Anailís ar Thúblach Cóngarach Agus Glomerulus na Duán
Mar 15, 2022
Déan teagmháil le:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Próifíliú Próitéamaíochta Neas-Aonchealla ar Thúblach Cóngarach agus Glomerulus an Ghnáthdhuáin Dhaonna
Tara K. Sigdel1, Paul D. Piehowski2, Sudeshna Roy1, Juliane Liberto1, Joshua R. Hansen2, Adam C. Swensen2, Rui Zhao3, Ying Zhu3, Priyanka Rashmi1, Andrew Schroeder1, Izabella Damm1, Swastika Sur1, Jinghui Luo4, Yingbao Yang4, Wei-Meitheamh Qian2* agus Minnie M. Sarwal1* don Chuibhreannas Tionscadal um Leigheas Beachtais Duán (KPMP).
1Rannóg Trasphlandú MultiOrgan, An Roinn Máinliachta, Ollscoil California, San Francisco, San Francisco, CA, Stáit Aontaithe Mheiriceá
2Saotharlann Náisiúnta Iarthuaisceart an Aigéin Chiúin, Rannán na nEolaíochtaí Bitheolaíochta, Richland, WA, Stáit Aontaithe Mheiriceá
3Saotharlann Eolaíochtaí Móilíneacha Comhshaoil, Saotharlann Náisiúnta Iarthuaisceart an Aigéin Chiúin, Richland, WA, Stáit Aontaithe Mheiriceá
4Roinn na Paiteolaíochta, Ollscoil Michigan, Ann Arbor, MI, Stáit Aontaithe Mheiriceá
Eochairfhocail:glomerulus, mais-speictriméadracht, anailís aonchealla, próitéamaíocht,duán
Is féidir le measúnuithe móilíneacha ag leibhéal aonchealla taighde bitheolaíoch a luathú trí mheasúnuithe mionsonraithe a sholáthar ar eagrú cealla agus ilchineálacht fíocháin i ngalar agus i sláinte araon. An duineduántá stáit chasta ilcheallacha aige a bhfuil feidhmiúlacht éagsúil acu, agus is féidir leas iomlán a bhaint as go leor de anois leis an dul chun cinn teicneolaíochta le déanaí i bpróitéamaíocht fíocháin ag leibhéal aonchealla nach mór. Pléifimid na bunchéimeanna i gcéad chur i bhfeidhm an mhodha próitéamaíche mais-speictriméadrachta (MS) seo chun anailís a dhéanamh ar fho-ailt den ghnáthdhuine daonna.duán, mar chuid den Tionscadal um Leigheas beachtais Duán (KPMP). Agus úsáid á baint againn as ~30–40 cealla duán micrea-dháilte a gabhadh ag léasair, d’aithníomar níos mó ná 2,500 próitéin daonna, le sainiúlacht dontubular proximal(PT; n=25 próitéiní) agus glomerular (Glom; n=67 próitéiní) réigiúin anduánagus a bhfeidhmeanna uathúla meitibileach. Soláthraíonn an staidéar píolótach seo an treochlár chun ár sreabhadh oibre próitéamaíocht gar-aon chill a chur i bhfeidhm chun anailís a dhéanamh ar mhicrea-ranna duánach eile, ar scála níos mó, chun suaitheadh na feidhme duánach focheallach sa ghnáthdhuán a réiteach chomh maith le etiologies éagsúla. de ghéarmhíochaine agus ainsealachagalar duáin.
is féidir le cistanche feabhas a chur ar fheidhm na duáin
Réamhrá
Is féidir le dul chun cinn le déanaí i bpróifíliú móilíneach, go sonrach anailís trascríobh ag leibhéal aonchealla, daonraí cille annamha a aimsiú laistigh d'fhíocháin chliniciúil ilchineálach, atá ag cur lenár dtuiscint ar bhitheolaíocht na nduán, agus a phróisis mhóilíneacha (1-7). Tá gá nár comhlíonadh le modhanna a fhorbairt ar féidir leo faisnéis chuimsitheach bhitheolaíoch a sholáthar ag leibhéil RNA agus DNA agus a cheadaíonn anailís fíocháin próitéamaí aonchealla.
