Comhchuingeacha Antashubstaintí Spreagtha Imdhíonachta Faightear Gníomhachtú Láidir Myeloid agus Díolúine Bhuan Frith-meall (Cuid 1)

Chun tuilleadh eolais a fháil plz déan teagmháildavid.wan@wecistanche.com

Teibí

Is féidir le gabhdóirí aitheanta patrún dúchasach, lena n-áirítear gabhdóirí cosúil le dola (TLRanna), micrithimpeallacht an siadaí agus príomh-imdhíonacht frith-meall oiriúnaitheach a athrú.Mar sin féin, níor glacadh go maith le agónaithe TLR mar gheall ar thocsainí a bhaineann le gníomhachtú imdhíonachta forleathan tar éis riarachán sistéamach.Teiripeach a dhearadh atá oiriúnach do sheachadadh sistéamach agusin ann freagairt spriocdhírithe ar mheall a fháil, d'fhorbraíomar aicme nua comhchuingeacha antashubstainte imdhíon-spreagtha (ISACs) a chuimsigh agónaí TLR7/8 atá comhchuingeach le hantasubstaintí a dhíríonn ar siadaí.Glacadh go maith le ISACanna frith-HER2 a riartar go sistéamach in vivo agus fuarthas gníomhachtú láidir cealla myeloid intratumoral, rud a d’fhág go raibh imréiteach siadaí agus cuimhne imdhíoneolaíoch ina dhiaidh sin.Bhí gá le hacmhainneacht in vitro agus le héifeachtúlacht in vivo le gníomhaíocht in éineacht arna thiomáint ag feidhmiúlacht Fc slán agus agónas TLR chun fagaicíotóis agus imdhíonacht frith-meall T-idirmheánach a chumasú.Ní raibh cuimhne imdhíoneolaíoch trí mheán an ISAC teoranta do HER2, toisc go raibh lucha a ndearnadh cóireáil orthu ag ISAC cosanta ó ath-ghaelú le siad2-diúltach HER.Soláthraíonn na torthaí seo réasúnaíocht láidir maidir le forbairt chliniciúil ISACanna agus léiríonn siad go gcuireann sineirgíocht idir comharthaíocht Fc R agus TLR7/8 le meicníocht na himdhíonachta frith-mheall trí mheán ISAC.

Cliceáil anseo chun tuilleadh a fhoghlaim faoi Cistanche

Réamhrá

Roimh dheireadh an 20ú haois, bhí trí mhódúlacht cóireála ar fáil d'othair ailse: resection máinliachta, radaíocht, agus ceimiteiripe. Chuir teacht chun cinn imdhíonteiripe ailse ceathrú módúlacht chumhachtach leis a leathnaigh go mór an stór oinceolaíochta ag tosú le ceadú rituximab le haghaidh liomfóma neamh-Hodgkin agus ag leathnú chuig glacadh forleathan coscairí seicphointe 1,2. Mar sin féin, tá aon teiripe amháin, lena n-áirítear imdhíonteiripe, teoranta ó thaobh ama ach amháin má chruthaíonn sé freagraí bitheolaíocha agus imdhíoneolaíochta buan a sháraíonn ilchineálacht siadaí agus ualach sócháin 3-5. Cuireann coscairí seicphointe ar nós antasubstaintí frith-PD-1 agus PD-L1 feabhas mór ar thorthaí i roinnt tásca, lena n-áirítear in othair a bhfuil ualach sócháin ard siadaí nó éagobhsaíocht mhicrea-satailít orthu, agus cinntitheach amháin de sho-ghabhálacht siadaí i leith imdhíonteiripe seicphointe ná an méid réamh-imdhíonteiripe. -insíothlú cille T atá ann cheana féin. Níl othair le siadaí “fuar” a bhfuil infiltrate cille T tearc acu chomh freagrúil ar imshuí seicphointí agus tá prognóis níos boichte acu i gcomparáid le hothair le siadaí “te” ina bhfuil cealla T imdhíon-imdhíonacha meall i láthair laistigh den mhicrea-thimpeallacht siadaí (TME) 6,7 . Tugann bithóipse meall agus imdhíon-histochemistry le fios go mbíonn cealla gairmiúla a thíolacann antaiginí (APCanna) amhail cealla dendritic (DCanna) níos minice laistigh den TME ná cealla T, cé go bhfuil siad fós so-ghabhálach do mheicníochtaí imdhíonta 8,9. I bhfianaise láithreacht cealla myeloid sa TME agus a ról i gcur chun cinn gníomhachtú cille T, tá iarracht mhéadaitheach déanta chun teiripí a fhorbairt a ghníomhaíonn APCanna a bhaineann le siadaí chun imdhíonacht fhorleathan cille T agus freagairt imdhíonachta frith-meall éifeachtach a fháil.

Figure 1: ISAC Design and Characterization. (a) Chemical structure of T785 (b) HEK-Blue-TLR7 or TLR8 reporter cells were cultured for 18 hours in the presence of T785, R848, or Poly-ICLC before the assessment of NF-κB- induced SEAP activity. Data shown are from 8 experiments and EC50 values are calculated as mean with SEM. (c) Freshly isolated human myeloid APCs were stimulated with 1 μM of T785 or R848 for 18 hours before the assessment of myeloid activation by flow cytometry. Data are from 1 experiment with 3 donors and are representative of >9 deontóir. (d) Imoibríodh rituximab le SATA trí iarmhair lísín chun aimín saora a thiontú ina ngrúpaí cosanta sulfhidrile roimh dí-aicéitiliú le hiodrocsalaimín agus imoibriú ina dhiaidh sin le T785-MCC chun an rituximab-ISAC a tháirgeadh. (e) Anailís LC-MS ar an rituximab-ISAC tar éis cóireála PNGase F. Ríomhadh DAR bunaithe ar an mbreisiú mais nascóirí-agonist de 606 g/mol. (f) Goradh rituximab nó rituximab-ISAC lipéadaithe fluaraiseacha le cealla meall CD20 móide Toledo ag 4 céim ar feadh 2 uair roimh anailís trí chitoiméadracht sreafa. Tagann na sonraí ó thurgnamh amháin le samplaí faoi thrí agus is ionann iad agus 2 thurgnamh.(gh) Saothraíodh APCanna myeloid daonna úrscoite le rituximab, T785, rituximab, agus T785 nó an rituximab-ISAC i láthair cealla meall CD20 móide Toledo le lipéad CFSE ag éifeachtóir 3:1 go dtí cóimheas sprice. Léirítear an tiúchan rituximab ar an X-ais agus tá an tiúchan T785 sna measúnachtaí seo comhsheasmhach leis an méid T785

conjugated to the rituximab-ISAC. (g) Hoffman modulation contrast microscopy showed at 40X magnification after (g) 18 hours following stimulation with 80 nM of rituximab-ISAC. Data are representative of >10 donors. (h) Myeloid APCs were analyzed via flow cytometry 18 hours after stimulation. Data shown are from 3 donors and are representative of >10 ndeontóir (meán agus SEM); *P<0.05,><0.01,><0.001,><>

