Nochtann Anailís i Sileac ar Venom Parasitoid Drosophila Leitheadúlacht Móitíf Gearrthóg Cation–Polar–Cation i bPróitéiní Knottin Cuid 1

Coimriú:

Mar fhoichí seadánóideach ginearálaithe, tá an-rath ar Leptopilina heteroatom ar go leor speiceas de chuileoga torthaí den ghéineas Drosophila. Táirgeann na paraisítín struchtúir speisialaithe ilstraitéiseacha cosúil le feisicín eischeallach (EV) ina ngeinim. Aithníodh roinnt próitéiní a bhaineann le himdhíonacht le hanailís próitéamaíoch, lena n-áirítear an peptide snaidhm, LhKNOT, ina bhfuil an fhillteán coiscthí cistéin (ICK) atá caomhnaithe go struchtúrach, atá i bpróitéiní ó thacsaí éagsúla. Nocht ár n-anailís struchtúrach agus duga ar fhillte chniotáin iarmhar croí LhKNOT, chomh maith leis an móitíf snaidhmthe féin, go bhfuil gearrthóg Cation-Polar-Cation (CPC) aige freisin.

Is substaint nádúrtha é cistéin inhibitor a úsáidtear chun damáiste ocsaídiúcháin a chosc agus fás cille a chur chun cinn. Maidir le díolúine, léirítear ról cistéin go príomha chun díolúine an chomhlachta a fheabhsú agus athlasadh agus ionfhabhtú a chosc.

Le blianta beaga anuas, léirigh staidéir níos mó agus níos mó gur féidir ról tábhachtach a bheith ag cistéin sa chóras imdhíonachta. Féadann sé iomadú cealla imdhíonachta a chur chun cinn, friotaíocht an chomhlachta ar phataiginí a fheabhsú, agus an baol ionfhabhtaithe a laghdú. Ina theannta sin, is féidir le cistéin táirgeadh fréamhacha saor in aisce a laghdú agus sláinte iomlán an chórais imdhíonachta a fheabhsú, rud a chuireann le díolúine an chomhlachta.

Cé go bhfuil éifeacht cistéin ar dhíolúine an-suntasach, nuair a úsáidtear inhibitor cistéin, ba chóir é a úsáid le rabhadh. Toisc go n-úsáidtear an cistéin inhibitor de ghnáth chun galair áirithe a chóireáil, mar shampla galar cardashoithíoch, airtríteas, etc., má dhéantar mí-úsáid air, cuirfidh sé isteach ar dhíolúine agus cuirfidh sé córas imdhíonachta an chomhlachta lagú, rud a mhéadóidh an baol ionfhabhtaithe.

Mar fhocal scoir, tá gaol dofhuascailte idir an t-inhibitor cysteine ​​agus díolúine. Cé gur féidir le coscairí cistéin sláinte an chomhlachta a chur chun cinn, ní mór iad a úsáid freisin faoi threoir dochtúir, agus ba cheart aird a thabhairt ar dáileog réasúnta a choinneáil chun sláinte an chomhlachta a chothabháil. Is féidir a fheiceáil go gcaithfimid díolúine a fheabhsú. Is féidir le Cistanche díolúine a fheabhsú go suntasach, toisc go bhfuil éagsúlacht de chomhábhair bhitheolaíocha gníomhacha ag fuinseog feola, mar shampla polaisiúicrídí, dhá bheacáin, Huang Li, etc. Is féidir leis na comhábhair seo córais imdhíonachta éagsúla a spreagadh. cealla cosúil le cealla, ag méadú a ngníomhaíocht imdhíonachta.

Cliceáil buntáistí sláinte cistanche

Ceaptar go n-éascaíonn móitíf gearrthóg CPC gníomhaíocht fhrithmhiocróbach i bpróitéin atá ceangailteach le heparin. Is ionadh é, tá móitíf ghearrthóg CPC ag tromlach na ICKanna a tástáladh, lena n-áirítear 75 próitéin bona fide planda agus knottin artrapóid a roinneann seicheamh ard agus/nó cosúlacht struchtúrach le LhKNOT. Cosúil le LhKNOT agus na próitéiní 75 knottin eile seo, fiú amháin an peptide antifungal Drosophila Drosomycin, géine sprice canonical de chonair imdhíonachta TollNF-kappa B na heitilte, tá an móitíf gearrthóg CPC seo. Le chéile, tugann ár dtorthaí le fios go bhféadfadh feidhm chosanta a bheith ann don LhKNOT parasóideach.

