Cosain Alfa Daonna 5 Slonn sa Duán Daonna agus sa Chonair Urinary

Tuilleadh eolais: ali.ma@wecistanche.com

John David Spencer et al

Teibí

Cúlra:Ní thuigtear go hiomlán na meicníochtaí a chothaíonn steiriúlacht sa chonair urinary. Tá baint ag staidéir le déanaí leis an tábhacht a bhaineann le peiptídí frithmhiocróbacha (AMP) chun an conradh urinary a chosaint ó ionfhabhtú. Anseo, tréithrímid léiriú agus ábharthacht an alfa-chosanta daonna AMP 5 (HD5) sa duineduánagus conradh urinary in ábhair gnáth agus ionfhabhtaithe.

Modheolaíocht/Príomhthorthaí:Ag baint úsáide as RNA scoite amach ón duineduán, úiréadar, agus fíochán lamhnán, rinneamar PCR cainníochtúla fíor-ama chun a thaispeáint go bhfuil DEFA5, an géine ionchódaithe HD5, in iúl go bunreachtúil ar fud an chonair urinary. Le pyelonephritis, tháinig méadú suntasach ar léiriú DEFA5 saduán. Ag baint úsáide as anailís immunoblot, mhéadaigh táirgeadh HD5 le pyelonephritis freisin. Imdhíonadh HD5 logánta chuig urothelium an lamhnáin agus an úiréadra. Sna duáin, táirgeadh HD5 go príomha sa nephron distal agus feadáin bhailiú. Ag baint úsáide as measúnachtaí imdhíonoblot agus ELISA, níor braitheadh ​​HD5 go rialta i samplaí fual daonna neamh-ionfhabhtaithe agus b'ionann sin agus méadú ar tháirgeadh HD5 fuail le hionfhabhtú conradh urinary E.coli.

Conclúidí/Tábhacht:Cuirtear DEFA5 in iúl ar fud an chonair urinary in ábhair neamh-ionfhabhtaithe. Go sonrach, cuirtear HD5 in iúl ar fud urothelium an chonair urinary íochtair agus i bhfeadáin bhailithe anduán. Le ionfhabhtú, méaduithe léiriú HD5 saduán, agus éiríonn leibhéil inbhraite sa fual. Go bhfios dúinn, is ionann ár dtorthaí agus na chéad chinn a rinne cainníochtú ar léiriú agus ar tháirgeadh HD5 sa duán daonna. Ina theannta sin, is é seo an chéad tuarascáil a bhrath láithreacht HD5 i samplaí fuail ionfhabhtaithe. Tugann ár dtorthaí le fios go bhféadfadh ról tábhachtach a bheith ag HD5 maidir le steiriúlacht an chonair urinary a chothabháil.

fo-iarsmaí Cistanche agus Cistanche tubulosa doduángalar, cliceáil anseo chun an sampla a fháil

Réamhrá

Is gnách go mbíonn an conradh urinary, seachas an meatus urethral, ​​steiriúil in ainneoin a ghaireacht le flóra fecal. Ní thuigtear go maith na meicníochtaí beachta trína gcoimeádann an conradh urinary a steiriúlacht. I measc na meicníochtaí molta a chuidíonn le cosaint an chonair urinary tá sreabhadh fual, athruithe ar pH fuail agus osmolarity, fholmhú rialta lamhnán, comhpháirteanna cosanta ceimiceacha den uroepithelium, agus sileadh / sní epithelial de chealla imdhíonachta éifeachtóra le spreagadh baictéarach [1]. Ina theannta sin, léiríodh le déanaí go bhfuil ról tábhachtach ag peiptídí frithmhiocróbacha (AMPanna) maidir le steiriúlacht an chonair urinary a chothabháil [2]. Is comhpháirt uileláithreach den chóras imdhíonachta dúchasach iad AMPanna, a fheidhmíonn mar antaibheathaigh nádúrtha arna dtáirgeadh ag beagnach gach orgánach. Is móilíní cationic iad AMPanna arna gcur in iúl ag cealla bána phagocytic agus cealla epithelial. I ndaoine agus i mamaigh eile, is mór-theaghlach AMP iad na cosantóirí. Go hiondúil bíonn gníomhaíocht fhrithmhiocróbach speictream leathan ag cosantóirí i gcoinne baictéir gram-dhiúltacha agus gram-dhiúltacha, víris, fungais agus prótozoa [2,3]. Déantar Defensins a shintéisiú ar dtús mar réamhproproteiní agus déantar iad a phróiseáil chun a bheith ina peptidí aibí, gníomhacha go bitheolaíoch [4]. I ndaoine, déantar na cosantóirí a rangú i gceann amháin de dhá theaghlach ag brath ar a bpatrún idirlinne disulfide - na cosaintí alfa nó na béite-chosaintí [5].