Tá sé dea-dhoiciméadaithe anois gur féidir le seachadadh áitiúil gníomhairí imdhíon-spreagthacha i múnlaí réamhchliniciúla APCanna cónaitheacha siadaí faoi chois a athchlárú isteach i gcealla gníomhachtaithe atá in ann antaiginí a bhaineann le siadaí a phróiseáil agus a chur i láthair, lena n-áirítear neoantigíní, chuig cealla T a dhéanann idirghabháil imdhíonacht frith-meall 10-13 ina dhiaidh sin. . Léirigh straitéis amháin dá leithéid a thosaigh Carmi et al go seachadtar intratumoral antasubstaintí allogeneic siadaí a dhíríonn ar agónaí gabhdóra dola (TLR)-3 nó le TNF agus CD40L APCanna a bhaineann le siadaí arna dtarrtháil go feidhmiúil as a dtiocfaidh méadú ar ghlacadh antaiginí agus ionduchtú díolúine cille T frith-meall ina dhiaidh sin. Mar thoradh ar an straitéis teaglaim seo, a ghiaráil feidhm éifeachtóra antashubstainte le hoibrí TLR, rinneadh siadaí príomhúla agus loit mheiteastáiteacha a dhíothú agus chosain an t-óstach ó atarlú siadaí 11,14. Ar an gcaoi chéanna, tá antasubstaint agonistic frith-OX40 i gcomhcheangal le agonist TLR9, CpG, APCs gníomhachtaithe agus cealla T laistigh den meall, rud a fhágann go bhfuil éifeachtúlacht shuntasach i gcoinne cineálacha meall iolracha i lucha 13. Tá aistriúchán éifeachtach straitéisí gníomhacha APC isteach sa chlinic á dhéanamh. imscrúdaíodh i táscairí iolracha le sonraí cliniciúla in othair a bhfuil meileanóma orthu a thugann le tuiscint go bhféadfadh crapadh siadaí agus freagairtí easbacha i loit neamh-insteallta a bheith mar thoradh ar sheachadadh inmhimeallach agónaithe TLR9 i gcomhar le hantasubstaintí frith-PD-1 15. Mar an gcéanna, go leor tá grúpaí ag leanúint agónaithe TLR7/8 le haghaidh imdhíonteiripe siadaí toisc go bhfuil patrún slonn TLR7/8 in APCanna daonna ag teacht níos dlúithe le patrún slonn TLR7 agus TLR9 i APCanna murine16-18. I ndeireadh na dála, beidh glacadh straitéisí seachadta laistigh den meall, má tá siad éifeachtach, teoranta ag inrochtaineacht siadaí toisc go bhfuil seachadadh sistéamach agónaithe imdhíonacha atá dírithe ar APCanna srianta ag tocsaineacht, leathréanna gearra, agus seachadadh fo-optamach chuig spriocláithreáin.Ba é an sprioc a bhí againn comhchuingeach antashubstainte imdhíon-spreagthach (ISAC) a dhearadh a chuimseodh antashubstaint mhonaclónach a dhírigh ar siadaí agus é comhchuingeach d’oibrí imdhíonachta mar chur chuige teiripeach nua chun imdhíonacht bhuan frith-meall a fháil. Spreag riarachán córasach an ISAC gníomhachtú logánta APC sa TME a bhí ag brath ar Fcfeidhm éifeachtóra agus gníomhachtú TLR agus iad ag dul timpeall ar thocsainí tipiciúla a bhaineann le seachadadh córasach agónaithe TLR. Ina theannta sin, d'fhág riarachán sistéamach na gcomhchuingeacha seo do lucha a raibh siadaí orthu próiseáil agus cur i láthair antaigin do chealla T, rud a d'fhág go raibh díolúine marthanach frith-meall i múnlaí iolracha atá frithsheasmhach don antashubstaint neamhchomhchuingeach dírithe ar siadaí.

Torthaí

Dearadh agus Tréithriú ISAC Chun comhchuingeach agónaí TLR le hantashubstaint a chumasú, úsáideadh uirlisí dugaireachta móilíneacha chun agónaí TLR7/8 (T785) nua a dhearadh le búitile-aimín a d'fheidhmigh mar phointe ceangail leis an antashubstaint a raibh rochtain ag tuaslagóir air ( Fíor 1A, Fíor Forlíontach 1A–C). D’fhostaigh T785 TLR7 daonna le EC50 de 0.643 μM agus TLR8 daonna le EC50 de 1.60 μM i línte cille HEK293 a chomhshloinneann NF-κB-inducible secreted phosphatase tuairisceoir agus ceachtar TLRFigure TLR7 nó T 1. ). Deimhníodh sainiúlacht T785 do TLR7/8 ag neamhábaltacht T785 gníomhaíocht NF-κB a spreagadh i gcealla tuairisceora HEK293 nach bhfuil léiriú TLR7/8 acu (Fíor Forlíontach 2A). Chun gníomhaíocht agonistic i gcealla príomhúla a dhearbhú, spreagtar monocytes agus DCanna úr-scoite, ar a dtugtar APCanna myeloid (~ monocytes 96 faoin gcéad, 4 faoin gcéad DC; Figiúr Forlíontach 3A), a léiríonn TLR7 agus TLR8 araon, thar oíche le 1 μM T785 nó R848, a agonist TLR7/8 dea-bhunaithe agus tréithrithe 19. Spreag T785 agus R848 APCanna myeloid go pointe comhchosúil (Fíor 1C) 20,21. Deimhníodh gníomhaíocht T785 freisin i DCanna plasmacytoid daonna úr-aonraithe (pDCanna), a léiríonn TLR7 ach ní TLR8 (Fíor Forlíontach 2B). Chun imscrúdú a dhéanamh ar éifeachtaí ISACanna ar chultúir in vitro daonna, gineadh ISAC le rituximab (Fíor 1D), antashubstaint mhonaclónach frith-CD20 atá bailíochtaithe go cliniciúil a úsáidtear chun urchóideacht cealla B a chóireáil, trí chomhchuingeach go T785 in imoibriú ilchéime. le trasnascairí heitreabifheidhmeacha comhoiriúnacha 22. Tomhaiseadh T785-éifeachtacht comhchuingeach ISAC ag LC-MS tar éis díghlicóisiú le PNGase F, agus mar thoradh air sin bhí meánchóimheas idir drugaí agus antasubstaint (DAR) de 1.71 (Fíor 1E). Dhearbhaíomar gur choinnigh an ISAC ceangal inchomparáide le CD20 tar éis turgnaimh cíteaiméadrachta sreafa leis an CD20- ag léiriú líne cille siadaí Toledo, líne cille dea-thréithe a dhíorthaítear ó othar le liomfóma mórchill idirleata (Fíor 1F) 23. T. 785-Rinne Biacore measúnú ar an gceangal ISAC leis na gabhdóirí Fc daonna (FCGR3A, FCGR2A, FCGR2B, FCGR1) agus bhí sé inchomparáide le rituximab (Tábla Forlíontach 1). Gníomhachtaíonn ISACanna APCanna mialóóideacha daonna Poitéinseal imdhíonta an rituximab T{{77} }}Déanadh measúnú ar ISAC tar éis comhshaothraithe a dhéanamh ar APCanna miailóideacha daonna úr-aonraithe le CD20 lipéadaithe CFSE móide cealla meall Toledo ar feadh 18 n-uaire. Chuaigh APCanna myeloid saothraithe le rituximab T{785-tháinig athruithe moirfeolaíocha tapa i gcomhréir le moirfeolaíocht DCanna i gcomhréir le moirfeolaíocht DCanna, ach ní raibh moirfeolaíocht DC ann. breathnaíodh i gcomhshaothraithe atá gortha le rituximab, T785 nó meascán equimolar de rituximab, agus T785 (Fíor 1G). D’fhan APCanna spreagtha le rituximab T785-ISAC inmharthana agus dendritic i moirfeolaíocht ar feadh suas le hocht lá ach bhí APCanna spreagtha leis an meascán neamh-inmharthana den chuid is mó faoin lá a hocht (Fíor 1H). Anailís chiteiméadrachta sreabhadh ildaitetar éis 18 n-uaire a thabhairt le fios gur spreag APCanna le rituximab T785-ISAC CD14 agus CD16 íosrialaithe agus CD123 uasrialaithe i gcomhthráth, marcóir dromchla cille a thaispeántar doa bheith uasrialaithe ar DCanna myeloid gníomhachtaithe 24. Os a choinne sin, APCanna spreagtha le rituximab,Níor mhodhnaigh T785 nó an meascán slonn na marcóirí seo (Fíor 1I, Fíor Fhorlíontach 4A, straitéis geata a bhfuil cur síos uirthi i bhFíoracha Forlíontacha 3BC).