Tugann leitheadúlacht móitíf gearrthóg CPC, atá intreach don snaidhm cistéin laistigh de na próitéiní snaidhm a scrúdaítear anseo, le fios go bhfuil an topology 3D dá bharr tábhachtach dá bhfeidhmeanna bithcheimiceacha. Is dócha gur móitíf struchtúrach an-chaomhnaithe atá sa ghearrthóg CPC a fhaightear i go leor próitéiní éagsúla a bhfuil cumas tuairiscithe ceangailteach heparin acu, lena n-áirítear próitéiní amyloid. Is spriocanna iad snaidhmeanna d’fhorbairt theiripeach drugaí, agus cuirfidh léargais ar a gcaidrimh struchtúr-feidhme dearadh nua drugaí chun cinn.

Eochairfhocail:

Óstach-parasite; Drosophila; Leptopilina; snaidhm cistéin; huaire snaidhm; Gearrthóg Cation–Polar–Cation; peptide frithmhiocróbach; móitíf ceangailteach heparin; próitéiní mion.

1. Réamhrá

In idirghníomhaíochtaí óstaigh-parasit, caithfidh an seadán brú maslach a sholáthar agus an t-óstach a choinneáil beo ag an am céanna chun sliocht inmharthana a chothú [1,2]. Mar gheall ar spriocanna contrártha den sórt sin, tháinig éabhlóid na bhfachtóirí virulence le straitéisí móilíneacha éagsúla agus ag an am céanna sainiúlacht ard óstaigh a chothabháil. Déanann Hymenoptera seadánacha suas le milliún speiceas, tá siad uileláithreach ar an phláinéid, agus parasitizes éagsúlacht artrapóid, feithidí go príomha [3].

Tá éagsúlacht de straitéisí iompraíochta agus bithcheimiceacha forbartha ag foichí a dhéanann ionsaí ar óstach feithidí le haghaidh rathúlachta agus tá siad fós faoi bhrú comh-éabhlóideach leanúnach lena n-óstach [4-7].

Samhail atá ag teacht chun cinn is ea an córas Leptopilina/Drosophila chun bunsraitheanna móilíneacha na bhfreagraí frith-foiche agus straitéisí géine foiche a thuiscint [8]. Chun díolúine óstaigh a bhaint, tugann baineannaigh Leptopilina fachtóirí venom isteach ina n-óstach larbha le linn oviposition [4,9,10]. Soláthraíonn na meicníochtaí imdhíonachta dea-shainithe in Drosophila [11-13] comhthéacs luachmhar chun staidéar a dhéanamh ar éifeachtaí na bhfachtóirí venom foichí seo.

Gníomhaíonn ionfhabhtú an speisialtóra L. boulardi na hairm imdhíonachta humoral agus cheallacha arna rialú ag cosán comharthaíochta Toll-NF-κB caomhnaithe na heitilte. Cuirtear an léiriú ar ghéinte peptide frithmhiocróbach (AMP) mar drosomycin i ngníomh tar éis ionfhabhtú L. boulardi [14]. Rialaíonn comharthaíocht dola-NF-κB freisin rannán agus forbairt cille fola [15,16], céimeanna a rialaíonn imchochlú agus bás uibheacha foiche [17,18].

I gcodarsnacht leis sin, cuireann ionfhabhtú an ghinearálaithe L. heteroatom an dá chosán imdhíonachta faoi chois [9,14], agus scriostar beagnach gach cealla fola larbha ag fachtóirí sa venom foiche [19,20].

Sa staidéar seo, déanaimid anailís ar struchtúr teoiriciúil peptide L. heteroatom, ar a dtugtar LhKNOT, a aithníodh laistigh de táil cosúil le horgán i venom L. heteroatom ach nach bhfuil i venom L. boulardi [21]. Áirítear leis na horgánaigh imdhíonachta-shochtadh seo níos mó ná 350 próitéin agus tá próifíl próitéamach acu de mhicribhithicíní eucaryotic agus raidhse próitéiní a bhaineann le díolúine [21-23].

Glacann LhKNOT an móitíf "Inhibitor Cysteine ​​Knot" (knottin) [24]. Caomhnaítear an móitíf knottin go ginearálta i raon tacsaithe, ó phlandaí [25,26] go seilidí [27]. Na peptídí beaga seo (<60 residues) are functionally diverse. Knottins are used offensively, in spider toxins [28] and cone snail venom [27], as well as defensively, e.g., in wound healing activities of cacti [26], and antimicrobial host defense in plants [25,26,29] and invertebrates [30].