Sa chonair urinary, cuirtear béite-chosaintí in iúl go forleathan ar fud an uroepithelium. Cealla epithelial líneáil anduánlúb Henle, tubule distal, agus duct a bhailiú go bunreachtúil in iúl daonna beta-cosanta 1 (hBD1). Cé nach leor leibhéil urinary ofhBD1 chun baictéir ionracha a mharú, soláthraíonn hBD1 sciath frithmhiocróbach atá ag gníomhú go tapa ar lumens feadánacha agus cuireann sé cosc ​​​​ar ionfhabhtú trí chosc a chur ar cheangal baictéarach leis an urothelium [6]. Léiríonn staidéir le déanaí go gcuireann staid redox hBD1 isteach go mór ar chumas frithmhiocróbach, mar sin go bhfuil an peptide laghdaithe i bhfad níos cumhachtaí ná an fhoirm ocsaídithe atá nasctha le disulfide [7]. Níl an tábhacht a bhaineann leis seo ag an dromchla urothelial cinnte. Níl defensin eile, béite-chosanta daonna 2 (hBD2) in iúl go bunreachtúil i bhfíochán sláintiúil duáin; áfach, tá léiriú hBD2 spreagtha ag ionfhabhtú [8].

Murab ionann agus na béite-cosanta, níl cur síos maith ar ról na n-alfa-chosaintí epithelial-díorthaithe sa chonair urinary. Tá léiriú agus feidhm alfa-chosaintí HD5 agus HD6 tuairiscithe den chuid is mó sa stéig bheag ina bhfuil siad secreted ag Panethcells isteach sa crypts intestinal agus cuireann siad le cothromaíocht na miocróib intestinal [9]. Tá HD5 logánaithe freisin i gconair ghiniúna na bhfear agus na mban, agus tugann fianaise le fios go bhfuil sé do-dhícheallach agus tábhachtach chun ionfhabhtú a dhíothú [10,11,12]. Braitheadh ​​HD5 urinary in othair a ndearnadh atógáil neobladder ileal orthu agus atreorú urinary seoladán ileal inar cuireadh foinse táirgeachta HD5 chun sochair go príomha do na cealla ileal Paneth [13,14]. Tá gníomhaíocht antibacterial ag HD5 i gcoinne baictéir gram-dearfach uropathogenic coitianta agus baictéir gram-diúltacha [15]. Tá gníomhaíocht fhrithmhiocróbach ag HD5 freisin i gcoinne víris uropathogenic amhail adenovirus agus víreas BK [16,17,18]. Sa staidéar seo, soláthraímid an cur síos tosaigh agus an chainníochtú ar léiriú HD5 sa duineduánagus a léiriú a shainiú tuilleadh sa chonair urinary íochtair le linn steiriúlacht agus ionfhabhtú.

Torthaí

Cuirtear mRNA DEFA5 in iúl go bunreachtúil sa lamhnán daonna, san úiréadar, agus sa duán

Léiríonn PCR fíor-ama cainníochtúil go bhfuil gach tástáil lamhnán, úiréadra, agusduáneiseamail gan ionfhabhtú arna chur in iúl go bunreachtúil DEFA5. Bhí slonn DEFA5 i bhfad níos mó sa chonair urinary íochtair ná sa chonair urinary uachtair (p= 0.014). Sa lamhnán (n=4), ba é meán slonn DEFA5 ná 4,656637 tras-scríbhinní in aghaidh an 10 ng RNA agus san úiréadra (n=4)bhí 4,1126170 tras-scríbhinn in aghaidh an 10 ngRNA (Fíor 1A) sa mheán slonn DEFA5. . Sa duán (n=6), ba é meán slonn DEFA5 ná 2,9376274 tras-scríbhinn in aghaidh 10 ng RNA. Rinneadh anailís ar slonn DEFA5 go leithleach i slonn cortex duánach, medulla, agus pelvis.DEFA5 nach raibh mórán éagsúlachta ann de réir réigiúin duáin (p= 0.45).

