Cur isteach ar Ghlicóisídí Feinileatánóideach Ó Cistanche Tubulosa Leis an Measúnacht MTT

Teagmháil: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Ríomhphost:audrey.hu@wecistanche.com

Yu-Jie Wang, Si-Min Zhou, Gang Xu agus Yu-Qi Gao

Coimriú:

Baineadh úsáid go forleathan as an measúnacht MTT, mar mhodh scagtha, chun inmharthanacht agus iomadú cealla a thomhas. Ba chóir a thabhairt faoi deara, áfach, go mb’fhéidir nach léireodh an measúnú MTT éifeacht naCistanche tubulosasliocht ethanolic ar inmharthanacht cealla EA.hy926. Chun imscrúdú agus aithint na gcomhpháirteanna atá freagrach as breathnuithe contrártha an mheasúnaithe MTT, echinacoside, agus acteoside, rinneadh dhá phríomh-gliocóisídí feinileatánóideach, ó C. tubulosa sliocht ethanolic. Tugann na sonraí a fuarthas ó thástálacha CCK-8, Hoechst 33342 agus iarscríbhinní V-FITC/PI le fios go raibh an grúpa caffeoile sa dá chomhdhúil iargúlta freagrach as torthaí contrártha an mheasúnaithe MTT. Leagann na sonraí seo béim ar an ngá atá le modhanna éagsúla éagsúla a úsáid chun éifeacht oibreáin íocshláinte ar inmharthanacht cille a chinneadh chun torthaí míthreoracha a sheachaint.

Eochairfhocail: Measúnacht MTT;glycosíd feinilethanoid; aigéad caiféin; inmharthanacht cille; cur isteach

Réamhrá

An planda seadánachaCistanche tubulosa(Schrenk) Tá R. Wight (teaghlach Orobanchaceae) scaipthe go forleathan i dtíortha na hAfraice Thuaidh, Arabacha agus na hÁise [1]. Eascraíonn óCistanche tubulosaagusCistanche deserticolatábhachtach i míochaine traidisiúnta na Síne, tar éis iad a úsáid le haghaidh cóireáil impotence, sterility, lumbago, agus constipation mar gheall ar táimhe colonic [2]. Ina theannta sin, tá sé léirithe go bhfuil éifeacht chosanta suntasach ag sliocht ethanolic de Cistanche tubulosa i gcoinne hypoxia cheirbreach i lucha [3].

Tá ról ríthábhachtach ag cealla endothelial i pathogenesis Hipirtheannas scamhógach hypoxic. Tá an líne cille endothelial EA.hy926 go mór cosúil le cealla endothelial bunscoile. Le linn ár staidéar féin ar an éifeacht frith-hypoxic deCistanche tubulosasliocht eatánólach ar chill endothelial EA.hy926, thugamar faoi deara go bhfuil an 3-(4,5-démheitilthiazol-2-il)-2,5-bróimíd défheiniltetrasóiliam (MTT) measúnacht, a úsáidtear go coitianta chun inmharthanacht cille a mheas i staidéir ar chiteatocsaineacht agus ar ghníomhaíocht chitostatach, a ghin torthaí contrártha trí inmharthanacht cille méadaithe EA.hy926 a thaispeáint tar éis cóireála.

Tá measúnú cruinn ar inmharthanacht na gceall riachtanach chun éifeachtaí cíteatocsaineacha nó cíteachosanta a d’fhéadfadh a bheith ag oibreán íocshláinte a aithint. Mar sin, rinneamar imscrúdú ar na comhpháirteanna atá i láthair i sliocht C. tubulosa ethanolic a d'fhéadfadh a bheith freagrach as na torthaí contrártha a breathnaíodh leis an measúnacht MTT. Scoramar dhá phríomh-gliocóisídí feinileatánóideach (PhGanna) ó sliocht C. tubulosa ethanolic, echinacoside (comhdhúil 1 anseo feasta) agus acteoside (comhdhúil 2 anseo feasta), agus chinneamar a n-éifeacht ar inmharthanacht cille EA.hy926 ag baint úsáide as modhanna éagsúla. Ina theannta sin, chun a shoiléiriú tuilleadh cén t-ionadaí de chomhdhúile 1 agus 2 a d'fhéadfadh a bheith freagrach as na torthaí contrártha, rinneamar tástáil ar a n-aglycóin, aigéad caiféin (comhdhúil 3 anseo feasta) agus 3,4-dé-hiodrocsailephenylethanol (comhdhúil 4 anseo feasta), ar inmharthanacht cille EA.hy926 ag baint úsáide as na modhanna céanna.