Cuirtear an raon leathan gníomhaíochta snaidhmthe i leith struchtúr foriomlán a fhillte, a bhraitheann go hiomlán ar mhóitíf caomhnaithe de shé iarmhair cistéin a bhaineann leas as cumas uathúil na gcistiní seo chun droichid déshilfíde a dhéanamh. Tarlaíonn an mhóitíf knottin nuair a bhreathnaítear iarmhair chistéin i bpatrún C1-C2-C3-C4-C5-C6(nuair is ionann "-" agus roinnt mhaith iarmhair an-athraitheach).

Ansin cruthaítear droichid déshulfíde ar an mbealach céanna caomhnaithe (C1-C4, C2-C5, agus C3-C6), as a dtagann C1-C4 agus C{{ 8}}C5 a fhoirmíonn macrith-rothach, agus tá C3-C6 laistigh den mhacriogthra seo, rud a fhágann go bhfuil topology "snaidhmthe" ann. Toisc go bhfuil an topology snaidhmthe seo ag brath go mór ar chaomhnú na sé iarmhar cistéin, ceadaíonn an móitíf snaidhmthe éagsúlacht shuntasach san ord iomlán [30]. Mar gheall ar a mbeagmhéid, a n-athraitheas ard-chaoinfhulaingt, agus an chobhsaíocht struchtúrach a breathnaíodh, tá snaidhmeanna mar scafall coitianta le haghaidh dearadh drugaí [30], d'fhéadfadh fiú amháin le haghaidh cóireálacha ailse [31].

Léiríonn nó tugann línte éagsúla fianaise turgnamhacha cumais fhrithmhiocróbacha le haghaidh muirmhíle éagsúla [25,26,29,30,32,33] nó idirghníomhaíochtaí cainéil ian gataithe [28,34], cé nach bhfuil na meicníochtaí móilíneacha trína gcuirtear na feidhmeanna seo i gcrích. tuigtear go maith. Ina theannta sin, ní fios an bhfuil meicníocht choitianta gníomhaíochta ag na feidhmeanna frithmhiocróbacha seo.

Mar gheall ar a fhionnachtain ó cháithníní imdhíonachta-sochtadh ó pharasítí cuileog, bhí ár spriocanna (a) seichimh a bhaineann le LhKNOT ó orgánaigh éagsúla a aithint, lena n-áirítear L. heteroatom, L. boulardi, agus parasitoids Ganaspis, a ionsaíonn Drosophila agus (b) aon cheann a aithint. móitíf(í) struchtúracha núíosacha atá i láthair sna homalóga LhKNOT atá ar eolas nó sna homaloganna nua LhKNOT agus é ag súil go bhféadfaí feidhmeanna féideartha do LhKNOT a mholadh dá ndéanfaí a leithéid de mhóitíf caomhnaithe a thuar agus taighde turgnamhach amach anseo a threorú.

Léirímid go bhfuil sainmharcanna an fhillte snaidhmigh ag samhail theoiriciúil de LhKNOT le trí bhileog béite fhrithsheasmhacha, srianta ag droichid déshilfíde. Tá gearrthóg CPC i múnla LhKNOT, atá in ann idirghníomhú le heparin, glycosaminoglycan (GAG) a bhfuil muirear diúltach aige agus a bhfuil luach suntasach míochaine aige. Tá an cumas ag LhKNOT freisin idirghníomhú le GAGanna eile, mar shampla sulfáit keratan (GAG atá an-sulfáitithe, cosúil le heparin) agus aigéad hyaluronic (an t-ionadaí aonair GAG nach gá sulfation) [35].

Ina theannta sin, tá móitíf gearrthóg CPC ag homalóga struchtúracha LhKNOT (.i. próitéiní bona fide móitífeanna knottin) ar féidir leo duga le heparin. Is ionadh é, cosúil le LhKNOT agus na próitéiní bona fide knottin eile seo, go roinneann fiú an peptide antifungal Drosophila Drosomycin an móitíf gearrthóg CPC seo ina struchtúr. Sainaithníodh an móitíf seo freisin i 41 as 46 homalog LhKNOT breise ó L. heteroatom, L. boulardi, agus Ganaspis spp. foichí go rathúil ar D. melanogaster.

Tugann siad seo i dtuairimí silico-bhunaithe le fios go bhféadfadh móitíf ghearrthóg CPC, atá bunúsach i go leor muirmhíle, an bonn struchtúrach a sholáthar chun feidhmeanna imdhíonachta nó borrtha a mhodhnú. Déanaimid tuairimíocht ar fheidhm fhrithmhiocróbach nó a bhaineann le virulence don fhoichí LhKNOT. Tugann flúirse an fhillte snaidhm agus a chomhthoil le móitíf ghearrthóg CPC sa chuid is mó de na peiptídí snaidhmithe nua-aitheanta ó thrí parasítóid Drosophila le fios go bhfuil ról tábhachtach fós le cinneadh dóibh i bhfiseolaíocht seadánóideach agus/nó san óstaigh-seadán. idirghníomhaíochtaí.