Is féidir le teicneolaíochtaí próitéamacha, murab ionann agus géanóm, faisnéis fheidhmiúil a sholáthar ar stáit cheallacha agus líonraí rialála (2). Dúshlán teicneolaíochta maidir le próitéamaíocht mais-speictreascópachta (MS) is ea teorannú an ábhair tosaigh. Murab ionann agus transcriptomics, ní cheadaíonn próitéamaíocht aimpliú móilíneach. Tá an factoid seo mar thoradh ar iarrachtaí substainteacha chun íogaireacht anailíseach próitéamaíocht MS-bhunaithe a fheabhsú, lena n-áirítear miniaturization teicneolaíochta agus éifeachtúlachtaí níos airde ag an bhfoinse ianaithe leictreaspray (8, 9), ionas gur leor an íogaireacht anailíseach anois chun próitéiní a bhrath i mamaigh aonair. cealla. In ainneoin íogaireacht ard anailíseach a bheith acu, tá dúshláin bhreise tugtha isteach ag iarratais próitéamacha ar mhéideanna samplacha beaga, mar asaithe neamhshonrach próitéiní agus peiptídí ar dhromchlaí feadáin imoibrithe, cinéitic díleá neamhéifeachtach, an gá le glantachán, agus dúshláin le seachadadh. Thug ár ngrúpa tuairisc le déanaí ar an modh próitéamaíocht gar-aon-chill (nscProteomics) i gcealla HeLa, a sholáthraíonn teicneolaíocht an-nuálach agus íogair le haghaidh tomhais proteome samplaí le méideanna próitéine fo-nanogram ó líon beag cealla (10). Teastaíonn trealamh próiseála samplach an-saincheaptha leis an modh seo agus tá sé deacair é a aistriú amach go saotharlanna taighde eile ina staid forbartha faoi láthair. Próiseáil daonnaduánbhí aird ghéar ag teastáil ó fhíocháin tríd an bpíblíne seo ar fhorbairt prótacail chun caomhnú fíocháin agus gabháil ceall a bharrfheabhsú.
Sa staidéar seo, dhíríomar ar threoirchlár a sholáthar chun ceistiú próitéamaíoch a thomhas go rathúil ar fho-ranna éagsúla deduán, ag an leibhéal gar-aon chillín, leis na táirgí insoláthartha seo a leanas: (i) Measúnú ar an mbailiú agus ar an stóráil fíocháin duáin optamach le haghaidh nscProteomics; (ii) An caighdeán tagartha iomchuí le haghaidh nscProteomics a shainaithint; (iii) Tiús an fhíocháin duáin a bharrfheabhsú le haghaidh micrithdháileadh gabhála léasair (LCM); (iv) Paraiméadair LCM a bharrfheabhsú; (v) Cur síos ar an modh nscProteomics ag baint úsáide as modh micreaPOTS lán-uathoibrithe bunaithe ar LC-MS (μPOTS; Próiseáil i bPota Amháin le haghaidh Trace Samples) (11); (vi) Anailísíocht sonraí le haghaidh nscProteomics.
Chun na tascanna thuasluaite a bhaint amach, tá 11 duine uathúil próiseáilte againnduánbithóipsí agus forbraíodh prótacail agus modheolaíochtaí chun léiriú próitéamamach an duine a bhailiú, a phróiseáil agus a cheistiúduánsamplaí ag μPOTS. Nuair a chuirtear i dteannta le LC-MS an-íogair, taispeánaimid modh μPOTS lán-uathoibrithe a chumasaíonn in-atáirgtheacht agus a sholáthraíonn tomhais próitéamacha cainníochtúla de ~3,000 próitéin ó 10 go 100 cealla duán micrea-dháilte (LCM) gabhála léasair, a leibhéal clúdaigh nár baineadh amach roimhe seo ach do na mílte cealla (12-17). Cabhróidh an staidéar seo le tréithriú móilíneach a dhéanamh ar ilchineálacht cheallacha fíocháin agus ar phaiteolaíocht i mbithóipí duánach ó othair a bhfuil cúiseanna éagsúla acu le galair duáin ghéarmhíochaine agus ainsealacha. Tá an cumas ag an teicneolaíocht uathúil seo ilchineálacht próitéamaíoch agus marcóirí uathúla próitéine a réiteach i réimsí éagsúladuánfo-chineálacha galair agus fo-struchtúir a chomhghaolóidh le pataigineas galair, prognóis, agus srathú riosca. Tá achoimre ar an staidéar i bhFíor 1.