Torthaí agus Plé

Comhdhúile a Aithint

Aithníodh struchtúir an dá chomhdhúil atá scoite ó C. tubulosa sliocht ethanolic trí anailísí athshondas maighnéadach núicléach (NMR) agus mais-speictriméadracht (MS) agus léirítear iad i bhFíor 1. Aithníodh cumaisc 1 mar echinacoside i gcomparáid le NMR (Tábla) a tuairiscíodh roimhe seo. 1) agus sonraí MS (m/z 785 [M−H]− ) [4]. Bhí speictream NMR cumaisc 2 an-chosúil leo siúd i gcomhdhúil 1, ach amháin i gcás nach raibh grúpa -D-glucopyranosil ann (Tábla 1). Aithníodh comhdhúil 2 (m/z 623 [M−H]− ) mar acteóisíd [5]. Rud atá tábhachtach, tá an t-aglycone céanna ag an dá chomhdhúil, lena n-áirítear aigéad caffeic (comhdhúil 3) agus 3,4-dé-hiodrocsailephenylethanol (comhdhúil 4).

Measúnachtaí Inmharthanachta Cille

Baineadh úsáid as measúnachtaí MTT agus CCK{{{0}} chun anailís a dhéanamh ar éifeacht chomhdhúile 1–4 ar inmharthanacht cille EA.hy926. Léirigh an measúnú MTT gur tháinig méadú suntasach ar inmharthanacht cealla EA.hy926 tar éis cóireála le 25 agus 5 0 μM cumaisc 1, 2, nó 3 (166.3 faoin gcéad agus 174.1 faoin gcéad le haghaidh cumaisc 1, 205.8 faoin gcéad agus 224.3 faoin gcéad le haghaidh cumaisc 2, agus 164.8 faoin gcéad agus 189.6 faoin gcéad le haghaidh cumaisc 3, faoi seach; p < 0.05),="" i="" gcomparáid="" le="" cealla="" rialaithe="" (fíor="" 2a).="" ina="" theannta="" sin,="" chinn="" iniúchadh="" moirfeolaíoch="" ar="" na="" cealla="" gur="" mhéadaigh="" cóireáil="" le="" 50="" μm="" cumaisc="" 1,="" 2,="" nó="" 3="" foirmiú="" criostail="" formazan="" corcra,="" a="" mheastar="" a="" bheith="" ina="" léiriú="" díreach="" ar="" chomhréir="" na="" gcealla="" beo="" (fíor="" 3).="" os="" a="" choinne="" sin,="" mhol="" measúnacht="" cck-8="" gur="" tháinig="" laghdú="" suntasach="" ar="" inmharthanacht="" cille="" tar="" éis="" cóireála="" le="" 12.5,="" 25,="" agus="" 50="" μm="" cumaisc="" 1,="" 2,="" nó="" 3="" (75.5="" faoin="" gcéad,="" 45.1="" faoin="" gcéad="" ,="" agus="" 43.7="" faoin="" gcéad="" le="" haghaidh="" cumaisc="" 1,="" 85.5="" faoin="" gcéad="" ,="" 51.8="" faoin="" gcéad="" ,="" agus="" 34.3="" faoin="" gcéad="" le="" haghaidh="" cumaisc="" 2,="" agus="" 64.5="" faoin="" gcéad="" ,="" 48.2="" faoin="" gcéad="" ,="" agus="" 36.4="" faoin="" gcéad="" le="" haghaidh="" cumaisc="" 3,="" faoi="" seach;="" p="">< 0.05),="" i="" gcomparáid="" le="" cealla="" rialaithe="" (fíor="" 2b).="" níor="" chuir="" comhdhúil="" 4="" isteach="" ar="" inmharthanacht="" cille="" sa="" mheasúnacht="" mtt="" nó="" cck-8.="" tugann="" an="" neamhréireacht="" idir="" na="" torthaí="" a="" fuarthas="" leis="" an="" dá="" mheasúnú="" le="" fios="" go="" bhféadfadh="" sé="" nach="" léiríonn="" ceann="" amháin="" den="" dá="" mheasúnú="" go="" cruinn="" éifeachtaí="" comhdhúile="" 1="" agus="" 2="" ar="" inmharthanacht="" cille="">