Rinne APCanna daonna spreagtha le rituximab T785-ISAC móilín costimulatory CD86 a uasrialáil ar bhealach a bhí ag brath ar dháileog, agus breathnaíodh treochtaí comhchosúla le huasrialú CD40 agus HLA-DR i gcomhréir le feinitíopa APCanna gníomhachtaithe (Fíor 1I & Fíor Forlíontach 4B). Bhí athruithe dáileog-spleách ar léiriú marcóirí dromchla comhsheasmhach cibé acu a ndearnadh measúnú orthu mar dhéine fluaraiseachta airmheán (MFI, Fíor 1) nó mar an gcéad de dhaonra iomlán na gceall atá dearfach don marcóir faoi seach (Fíor Forlíontach 5). Léiríodh le hanailís a rinneadh ina dhiaidh sin ar shásghlantóirí gan chealla go ndearna rituximab T785-APCanna spreagtha ag ISAC méideanna níos airde de TNF agus IL-1 a scaoileadh (Fíor 2J agus Fíor Forlíontach 4C). Ní raibh acmhainn imdhíon-spreagthach T785-ISACs teoranta do rituximab, toisc gur spreag T785-ISAC a gineadh le trastuzumab gníomhachtú mialóóideach feabhsaithe (Fíor Forlíontach 4D). Rinneadh measúnú ar chumas APCanna spreagtha ag ISAC chun cur i láthair antaigin agus tras-priming cealla CD8 móide T a fháil trí úsáid a bhaint as an tsamhail ovabumin (OVA) córas antigen 25,26. Saothraíodh splenic CD11c móide DCanna atá scoite amach ó lucha fiáine thar oíche le coimpléisc imdhíonachta a foirmíodh le OVA agus ceachtar den antasubstaint frith-OVA nó ISAC. Rinneadh DCanna luchtaithe OVA a chainníochtú agus a ghoradh le OT-I CD8 móide cealla T a bhfuil sainiúlacht TCR acu don pheptíd OVA, SIINFEKL, arna choimpléasc le MHC-I. Traschur i láthair feabhsaithe frith-OVA ISAC-idirghabhála, arna thomhas ag an méid MHC-I, peptide SIINFEKL faoi cheangal, agus tras-priming feabhsaithe arna thomhas ag CD8 móide iomadú cille T (Figiúirí Forlíontacha 6A & 6B). agus comharthaíocht intracellular Fc R-ghaolmhar i APCanna myeloid daonna Iondaíonn Gníomhachtú Fc Rs agus TLRanna easghluaiseachta casta fosfa-chomharthaíochta, agus tá difríocht idir méid agus tréithe na bhfreagairtí seo i measc fo-thacair éagsúla cealla imdhíonachta 27. Rinneamar imscrúdú ar na cosáin chomharthaíochta intracellular iartheachtacha a bhíonn ag gabháil do éagsúla. cineálacha cille laistigh de chomhshaothraithe meall PBMC-spreagtha leis an rituximab T{785-ISAC i gcomparáid le rialtáin meascán cothromaíochta ag baint úsáide as mais-chíteiméadracht (CyTOF) 28. Aithníodh foghrúpaí leukocyte (.i. monocytes, cealla CD4 móide T) trí bhraisliú SPADE ag baint úsáide as marcóirí lineage le spriocchealla ag cuimsiú CD20 móide cealla meall Toledo agus cealla B sláintiúil 29. Teagmhais fosfarlaithe a bhaineann le comharthaíocht TLR (pIRF7) agus Fc R (pERK1/2). méadaíodh 15 nóiméad tar éis an spreagtha leis an T785-ISAC i monaicítí agus CDCanna, i gcomparáid leis an meascán comhpháirteanna aonair 30,31. Bhí comharthaíocht intracellular teoranta den chuid is mó do chealla de bhunús myeloid (monocytes agus cDCanna) chomh maith le pDCanna, acuireann siad go léir na Fc Rs agus TLR7 agus/nó TLR8 in iúl. I monaicítí agus cDCanna, ba é an toradh a bhí ar an spreagadh a spreag an ISAC ná fosfarú i bhfad níos airde de MAPKAPK2, p38, CREB, agus próitéin ribosómach S6 (RPS6), ceanglas chun sintéis próitéin iartheachtacha a thionscnamh (Fíor 2A–C & Fíor Forlíontach 7A). Thaispeáin CD141 móide cDCanna agus CD1c móide cDCanna leibhéil inchomparáide pIRF7 thar an dá fho-thacair CDC, agus bhí treocht níos airde ag leibhéil RPS6 agus pERK1/2 i CD141 móide cDCanna, atá ar fheabhas ar phríomhú cille CD8 móide T agus tras-léiriú antaigin, i gcomparáid le CD1c. móide CDCanna (Fíor Forlíontach 7B).

Bhí cinéitic spreagadh T{{0}ISAC comhsheasmhach le dinimic chomharthaíochta ionchais: tháinig buaicphointe fosfarylation ERK1/2 tar éis 5 nóiméad, agus níor shroich a chomhpháirtí iartheachtacha RPS6 buaicfhosfarylation go dtí an 15-pointe ama nóiméad (Forlíontach Fíor 7C). Tacaíonn an cinéitic seo le dinimic a bhfuiltear ag súil leis de réir mar a mhéadaíonn comharthaíocht le himeacht ama, agus molann sé go bhfuil freagra comharthaíochta marthanach agus méadaithe ann do spreagadh ISAC ar APCanna. Ag cur san áireamh an fhreagairt mhéadaithe a breathnaíodh tar éis spreagadh ISAC a bhaineann le cosáin chomharthaíochta Fc R agus TLR, d’úsáideamar an chéad uair eile an Meastachán Athshampláilte Coinníollach Dlús ar Fhaisnéis Fhrithpháirteach (DREMI) agus na halgartaim Amharcléiriú Athscála Coinníollach-Dlúis (DREVI) chun neart na gcaidrimh péireáilte laistigh a chainníochtú. na cosáin chomharthaíochta Fc R agus TLR 32. Gineann na halgartaim seo ceapacha DREVI le haghaidh léirshamhlú, áit a bhfuil an limistéar faoin gcuar (AUC) ina tháscaire ar dhéine comhartha foriomlán, is tomhas ar an tairseach gníomhachtaithe é an pointe infhillte (IP), agus an Déanann scór DREMI spleáchas an dá phosphoproteiní atá i gceist a chainníochtú. D’aithin an anailís seo scóir DREMI méadaithe a léirigh spleáchas feabhsaithe péirewise idir próitéiní a bhaineann le cosáin chomharthaíochta Fc R agus TLR tar éis spreagadh T785-ISAC i gcomparáid leis na rialuithe meascáin chothrománacha (Fíor 2D). Breathnaíodh idirspleáchas láidir idir pERK1/2 agus pIRF7 go uathúil tar éis spreagadh le T785-ISAC, ach ní meascán, mar a léirítear le scór DREMI méadaithe, déine comhartha méadaithe, agus tairseach gníomhachtaithe laghdaithe a theastaíonn le haghaidh fosfarylation IRF7 (Fíor 2D ). Léirigh an anailís seo freisin tairseach gníomhachtaithe laghdaithe a theastaíonn chun aistriú próitéine (RPS6 fosfarylation) a thionscnamh tar éis spreagadh ISAC arna chainníochtú ag scóir DREMI méadaithe agus IPanna laghdaithe do na teaglamaí péirewise de pERK1/{2-pRPS6 agus pIRF{7-pRPS6 . Ina theannta sin, méadaíodh an leibhéal fosfarylation RPS6 mar thoradh ar fosfarylation ERK1/2 nó IRF7 arna chinneadh ag AUCs pairwise méadaithe (Fíor 2D). Ní hamháin go ndeimhníonn na comhthorthaí seo comharthaíocht an ISAC trí na conairí Fc R agus TLR a bhfuiltear ag súil leo ach ina theannta sin, tacaíonn siad le sineirgíocht idir an dá chonair as a dtiocfaidh tairseacha laghdaithe gníomhachtaithe agus déine comhartha méadaithe.