Fíor 1. Tá an sreabhadh oibre próitéamaíocht gar-aonchealla (nscProteomics) optamaithe le haghaidh próiseála daonnaduánfíocháin. Áirítear ar an sreabhadh oibre a aithint optamachduánbailiú agus stóráil fíocháin, na rialuithe cáilíochta do mhicrithdháileadh gabhála léasair modh nscProteomics a bhunú do chealla duáin.
Nósanna Imeachta Turgnamhach
Staidéar Dearadh
Léiriú scéimreach ar na staidéir próitéamacha a rinneadh ar 11 gnáthchineál daonna uathúladuáinléirithe i bhFíor 2A. Rinneadh 28 rith mais-speictriméadrachta (MS) san iomlán le haghaidh nscProteomics micrea-dháilte bulc-ghabhála agus léasair (LCM) ar chodanna péireáilte glomerular (Glom) agus feadánacha convoluted proximal (PT). Fíocháin ón gcéad dáduáincaomhnaíodh iad mar FFPE agus i meán cumaisc teocht gearrtha is fearr (OCT). Níor próiseáladh saincheisteanna fíocháin duán ó 9 duáin eile ach amháin in OCT (Fíor 2A).
Fíor 2. (A) Achoimre ar shamplaí agus ar thástálacha staidéir. (B) An plota QC le haghaidh atáirgtheacht an phróisis ag baint úsáide as fíochán OCT. Rinneadh difríochtaí comhairimh speictreach idir próitéiní le haghaidh 2 rith ar leith ag baint úsáide as fíochán OCT a bhreacadh i gcoinne an chomhaireamh speictreach meánphróitéine do 1,257 próitéin. Sa phlota, léiríonn an líne ghorm meándifríocht; léiríonn na línte dearga agus glasa 2 teorainn SD agus 3 SD faoi seach. Tá 97.96 faoin gcéad de phróitéiní laistigh den teorainn in-atáirgtheachta ríofa de 13.52 rud a léiríonn ardleibhéal in-atáirgtheachta. Feictear freisin go bhfuil éagsúlacht idir-reáchtáil an phróisis lena mbaineann fíochán OCT níos ísle ná mar atá sa phróiseas lena mbaineann fíochán FFPE (teorainn in-atáirgthe ríofa: 24.43). (C) Comparáid idir dáileadh comhairimh speictreach 374 próitéin choiteann in OCT agus FFPE. Léiríonn líon níos mó próitéiní ó fhíochán OCT ardáireamh speictreach agus feictear go bhfuil líon níos airde de chomhaireamh speictreach íseal le haghaidh próitéiní ó fhíochán FFPE. (D) Comparáid idir dáiltí comhairimh speictreach de 76 próitéin uathúla in FFPE agus 244 próitéin uathúla in OCT. Tá an leitheadúlacht níos airde de phróitéiní le comhaireamh speictreach íseal le feiceáil i bhfíochán OCT. D’fhéadfadh sé seo a léiriú go bhfuil teicníc fíocháin OCT níos fearr chun próitéiní íseal-flúirseach a bhrath sa chás reatha. Ba é an chomhéifeacht comhghaolúcháin idir próitéiní a aithníodh ó 2 fhíochán reoite OCT ná 0.96 (P <>
Fáil Samplach Fíocháin Duán
Duinefíocháin duáinBailíodh ó 11 nephrectomies páirteach dí-shainaitheanta san iomlán, a fuarthas ó Ollscoil California San Francisco (UCSF) agus Ollscoil Michigan (UM), le IRB ceadaithe, mar chuid de staidéar féidearthachta teicneolaíochta píolótach sa NIH Kidney Precision Medicine Tionscadal (KPMP). Níl ach réimse sláintiúil anduánBaineadh úsáid as mar a chinnfidh paiteolaí oilte chun na críche seo. Rinneadh na samplaí a anaithnidiú agus ba é an t-aon rud a bhí ann ná gur bailíodh na fíocháin ó dhaoine fásta. Chun measúnú a dhéanamh ar an bprótacal bailiúcháin samplaí is fearr don teicneolaíocht, ar dtús, roinneadh ~100 mg fíocháin ó 2 duáin go cothrom agus ullmhaíodh é mar chodanna fíocháin paraifín-leabaithe (FFPE) le formailin nó reo sa Comhdhúil OCT Fíocháin-Plus™ (Fisher Eolaíoch). Gearradh ceann amháin 5 μm agus trí 10 μm tiubh as a chéile ó gach bloc OCT le cryo-microtome agus suite ar 1.0 sleamhnáin membrane terephthalate poileitiléin (PET) (Zeiss) le haghaidh glomerular agustubule cóngarachdeighilt. Bhí an chuid 5 µm tiubh daite H&E chun léirshamhlú ar struchtúir mhóra histeolaíochta. Fágadh na hailt 10 μm tiubh atá fágtha gan dhaite. Stóráladh na sleamhnáin go léir ag −80 céim go dtí go ndéantar iad a scaradh.