2. Torthaí
2.1. Léiríonn Seicheamh LhKNOT Cosúlacht le Peptides Frithmhiocróbacha Feithidí agus Plandaí

Léirigh cuardach BLASTp ar bhunachair shonraí an nr agus TSA ag baint úsáide as an t-ord LhKNOT lán-fhad (60 aimínaigéid) líon teoranta amas suntasach, anótáilte go príomha mar "peiptídí frithmhiocróbacha", ó phlandaí agus feithidí. Aithníodh cúpla seicheamh fungasach freisin. Léirigh na torthaí go léir níos lú ná 60 faoin gcéad céannacht aimínaigéad do LhKNOT. Ba é an cluiche is fearr do LhKNOT sa bhunachar sonraí nr ná peptide frithmhiocróbach ón gciaróg choitianta, Callosobruchus maculates, agus ba é an buaic is airde i mbunachar sonraí TSA ná peiptíd frithmhiocróbach ón mite curl cruithneachta Aceria Coachella.

Bhí an caomhnú is suntasaí sa réigiún den mhóitíf seicheamh amháin a bhain le LhKNOT, an síniú 'peptide antifungal' a bhfuil snaidhm air le cistéin (pfam11410 domain, E=2.8 × 10−3 ). Tar éis PSI-BLAST a reáchtáil chun homalóga cianda a bhrath, nochtadh seichimh bhreise. Léirigh PSI-BLAST torthaí comhchosúla le gléasra oighir coitianta, Mesembryanthemum crystallinum; mites dearg, Dinothrombium tinctorium; foiche parasitoid, Trichogramma pretiosum; ciaróg cliceáil, Ignelater lonrúil; foiche parasitoid, Trichogramma brassicae; ciaróg pailine coitianta, Brassicogethes aeneus; tolladóir fuinseoige, Agrilus planipennis; agus go sábhálta, Neodiprion lecontei.

Ag baint úsáide as an bhfreastalaí gréasáin HMMER atá tiomáinte ag Hidden Markov Models mar mhodh eile chun homalóga cianda a bhrath, d'aithin muid cúig amas fungais ó Akanthomyces lecanii, Cordyceps javanica, Cordyceps confragosa, Roselinia necatrix, agus Beauveria bassiana.

Níor tháinig cuardach ar an PDB le haghaidh seichimh chomhchosúla ach dhá thoradh shuntasacha, ceann amháin le haghaidh peptide antifungal de chineál knottin Alo-3 ón feithid Acrocinus longimanus agus an dara ceann ón peiptíd leighis créachta dísulfide-srianta pB1 ó Pereskia bleo. Tá achoimre i dTábla Forlíontach S1 ar shonraí na n-homalóg gar agus iargúlta go léir a aithníodh agus úsáid á baint as na cineálacha cur chuige cosúlachta seichimh éagsúla.

Léirigh ailíniú LhKNOT leis na struchtúir aitheanta de chnoicíní tipiciúla chomh maith le homalóga sainaitheanta caomhnú na sé chistéin atá mar na trí dhroichead dédhuilfíde i LhKNOT (Fíor 1A). Ar a N-fhoirceann, tá teascán fada helical i LhKNOT a thuartar go bhfeidhmeoidh sé mar sheicheamh comhartha; go hinmheánach, tá trí bhéite-bhileog ann, mar a bhíothas ag súil leis ó struchtúr tánaisteach peptídí knottin (Fíor 1B).

Ina theannta sin, díríodh measúnú ar chosúlacht seicheamh LhKNOT ar na tras-scríbhinní L. heteroatom agus L. boulardi atá ar fáil agus ó pharasídeach eile Drosophila, Ganaspis spp. (féach Modhanna), léirigh raidhse de sheichimh ghaolmhara. Maidir le L. heterotoma (Lh14), d'aithníomar 16 próitéin knottin breise Lh14 (Tábla Forlíontach S2).
Maidir le L. boulardi, d'aithin muid 22 próitéin knottin (Tábla Forlíontach S3). Aithníodh sé homalóg LhKNOT mar an gcéanna ón Ganaspis hookeri (G1) agus fuarthas dhá homalóg LhKNOT sna tuar próitéine a rinneadh ón genome G. brasiliensis (VA) (Tábla Forlíontach S4). Taispeánann Figiúr 2 caomhnú na seichimh chniotán parasitoid seo le LhKNOT. Mar sin, is cosúil go n-ionchódaíonn na cúpla parasitoids Drosophila a sampláladh sa staidéar seo próitéiní snaidhmithe iolracha. Féadfaidh na foichí seo peiptídí breise den sórt sin a ionchódú, agus tá gá le cineálacha cur chuige próitéamacha/bithfhaisnéise córasacha chun liosta cuimsitheach a fháil. Ní fios fós feidhmeanna na snaidhmeanna toimhdeacha seo i bhfiseolaíocht na seadán.