Measúnú Apoptosis ag Hoechst Staining

Is stain DNA cealla-thréscaoilteach é Hoechst 33342 atá sceitimíní ar sholas ultraivialait agus a astaíonn fluaraiseacht gorm ag 460 go 490 nm. Déanann crómatin comhdhlúite cealla apoptotic stain níos gile ná crómatin na gcealla gnáth [6]. De bharr an méid a léirigh cealla rialaithe crómatin scaipthe go haonfhoirmeach, gnáth-orgánelles, agus seicní cille slán, léirigh cealla a bhí gortha le comhdhúile 50 μM 1, 2, nó 3 ar feadh 48 h an staining tipiciúil de chealla apoptotic (Fíor 4A). Os a choinne sin, níor mhéadaigh nochtadh cealla go 50 μM de chomhdhúil 4 líon na núicléis apoptotic i gcomparáid leis an gcóireáil rialaithe.

Anailís Shreabhadh Cítiméadrach ar Chealla Apoptotic

Aithnítear cealla apoptotic sa mheasúnacht um dhathú dúbailte iarscríbhinn V-FITC/PI trí cheangal ard-chleamhnas d’iarscríbhinn V-FITC le fosfatidylserine, a sheachnaíonn i gcealla atá faoi apoptosis [7]. Sa mheasúnacht seo, ní cheanglaíonn cealla inmharthana le hiarscríbhinn V ná le PI agus mar sin níl siad daite (ceathrú íochtair ar chlé), déantar cealla luatha apoptotic a dhaite glas trí iarscríbhinn V-FITC (ceathrú ar dheis íochtair), agus cealla apoptotic déanacha a cheangal. atá daite glas agus dearg trí iarscríbhinn V-FITC a cheangal le fosfatidylserine agus PI le cealla necrotic, faoi seach (ceathrú uachtarach ar dheis). Mar a thaispeántar i bhFíor 4B, cealla gortha le comhdhúile 50 μM 1, 2, nó 3 ar feadh 48 h, mhéadaigh céatadán na gcealla apoptotic ó 3.74 faoin gcéad (cealla rialaithe) go 10.32 faoin gcéad, 12.95 faoin gcéad, agus 11.30 faoin gcéad, faoi seach. I gcomparáid le cealla rialaithe, níor mhéadaigh cumaisc 4 an céatadán de chealla apoptotic EA.hy926.

Ag teacht leis na torthaí a fuarthas le measúnacht CCK-8 agus le staining Hoechst 33342, léirigh an measúnú citeiméadrachta sreafa go raibh comhdhúile 1, 2, agus 3 ionduchtaithe apoptosis i gcealla EA.hy926. San iomlán, tugann na tuairimí seo le fios gur toradh bréagach-dearfach é an méadú ar inmharthanacht cille EA.hy926 a breathnaíodh leis an measúnacht MTT tar éis cóireála le comhdhúile 1–3.

Plé

I 1983, d'fhorbair Mosmann measúnacht dathmhéadrach micreaphláta MTT chun iomadú cille agus cíteatocsaineacht a thomhas [8]. Úsáidtear an mheasúnacht shimplí seo, agus modhnuithe air, go forleathan anois i saotharlanna bitheolaíochta cille ar fud an domhain. Léirigh staidéir codáin i gcealla mamaigh go bhfuil an cofactor laghdaithe núicléitíde pyridine, NADH, freagrach as an chuid is mó de laghdú MTT. Thacaigh staidéir ag baint úsáide as cealla iomlána leis seo [9]. Mar sin, baineann laghdú MTT le cealla atá gníomhach go meitibileach agus ní hamháin go bhfuil sé in éineacht le riospráid mitochondrial, ach freisin leis an cíteaplasma agus seicní neamh-mhiochondrial lena n-áirítear an urrann endosome / lysosome agus an membrane plasma [10]. Is é an glanlucht deimhneach ar an móilín MTT an príomhfhachtóir dá nglacadh ceall tríd an bpoitéinseal scannán plasma.