Ciste chun feabhas a chur ar mhífheidhm duáin
Measúnú ar Thionchar Loingsiú agus Próiseáil Fíocháin ar Aschur Próitéamach
Chun measúnú a dhéanamh ar thionchar moille ar an anailís próitéamaíoch ar fhíochán reoite OCT,duántissue samples were collected at one center, shipped to a second site >4 h taisteal ar shiúl, agus a phróiseáil ag an dara ionad, agus vice versa. Rinneadh mórphróitéamaíocht ar dhá 2 uathúladuáin(duáin #3, #4), faighte ag Ollscoil Michigan, agus seolta chuig 2 ionad éagsúla (Ohio State University agus UCSF) le haghaidh anailíse MS, ag baint úsáide as an bprótacal céanna agus paraiméadair MS ag an dá shuíomh. Ansin rinneadh comparáid idir torthaí na rití BS idir an 2 shuíomh.
Eastóscadh Próitéin agus Frasaíocht
Rinneadh é seo ar mhodhanna ullmhúcháin fíocháin OCT agus FFPE araon chun an modh is fearr a roghnú le haghaidh próitéamaíocht fíocháin. Roinneadh fíochán OCT i gcodanna 10 μm tiubh ag baint úsáide as criómicrotome. Chun an méid íosta fíocháin a theastaíonn le haghaidh eastóscadh próitéine do MS a roghnú, gearradh trí chuacha (alt a chuirtear i bhfeadán Eppendorf in ionad é a scaipeadh ar an sleamhnán), agus 5 chuacha d'fhíocháin reoite, iad leáite, agus aistríodh iad chuig feadáin microcentrifuge. ina bhfuil coirnín cruach dhosmálta 5 mm (Qiagen), faoi lé Maolán Lysis Cell Mamach (lena n-áirítear Benzonase® Nuclease® and Protease Inhibitor Solution; Qiagen), agus homogenized i TissueLyser LT (Qiagen) ag 50 r / s ar feadh 3 nóiméad. Rinneadh tiúchan próitéine a chainníochtú (measúnú Bradford; Thermo Scientific) agus é a stóráil ag −20 céim go dtí go n-úsáidfí é. Stóráil fíocháin le haghaidh<2 months="" in="" ffpe="" was="" sectioned="" into="" ten="" 10="" μm="" thick="" sections="" using="" a="" microtome.="" three="" and="" five="" curls="" of="" tissue="" were="" cut,="" deparaffinized="" in="" xylene,="" centrifuged,="" and="" incubated="" in="" extraction="" buffer="" exb1="" (qiagen)="" supplemented="" with="" β-mercaptoethanol.="" samples="" were="" incubated="" on="" ice,="" followed="" by="" incubation="" at="" 80°c="" for="" 2="" h.="" protein="" was="" quantified="" (bradford="" assay;="" thermoscientific)="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" further="" use.="" protein="" was="" precipitated="" by="" the="" addition="" of="" cold="" acetone,="" followed="" by="" centrifugation="" to="" pellet="" and="" dry="" the="" precipitated="" protein.="" the="" pellet="" was="" re-suspended="" in="" 6="" m="" urea/100="" mm="" tris-hcl="" ph="" 7.8,="" and="" protein="" concentration="" was="" quantified="" (bradford="" assay;="" thermoscientific)="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" trypsin="">
Díleá Trypsin
Nochtadh thart ar 150 ug den phróitéin iomlán (~15 faoin gcéad den ionchur a bhí ar fáil) d’oibreáin laghdaithe (200 mM DTT agus 100 mM Tris-HCl) agus imoibrithe alicylating (200 mM iodoacetamide agus 100 mM Tris-HCl) agus caolaíodh é ansin le huisce saor ó RNAse/DNAse chun tiúchan Úiré a laghdú go 0.6 M. Cuireadh ceithre ug de thrypsin muc (Sigma) leis agus díleáíodh an sampla ag 37 céim . Rinneadh tiúchan próitéine a chainníochtú (measúnú Bradford; ThermoScientific) agus úsáideadh 10 ug próitéine le haghaidh MS.