Fíor 3: Éilíonn ISACs feidhm éifeachtóra Fc agus agonist TLR chun gníomhachtú myeloid a idirghabháil. Saothraíodh APCanna miailóideacha daonna úrscothacha ar feadh 18 uair an chloig i láthair CD20 móide cealla meall Toledo ag éifeachtóir 3:1 go dtí cóimheas sprice agus (a) 80 nM den rituximab-ISAC a bhfuil 1 μM R406 acu nó nach bhfuil, (b) rituximab-ISACs ar an isitíopa antashubstainte léirithe, (c) rituximab-ISAC nó rituximab-ISAC díghliccosilated (ISAC-deglycosylated). (ac) Rinneadh anailís ar chealla de réir cíteiméadracht sreafa agus tuairiscítear sonraí mar dhéine fluaraiseachta airmheánaigh. (d) Saothraíodh cealla tuairisceora HEK-Blue-TLR7 nó TLR8 ar feadh 18 n-uaire an chloig i láthair T785 nó TLRnull roimh mheasúnú ar ghníomhaíocht SEAP NF-κB-spreagtha. Is iad na sonraí a thaispeántaró thurgnamh amháin agus ionadaíoch ar 3 thurgnamh ar a laghad. (e) Saothraíodh APCanna miailóideacha daonna úrscoite ar feadh 18 n-uaire an chloig i láthair cealla meall CD20 móide Toledo agus na rituximab-ISACanna léirithe agus rinneadh anailís orthu de réir cíteiméadracht sreafa (sonraí arna dtaispeáint mar airmheán).déine fluaraiseachta). (ae) Tá na sonraí a thaispeántar ionadaíoch do 1-4 thurgnaimh bhreise agus Níos mó ná nó cothrom le 3 deontóir do gach turgnamh (meán agus SEM). Sainmhínítear tábhacht staitistiúil mar *P<0.05,><0.01,><0.001,><>

Éilíonn ISACanna feidhm éifeachtóra Fc chun gníomhachtú APCanna myeloid a idirghabháil Rinneadh imscrúdú ar an méid a chuireann gníomhaíocht Fc le feidhm ISAC tar éis comharthaíocht Fc R iartheachtach a bhaint le R406, inhibitor kinase móilín beag Syk a chuireann cosc ​​​​ar aistriú comhartha le sruth ó ghníomhachtú Fc Rs 33,34 . Cuireadh leis an R406 gníomhachtú mialóideach T785-ISAC-mediated mar is léir ón easpa upregulation CD móilín comhstimulatory86 ach níor athraigh an fhreagairt cheallacha ar TLR7/8 gníomhachtú ag T785 (Fíor 3A & Fíor 8 Forlíontach). Breathnaíodh cosc ​​​​syk le R406 comharthaíocht aisghairthe freisin i monocytes tar éis spreagadh T{33ISAC, leleibhéil laghdaithe go suntasach de MAPKAPK-2 fosfarilaithe, ERK1/2, agus IRF7 tomhaiste (Fíor Forlíontach 7D).Ag cur na sonraí seo san áireamh, foirmíodh rituximab T785-ISACanna le DARanna inchomparáide ar gach ceann de na ceithre isitíopa a tharlaíonn go nádúrtha chun a mhéid a athraíonn gníomhaíocht T785-ISAC a shainiú le cleamhnais cheangailteach Fc R aitheanta 35,36. Rinneadh imscrúdú freisin ar ISACanna rituximab aglycosylated agus fucosylated, toisc go n-ablaíonn glycosylation ceangailteach Fc R agus go méadaíonn fucosylation an cleamhnas ceangailteach do FCGR3A 37. Cumas imdhíon-spreagthach an rituximab T785-ISAC a chomhghaolú le cleamhnas Fc R an isitíopa antashubstainte (Figure). 3B). Os a choinne sin, spreag an cineál fiáin IgG1 (IgG1-AF), an cineál fiáin IgG1, agus IgG3 T785-ISACs gníomhachtú mialóideach, agus an IgG1-AF T785-Is é an IgG1-AF T785-Is é an toradh is airde. leibhéil uasrialála CD86 (Fíor 3B). Deglycosylation an wildtype rituximab T785-ISAC le PNGase F, a laghdaíonn an cleamhnas ceangailteach Fc-Fc R mar thoradh ar ghníomhaíocht spreagtha imdhíonachta ISAC laghdaithe in vitro, ag tacú leis an tábhacht a bhaineann le réigiún Fc atá gníomhach ó thaobh feidhme (Fíor 3C).

Éilíonn ISACanna ar agónas TLR idirghabháil a dhéanamh ar ghníomhachtú mialóideach Rinneadh imscrúdú ar an méid a chuir gníomhaíocht TLR le feidhm ISAC tar éis ablation an agónais TLR tríd an 2-aimín pyridine a bhaint de T785 a chreidtear a chruthaíonn droichead salainn le hiarmhair asppartate ríthábhachtach sa cheangal. pócaí TLR7 agus TLR8 38 (TLRnull, Fíor 3D). Rinneadh an cumaisc TLRnull a chomhchuingeach le rituximab (TLRnull ISAC) agus rinneadh measúnú air le haghaidh acmhainneacht gníomhachtaithe myeloid i láthair CD20 móide cealla meall in vitro. Níor spreag an ISAC TLRnull uasrialáil an mhóilín comhspreagthach CD86 ná níor mhodhnaigh sé slonn CD14 nó CD123, rud a thugann le fios go bhfuil gá le haigneachas TLR don fheinitíopa gníomhachtaithe a breathnaíodh le T785-ISACs (Fíor 3E). Ina theannta sin, níor spreag ISAC TLRnull fosfarú IRF-7 i monaicítí, comhsheasmhach lena neamhábaltacht TLR7/8 (Fíor Forlíontach 7E). Gníomhaíocht cille B, T, nó NK i múnlaí siadaí xenograft daonna Rinneadh measúnú ar chumas ISACanna scriosadh myeloid- agus neodrófail-mheánaithe siadaí soladacha in éagmais ghníomhaíocht chealla B, T, agus NK ag baint úsáide as samhlacha xenograft daonna 39,40. Roghnaíodh Trastuzumab, atá bailíochtaithe go cliniciúil HER2-atá dírithe ar antashubstaint, don imscrúdú chun a chinneadh an bhféadfadh an trastuzumab T785-ISAC friotaíocht siadaí in aghaidh trastuzumab a shárú in HER2 móide samhlacha siadaí soladacha (Fíor 4 agus Fíor Forlíontach 9). ) 41,42. Ar an gcéad dul síos, rinneadh riarachán sistéamach ar trastuzumab T785-ISAC a chur i gcomparáid le seachadadh laistigh den meall de mheascán de trastuzumab agus T785. Spreag an trastuzumab T785-ISAC aischéimniú agus imréiteach siadaí, ach chuir seachadadh meascán comhionann de chomhpháirteanna an buntáiste teiripeach íosta i gcomparáid le trastuzumab amháin (Fíor 4A). Deimhníodh i staidéir a rinneadh ina dhiaidh sin a rinne comparáid idir ISACanna atá dírithe ar siadaí agus a rialuithe isitíopa cuí go raibh gá le spriocdhíriú siadaí le gníomhaíocht frith-meall (Fíor 4B agus Fíor Forlíontach 10). Rud atá tábhachtach ná gur glacadh go maith le riarachán sistéamach an ISAC trastuzumab T785- agus a rialú isitíopa, le tionchar íosta ar mheáchan coirp (Fíor Forlíontach 11).Chun a chinneadh an bhfuil an mheicníocht gníomhaíochta a chuireann le héifeachtúlacht ISAC in vivo cosúil leis an gceann a thuairiscítear in vitro, rinneadh tástáil ar Fc-incompetent (trastuzumab N297A-ISAC) agus trastuzumab TLRnull-ISACs sa tsamhail xenograft meall cíche céanna icomhthreomhar le cineál fiáin trastuzumab T785-ISAC.Cé gur tháinig aischéimniú agus imréiteach siadaí mar gheall ar an trastuzumab T{0}}ISAC, níor éirigh leis na ISACanna Fc-incompetent agus TLRnull araon gníomhaíocht frith-meall a fháil (Fíor 4C).Léiríonn na sonraí seo le chéile go bhfuil gá le spriocdhíriú siadaí agus rannpháirtíocht Fc R agus TLR le haghaidh gníomhaíochta frith-meall ISAC.