Go háirithe, b’fhéidir nach léireodh an measúnú MTT ó am go chéile go cruinn an éifeacht iarbhír a bhíonn ag cumaisc thástáilte ar chealla ar leith. Mar sin féin, níor sainaithníodh na struchtúir cheimiceacha nó na grúpaí ceimiceacha a d’fhéadfadh torthaí contrártha a chruthú sa mheasúnú MTT. Tá sé léirithe ag staidéir le déanaí go bhféadfadh an measúnú MTT gannmheas a dhéanamh ar éifeacht frith-iomadaithe (−)-epigallocatechin-3-gallate, an polyphenol is flúirseach i tae glas [11]. I staidéir a úsáideann an measúnú MTT chun cemosensitivity meall a bhrath, léirigh gníomhairí ceimiteiripeacha frith-ailse, mar shampla epirubicin, paclitaxel, docetaxel, agus imatinib mesylate (Gleevec), inmharthanacht cille méadaithe [12,13]. Thairis sin, tá roinnt staidéir tar éis a thuairisciú go bhféadfadh sleachta plandaí áirithe agus polyphenols redox-active cur isteach ar an measúnacht MTT mar a laghdaíonn siad go díreach salann tetrazolium MTT in éagmais cealla [14].

Cuireann an gá atá le criostail formazan MTT a intuaslagtha roimh anailís speictrophotiméadrach i léitheoir micreaphláta agus mar gheall ar nádúr críochphointe dúchasach an imoibrithe teorainn le húsáid an mheasúnaithe MTT d'fheidhmchláir áirithe. Mar thoradh air seo forbraíodh analógacha tetrazolium inar maisíodh na codanna feanile le grúpaí sulfónáit luchtaithe go diúltach, mar 2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro- 5-) suilfheinil)-2H-tetrazolium-5-carboxamide (XTT), salann istigh a luchtaítear go diúltach [15] agus 3-(4,{3-démheitilthiazól-2-il) -5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS), salann istigh lag aigéadach a bhfuil dlúthbhaint aige le MTT [16] . Mar thoradh ar na modhnuithe sin táirgeadh táirgí formazan meán-intuaslagtha sa chultúr a chuir deireadh leis an gceanglas maidir le céim intuaslagtha roimh an gcainníochtú. Dá réir sin, de réir mar a laghdaigh an lucht diúltach méadaithe ar na móilíní seo a gcumas bogadh trasna na seicní cille [17], glacadóirí leictreon idirmheánacha (IEA), mar 1-methoxy-5-meitile feinasiniam meitile sulfáit ({{25) }}methoxy PMS) chun laghdú ar lí tetrazole a éascú nó chun an ráta laghdaithe a fheabhsú.

Le déanaí, forbraíodh glúin nua de shalainn tetrazolium intuaslagtha in uisce agus is é WST-1 an fhréamhshamhail [18]. Tá WST-1, salann istigh dídhulfónaithe a luchtaítear go diúltach agus ina bhfuil iarmhar iaidín, níos cobhsaí ná XTT agus MTS i láthair 1-methoxy PMS, a IEA éigeantach. Mar thoradh air seo rinneadh margaíocht ar WST-1/{1-methoxy PMS mar threalamh áisiúil um iomadú cille imoibrí aonair. Forbraíodh roinnt salainn tetrazolium eile sa tsraith WST, agus b'fhéidir gurb é WST-8 [19] an ceann is úsáidí díobh. Is cosúil go bhfuil airíonna laghdaithe ceallacha atá an-chosúil le WST-8 agus WST-1 agus tá sé á mhargú go neamhspleách mar mheasúnacht CCK-8. Tá WST-8 neamh-thréscaoilteach cille agus dá bhrí sin laghdaítear é go seachcheallach, trí iompar leictreon ó NADH intéireallach go WST-8 trasna an scannáin plasma arna idirghabháil ag 1-methocsaí PMS. Cé go bhfuil laghdú MTT agus WST-8/{{-1meatocsa PMS araon á dtiomáint ag NADH intracellular, is cosúil go bhfuil difríocht idir foinse NADH laistigh den dá mhodh seo. Braitheann laghdú WST-8/1-meitiocsaí PMS níos mó ar an tointeáil mhaláit/aspartate a nascann timthriall aigéid mhiotachondrial tricarbocsaileacha-NADH leis an spás eis-mhiochondrial [20].