MS do Bhulcphróitéamaíocht chun an Modh Próiseála Fíocháin Duán is Fearr a Mheas
Aigéadaíodh an meascán peptide tryptic le haigéad formach, glanadh le colúin C18 Monospin, agus rinneadh anailís ar an Orbitrap Q Exactive HF-X (Thermo Scientific). Rinneadh MS/MS ag baint úsáide as Dissociation C-Gaiste Ardfhuinnimh (HCD). Rinneadh anailís ar mais-speictrim ag baint úsáide as Byonic v2.14.27 (Méadracht Próitéin) ag ligean do lamháltais maise 12 ppm. Ceadaíodh modhnuithe iar-aistriúcháin athraitheacha, lena n-áirítear ocsaídiú, meitiliú, carbamylation, agus fosfarylation. Bhí próitéiní teoranta dóibh siúd a scóráil níos fearr ná ráta fionnachtana bréagach 1 faoin gcéad (FDR). Rinneadh comparáid idir flúirse próitéine agus sonraí MS chun an modh is fearr a roghnú le haghaidhduánbailiú fíocháin idir FFPE agus OCT.
Microdissection Gabhála Léasair
Cuireadh ailt tiubh neamhdhaite 5, 10, agus 20 μM suite ar shleamhnáin PET ar an stáitse de chóras Microdissection Laser MicroBeam Zeiss PALM (Zeiss) chun an tiús gearrtha is fearr a thástáil. Glomerular agustubule cóngarachRoghnaíodh réigiúin ag baint úsáide as an uirlis saorláimhe agus rinneadh deighiltí ag cuspóir 10X. Gabhadh codanna le ~ 4,580 μm2 achar agus tiús 10 uM, arbh ionann iad agus ~40 ceall glomerular bunaithe ar an bhfoirmle a foilsíodh roimhe seo chun cealla glomerular a mheas i ndaoine fásta sláintiúilduán(18). Dontubular proximalcealla, ghlacamar ~ 2,900 μm2 detubular proximalcealla, arbh ionann é agus ~36 cill. Rinneadh na hailt gearrtha a chatalú isteach i gcaipín greamaitheacha teimhneach 200 μL (Zeiss) (LPC Energy, 66; LPC Focus, 79) agus a stóráil ag −80 céim .
Próitéamaíocht Neas-Aonchealla (nscProteomics)
Chun próitéiní a bailíodh i caipíní gabhála a thuaslagadh le LCM, cuireadh braoinín 10 μL de 0.1 faoin gcéad DDM 50 mM Tris pH 8 go díreach leis an gcaipín. Gortaíodh samplaí ar feadh 30 nóiméad ag 37 céim i teirmeabúscaire Eppendorf ThermoTop chun galú a laghdú, agus ina dhiaidh sin lártheifneoiriú ag 2,000 × g ar feadh 1 nóiméad chun an lysate a aistriú chuig an vial. Laghdaíodh próitéiní le 5 mM dithiothreitol agus gor iad ag 37 céim ar feadh 30 nóiméad. Rinneadh ailciliú ag iaidídéicéitíd 10 mM agus gor 45 nóiméad sa dorchadas ag 25 céim. Ansin, cuireadh slánchuid 10 ng de Ls-C leis ina dhiaidh sin gor 3 h ag 25 céim . Cuireadh slánchuid de 10 ng trypsin leis ansin agus díleá thar oíche ag 25 céim ina dhiaidh sin. Meascadh na peptídí díleáite le slánchuid 15 μL de 18 MΩ uisce.
Ardán LC-MS do na Samplaí Ultra-Bheaga
Scaradh samplaí peptide (25 μL) ag baint úsáide as colún 60 cm, le trastomhas istigh 50 μm agus emitter comhtháite (Cuspóir Nua). Pacáladh na colúin go hinmheánach le meán Uiscí BEH trastomhas 1.7 μm. Táirgeadh grádán 100-nóiméad ag baint úsáide as caidéal nana Dionex Ultimate 3000 RSLC (Thermo Scientific). Cúpláladh an córas seo le mais-speictriméadar QExactive Plus (Thermo Scientific). Bailíodh mais-speictrim ó 300 go 1,800 m/z, ag baint úsáide as modh fála a bhraitheann ar shonraí sna 12 barr. Bailíodh speictream MS1 le mais-taifeach 35K agus MS2 le 17.5K. Baineadh úsáid as uasmhéid TF 100 ms chun aitheantais ó iain raidhse ísle a mhéadú.