Rinneadh measúnú ar rannchuidiú difreálach neodrófilí i gcoinne cealla myeloid eile chun éifeachtaí frith-meall a idirghabháil trí ídiú cille-shonrach.Ídíodh neodrófilí ag baint úsáide as antashubstaint Ly6G, agus ídiú neodrófail agus APCanna neamhaibí (monocytes) araon.Baineadh amach le hantasubstaint frith-Gr1.Ídíodh cealla phagocytic ag baint úsáide as liposóim luchtaithe clodronate.Fuaireamar amach gur chuir cealla phagocytic, macrophages is dócha, go mór le hidirghabháil a dhéanamh ar ghníomhaíocht frith-meall tar éis cóireáil ISAC (Fíor 4D).Mar sin féin, ní raibh aon tionchar ag ídiú neodrófail le frith-Ly6G ar éifeachtúlacht ISAC.Ní raibh tionchar láithreach ag ídiú Gr1 ar éifeachtúlacht idirghabhála ISAC ach laghdaigh sé fad rialaithe siadaí (Fíor 4D).Chun iniúchadh a dhéanamh ar chumas T785-ISACs fás siadaí a rialú i múnlaí le hísleLonn HER2, an chéad uair eile rinneamar éifeachtúlacht a mhúnlú sa mhúnla siadaí meánléiritheach trastuzumab-resistant, HER2-, JIMT-1.Meastar go bhfuil thart ar 6.5 x105 cóip de dhromchla HER2 ag an líne chill ailse JIMT-1 agus cuireann sí leibhéal laghdaithe in iúlHER2 i gcomparáid le líne cille meall HCC1954 de réir cítoiméadracht sreafa 43.Cé go bhfuil antrastuzumab T785-Chuir ISAC moill shuntasach ar fhás siadaí i gcomparáid leis an isitíopa ISAC nó rialuithe trastuzumab, níor breathnaíodh aon aischéimniú nó imréiteach siadaí (Fíor 4E).Rinneamar hipitéisiú go méadódh pertuzumab, a cheanglaíonn eiseapóp HER2 éagsúil ó shuíomh ceangailteach trastuzumab, an Fc-chnuasach, agus ina dhiaidh sin chuirfeadh sé le ADCP agus éifeachtúlacht an ISAC sa tsamhail JIMT-1.Mar thoradh ar chomhcheangal an trastuzumab T785-ISAC le pertuzumab tháinig feabhas suntasach ar éifeachtúlacht agus cúlú suntasach siadaí (Fíor 4F).Gan spreagadh imdhíonachta an trastuzumab T785-ISAC, níor bhain an meascán de pertuzumab le trastuzumab tairbhe ar bith as.

An chéad uair eile rinneamar imscrúdú ar na teagmhais mhóilíneacha agus cheallacha a spreagann trastuzumab T785-ISAC as a dtagann éifeachtúlacht frith-meall ar deireadh.Athruithe léiriú géine go luath i siadaía thomhas leis an bpainéal próifílithe imdhíonachta pan-ailse luch NanoString, ag nochtadh upregulation suntasach de 13.7 faoin gcéad de na géinte laistigh de 24 uair an chloig de chóireáil lena n-áirítear géinte a bhaineann le TLR7 comharthaíocht agus gníomhachtaithe (IRF{5}}, géinte a bhaineann NF-kB)i gcomparáid le 0-0.1 faoin gcéad tar éis cóireáil trastuzumab nó isitíopa T785-ISAC (Fíor 4G) 44.Nocht anailís ar bhealaí slonn géine arna measúnú ag nSolver Advanced Analysis Pathway Scór uasrialála suntasach ar phríomhshínithe géine a bhaineann le himdhíon (Feidhmeanna Macrophage, Feidhmeanna DC, Próiseáil & Cur i Láthair Antaigin) a bhíag teacht leis na torthaí in vitro agus in vivo go bhfuil idirghníomhaíochtaí Fc-Fc R ríthábhachtach do ghníomhaíocht idirghabháil ISAC (Fíor 4H agus Fíor Forlíontach 12).Ardaíodh na scóir sínithe géine a bhaineann le ceimicíní agus cítocíní tar éis cóireáil trastuzumab T785-ISAC, ag teacht le cainníochtú próitéine a rinneadh cítocín agus secretion ceimicín a thomhas laistigh den siad 24 uair tar éis an riaracháin (Fíor 4H).agus Fíor 13 Forlíontach).Léiríonn na torthaí seo, ar aon dul leis na sonraí éifeachtúlachta in vitro agus in vivo, go bhfuil freagairt láidir TLR- agus Fc R-idirghabhála spreagtha ag an ISAC.