Fíor 1. (A) Ailíniú seicheamh iolrach LhKNOT (barr) agus homologs sa teaghlach knottin (barr go bun): Mesembryanthemum crystallinum (gléasra; frithmhiocróbach; ID NCBI: AAC19399), Aceria tosichella (mite; frithmhiocróbach; ID NCBI :MDE48292.1), Callosobruchus maculatus (ciaróg; anaithnid; ID NCBI: VEN35376.1), Dinothrombium tinctorium (mite; anaithnid; ID NCBI:RWS16713.1), Trichogramma pretiosum (Alo{{10}} cosúil le; foiche parasitoid; frithmhiocróbach; ID NCBI: XP_014233229.1), Ignelater luminosus (ciaróg; anaithnid; ID NCBI: KAF2884324.1), Trichogramma brassicae (foiche parasitoid; anaithnid; ID NCBI: CAB{{27) }}{{30}}31014.1), Brassicogethes aeneus (ciaróg; anaithnid; Aitheantas NCBI: CAH0563829.1), Agrilus planipennis (borair fuinseoige; frithmhiocróbach; ID NCBI : XP_018321119.1), Neodiprion lecontei (sawfly; anaithnid; NCBI ID: XP_015517007.2), Akanthomyces lecanii (fungas; antifungal; Uniprot ID: A0A168C5L6), Cordyceps javanica (fungas; antifungal ; Uniprot ID: A0A545VVU1), Cordyceps confragosa (fungas; anaithnid; Uniprot ID: A0A179IJT7), Rosellinia necatrix (fungas; anaithnid ; Aitheantas Uniprot: A0A1S8A723), Beauveria bassiana (fungas; anaithnid; ID Uniprot: A0A0A2VUF6), Acrocinus longimanus (Alo-3; ciaróg; antifungal; ID PDB: 1Q3J), agus Peresskia bleo (PB1: cactus; 5XBD). Aibhsítear iarmhair chomhionanna le dearg, agus aibhsítear iarmhair atá cosúil go ceimiceach le buí. Léiríonn saigheada dubha na hiarmhair cistéin caomhnaithe atá freagrach as an bhfillteán struchtúrach snaidhm, agus tá nascacht droichead disulfide na dtrí dhroichead disulfide marcáilte le huimhreacha glas neon.

Seasann X agus XX do líon athraitheach na n-iarmhar ag an gcríochfort N- agus C, faoi seach. Taispeántar gnéithe de struchtúr tánaisteach den LhKNOT mhúnlaithe ag an mbarr. agus seasann T -shnáithe, agus -cas, faoi seach. (B) Réamh-mheastachán ar struchtúr tánaisteach do LhKNOT, ag taispeáint teascán fada helical (sorcóir bándearg; peptide comhartha) agus trí shraith béite (saigheada buí) ina dhiaidh sin. Leanann an struchtúr tánaisteach seo síniú canónach Knottin [36]. (C) Fréamhshamhail den fhilleadh struchtúrach snaidhm ó bhunachar sonraí KNOTTIN [36] (cead chun an íomhá seo a atáirgeadh tugtha ag an Dr. Jean-Christophe Gelly, INSERM, Deireadh Fómhair 2019). Cruthaíonn an dá dhroichead déshulfíde (glas) macra-timthriall, agus tarraingíonn an tríú cuid (gorm) tríd an lár rud a thugann a topology snaidhmthe ainm don phróitéin. (D) Struchtúr treasach tuartha LhKNOT, a thaispeánann an topology snaidhmithe agus an mhóitíf cistéin chaomhnaithe, cruthaíonn iarmhair chistéin droichid déshulfíde sa phatrún caomhnaithe a fheictear ar fud an teaghlaigh snaidhmthe (C1 -C4 agus C{-foirm C5). an macra-timthriall, tarraingíonn C3 -C6 tríd an lár).