I réamh-turgnaimh, dheimhnigh muid nach bhféadfadh comhdhúile 1, 2, 3, agus 4 an salann tetrazolium MTT a laghdú go díreach (nach bhfuil léirithe). Sa staidéar seo, cuireadh deireadh le tionchar díreach na gcomhdhúile féin leis an imoibrí trí na micreaphlátaí a ní go cúramach le saline maolánach fosfáite (PBS) sular cuireadh an tuaslagán MTT nó CCK-8 leis, mar a léirítear i bprótacail an mhonaróra. Mar sin féin, bhí na torthaí a fuarthas ag baint úsáide as an dá mhodh contrártha fós (Fíor 2). De réir mar a bhíothas ag súil leis, mhéadaigh gor na gceall le comhdhúile 1, 2, agus 3 laghdú ar an salann tetrazolium go formazan corcra, i gcomparáid leis an ngrúpa rialaithe (Fíor 3), rud a thugann le tuiscint nach raibh ach laghdú ar an salann tetrazolium i láthair comhdhúil ar leith. ní leor é chun cumas an chomhdhúil cur isteach ar an measúnacht MTT a mheas.

Chun a chinneadh an bhféadfadh comhdhúile 1, 2, 3, agus 4 apoptosis a aslú i gcealla EA.hy926, rinneadh measúnú ar athruithe moirfeolaíocha ceallacha agus ar sheachtrú fosfatidylserine. Ag teacht leis an laghdú ar inmharthanacht cheallacha a breathnaíodh leis an measúnacht CCK-8, mhol torthaí anailíse ar chíteiméadracht staining agus sreafa Hoechst ag baint úsáide as iarscríbhinn V-FITC/PI go raibh an cosc ​​ar fhás a breathnaíodh tar éis cóireála cumaisc 1, 2, agus 3. mar gheall, go páirteach ar a laghad, ar apoptosis cille EA.hy926. Thacaigh ár dtorthaí freisin leis an smaoineamh go raibh an grúpa caffeoyl atá i láthair sa dá chomhdhúile 1 agus 2 freagrach as na torthaí contrártha a fuarthas leis an measúnacht MTT.

Cosúil lenár dtorthaí, níor léirigh Rottlerin, oscailteoir cainéal potaisiam mór seoltachta, imoibríocht i dtreo MTT in vitro. Mar sin féin, chuir sé go mór le foirmiú criostail formazan taobh istigh de chealla, toradh a bhí i gcoimhlint shoiléir le cosc ​​​​Rottlerin ar NF-κB agus iomadú cille a breathnaíodh trí anailís a dhéanamh ar ionchorprú [3 H] -thymidine i DNA [21]. Cuireadh an mheicníocht trínar chuir Rottlerin feabhas ar laghdú MTT i leith a éifeacht díchúplála mitochondrial [22]. Tá grúpa ionadach d'aigéad cinnamoile ag Rottlerin. I gcomparáid le haigéad cinnamoilile, tá dhá iarmhair hiodrocsaile bhreise ag comhdhúil 3, atá suite ag C-3 agus C-4. Mar sin, déanaimid tuairimíocht go bhféadfadh baint a bheith ag an meicníocht trína gcuireann comhdhúile 1 agus 2 le torthaí contrártha sa mheasúnacht MTT lena n-éifeachtaí díchúplála miteachondrial freisin. Chun an hipitéis seo a thástáil, tá gá le staidéir chomparáideacha i measc comhdhúile 1, 2, agus díchúplóir ceimiceach, mar shampla feinilhydrazone trifluorocarbonylcyanide (FCCP).