Baineadh úsáid as cíteiméadracht sreafa agus IHC le measúnú a dhéanamh ar cé acu arbh é an toradh a bhí ar ghníomhachtú méadaithe T785-ISAC-idirghabhála agus léiriú ceimicín ná earcú cealla imdhíontóra.Próifílíodh infiltrates imdhíonachta myeloid trí chiteiméadracht sreafa 24 uair agus 7 lá tar éis dáileog amháin de trastuzumab T785-ISAC nó trastuzumab a riaradh agus i gcomparáid le rialuithe neamhchóireáilte.Nochtadh anailís ar thumaí 24 uair tar éis cóireálainsíothlú CD11b móide Ly6C móide monocytes agus CD11b móide Ly6G móide granulocytes sna siadaí atá cóireáilte le trastuzumab nó trastuzumab T785-ISAC i gcomparáid leis na rialuithe neamhchóireáilte (Fíor 4I).Seacht lá tar éis na cóireála, méadaíodh CD11b móide CD11c móide F4/80 móide APCanna miailóideacha dearfacha go suntasach sa ghrúpa cóireáilte trastuzumab T785-ISAC i gcomparáid letrastuzumab nó rialuithe neamhchóireáilte (Fíor 4I) 45,46.D’fhéadfadh go mbeadh an méadú seo ar APCanna myeloidcurtha i leith an mhéadaithe shuntasaigh i dtáirgeadh chemokines a bhaineann le myeloid tar éis cóireáil trastuzumab T785-ISAC.Cé nach raibh méadú suntasach ar mhinicíocht APCanna myeloid ag an bpointe ama 24-uair an chloig, cuireadh cealla den fheinitíopa seo i ngníomh tar éis cóireáil trastuzumab T785-ISAC, arna thomhas ag upregulation CD40 ar dhromchla na cille , i gcomparáid leis an daonra céanna ó trastuzumab nó rialuithe neamhchóireáilte (Fíor 4I).Léiríonn an toradh seo, mar aon leis na sonraí NanoString, cumas trastuzumab T785-ISAC chun gabháil agus gníomhachtú cealla myeloid i micri-thimpeallacht an siadaí.I bhfianaise dearfacht CD11b na n-APCanna myeloid a breathnaíodh seachtain amháin tar éis cóireála, d'fhéadfadh go mbeadh insíothlú luath monocytes mar réamhtheachtaithe don daonra APCanna myeloid a aibíonn i siadaí cóireáilte ISAC ach nach bhfuil i siadaí cóireáilte le trastuzumab.Mar sin féin, tá sé fós le cinneadh conas a d'imir na teagmhais pro-athlastacha proximala 24 uair an chloig tar éis spreagadh ISAC ag NanoString agus MSD tionchar ar deireadh thiar ar imeachtaí distal mar aibiú cealla myeloid i micri-thimpeallacht siadaí ag athrú ag an bpointe ama níos déanaí 6-. , agus ar deireadh thiar, bhí tionchar aige ar aischéimniú agus ar imréiteach siadaí.
Ar deireadh, rinneadh IHC chun láithreacht agus suíomh príomhdhaonraí cealla imdhíonachta sa siad a mheas tar éis cóireála leis an trastuzumab T785-ISAC i gcomparáid lena rialuithe.Ag teacht leis an lá 7 cíteiméadracht sreabhadh, F4/80 in iúl cealla iardaíodh an réigiún meall agus peritumoral ar an lá 9 tar éis cóireála amháin le trastuzumab T785-ISAC (Fíor 4J).Ina theannta sin, mar thoradh ar chóireáil spriocdhírithe ISAC tháinig méadú suntasach ar CD11c móide cealla sa réigiún peritumoral nach raibh le feiceáil tar éis cóireála antasubstainte rHER2 nó cóireáil le isitíopa nó isitíopa-ISAC (Fíor 4J).Bhí an t-ingearchló i gcillíní CD11c móide ag cítoiméadracht sreafa agus IHC le feiceáil freisin i sonraí NanoString, inar ardaíodh léiriú mRNA de ITGAX go suntasach ar laethanta 6 agus 9 i ndiaidh riarachán trastuzumab T785-ISAC (Fíor Forlíontach 14).

Fíor 5: T785-Faigheann ISACanna éifeachtaí láidre frith-meall i múnla siadaí singeneic MMC. (ah) Ionchlannaíodh lucha FVB/N-TgN (MMTV-Erbb2) le líne ceall meall MMC. (a) Rinneadh lucha baineanna a randamacht nuair a shroich toirt an siadaí thart ar 500 mm3. Cóireáladh lucha ansin trí instealladh ion-peritoneal le 5 mg/kg q5d x 2 d’antasubstaint HER2 frith-rata luiche, luch frith-rata HER2 T785-ISAC, nó isitíopa T785-ISAC (TA99) (n =4-7 lucha in aghaidh na láimhe). (b, c) Rinneadh lucha fireann a randamach nuair a shroich an toirt meall thart ar 500 mm3 agus rinneadh réamhchóireáil orthu ag tosú lá amháin roimh an dáta cóireála tosaigh le liposomes clodronate-luchtaithe nó rialaithe le haghaidh ídiú phagocyte (6 thimthriall, trí Lá 15) nó frith. -CD8 depleting antibody (rIgG2b control) for CD8 T cell depletion (8 cycles, through Day 21). Animals were treated with 5 mg/kg rHER2 T785-ISAC q5d x 2 (n=6 mice per group) intraperitoneally. For phagocyte depletion, statistics reflect a comparison of T785-ISAC treatment with clodronate or control liposomes, while for CD8 T cell depletion, statistics reflect a comparison of T785-ISAC with T785-ISAC + CD8 Depletion or T785-ISAC + rat isotype IgG2b. (d) Anti-rHER2 T785-ISAC treated mice that experienced complete tumor regression for >Dúshlán 60 lá tar éis a gcóireála deiridh le líne cille meall MMC. Bhí lucha naive meall mar rialuithe ionchlannú (n=5 lucha in aghaidh an ghrúpa). (ad) Tá na sonraí ionadaíoch do 2 thurgnamh ar a laghad. Bhí lucha eotanized go daonnachtúil nuair siadaíshroich 2,000 mm3. Taispeántar sonraí maidir leis na grúpaí sin nár shroich aon siadaí2,000 mm3. (ei) Rinneadh randamach ar chohóirt lucha nuair a shroich toirteanna siadaí tumaí MMC thart ar 50 0 mm3 agus cóireáilte le 5 mg/kg ISAC nó antasubstaintí rialaithe dáileog ag lá 0 agus lá 5. Próiseáladh siadaí le haghaidh tomhais cítocín ag MSD , anailís cíteaiméadrachta sreafa, cainníochtú mRNA NanoString, nó formailin-seasta agus paraifín-leabaithe doimmunohistochemistry ag na hamanna a thaispeántar. (e) Léiríonn ceapacha bolcáin athrú log2 huaire ar shloinneadh géine i siadaí rialaithe isitíopa cóireáilte vs siadaí arna dtomhas ag NanoString ag 24 uair (n=5 lucha in aghaidh an ghrúpa). Taispeántar athruithe le p-luach coigeartaithe < 0.05="" i="" dearg.="" (f)="" scóir="" sínithe="" géine="" cainníochtaithe="" ag="" nsolver="" scór="" conair="" anailíse="" casta="" le="" haghaidh="" siadaí="" arna="" anailísiú="" 24="" uair="" tar="" éis="" cóireála="" (n="5" lucha="" in="" aghaidh="" an="" ghrúpa).="" (g,="" h)="" anailís="" cíteaiméadrachta="" sreafa="" ar="" chomhdhéanamh="" ceallacha="" siadaí="" agus="" staid="" gníomhachtaithe="" 24="" uair="" agus="" 6="" lá="" tar="" éis="" tús="" a="" chur="" le="" cóireáil="" (n="4" lucha="" in="" aghaidh="" an="" ghrúpa).="" tá="" na="" sonraí="" ionadaíoch="" ar="" 2="" thurgnamh="" ar="" a="" laghad.="">Íomhánna ionadaíocha chomh maith le cainníochtú F4/80, CD11c, agus CD8 IHC de thumaí a bhaintear 6 lá tar éis gach cóireála sonraithe. Tá barraí scála 50 μm. (ai) Tuairiscítear sonraí mar mheán agus SEM; *P<0.05,><0.01,><0.001,><>