Méadú léiriú DEFA5 agus léiriú peptide HD5 le pyelonephritis

Anailís chainníochtúil PCR fíor-ama déanta arfíocháin duáin leléirigh pyelonephritis méadú suntasach ar léiriú DEFA5 i gcomparáid le fíocháin duáin neamh-ionfhabhtaithe. Withpyelonephritis (n= 6), meán slonn DEFA5 méadaithe go 7,82961,052 tras-scríbhinní in aghaidh 10 ng RNA (p= 0.019) (Fíor 2A).

Chun an méadú seo ar léiriú le pyelone-phritis a mheas tuilleadh, rinneamar anailís inmunoblot ar an gcéannaduánfíochán a úsáidtear le haghaidh anailíse PCR fíor-ama chun meastóireacht a dhéanamh ar mhéaduithe comhthráthacha i dtáirgeadh peptide HD5 (Fíor 2B, painéal lár). }) i gcomparáid le neamh-ionfhabhtaitheduánfíocháin(n=6). Neamh-ionfhabhtaitheduánfíocháin léirithe 300625 ng HD5/gram meáchan fíocháin fhliucha agusduánfíochán le pyelonephritisexpressed 600621 ng HD5/gram meáchan fíocháin fhliucha (p,0.0001). Rinneadh blotaí a athscrúdú le GAPDH chun feidhmiú mar rialú luchtaithe (Fíor 2B, painéal lár) agus rinneadh stain airgid freisin chun luchtú próitéine comhionann a dhearbhú (Fíor 2B, an painéal barr).

Táirgtear peptide HD5 ar fud na duáin agus an chonair urinary daonna

Rinneadh imdhíonadh chun táirgeadh HD5 a logánú sa chonair urinary. Léirigh Immunohistochemistry (IHC) go raibh imdhíonghníomhaíocht HD5 i láthair ar fud urothelium an úiréadra agus lamhnán na n-eiseamal imscrúdaithe go léir (n=4, Fíor 3). Thaispeáin IHC freisin gur táirgeadh HD5 i dtiúbáin den choirtéis duánach agus i medulla ar fad. eiseamail (n= 6, Fíor 4). Léirigh imdhíonfluaraiseacht (IF) go raibh léiriú HD5 ar an méid is mó sa néarón distal agus sna feadáin bailithe (Fíor 5). Níor léirigh an interstitium agus glomeruli imdhíon-imoibríocht HD5. Rinneadh an imdhíonacht a thaispeántar i bhFíoracha 3, 4, agus 5 ag baint úsáide as antasubstaint frith-HD5 monaclónach luch (8C8) a aithníonn an propeptide HD5 (Abcam, Cambridge, MA). Bhí na torthaí comhchosúil nuair a bhí antasubstaint frith-HD5 polyclonal coinín á úsáid a aithníonn an propeptide HD5 agus peptide aibí (sonraí nach bhfuil léirithe) - rud a thugann le tuiscint go bhfuil HD5 stóráilte mar propeptide.

Le pyelonephritis, tháinig méadú suntasach ar imdhíon-imdhíonacht HD5. Méadaíodh imdhíon-imdhíonacht HD5 ar fud an nephron proximal, an nephron distal, agus na feadáin bailithe (Fíor 4 agus Fíor 5). Cosúil le heiseamail neamh-ionfhabhtaithe, níor léirigh an glomeruli agus an interstitium aon léiriú HD5 le hionfhabhtú. Níor léirigh rialuithe diúltacha aon imdhíon-imoibríocht HD5.