Fíor 2. (A) Ailíniú seicheamh iolrach de LhKNOT (barr) agus homalogs i Lh14. (B) Ailíniú seicheamh iolrach de LhKNOT (barr) agus homalogs i L. boulardi. Freagraíonn an X atá marcáilte sa bhosca glas do na cuir isteach seo a leanas in dhá sheicheamh Lb17: Lb: GISX01151661.1 X=SQAPPPTPEPFHPPGTPP; Lb: GISX01151653.1 X=SQLTSPRSTFPPTGSTIPSIITT. (C) Ailíniú seicheamh iolrach de LhKNOT (barr) agus homologs i Ganaspis spp. Aibhsítear iarmhair chomhionanna le dearg, agus aibhsítear iarmhair atá cosúil go ceimiceach le buí.

Léiríonn saigheada dubha na hiarmhair cistéin caomhnaithe atá freagrach as an bhfillteán struchtúrach snaidhm, agus tá nascacht droichead disulfide na dtrí dhroichead disulfide marcáilte le huimhreacha glas neon. Taispeántar gnéithe de struchtúr tánaisteach den LhKNOT mhúnlaithe ag an mbarr. agus seasann T -shnáithe, agus -cas, faoi seach. Cuirtear réaltaí liatha ar bharr bloic seicheamh, is ionann na hiarmhair thuas agus iarmhair atá múnlaithe le comhréireanna malartacha.

2.2. Struchtúr Tríthoiseach LhKNOT

Sainmhínítear huaire struchtúrach tipiciúil peptide knottin ag sé chistéin a bhfuil baint acu le trí bhannaí disulfide chun béite-bhileog antiparallel trí-shnáithe trí-shnáithe cistéin a fhoirmiú [25]. Tréith thábhachtach den fhilleadh seo is ea nascacht na n-iarmhar cistéin chun na droichid déshulfíde a fhoirmiú agus an droichead déshuilfíde de chistéiní 3 agus 6 ag dul trí dhéshuilfídeanna 1–4 agus 2–5 chun déshilfíd speisialta a dhéanamh trí snaidhm déshulfíde (Fíor 1A, C). ).

Déanann an díshulfíd seo, trí ghné snaidhm díshulfíde, idirdhealú a dhéanamh ar fhilleadh snaidhm ó phróitéiní snaidhmí cistéin eile. Seachas na cistéiní caomhnaithe, is féidir leis an gcuid eile den seicheamh aimínaigéad a bheith sách athraitheach, agus mar sin, ní aithnítear ach líon teoranta muirmhíle trí chur chuige cosúlachta seichimh do LhKNOT (féach an t-alt roimhe seo agus Tábla Forlíontach S1).

Ar an láimh eile, d'éirigh le halgartaim aitheantais fillte agus cineálacha cur chuige samhaltaithe bunaithe ar theimpléad, roinnt snaidhmeanna éagsúla a aisghabháil mar iarrthóirí oiriúnacha do shamhaltú LhKNOT. I measc na múnlaí LhKNOT éagsúla a gineadh, ba é an tsamhail is fearr ná múnla il-theimpléad-bhunaithe de LhKNOT a cruthaíodh ag baint úsáide as an gclár HHpred [37] le srianta struchtúracha a dhíorthaítear ó na trí theimpléad is airde, Alo-3 (PDB: 1Q3J) [ 30], omega-agatoxin-IVA (PDB: 1IVA) [28], agus PAFP-S (PDB: 1DKC) [25]. Léirigh próifílí fuinnimh eolasbhunaithe arna ríomh ag baint úsáide as ProSA-web [38] don tsamhail roghnaithe seo fuinneamh íseal agus z-scór de −4.53, atá inchomparáide le struchtúir réitigh.

Rinne Verify3D [39] measúnú ar an tsamhail ilteimpléad-bhunaithe seo le scór pasála (100.00 faoin gcéad de na hiarmhair sa tsamhail tá 3D ar an meán-1 D scór níos mó ná nó cothrom le 0.2). Is dócha gur léiriú é scór VoroMQA [40] de 0.325 ar mhéid beag an pheptíde agus bhí scóir na dteimpléad sa raon céanna (Fíor Forlíontach S1).

Is éard atá sa tsamhail il-teimpléad seo ná an fhillteán snaidhmithe le trí bhéite-shnáithe frith-chomhthreomhara, srianta ag droichid déshulfíde agus nascacht ionchasach droichid dídhuilfíde (Fíor 1D). Dhearbhaigh KNOTER3D, uirlis i mBunachar Sonraí KNOTTIN [36] go bhfuil fillte bona fide knottin ag an múnla seo agus dheimhnigh sé an patrún nasctha disulfide a aithníodh roimhe seo i bhFíor 1D.