Rannóg Turgnamhach

Imoibrithe agus Ceimiceáin

Ceannaíodh Comhdhúil 3 (aigéad caiféiseach-púdar, íonacht=98.6 faoin gcéad ) ó Chengdu Push Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, an tSín). Fuarthas Comhdhúil 4 (3,4-dihydroxylphenylethanol-ola, íonacht=98.5 faoin gcéad ) ó Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, an tSín). Fuarthas MTT agus sulfocsaíd démheitil (DMSO) ó Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SAM). Ceannaíodh an measúnacht CCK-8 ó Dojin Laboratories (Kumamoto, an tSeapáin). Ceannaíodh trealamh braite apoptosis Hoechst 33342 agus iarscríbhinn V-FITC/PI ó Institiúid Biteicneolaíochta Beyotime (Haimen, an tSín)

Ábhar Plandaí

Bailíodh gais C. tubulosa ó Yutian Prefecture, Réigiún Uathrialach Xinjiang Uygur, an tSín. Taisceadh eiseamail dearbháin i bPríomh-Saotharlann an Leighis Ard-Airde, an Tríú Ollscoil Míochaine Míleata (Chongqing, an tSín) agus fíordheimhnigh Yi Zhang ó Ollscoil Chengdu um Leigheas Sínis Traidisiúnta (Chengdu, an tSín) iad.

Eastóscadh agus Leithlisiú Ábhar Plandaí

Púdaraíodh gais C. tubulosa aeir-triomaithe (0.6 kg) agus baineadh iad le 50 faoin gcéad eatánól ar feadh 2 h ag 70 céim . Tar éis an tuaslagóir a bhaint faoi bhrú laghdaithe, rinneadh an sliocht ethanolic (212.5 g) a thuaslagadh agus a fhionraí in uisce (2 L) agus a bhaintear le n-butanol (2 L × 3). Rinneadh an tsliocht n-butanólach (110 g) a chromatagrafaíocht ar cholún polaimíde agus é a chur faoi uisce le eatánól/uisce (0:100, 5:95, 15:85, 30:70, 50:50) ag táirgeadh cúig chodán (A–E) . Rinneadh codán B (65 g) a chodánú ar cholún ODS; elution le eatánól: uisce (1:9) scartha cumaisc 1 (3 g). Rinneadh codán D (10.5 g) a chodánú ar cholún ODS; elution le eatánól/uisce (1:4) comhdhúil scartha 2 (1 g).

Taifeadadh speictrim NMR ar speictriméadar Bruker Avance 600 i CD3OD le Tetramethylsilane (TMS) mar chaighdeán inmheánach. Rinneadh mais-speictrim ar speictriméadar maise BioTOF-Q.

Cultúr na Cille

Fuarthas línte cille EA.hy926 ó Bhailiúchán Cultúir Cineál Mheiriceá (Manassas, VA, SAM). Saothraíodh cealla i meán RPMI 1640, forlíonta le 10 faoin gcéad (v/v) séiream bó féatais agus 1 faoin gcéad (v/v) peinicillin-streiptimícin i dtimpeallacht tais le 5 faoin gcéad CO2 ag 37 céim .

Inmharthanacht Cille

Rinneadh measúnú ar inmharthanacht na gceall trí úsáid a bhaint as na measúnachtaí MTT agus CCK{{{{0}}. Comhdhúile 1 agus 2, agus a n-aglycóin, aigéad caffeic (3) agus 3,4-dihydroxylphenylethanol (4) a thuaslagadh i DMSO go dtí an tiúchan DMSO deiridh < 0.1="" faoin="" gcéad="" (v/v)="" i="" meáin="">

Síolaíodh cealla EA.hy926 ar 96-phlátaí tobair ag 4 × 103 cill/tobar. Tar éis goir ar feadh 24 h, déileáladh le cealla le cumaisc 6.25-50 μM 1, 2, 3, nó 4 ar feadh 24 h. Baineadh an meán cultúir agus nite cealla faoi dhó le saline maolánach fosfáit (PBS). Cuireadh Aliquots (10 μL) de thuaslagán MTT stoc (5 mg · ml - 1 ) le gach tobar ina bhfuil 100 μL de mheán agus gortha le cealla ar feadh 4 u. Tar éis goir, baineadh an meán agus cuireadh slánchuid 150 μL de DMSO le gach tobar chun na criostail formazan a thuaslagadh. Tomhaiseadh ionsú ag 490 nm ag baint úsáide as léitheoir microplate (Bio-Tek Synergy HT, Winooski, VT, USA). Léiríodh inmharthanacht cille mar chéatadán de laghdú MTT, ag sannadh an luach 100 faoin gcéad ar ionsú na gcealla rialaithe. Rinneadh na turgnaimh go léir trí huaire agus cuireadh i láthair iad mar mheán ± diall caighdeánach (SD).