Tá tiúchain intomhaiste de pheptíde HD5 i bhfual daonna ionfhabhtaithe

D'aithin anailís imdhíonta, ag baint úsáide as antiserum polyclonal coinín a bhraitheann an réamhtheachtaí proHD5 agus foirmeacha próiseáilte eile leibhéil intomhaiste HD5 i 13 de na 15 shampla fuail a tástáladh a bhí ionfhabhtaithe le E.coli uropathogenic (Fíor 6A agus B). Nuair a bhí sé i láthair, bhí leibhéil HD5, normalaithe go creatinín fuail, sa raon ó 299.8–669.7630 ng HD5/mg fual Cr (110.67 ng/mL–276.67 ng/mL), a fhreagraíonn do 11.10–27.67 nmol/L. Bhí samplaí fuail neamh-ionfhabhtaithe (n=15), HD5 ag an teorainn braite de (,50 ng) nó faoina bhun. Measúnacht imdhíonta einsím-nasctha (ELISA) ar na samplaí fuail céanna, ag baint úsáide as an antashubstaint mhonaclónach luiche (8C8) a bhraitheann ach an réamhtheachtaí proHD5, braitheadh ​​leibhéil intomhaiste proHD5 i 13 de na 15 shampla ionfhabhtaithe a tástáladh. Bhí tiúchan proHD5 urinary sa raon ó 122.78–490.060.03 ng HD5/mg fual Cr (30.02 ng/mL–200.5 ng/mL) nuair a bhí siad i láthair (Fíor 7).

Plé

Sa staidéar seo, soláthraímid tréithriú tosaigh HD5 sa duineduán, ureter, agus lamhnán. Tá sé léirithe go bhfuil HD5 ina AMP tábhachtach a chuireann cosc ​​ar ionfhabhtú ionrach sa stéig agus a uasrialaítear sa chonair ghiniúna le linn ionfhabhtaithe[11,18,19,20,21]. Léiríodh go bhfuil AMPanna epithelial-díorthaithe, cosúil le HD5, tábhachtach chun steiriúlacht a choinneáil sa chonair urinary[8,22,23,24]. D’fhéadfadh ionfhabhtú géara agus/nó ainsealach a bheith mar thoradh ar easnaimh sna cosaintí mucosal dúchasacha seo [25,26].

Léiríonn ár dtorthaí cainníochtúla PCR fíor-ama go gcuirtear DEFA5 in iúl go bunreachtúil sa duineduáin, ureters, agus lamhnán. Méadaíonn slonn DEFA5 ón gconair urinary uachtair go dtí an conradh urinary íochtair – tar éis shreabhadh an tsrutha urinary agus chomh gar do phointe ionraidh an mhicribhiota atá ag méadú. Go bhfios dúinn, is é seo an chéad staidéar chun slonn DEFA5 sa duán agus sa lamhnán daonna a chainníochtú. Le déanaí, léirigh Townes et al gur féidir le gnáth-úiréadar distal a chur in iúl DEFA5 [14]. Tugann ár dtorthaí le fios freisin go gcuirtear DEFA5 in iúl go bunreachtúil ag an úiréadar distal. Cé go bhfuil slonn DEFA5 sa chonair urinary beagnach 100-fillte níos ísle ná mar a fhaightear i bhfíocháin ghastraistéigeacha, tá léiriú uroepithelial basal de DEFA5 inchomparáide leis an slonn aimpeanna rian urinary a bhfuil cur síos orthu roimhe seo mar cathelicidin, hBD{8}}, hBD -2, agus ribonuclease 7[6,8,22,24,27].

