla E18 le blotting an Iarthair ag baint úsáide as antashubstaint phosphospecific JNK (Thr183/Tyr185). Spreagadh cealla E18 le 25lM paraquat tháirgtear méadú suntasach agus go luath inJNK (46/54 kDa) phosphorylation (Fíor 6 A). Bhí na méaduithe seo uasta tar éis 5 nóiméad tar éis a laghdaigh leibhéil phosphorylation i dtreo leibhéil basal (Fíor 6 A). Mar sin féin, ní raibh méaduithe paraquatmediated i JNK1 / 2 phosphorylation tiúchan-spleách ( Fíor. 6 B ). Bhí méaduithe paraquat-idirghabhála i bhfosfarylation JNK1/2 íogair don inhibitor theJNK1/2 SP 600125 (10lM; Fíor 7; Bennett et al., 2001). Ar deireadh, níor spreag paraquat (25lM) méaduithe intomhaiste ar phosphorylation p38 MAPK i gcealla E18 sna turgnaimh ama-chúrsa céanna (sonraí nach bhfuil léirithe). Rinneadh na turgnaimh seo ag baint úsáide as antashubstaint phosphospecific p38 MAPK(Thr180/Tyr182).

Inmharthanacht na gCeall a Thomhas Tar éis Cóireáil Cealla E18 le Coscairí Paraquat agus Kinase

Tar éis a thaispeáint go dtáirgeann paraquat gníomhachtú luath ERK1/2, PKB, agus JNK1/2 i gcealla E18 i ngach cás, chinneamar ina dhiaidh sin ról gníomhachtú tapa na gcosán kinase seo i mbás cille de bharr tiúchan íseal paraquat ag baint úsáide as sainiúil cógaseolaíochta. coscairí. Mar a léirítear i bhFíor 1, d'eascair laghdú suntasach ar inmharthanacht cille de bharr nochtadh cealla E18 do 25lM paraquat (thart ar 50 faoin gcéad ). Chun imscrúdú a dhéanamh ar ról ERK1/2, PKB, agus JNK1/2 i mbás cille paraquat-spreagtha, réamhghortaíodh cealla E18 ar feadh 30 nóiméad leis na coscairí kinase seo a leanas: PD(galar Parkinson)98059 (50lM; MEK1/2 inhibitor), LY 294002 (30lM; inhibitor PI-3K), wortmannin(100nM; PI-3K inhibitor), agus SP 600125 (10lM; coscaire JNK1/2). Mar a léirítear i bhFíor 8 (agus tá achoimre air i dTábla 1), ní raibh aon éifeacht shuntasach ag wortmannin, LY 294002, agus PD 98059 ar chaillteanas inmharthanacht cille a tharlódh de bharr 25lM paraquat.

PLÉ

Le déanaí, mhéadaigh staidéir éagsúla spéis sa fhéidearthacht go bhféadfadh baint a bheith ag neurotocsainí comhshaoil ​​​​cosúil le lotnaidicídí le forbairt PD neamhghéiniteach.(galar Parkinson)(Cory Slechta et al., 2005; Landrigan et al., 2005; Norris et al., 2004; Ritz agus Yu, 2000; Sherer et al., 2001). Tá PQ ar cheann de na luibhicídí féideartha a bhaineann le PD, mar gheall ar struchtúr ceimiceach cosúil le MPPþ agus an comhghaol láidir idir minicíocht an ghalair agus an méid PQused (Lanska, 1997; Liou et al., 1997; Ritz agus Yu, 2000). Mar sin féin, níor cinneadh meicníocht na tocsaineachta néarónach a tharlaíonn tearc-nochtadh do leibhéil ísle paraquat. Ar aon chuma, níl suim ag oibreacha roimhe seo sa phróiseas luath a léirítear tar éis an nochtadh do paraquat. Is é príomhthoradh an staidéir seo ná gur léirigh muid gur mhéadaigh cealla E18neuroblast a nochtar do thiúchan íseal paraquatrapidly fosfarlú gníomhachtaithe na gconairí comharthaíochta ginearálta antiapoptotic PI-3K/PKB agus MEK ERK agus freisin an JNK1/ go ginearálta proapoptotic 2 LÉARSCÁIL. I gcodarsnacht leis sin, níor spreag paraquat méaduithe intomhaiste a bhí ag brath ar am nó ar thiúchan i bhfosfarylation p38 MAPK. Mar a léiríodh thuas, d'úsáideamar tiúchan íseal paraquat. Tá plé déanta ar ábharthacht an fhíric an féidir le paraquat dul isteach san inchinn nó nach ea toisc gur móilín luchtaithe é. Mar sin féin, léirigh torthaí le déanaí (Shimizu et al., 2001) gur féidir le paraquat caidéal neodrach aimínaigéad a úsáid chun dul isteach san inchinn. Léiríonn na torthaí a chuirtear i láthair san obair seo nach bhfuil ach tiúchan íseal paraquat ag teastáil sa chill chun roinnt conairí comhartha a spreagadh go tapa lena n-áirítear NK, atá bainteach le próisis báis cille. Tá na gníomhachtaí luatha seo mar gheall ar an tiúchan íseal paraquat molta, den chéad uair, san obair reatha.