Eastóscadh Sonraí Próitéamacha
Próiseáladh gach comhad amh ag baint úsáide as MaxQuant (leagan 1.5.3.30) chun gné a bhrath, cuardach bunachar sonraí agus cainníochtú próitéine / peptide (19) tar éis na socruithe a ndearnadh cur síos orthu roimhe seo (10). Cuardaíodh mais-speictream tandem i mbunachar sonraí daonna UniProtKB/Swiss-Prot (íoslódáil ar 29 Nollaig 2018 agus ina raibh 20,417 iontráil athbhreithnithe). Taisceadh na sonraí próitéamaíochta MS le haghaidh nscProteomics chuig an Cuibhreannas ProteomeXchange tríd an stór comhpháirtithe PRIDE (20) leis an aitheantóir tacar sonraí PXD015058 agus 10.6019/PXD015058.
Anailís Sonraí
Fuarthas sonraí MS ó ritheanna a rinneadh ag PNNL (nscProteomics) agus Ollscoil Stanford (próitéamaíocht mórchóir). Le haghaidh próitéamaíocht mórchóir. Baineadh úsáid as na modhanna staitistiúla seo a leanas chun na modhanna is fearr a roghnúduánmodh bailithe fíocháin, reoite in OCT nó próiseáilte mar FFPE, arna mheasúnú ag próitéamaíocht toirte fíocháin chainníochtúil, (i) Ríomhadh toradh próitéine/mg d’fhíocháin ionchuir choibhéisigh; (ii) Rinneadh tástáil ar in-atáirgtheacht MS ar aschur MS ó chodanna FFPE agus OCT ó gach ceann de na duáin 2, arna ullmhú ag an duine aonair céanna ag baint úsáide as an bprótacal céanna, arna anailísiú ar an ionstraim MS céanna ag baint úsáide as prótacal socraithe, cúpla lá óna chéile (21). Baineadh úsáid as teorainn in-atáirgthe (22) chun neas-cheangal a sholáthar ar dhifríochtaí tomhais idir rití comhleanúnacha próisis aonair chomh maith le meastachán beachtas chun comparáid a dhéanamh idir próisis. Ríomhadh an chomhéifeacht comhghaoil, a sholáthair an méid comhaontaithe idir ritheanna comhleanúnacha (ag baint úsáide as an bhfíochán céanna); (iii) Ríomhadh flúirse próitéine agus dáileadh méid blúirí peiptíde chun measúnú a dhéanamh ar éagsúlachtaí a tháinig ó dhíghrádú próitéin, trasnascadh de bharr formailin, etc. Áiríodh le gnéithe eile de QC, (iv) measúnú ar shreabhadh próisis thar mhacasamhlacha agus ama trí úsáid a bhaint as comhthiomsú.duántagairt agus (v) ríomh laofachta. Anailís chainníochtúil dhian agus sainaithint próitéiní uathúla a úsáidtear sonraí amháin le próitéiní a bhfuil comhaireamh speictreach acu Níos mó ná nó cothrom le 5 (23). Baineadh úsáid as tástáil bheacht Fisher chun measúnú a dhéanamh ar shaibhriú próitéiní coitianta agus uathúla atá mapáilte idir dhá ghnáthduáin dhaonna, (#1 agus #2). Bunaithe ar an anailís thuas (féach na torthaí), roghnaíodh fíochán reoite OCT mar an modh bailiúcháin do gach anailís ina dhiaidh sin.
Ba é an chéad chéim eile d’fhócas na hanailíse sonraí ná tacair phróitéin a shaibhrítear sna ~10–100 cill a fuarthas ó gach ceann den dá cheann roghnaithe a shainaithint, a chainníochtú agus a bhailíochtú.duánfo-urranna — réigiúin Glom agus PT, a fhaightear uathuduán, ar an mórchóir agus LCM de OCT reoitefíochán duáin(n=9; na duáin #3–11) agus á rith ag nscProteomics.