I gcodarsnacht leis an gconair ghastraistéigeach aibí ina gcuirtear DEFA5 in iúl ag leibhéil arda sa dá stát sláinte agus ionfhabhtú/athlasadh, léiríonn ár sonraí PCR cainníochtúla fíor-ama go bhfuil léiriú DEFA5 saduánTá sé uas-rialaithe go mór le hionfhabhtú [27,28,29]. Tá an patrún cainte inducible seo ar aon dul le léiriú DEFA5 sa chonair atáirgthe baineann nuair a mhéadaíonn léiriú DEFA5 le salpingitis [30]. Sa chonair urinary, léirigh Townes et al treocht i dtreo léiriú ureteral níos mó de DEFA5 in othair le UTIanna a ndearnadh atreorú urinary seoladán ileal [14]

Comhlánaíonn ár n-anailís inmunoblot na sonraí PCR fíor-ama trína léiriú go méadaíonn táirgeadh peptide HD5 le pyelonephritis. Tá an patrún ionduchtaithe seo de tháirgeadh HD5 cosúil leis an bpatrún a fheictear i roinnt ball den teaghlach béite-chosanta.hBD2 patrún táirgeachta do-induchtach le hionfhabhtú sa chonair urinary agus/nó pyelonephritis ainsealach [8,31,32]. Tá sé léirithe go dtiocfaidh méadú ar tháirgeadh HD5peptide sa chonair ghiniúna uachtarach baineann agus úiréadra fireann le athlasadh [11,30].

Trí úsáid a bhaint as imdhíonadh, léirímid go dtáirgtear HD5 go haonfhoirmeach ar fud an úiréadra agus an lamhnán. Toisc go n-eascraíonn formhór mór na UTIanna ó fhlóra fecal a théann suas sa lamhnán, tugann na torthaí seo le fios go bhfuil léiriú HD5 i láthair in áiteanna ina dtarlaíonn nochtadh miocróbach is minice [33]. Mar sin, tá HD5 suite go hidéalach chun ionfhabhtú miocróbach ardaitheach a chosc. Saduán, HD5 a tháirgtear go príomha sa nephron distal agus a bhailiú tubule. Tugann na torthaí seo le fios go dtáirgtear HD5 in áiteanna ina mbeidh sé suite chun an ghníomhaíocht fhrithmhiocróbach is fearr a bheith ann. Léiríodh i staidéir roimhe seo go bhfuil airíonna frithmhiocróbacha na gcosantóirí ag brath ar thiúchan salainn – le tiúchan salainn níos airde ag laghdú gníomhaíocht fhrithmhiocróbach [23,34,35]. Tuairimíd go soláthraíonn tiúchan salainn íseal an nephron distal agus na feadáin bailithe milieu fabhrach do ghníomhaíocht fhrithmhiocróbach HD5.

Léiríonn anailís Immunoblot agus ELISA freisin go bhfuil HD5 á scaoileadh isteach san fhual ag leibhéil ísle. I bhfianaise mhéid (8.1 kDa agus3.7 kDa) agus lucht dearfach proHD5 agus HD5 lánphróiseáilte, is féidir go dtagann roinnt peiptíde fuail HD5, go páirteach ar a laghad, ó scagáit plasma. Mar sin féin, is beag fianaise atá ann le tuiscint go leanann HD5 sa phlasma [27]. Ina theannta sin, le feiceáil sa fual, bheadh ​​ar HD5 na meicníochtaí ionsúcháin peptide éifeachtacha a éalú sa tubule proximal [6,36]. Ar deireadh, rinneadh lártheifneoiriú ar shamplaí fuail a úsáideadh sular rinneadh na measúnachtaí, rud a bhain foinsí ceallacha HD5 amach.

Ag na tiúchain braite, ní dócha go mbeidh HD5 fuail go díreach frithmhiocróbach i gcoinne miocrorgánaigh uropathogenic mar go bhfuil tiúchan coisctheach íosta (MIC) ag HD5 lánphróiseáilte idir 6-10 mg/mL i gcoinne baictéir ghéiniteacha uropatho gram-dhiúltacha coitianta [15]. Mar sin féin, is dócha go mbeidh tiúchan dromchla mucosal níos airde. Ina theannta sin, léiríonn anailís imdhíon-blot go bhfuil tiúchan HD5 i bhfad níos airde snaduán. Tugann na torthaí seo le fios go bhfuil baint ag HD5 le cosaint mhúcóis an chonair urinary. Feictear patrún analógach lehBD1, áit nach leor na comhchruinnithe fuail de hBD1 chun gníomhaíocht fhrithmhiocróbach a thaispeáint ach go n-aimsítear tiúchan peiptíde níos airde in aice leis na feadáin duánach [6,31].