Is beag aird a tugadh ar staidéar a dhéanamh ar na hathruithe ar leibhéil fosfarylation de PKB nó ERK1/2 de bharr paraquat (Cheng et al., 2003; Peng et al., 2004). Ar aon chuma, úsáideann tuarascálacha roimhe seo (Peng et al., 2004) tiúchain sách ard paraquat (400lM), ag tomhas céim fosfarlaithe ERK tar éis 12-18 h de nochtadh. Ag na hamanna seo, níor thug siad faoi deara athruithe ar na leibhéil p-ERK. Inár gcuid oibre, braitheadh ​​​​muid gníomhachtú luath (5-10 nóiméad) agus tábhachtach ERK1/2 (Fig.2A). Laghdaíonn an gníomhachtú seo go mall go dtí na bunleibhéil. Inár gcoinníollacha, tá na leibhéil fosfarlaithe ERK1/2 (tar éis 12-18h) mar an gcéanna leis an rialú, rud a thugann le fios nach bhfuil an cosán seo gníomhach ag na hamanna seo (sonraí nach bhfuil léirithe) mar a thuairiscítear ag Peng et al. (2004). Níl an gníomhachtú seo ag brath ar thiúchan, rud a léiríonn an toradh go bhfaightear agus go gcoimeádtar spreagadh láidir ERK le tiúchan an-íseal paraquat. Níor cuireadh síos go fóill ar athruithe i leibhéil PKB fosfarlaithe tar éis nochtadh paraquat. Léirímid i bhFíor 4 go bhfuil na torthaí ag brath ar am agus ar thiúchan, ag taispeáint éifeacht uasta tar éis 20-nochtadh min le25lM paraquat. Is é sin, tá méaduithe luath-idirghabhála paraquat i bhfosfarylation PKB inchomparáide leo siúd a breathnaíodh forERK1/2. Léiríonn na sonraí seo méadú luath ar ghníomhachtú fosfarylation na mbealaí marthanais PKB agus ERK araon. Níl aon sonraí ann faoi ghníomhachtú luath PKB nó ERK i mbás cille paraquat-spreagtha. Mar sin féin, déanann staidéir roimhe seo (Halvorsen et al., 2002) cur síos ar mhéadú luath den chineál céanna sa dá chonair i gcealla neuroblastoma SH-SY5Y nochta do MPPþ.Sa chás seo, ní thagann meath ar leibhéil fosfarylation i dtreo an bhunleibhéil. Tá na sonraí seo suimiúil go háirithe mar gheall ar an struchtúr comhchosúil a bhaineann roimhe seo idir paraquat agusMPPþ, rud a thugann le fios go bhfuil tús difriúil ag an innealra ceallacha a bhaineann le héifeacht an dá mhóilíní.

Díríodh níos mó airde ar ról JNK1/2pathway in idirghabháil a dhéanamh ar chomharthaí a chuireann le bás cille de bharr paraquat. Sa staidéar seo, tá sé léirithe againn go spreag tiúchan íseal (25lM) de paraquat méaduithe suntasacha i fosphorylated JNK1/2 (Fig. 6). Mar a tharlaíonn i PKBor ERK1/2, braitheann an gníomhachtú seo ar am le tús an-luath (5 nóiméad) agus le filleadh mall ar na bunleibhéil. Léiríonn saothair roimhe seo (Cheng et al., 2003; Chun et al., 2001; Peng et al., 2004) gníomhachtú déanach (12-18 h) de chonair JNK1/2 a tháirgtear ar aon nós trí thiúchan measartha ard paraquat (ó 400lM [Peng et al., 2004] go 800lM [Chunet al., 2001]). In ár gcoinníollacha, tá an chéim fosfarylation deJNK1/2 ag na hamanna atá léirithe inchomparáide leis an rialú. Tríd is tríd, léiríonn na torthaí seo don chéad uair go gcruthaíonn nochtadh cille do thiúchan an-íseal paraquat gníomhachtú luath ar bhealaí PKB, ERK1/2, agus JNK1/2.