Faigheann T785-ISACs spriocdhírithe meall aischéimniú siadaí sa tsamhail siadaí MMC singenéiseach
Chun measúnú a dhéanamh ar chumas ISACanna éifeachtúlacht frith-meall a idirghabháil i láthair cealla B, T, agus NK, d'úsáideamar líne cille francach singeneic HER2 (rHER2) - ag cur in iúl carcinoma mamaire luiche (MMC) a díorthaíodh ó mhamar spontáineach. carcanóma i rHER2- ag léiriú lucha FVB.Chun imdhíon-ghineacht trasspeicis a bhaineann le slonn rHER2 i MMC a íoslaghdú, lucha trasgenacha a chuireann francach Her2 in iúl go hinchineálach faoi rialúden tionscnóir MMTV mar an t-óstach (Figiúr Forlíontach 15) 47. Ag giaráil láithreacht chóras imdhíonachta iomlán slán, bhí sé mar aidhm againn measúnú a dhéanamh ar chumas an ISAC chun siadaí a chomhrac le ualach mór siadaí de 500 mm3, mar go bhfuil siadaí níos mó i gcoitinne. níos deacra a chóireáil i múnlaí réamhchliniciúla 48. Glacadh go maith le riarachán sistéamach na gcóireálacha go léir, lena n-áirítear an rHER2 T785-ISAC, le tionchar íosta ar mheáchan coirp (Fíor Forlíontach 16A). Ní raibh ach an rHER2 T785-ISAC, áfach, in ann lucha a raibh siadaí móra seanbhunaithe orthu a leigheas (Fíor 5A). Mar a chonacthas sa tsamhail xenograft, léirigh staidéir ar ídiú cille gur cailleadh gníomhaíocht shuntasach frith-meall nuair a ídíodh cealla phagocytic le liposóim luchtaithe clodronate (Fíor 5B). Cé nach bhfuiltear ag súil go ngníomhóidh an ISAC go díreach ar chealla T, chaill lucha a ndearnadh réamhchóireáil orthu le CD8-antasubstaint ídithe an cumas siadaí a ghlanadh tar éis dhá riarachán de rHER2 T785-ISAC (Fíor 5C). Tugann sé seo le tuiscint gur féidir le ISACanna siadaí-dírithe gníomhú go hindíreach trí chealla T, tar éis antaiginí a bhaineann le siadaí a chur i láthair. Ag teacht le láithreacht cuimhne imdhíoneolaíoch, luchaleigheasadh siadaí MMC tar éis cóireáil rHER2 T785-Cosnaíodh iad in aghaidh athdhúshlánaigh siadaí (Fíor 5D).

Chun an mheicníocht atá mar bhunús le héifeachtúlacht ISAC sa tsamhail shingenéiseach a fhiosrú tuilleadh, rinneamar imscrúdú ar na hathruithe ceallacha, tras-aistrithe agus cítocine i micri-thimpeallacht an siadaí tar éis dáileog ISAC. Cuireadh cóireáil ar dhá chohórt lucha a raibh siadaí móra MMC orthu le rHER2 T785-ISAC nó rialtáin. Baineadh siadaí ón gcéad chohórt 24 uair an chloig tar éis dosing (Lá 1) nuair a bhí na siadaí go léir den mhéid céanna (Figiúr Forlíontach 16B). Tugadh an dara dáileog don chohórt eile 5 lá tar éis na chéad dáileoige, agus ansin baineadh é 24 uair níos déanaí (Lá 6), agus ag an bpointe sin d'fhás siadaí sna grúpaí cóireála go léir go intomhaiste ach amháin iad siúd ar cuireadh cóireáil orthu le T785-ISAC (Figiúr Forlíontach 16B). ). Rinne IHC, léiriú mRNA, agus secretion cytokine i lysates próitéine anailís ar siadaí. Ag tacú tuilleadh lenár dtuairimí sna samhlacha xenograft go bhfuil gá le díriú siadaí le haghaidh gníomhaíochta ISAC, léirigh anailís mRNA ar siadaí 24 uair tar éis cóireáil rHER2 T785-ISAC upregulation suntasach de 34.1 faoin gcéad de na géinte sa luch NanoString uile-ailse imdhíonachta. painéal próifílithe i gcomparáid le siadaí cóireáilte isitíopa. Ní raibh ach tionchar beag ag an antashubstaint frith-rHER2 amháin ar léiriú géine (3.5 faoin gcéad de na géinte a ndearnadh anailís orthu) ach níor chuir an t-isitíopa neamh-spriocdhírithe T785-ISAC isteach ar léiriú géine (Fíor 5E). Mar atá le feiceáil i múnla xenograft HCC1954, rinneadh géinte a bhaineann le comharthaíocht agus gníomhachtú trí mheán TLR a uasrialáil go suntasach ag an rHER2 T785-ISAC dírithe ar siadaí, rud a léiríonn freagairt láidir TLR-idirghabhála (Fíor 5E). Nocht anailís conair slonn géine arís uasrialú suntasach ar phríomhshínithe géine a bhaineann le himdhíonacht, lena n-áirítear sínithe le haghaidh anailíse conair slonn géine, nochtadh suntasach ar phríomhshínithe géine a bhaineann le himdhíon tar éis cóireáil rHER2 T785-ISAC, lena n-áirítear iad siúd a bhaineann le ceimicíní. agus cítocíní (Fíor 5F). Rinneadh cainníochtú próitéine ar na siadaí céanna a ndearna NanoString anailís orthu, agus ag teacht le torthaí sínithe géine, tomhaiseadh leibhéil shuntasacha cítocíní pro-athlastacha agus ceimicíní ag 24 uair tar éis cóireáil rHER2 T785-ISAC (Fíor Forlíontach 17). ). Ardaíodh scóir sínithe géine go suntasach freisin do Phróiseáil & Léiriú Antaiginí, Feidhm Cille Dendritic, agus Feidhm Macrophage, ag tacú tuilleadh le freagairt idirghabhálaithe anFc-Fc R agus faoi thiomáint ag fagaicíotóis 24 uair tar éis rHER2 T785-ISACcóireáil (Fíor 5F agus Fíor Forlíontach 18). Chomh maith le scóir sínithe géine ardaithe go suntasach atá cleamhnaithe le freagairt láidir TLR- agus Fc R-idirghabhála, méadaíodh go suntasach an scór sínithe géine le haghaidh Feidhmeanna cealla T laistigh de 24 uair an chloig ó chóireáil rHER2 T785-ISAC, ag tacú tuilleadh leis an fáil amach go bhfuil cealla T ag teastáil le haghaidh éifeachtúlachta idirghabhála ISAC (Fíor 5F agus Fíor Forlíontach 18).