Toisc go léiríonn IHC gur foirm mhór deHD5 é proHD5 saduánagus toisc go n-aimsítear an dá aibí agus proHD5 sa fual, tuairimíonn muid go bhfuil HD5 secreted go príomha mar mhóilín réamhtheachtaithe agus go ndéantar próiseáil próitéalaíocha ansin chun foirmeacha aibí a ghiniúint - cosúil leis na conairí gastrointestinal agus giniúna [11,30,37]. Sa stéig bheag, táirgeann cealla Paneth trypsin, a scoilteann an propeptide HD5 ionas gurb é an peptide lánphróiseáilte an fhoirm is mó sa lumen intestinal [37]. Sa úiréadra fireann, is iad na heinsímí próiseála agus gníomhachtaithe eochair do HD5 próitéisí neutrophil a chuireann neodrófail a earcaítear chuig suíomh an ionfhabhtaithe [11]. Tá rannchuidiú trypsinogen epithelial, trypsin fuail, agus/nó próitéisí neodrófail le próiseáil HD5 sa chonair urinary le linn ionfhabhtaithe fós le cinneadh. Ina theannta sin, tá iarmhairtí na n-athruithe sa timpeallacht urinary ar fheidhm HD5 (athruithe ar osmolarity, pH, agus tiúchan cationic) fós le cinneadh freisin.

Mar fhocal scoir, is é seo an chéad staidéar chun slonn agus táirgeadh HD5 sa chonair urinary a aithint agus a chainníochtú. Tugann ár dtorthaí le fios gur AMP epithelial-díorthaithe é HD5 a d'fhéadfadh ról tábhachtach a bheith aige i ndíolús dúchasach an uroepithe lium daonna a choscann traslonnú pataiginí ionradh isteach sa chúrsaíocht. D’fhéadfadh soiléiriú ar na fachtóirí a rialaíonn táirgeadh HD5 léargas nua a thabhairt ar phataigineas UTIanna in othair atá i mbaol UTIanna agus othair a bhfuil ionfhabhtuithe ainsealacha orthu.

Modhanna

Faomhadh staidéir

Fuarthas toiliú eolasach i scríbhinn ó gach othar a ghlac páirt sa staidéar seo. I gcás ábhair faoi bhun 18 mbliana d'aois, fuarthas toiliú scríofa tuismitheora/caomhnóra. Cheadaigh Bord Athbhreithnithe Institiúideach Ospidéal NationwideChildren's (NCH) an staidéar seo mar aon leis an bpróiseas toilithe agus na doiciméid (IRB07-00383).

Samplaí Fíocháin Dhaonna agus Fual

Fuarthas úiréadar distal neamh-ionfhabhtaithe agus fíochán lamhnán (n= 4) ó leanaí a bhí faoi ath-ionchlannú ureteral ar chúiseanna seachas ionfhabhtú athfhillteach. Neamh-ionfhabhtaitheduánFuarthas samplaí (n=6) ó othair a bhí ag dul faoi nephrectomy le haghaidh siadaí duánach. Bhí samplaí fíocháin saor ó chomharthaí macrascópacha galair nó athlasadh.Duánsholáthair an Líonra Comhoibritheach um Fhíocháin Dhaonna (n=6) fíocháin ó othair a bhfuil pyelonephritis ainsealach orthu [38]. Dhearbhaigh dhá phaiteolaí neamhspleácha diagnóis histeapaiteolaíoch pyelonephritis. Rinneadh samplaí fíocháin a snap-reoite nó caomhnaithe mar chodanna neodracha foirmiúla-seasta agus leabaithe pairifín. Rinneadh codanna d'fhíochán duánach neamh-ionfhabhtaithe a roinnt ina cortex, medulla, nó pelvis duánach roimh é a stóráil(n=4).