2.3. Léiríonn LhKNOT Láithreacht Gearrthóg CPC, In ann Idirghníomhú le Heparin agus le GAGanna Eile

Chun feidhmeanna féideartha LhKNOT a chuardach, rinneadh imscrúdú ar chomhghaolta struchtúr-feidhm de dhlúth-homalóga struchtúracha LhKNOT. Tá móitíf ceangailteach heparin ar a dtugtar an gearrthóg CPC ag próitéin knottin ón cactus Pereskia bleo (PDB: 5XBD) [26]. Cruthaíonn an móitíf struchtúrach seo gearrthóg geoiméadrach srianta de dhá iarmhair cationic agus aon iarmhar polar a idirghníomhaíonn le heparin trí dhroichid salainn agus bannaí hidrigine a chlampáil ina seasamh laistigh de dhromchla luchtaithe go dearfach an ghearrthóg [41].

Léirigh forshuíomh struchtúrach den chactus knottin agus LhKNOT go bhfuil an dá struchtúr an-chosúil le chéile, le difríocht iomlán níos lú ná 2Å. Léirigh anailís dhuála ar LhKNOT le heparin, ag baint úsáide as sainpharaiméadair ClusPro do heparin mar ligand, go dtarlaíonn na hidirghníomhaíochtaí polacha a fheileann don mhóitíf gearrthóg CPC in iarmhair R1-S3-R14 (Fíor 3A) do LhKNOT .

Bhí faid tomhaiste (idir alfa-charbóin agus lárionaid mhais na taoibhshlabhraí iarmhair rannpháirteacha) níos lú ná 1Å agus na hachair a bhí sa ghearrthóg CPC níos lú ná 1Å, rud a thugann le tuiscint go raibh gearrthóg toimhdeach CPC i LhKNOT (Fíor 3B). Léirigh leictreastatach dromchla an LhKNOT múnlaithe freisin láithreacht an phóca ceangailteach cationic a raibhtear ag súil leis a chruthaigh an gearrthóg CPC [41,42] (Fíor 3C).

Chun measúnú a dhéanamh ar chumas gearrthóg CPC idirghníomhú le GAGanna eile, rinneadh anailís dhugála bhreise le LhKNOT agus sulfáit keratan (PDB ID: 1KES) agus le LhKNOT agus aigéad hyaluronic (PDB ID: 1HYA). Sa dá chás, tá an dromchla ceangailteach luchtaithe deimhneach a chruthaíonn an gearrthóg CPC ceangailte leis na móilíní a luchtaítear go diúltach. Dhearbhaigh ligplots ginte ag PDBSum nasc idir na GAGanna agus na hiarmhair a fhoirmíonn CPC (Figiúirí Forlíontacha S2 agus S3).

2.4. Homalóga Struchtúracha Eile LhKNOT Tá Móitíf Gearrthóg CPC ann freisin

Mhol láithreacht na gearrthóg CPC i LhKNOT agus a homalóg struchtúrach ó Pereskia bleo (pB1) go bhféadfaí caomhnú níos leithne a dhéanamh ar an gearrthóg CPC laistigh den teaghlach knottin. Léirigh anailís ar 21 gar-homalóg struchtúrach de LhKNOT le PDBanna a réitigh go turgnamhach i mbunachar sonraí KNOTTIN go bhfuil móitíf gearrthóg CPC ag na peptídí, i ngach cás. I gcás an chuid is mó de na peiptídí (m.sh., T. tridentatus), d'imigh na paraiméadair móitíf níos lú ná 1Å ón bhfillteán knottin lárnach, agus i gcás daoine eile (m.sh., na snaidhmí ionsaitheacha), bhí an diall suas go dtí corrlach 3Å (Tábla Forlíontach S5). Ar an gcaoi chéanna, léirigh próitéiní snaidhmithe múnlaithe de na homalóga aitheanta go raibh an gearrthóg CPC i seilbh beagnach gach ceann acu.

Múnlaíodh agus rinneadh anailís ar shé sheicheamh déag breise ó L. heteroatom, 22 seicheamh ó L. boulardi, agus 8 seicheamh ó Ganaspis spp., gan aon struchtúir 3D ar eolas, maidir le láithreacht mhóitíf ghearrthóg CPC. Cé gur nocht 13 de na 16 muirmhíle tuartha L. heteroatom agus 20 de 22 snaidhm tuartha L. boulardi móitíf gearrthóg CPC, bhí an gearrthóg CPC (Tábla Forlíontach S5) i ngach seicheamh Ganaspis. Is díol spéise go mbaineann na seacht n-homalóg nár léirigh móitíf gearrthóg CPC le (a) seicheamh coitianta ciaróg pailine (B. aeneus (CAH0563829.1), (b) seicheamh fungais R. necatrix (A0A1S8A723), agus (c) trí Knottins L. heterotoma 4,5,6 agus L. boulardi knottins 3 agus 20 (Tábla Forlíontach S5).