Glacadh le cur chuige scagtha leathchoimeádach céim {{0} chun déileáil le saincheisteanna a bhaineann le sonraí in easnamh/neamhiomlán, agus úsáideadh an G-tástáil (24) chun a fháil amach an raibh na sonraí ar Iarraidh go Fánach (MAR) nó Gan Ar Iarraidh go Randamach (MNAR). Rinneadh measúnú iontaofachta sonraí breise trí phróitéiní a breathnaíodh i níos mó ná nó cothrom le 50 faoin gcéad de na samplaí go léir a roghnú go docht. Baineadh úsáid as T-tástáil chun saibhriú suntasach i glomming nó PT a aithint do phróitéiní agus cuireadh ceartúchán ilthástála (Benjamini-Hochberg FDR) le tairseach suntasachta 0.1 i bhfeidhm. Chun críocha na hanailíse, faightear na sonraí maidir le déine coibhneasta MS (log 2 a chlaochlú) ó Glom, PT, agus codáin bhulc ó aonduánmeasadh go raibh siad péireáilte. D’aithníomar próitéiní saibhrithe i Glom (le leibhéil ísle i PT/bulc), agus uathúil do Glom (as láthair in PT) chomh maith le próitéiní saibhrithe i PT (le leibhéil ísle i Glom / toirt) agus uathúil do PT (as láthair in Glom) . Ní dhearnadh anailís saibhrithe ach ar shonraí gan luachanna in easnamh i ngach grúpa chun muinín a mhéadú. Baineadh úsáid as an gcomhghaol idir luachanna flúirseachta na bpróitéiní coitianta chun measúnú a dhéanamh ar an méid comhaontaithe idir próitéiní saibhrithe fo-rannáin idir rití ar leith den turgnamh céanna. Rinneamar tras-bhailíochtú freisin ar phróitéiní saibhrithe go suntasach i ngach urrann trí na comparáidí seo ó thacair shamplacha uathúla idir 2 rith éagsúla, Rith 1 agus Rith 2 a pharsáil. ag fiafraí an bhféadfaí próitéiní saibhrithe fo-rannáin atá ar eolas a logánú ar ais chuig a réigiúin shonracha i sonraí poiblí ón Atlas Próitéin Daonna (https://www.proteinatlas.org/) (25).
Cistanche le haghaidh comharthaí teip duánacha
Comparáid/Comhtháthú Sonraí Tras-Ómaí
Chun comhréireacht slonn próitéine ag leibhéal an RNA a mheasúnú, baineadh úsáid as sonraí a ghintear ó sheicheamhú RNA aonchealla (scRNA Seq) a rinneadh ar 10 nephrectomies dúchasacha, agus bhí 9 gcinn acu ag forluí leis anduáina úsáidtear i nscProteomics. Chuige seo, baineadh úsáid as ardán 10x Géanóm Cróimiam le ceimic v3 ag baint úsáide as an modh optamaithe i saotharlann Sarwal mar Shuíomh Fiosrúcháin Fíocháin (TIS) de chuid KPMP Consortium (tá lámhscríbhinn ina sonraítear an modh agus na torthaí á hullmhú). Don anailís tras-omics seo, d’úsáideamar sonraí tras-ómaíochta ó 45,411duáncealla réitithe ina naoi mórchineál cille: Podocytes, cealla mesangial, endothelium glomerular, stroma/interstitium, cealla imdhíonachta,tubule cóngarach, géag tiubh ardaitheach den lúb Henle, feadáin distal/ceangail, agus ducht bailithe. Rinneadh anailís ar shonraí aonchealla ag baint úsáide as leagan pacáiste Seurat R 2.3.4. Tá anailís níos doimhne ar na sonraí seo á forbairt (26).
Ó: 'Próifílíocht Próitéamaíochta Near-Aon-chill ar anTubular ProximalagusGlomerulusan Duine GnáthDuán' le Tara K. Sigdel1, Paul D. Piehowski2, Sudeshna Roy1, Juliane Liberto1, Joshua R. Hansen2, Adam C. Swensen2, Rui Zhao3, Ying Zhu3, Priyanka Rashmi1, Andrew Schroeder1, Izabella Damm1, Swastika Sur1, Jinghui Luo4 Yang4, Wei-Meitheamh Qian2* agus Minnie M. Sarwal1* donDuánCuibhreannas Tionscadal um Leigheas Beacht (KPMP).
---alt TAIGHDE BHUNÚSACH Tosaigh. Med., 17 Meán Fómhair 2020 |