Fuarthas samplaí fual neamh-ionfhabhtaithe agus ionfhabhtaithe ó leanaí a tháinig chuig rannóg éigeandála an NCH nó chuig an gclinic theafreolaíochta. Rinneadh diagnóis UTI trí chultúr fual dearfach de réir na dTreoirlínte Acadamh Pediatrics Mheiriceá [39]. Bhí .106 CFU/ml de E.coli ag gach sampla fuail ionfhabhtaithe. Bhí luachanna pH urinary sa raon ó 5.5 go 8.5 (meán fual 6.9). Níor rinneadh an comhdhéanamh ianach urinary a thomhas. Rinneadh samplaí fuail a lártheifneoiriú chun dríodar fuail a bhaint, agus cuireadh cocktail coscaire prótease leis (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).

Leithlisiú Aigéad Ribonúicléach agus Trascríobh Droim ar Ais

Rinneadh RNA iomlán a leithlisiú ó fhíochán reoite ag baint úsáide as an gCóras Leithlisithe RNA PromegaTotal (Promega, Madison, WI, SAM). Rinneadh sintéis ForcDNA, 4-8 mg de RNA iomlán a thrascríobh ar ais le trascríobh droim ar ais Superscript III ag baint úsáide as oligo-(dT) 12-18primer de réir phrótacal an tsoláthraí (Invitrogen, Carlsbad, CA, SAM).

Plasmid Sainiúil Géine a Chlónáil do Chuair Chaighdeánacha

Clónáladh an t-ionchódú cDNA DEFA5 agus GAPDH isteach i 4-veicteoir Topo plasmid (Invitrogen) de réir threoracha an déantóra. Cuireadh Plasmids in ord chun a dhearbhú go bhfuil an ceart

Fuarthas tógálacha. Rinneadh caolú sraitheach ar plasmidanna géine-shonracha a chainníochtú (trí ionsúchán speictrophotiméadrach ag 260 agus leictreafóiréis glóthach agairóis dhaite le bróimíd eitiliam) agus úsáideadh iad i PCR fíor-ama chun cuair chaighdeánacha a ghiniúint do gach imoibriú.

PCR Cainníochtúil Fíor-ama

Rinneadh PCR fíor-ama cainníochtúil ag baint úsáide as cDNA aon-shnáithe ón duineduán, úiréadar, agus fíocháin lamhnán le péirí sonracha oligonucleotide primer ag baint úsáide as an Córas PCR Fíor-Ama 7500 (Bithchórais Fheidhmeach, Carlsbad, CA, SAM).Dearadh priméirí acomhal exon PCR agus deimhníodh seichimh ag baint úsáide as DNAstarH Laser Gene SeqBuilder (DEFA5 ar aghaidh primer : 59- TCC CTC CTG CAG GTG ACC CCA-39 agus primer droim ar ais DEFA5 59-GTG GCT CTT GCC TGA GAA CCT GA-39).

Go hachomair, d'fhóin cDNA a fhreagraíonn do 10 ng RNA mar aimpléad in imoibriú 25 ml ina raibh 2.0 mM de gach primer agus16 Light-Cycler-Fast Start DNA Master SYBR Meascán glas. Ba iad na coinníollacha PCR ná: dínádúrú tosaigh ag 95uC ar feadh 10 nóiméad, agus 40 timthriall ina dhiaidh sin le gach timthriall comhdhéanta de dhínádúrú ag 94uC ar feadh 30 soicind, anáil ag 64uC ar feadh 30 soicind, agus síneadh ag 72uC ar feadh 30 soicind. Rinneadh monatóireacht ar astaíocht fhluaraiseachta timthriall go timthriall ag 530 nm agus rinneadh anailís air ag baint úsáide as 7500Software V2.0.3 (Bithchórais Fheidhmeach). Áiríodh caighdeáin plasmid a bhaineann go sonrach le géin le gach sraith imoibrithe. Mar rialú dearfach, áiríodh RNA ileum críochfoirt le gach sraith imoibrithe, agus rinneadh comparáid idir na torthaí le caighdeáin a foilsíodh roimhe seo [27].