Léirigh suirbhé ar muirmhíle i mbunachar sonraí KNOTTIN, nach mbaineann le LhKNOT, ach ionadaíoch do tacsaithe éagsúla (seilide cón, portán crúibe, feithidí, planda, scairp agus damhán alla), móitíf gearrthóg CPC. I ngach cás, tá próifíl leictreastatach dromchla an mhóitíf gearrthóg CPC luchtaithe go dearfach, is dócha, chun idirghníomhaíochtaí a éascú leis an heparin a ghearrtar go diúltach (Fíor 4). Mar sin féin, cosúil leis na muirmhíle ciaróg, fungacha agus foichí a bhfuil cur síos orthu thuas, níor aithníodh an gearrthóg CPC i muirmhíle ón gciocláitíd agus na spúinsí plandaí (Tábla Forlíontach S5).

Fíor 4. Torthaí duga heparin agus leictreastatach dromchla (A) peptide antifungal de Phytolacca americana (PFAP-s; planda; PDB: 1DKC), (B) cainéal cailciam roghnach omega-agatoxin de Agelenopsis aperta (Omega-agatoxin IV-A damhán alla; PDB: 1IVA), (C) peptide antifungal de Acrocinus longimanus (Alo-3; ciaróg; PDB: 1Q3J), (D) peptide leighis fhoirceannadh de Pereskia bleo (pB1; cactus; PDB: 5XBD) , (E) LhKNOT, (F) peptide antifungal "Drosomycin" de Drosophila spp. (Drosomycin; eitilt; PDB: 1MYN), (G) Conotoxin GS (Conotoxin GS; seilidí cón; PDB: 1AG7), (H) peiptíd fhrithmhiocróbach Tachystatin A scoite ó phortáin capaill (Tachystatin A; portáin chrú; PDB: 1CIX) agus (I) Clórotoxin, tocsain beag scairp de Leiurus quinquestriatus (Clóratoxin; scairp; PDB:1CHL) a thaispeánann móitíf gearrthóg cationic CPC. Figiúirí atá dírithe ar an struchtúr gearrthóg CPC a thaispeáint is fearr. Tá na féidearthachtaí leictreastatacha dromchla grádaithe ó −4 kT/e (dearg) go móide 4 kT/e (gorm).

2.5. In Anailís Frithpháirteach Silico ar Ghearrthóg CPC LhKNOT Nochtann Gearrthóg CPC Tánaisteach

Rinneadh imscrúdú ar mhúnlaí de thriúr i mutants LhKNOT silico (R1A, S3A, R14A) chun comparáid a dhéanamh idir idirghníomhaíochtaí ceangailteacha de chineál fiáin agus próitéiní mutant. I gcás an mutant R14A, léiríodh go raibh baint iontas ag heparin le gearrthóg CPC tánaisteach a bhain leis na hiarmhair R1, S3, agus R30 in ionad an mhóitíf R1, S3, agus R14 sa chineál fiáin (Figiúr Forlíontach S4). Níor léirigh mutants dúbailte nó triple (R14A-R1A; R14A-S3A-R1A), áfach, idirghníomhú le haon cheann de na hiarmhair móitíf gearrthóg CPC bunscoile nó tánaisteach (Figiúr Forlíontach S4C, D).

Léirigh na mutants in silico leis an sóchán R1A (ag cur isteach ar mhóitífeanna gearrthóg CPC bunscoile agus tánaisteacha araon), áfach, go raibh baint ag heparin le R29 agus R30, mar go soláthraíonn siad an t-aon dromchla cationic atá fágtha (Fíor Forlíontach S4C, D). Suimiúil go leor, is fearr leis an ligand a chomhlachú le móitíf gearrthóg CPC, i gcás na gearrthóga bunscoile agus tánaisteacha, thar an dromchla cationic breise seo nuair a bhíonn an móitíf ar fáil, rud a thugann le tuiscint go bhféadfadh idirghníomhú sonrach an ghearrthóg CPC comhlachas níos cobhsaí a cheadú. idirghníomhú leictreastatach neamh-shonrach.

For more information:1950477648nn@gmail.com