Chun na cealla imdhíonachta a d’fhéadfadh cur leis an méadú luath ar tháirgeadh cítocine pro-inflammatory agus chemokine a thréithriú, rinneadh anailís ar shreabhadh cítocine 24 uair an chloig tar éis an chéad dáileog de rHER2 T785-ISAC nó na rialuithe a dhéanamh, agus 6 lá tar éis tionscanta an chitocine. cóireáil, 24 uair an chloig tar éis an dara dáileog. Nocht anailís ar siadaí ar Lá 1 go raibh insíothlú CD11b móide Ly6C móide monaicítí sna siadaí ar cuireadh cóireáil orthu le rHER2 T785-ISAC, agus CD11b móide Ly6G móide granulocytes sna siadaí ar cuireadh cóireáil orthu le rHER2 mAb nó rHER2 T785-ISAC , ach ní na rialuithe isitíopa ISAC nó antashubstaintí isitíopa (Fíor 5G). Méadaíodh leibhéil monocytes arís i siadaí rHER2 T{785-ISAC tar éis 6 lá. Cosúil leis an méid a thugamar faoi deara i múnla xenograft HCC1954, ardaíodh APCanna myeloid (CD11b móide CD11c móide F4/80 móide ) go suntasach ar lá 6 tar éis cóireáil rHER2 T785-ISAC i gcomparáid leis na rialuithe (Fíor 5G agus Fíor Forlíontach 19). ). Ina theannta sin, fuarthas amach go raibh APCanna myeloid gníomhachtaithe go sonrach sa ghrúpa cóireáilte ISAC rHER2 T785- ag an dá phointe ama, arna thomhas ag upregulation CD40 ar dhromchla na cille (Fíor 5H). Rud atá tábhachtach, níor tomhasadh méadú ar APCanna myeloid meall tar éis ídiú phagocyte ag baint úsáide as liposomes clodronate-luchtaithe (Figiúr Forlíontach 20). Ar deireadh, rinneadh IHC chun láithreacht agus suíomh na bpríomhdhaonraí cille imdhíonacha sa tsamhail MMC a mheas tar éis cóireála leis an rHER2 T{785-ISAC. Mar a chonacthas i múnla xenograft HCC1954, tháinig méadú suntasach ar chealla CD11c móide agus F4/80 móide sa réigiún peritumoral mar thoradh ar chóireáil leis an rHER2 T785-ISAC nach bhfacthas tar éis cóireála antasubstainte rHER2 nó cóireáil le isitíopa. nó isitíopa T785-ISAC (Fíor 5I). Ag teacht le léiriú luath na gceimicíní cille T agus an scór sínithe géine méadaithe d’Fheidhm T Cell, chonacthas IHC insíothlú suntasach de chealla CD8 móide laistigh d’siadaí lucha cóireáilte rHER2 T{785-ISAC ar lá 6, ach D'fhan staining CD8 i lucha a ndearnadh cóireáil orthu le rialuithe antashubstainte nó isitíopa frith-rHER2 íseal (Fíor 5I). Tacaíonn méadú ar CD8 móide staining IHC, mar aon le léiriú géine méadaithe de ghéinte a bhaineann le feidhm chealla T agus imréiteach siadaí cleithiúnach CD, le cumas T{57}}ISAC meall fuar a iompú te.CL{ {58}}Faigheann ISACs aischéimniú siadaí i múnla siadaí xenograft meánléiritheach HER2-Chun a léiriú gur ardán láidir iad ISACanna thar il-ualaí spreagtha imdhíonachta, d'fhorbraíomar ISAC ag baint úsáide as agónaí TLR7 aitheanta, CL264 le DAR. inchomparáide leis an trastuzumab T785-ISAC (Fíor 6A agus Fíor Forlíontach 21). Rinneadh measúnú ar chumas ISACanna trastuzumab a tháirgtear le CL264 nó T785 chun gníomhachtú myeloid laistigh den meall a idirghabháil sa tsamhail xenograft HCC1954 24 uair tar éis riarachán amháin de trastuzumab, trastuzumab CL264-ISAC nó trastuzumab T785-ISAC . Breathnaíodh gníomhachtú myeloid feabhsaithe le trastuzumab CL264-ISAC mar is léir ón léiriú CD40 méadaithe ar CD11b a insíothlaíonn siadaí móide CD11c móide F4/80 móide APCanna myeloid i gcomparáid le trastuzumab nó trastuzumab T785-ISAC (Fíor 6B). ).Chun a fháil amach an aistríodh cumas feabhsaithe gníomhachtaithe myeloid an CL264-ISAC go gníomhaíocht frith-meall níos mó in vivo, cuireadh an trastuzumab CL264-ISAC i gcomparáid leis anT{0}}ISAC sna samhlacha siadaí HER2High HCC1954 agus HER2Med JIMT-1. Cé go bhfuil an dáRinne ISACs trastuzumab idirghabháil ar aischéimniú iomlán siadaí i múnla HCC1954 HER2High, léirigh CL264-ISAC gníomhaíocht mhéadaithe frith-meall sa tsamhail JIMT{4}} HER2Med ag tabhairt le tuiscint go bhféadfadh cumas ISAC agus an cumas díriú ar shiadaí dlúis antaiginí níos ísle. a bheith nasctha (Fíor 6C–D).

Glacadh go maith leis an dá ISAC, ach thugamar faoi deara gur cailleadh meáchain choirp neamhbhuan de 5-10 faoin gcéad in ainmhithe a cuireadh faoi chóireáil leis an trastuzumab CL264-ISAC nó rituximab CL264-ISAC, le meáchan coirp ag téarnamh go dtí nó os cionn na bunlíne faoin tríú dáileog (Fíor Forlíontach 16A). Tomhaiseadh secretion cítocine sistéamach tar éis cóireála le T785-ISAC nó CL264-ISAC. Tomhaiseadh leibhéil ísle TNF i séiream na n-ainmhithe ceithre huaire an chloig tar éis an T785-ISAC a thabhairt, agus d’eascair leibhéil níos airde de secretion TNF go sistéamach leis na spriocdhírithe agus na isitíopa CL264-ISACs (Figiúr Forlíontach 11). . Ní dócha gur tharla na héifeachtaí seo idir ISACanna T785 agus CL264 mar gheall ar thionchar díreach an ISAC ar fhás cille siadaí, toisc nár chuir an ISAC bac ar iomadú cille ailse in vitro (Figiúr Forlíontach 9).

CL264-Faigheann ISACs imréiteach siadaí agus cuimhne imdhíoneolaíoch i múnlaí siadaí singeneic Ag cur san áireamh an cumas agus an éifeachtúlacht mhéadaithe a breathnaíodh leis an CL264-ISAC i múnlaí xenograft siadaí daonna le dlús éagsúil antaigin HER2, rinneamar an chéad shaintréithe den ghníomhaíocht CL. 264-ISACs i múnlaí siadaí singeneic. Cosúil leis an T785-ISAC sa tsamhail MMC, ba é an toradh a bhí ar CL264-ISAC ná aischéimniú siadaí agus imréiteach ar bhealach T-spleách ar chealla T, rud a d’eascair cuimhne imdhíoneolaíoch marthanach (Fíor Forlíontach 22A). Chun éifeachtúlacht ISAC a mheasúnú i múnla siadaí singeneic le léiriú laghdaithe antaigin, d’fhorbraíomar líne cille CT26 a chuireann francach HER2 (CT26-rHER2) in iúl go cobhsaí. Rud atá tábhachtach, ní chuireann thart ar 8.5 faoin gcéad de na cealla CT26 in iúl rHER2 tar éis ionchlannú meall (Fíor 6E). Thaispeáin lucha Wildtype Balb/c a cóireáladh leis an rHER2 CL264-ISAC imdhíonacht shubstaintiúil frith-meall sa mhéid is gur ghlan 75 faoin gcéad (6 as 8) de na lucha a gcuid siadaí agus gur fhan siad saor ó siadaí ar feadh ré an turgnaimh, ach ní raibh cúlchéimniú iomlán ag aon cheann de na lucha ar cuireadh cóireáil orthu leis an antasubstaint frith-rHER2 (Fíor 6F). Breathnaíodh meáchain caillteanas neamhbhuan de thart ar 10 faoin gcéad de mheáchan coirp tar éis cóireála rHER2 CL{264-ISAC, agus tháinig feabhas ar mheáchan coirp ocht lá tar éis thionscnamh an staidéir (Fíor Forlíontach 22B). Rinneamar measúnú ar cibé an ndearna an rHER2 CL264-ISAC cuimhne imdhíoneolaíoch idirghabhála i gcoinne siadaí a raibh easpa léirithe acu ar an antaigin spriocdhírithe, rHER2, trí dhúshlán a thabhairt do lucha a leigheasadh roimhe seo de shiadaí CT26-rHER2 le líne chill CT26 tuismitheora nach raibh rHER2 ann. léiriú. Bhí lucha a leigheasadh cheana de shiadaí CT26-rHER2 le rHER2 ISAC a chosaint go hiomlán ó dhúshlán le líne chill CT26 na dtuismitheoirí (Fíor 6I). Léirigh ídiú cealla CD4 agus CD8 T roimh an athdhúshlán meall go bhfuil gá le cealla T le haghaidh cosanta. Mar fhocal scoir, rinneamar tástáil ar cibé an raibh an chuimhne imdhíoneolaíoch a forbraíodh i lucha a leigheasadh roimhe seo leis an ISAC sainiúil d'antaiginí a bhaineann le siadaí den siadaí príomhúil a ndearnadh cóireáil orthu. Le linn athdhúshlán meall CT26 na dtuismitheoirí, tugadh dúshlán do lucha ag an am céanna le meall difriúil, 4T1, a ionchlannú ar an taobh contralateral. Léiríonn na sonraí go raibh forbairt na cuimhne imdhíoneolaíocha bhaineann go sonrach le hantaiginí siadaí CT26 atá éagsúil ó rHER2, toisc nach raibh tionchar ar fhás siadaí siadaí 4T1 (Fíor 6G).