Tar éis a shuíomh go spreagann paraquat gníomhachtú luath PKB, ERK1/2, agus JNK1/2 i gcealla E18, rinneamar imscrúdú ansin ar ról na gcosán próitéine kinase seo i mbás cille paraquat-spreagtha ag baint úsáide as roinnt coscairí cógaseolaíochta. Rinneadh monatóireacht ar inmharthanacht cille trí thomhas a dhéanamh ar an gclaochlú go MTT go dath formazan a ionsúnn solas ag 570 nm. Baineadh úsáid as measúnacht MTT chun gortú néaránach a thomhas go cruinn tar éis masla éagsúla lena n-áirítear MPPþ nó paraquat (Gonzalez Polo et al., 2003, 2004; Schmuck et al., 2002; Sheng et al., 2002; Storch et al., 2004; ), agus is é an modh is mó a úsáidtear chun bás cille a chinneadh. Mar a léirítear i bhFíor 8, laghdaigh réamhchóireáil leis an inhibitor roghnach JNK1/2 SP 600125 bás cille de bharr paraquat go suntasach. Chuir an tiúchan seo de SP 600125 bac iomlán ar ghníomhachtú paraquat-spreagtha JNK1/2 (Fíor 7). Tugann na sonraí seo le fios go gcosnaíonn cosc ​​ar ghníomhachtú luath an chosáin JNK1/2 cealla ó bhás cille de bharr paraquat. Tá na sonraí seo ag teacht le staidéir roimhe seo (Chun et al., 2001; Peng et al., 2004), a léirigh go bhfuil baint ag JNK1/2 le bás cille néarónach a spreag paraquat. Mar sin féin, úsáideann na staidéir seo idir 15 agus 30 uair níos mó tiúchan paraquat ná mar a úsáidtear sa staidéar seo. Léirímid freisin gur féidir le tiúchan íseal paraquat ní hamháin gníomhachtú ach freisin gníomhachtú luath an chosáin seo. Léiríonn an chosaint a breathnaíodh le SP600125 freisin go bhfuil baint ag cosán JNK1/2 le bás cille a tharlódh de bharr paraquat. Ina theannta sin, tá cosc ​​JNK1/2 deartha mar straitéis fhéideartha chun PD a chóireáil(galar Parkinson)i roinnt samhlacha in vivo agus in vitro (Wang et al., 2004).

éifeacht neuroprotective de cistanche

Léirigh staidéir roimhe seo go bhfuil baint ag PKB agus ERKpathways le maireachtáil néarónach (Guyton et al., 1996; Shin et al., 2001). Sa staidéar seo, léirigh muid go spreagann tiúchan íseal paraquat bealaí PKB agus ERK araon. Tugann na tuairimí seo le fios go bhféadfadh gníomhachtú PKB agus ERK de bharr paraquat a bheith bainteach le cealla a chosaint ar bhás cille de bharr paraquat. Chun an fhéidearthacht seo a fhiosrú, d’úsáideamar na coscairí PI-3K nach raibh gaolmhar leo ó thaobh struchtúir de, wortmannin agus LY 294002 agus an ERK1/2inhibitor PD(galar Parkinson)98059. Díol spéise é, níor athraigh coisc PKB agus ERK araon inmharthanacht na gceall i láthair paraquat, rud a thugann le tuiscint, inár gcoinníollacha, nach bhfuil PKB méadaithe agus ERKactivation riachtanach chun maireachtáil i mbás cille paraquat-spreagtha i gcealla E18.

Is eol go maith go ndéantar meicníocht na néarthocsaineachta paraquat, i measc fachtóirí eile, a idirghabháil trí strus ocsaídiúcháin (Gonzalez-Polo et al., 2004; Mollace et al., 2003). Sa chiall seo, tá cur síos déanta le déanaí ar strus ocsaídiúcháin citosólach an-tapa in imeachtaí apoptotic luatha a bhaineann le bás cille de bharr paraquat (Gonzalez-Polo et al., 2004). Toisc go ngníomhaíonn strus ocsaídiúcháin baill den teaghlach MAPK (amhail ERK1/2 agus JNK1/2) agus PKB (Kamata agus Hirata, 1999), is féidir an gníomhachtú luath seo de ERK1/2, JNK1/2, agus PKB a chur i leith an ocsaídiúcháin tapa. strus-spreagtha tar éis nochtadh paraquat.

Go hachomair, léiríonn ár dtorthaí don chéad uair go spreagann tiúchan íseal paraquat méaduithe an-luath agus láidir i gcealla PKB, ERK1/2, agus JNK1/2 fosfarylation inE18. Ina theannta sin, tá sé léirithe againn go gcosnaíonn cosc ​​ar ghníomhachtú luath an chosáin JNK1/2 cealla E18 ó bhás cille de bharr paraquat. Tugann an toradh seo le fios go bhfuil roinnt imeachtaí luatha ann (mar ghníomhachtú tapa JNK1/2) a bhfuil ról riachtanach acu i mbás cille a tharlódh de bharr tiúchan íseal paraquat. Osclaíonn an toradh seo líne nua spreagúil freisin sa staidéar ar thocsaineacht paraquat agus an impleacht a d’fhéadfadh a bheith uirthi maidir le forbairt PD.(galar Parkinson).

NÓTA: Cistancheis luibh traidisiúnta Síneach é a bhfuil éifeachtaí aige ar néaróin agus ar chealla inchinn. Tugtar an ginseng Desert ar cistanche freisin, is cóireáil fhéideartha é le haghaidh galar neuro, mar shamplagalar Parkinsonbunaithe ar an staidéar cógaseolaíochta nua-aimseartha