Rinneadh an measúnú CCK-8 tar éis na litríochta le mionathruithe [23]. Go sonrach, déileáladh le cealla le comhdhúile 6.25-50 μM 1, 2, 3, nó 4 ar feadh 24 h agus nite faoi dhó le PBS sular cuireadh tuaslagán 10 μL CCK-8 agus 100 μL de mheáin chultúir leis. Tar éis an microplate a chothú ag 37 céim ar feadh 2 h, tomhaiseadh ionsúiteacht ag 450 nm ag baint úsáide as léitheoir microplate. Cuireadh in iúl inmharthanacht cille mar an céatadán de chealla inmharthana i gcomparáid le cealla rialaithe ( 100 faoin gcéad ). Rinneadh na turgnaimh go léir trí huaire agus cuireadh in iúl iad mar mheán ± SD.

Measúnú Apoptosis ag Hoechst 33342 Staining

Breathnaíodh athruithe moirfeolaíocha apoptotic le staining Hoechst 33342. Go hachomair, síolaíodh cealla EA.hy926 ar 48-phlátaí tobair (2 × 104 cealla / tobar) agus déileáladh leo le cumaisc 50 μM 1, 2, 3, nó 4 le haghaidh 48 h ag 37 céim, nite faoi dhó le PBS, agus seasta le paraformaildéad 4 faoin gcéad (v/v) ar feadh 15 nóiméad ag teocht an tseomra. Tar éis sruthlaithe faoi dhó le PBS, bhí dhaite cealla le Hoechst 33342 (10 ug · ml - 1 ) ar feadh 5 nóiméad ag teocht an tseomra agus nite faoi dhó le PBS. Rinneadh núicléis dhaite Hoechst a léirshamhlú ag baint úsáide as micreascóp fluaraiseachta (Olympus, Tóiceo, an tSeapáin).

Anailís apoptosis ag Sreabhadh Cytometry

Braitheadh ​​cealla apoptotic ag iarscríbhinn V-FITC/PI um dhathú dúbailte agus anailís chitiméadrachta sreafa. Go hachomair, tar éis cóireála le cumaisc 50 μM 1, 2, 3, nó 4 le haghaidh 48 h, baineadh cealla agus athchuireadh iad i PBS ag cealla 1 × 105 · ml -1. Tar éis lártheifneoiriú ag 500 × g ar feadh 5 nóiméad ag 25 céim , cuireadh 195 μL de iarscríbhinn maolán ceangailteach V-FITC agus 5 μL de iarscríbhinn V-FITC leis. Tar éis meascadh vortex milis, gor an meascán ar feadh 10 nóiméad ag teocht an tseomra sa dorchadas. Tar éis lártheifneoraithe ag 500 × g ar feadh 5 nóiméad ag 25 céim , cuireadh 190 μL d'iarscríbhinn V comhchuingeach maolán agus 10 μL PI leis. Tar éis meascadh vortex mín, rinneadh anailís ar shamplaí agus úsáid á baint as Cítiméadar Sreafa FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, SAM) laistigh de 30 nóiméad.

Anailís staitistiúil

Cuireadh na sonraí turgnamhacha go léir in iúl mar mheán ± SD. Rinneadh measúnú ar thábhacht na ndifríochtaí idir samplaí turgnamhacha agus an rialú comhfhreagrach trí anailís aontreo ar athraitheacht (ANOVA) ag baint úsáide as bogearraí SPSS (leagan 11.5). Socraíodh tábhacht staitistiúil ag p <>

Conclúidí

Tugann ár dtorthaí le fios go bhféadfadh an rómheastachán ar líon na gceall inmharthana a breathnaíodh sa mheasúnú MTT cíteatocsaineacht comhdhúile áirithe a cheilt. Mar sin, le linn próisis scagthástála drugaí, molaimid úsáid a bhaint as modhanna éagsúla chun éifeacht an chomhdhúil shonraigh ar inmharthanacht cille a chinneadh (cosúil le CCK-8 agus 3 thástálacha H-TdR) chun torthaí míthreoracha a sheachaint.