Chun aimpliú PCR ar an táirge beartaithe a dhearbhú, rinneadh anailís ar shampla ionadaíoch trí leictreafóiréis ar fhoirmiú agarose 1.5 faoin gcéad. Rinneadh na táirgí a léirshamhlú trí bhróimídíde ethidium agus cuireadh i gcomparáid iad le caighdeáin mhéid DNA go dtí méid an táirge a raibh coinne leis (nár léirítear). Ina theannta sin, socraíodh cuar próifíl teocht leá de gach imoibriú PCR ag deireadh gach imoibrithe.

HD5 antasubstaintí

Aithníodh an propeptide HD5 (AA20-94) agus foirmeacha próiseáilte go páirteach (AA36-94 agus 56–94) ag baint úsáide as antashubstaint frith-HD5 mhonaclónach luiche (8C8) atá ar fáil go tráchtálach (Abcam). An propeptide HD5 agus aithníodh an peptide aibí (AA{63-94) ag baint úsáide as antiserum polyclonal coinín a ndearnadh cur síos air roimhe seo[13,40].

Imdhíonachta

Ailt den chéannaduánrinneadh eiseamail a úsáideadh le haghaidh anailís chainníochtúil PCR fíor-ama (3-6 mg meáchan fliuch) a smidiríní ag baint úsáide as moirtéal agus pestle i nítrigine leachtach agus tuaslagtha i maolán RIPA le coscairí próitéáis. Baineadh próitéiní urinary as samplaí fuail ag baint úsáide as Micrimhilseogra Tiúchan Próitéiní Fual ProteospinTM (Norgen Biotek Corporation, Thorold, ON, Ceanada). Rinneadh tiúchan próitéine duán agus fuail a chainníochtú trí úsáid a bhaint as Measúnacht Bradford modhnaithe agus deimhníodh iad ag baint úsáide as léamh anOD280 nm. Lódáltar comhchruinnithe fíocháin duáin nó próitéin fuail ar glóthacha grádán dódeicile sulfáit sóidiam 18 faoin gcéad agus cuireadh faoi leictreafóiréis iad. Chun luchtú próitéine comhionann a chinntiú, rinneadh stain airgid.

Tar éis scaradh electrophoretic, aistríodh próitéiní isteach ar membrane nitrocellulose. Tar éis socrú le 0.05 faoin gcéad glutaraldehyde i TBS, cuireadh bac ar na seicní i mbainne saor ó shaille 5 faoin gcéad ar feadh 30 go 60 nóiméad agus goraíodh iad i caolú 1:1,000 ar antiserum polaclónach coinín HD5 thar oíche. . Tar éis níocháin, cuireadh an antashubstaint thánaisteach, IgG frith-choineán peroxidase horseradish frith-chomhchuingeach caolaithe 1:10, 000 (Teicneolaíocht Comharthaíochta Cille, Danvers, MA, SAM), i bhfeidhm ar feadh 1 uair ag teocht an tseomra. Imdhíonadh óduánScrúdaíodh fíocháin freisin le hantasubstaint frith-GAPDH (Sigma Aldrich) ar feadh dhá uair an chloig ag teocht an tseomra agus ansin goraíodh iad leis an antasubstaint thánaisteach a bhfuil cur síos air thuas. Rinneadh na próitéiní a léirshamhlú ag baint úsáide as córas braite ECL agus scannán cemiluminescence de réir threoracha an mhonaróra (BioExpress, Kaysville, UT, USA).

Rinneadh HD5 a chainníochtú trí dhéine bannaí dá bharr a chur i gcomparáid le caolú sraitheach ar phróitéin chaighdeánach athchuingreach proHD5 (Peptides International, Louisville, KY, USA).DuánRinneadh comhchruinnithe HD5 a chaighdeánú go dtí meáchan fíocháin fhliucha. Roinneadh tiúchan UrinaryHD 5 ar chreatinín fuail chun cóimheasa caighdeánaithe HD5-go-creatinine (mg/mg) fual a bhunú chun caolú fuail a áireamh. Rinneadh tiúchan creatiníne fuail a chinneadh trí úsáid a bhaint as measúnacht micreaphláta creatinine Oxford Bioleighis (Rochester Hills, Michigan, SAM).

Imdhíon-cheimic

Tar éis díphairifínithe, athhiodráitiú, agus aisghabháil antaigin, rinneadh bloc biotin agus bloc próitéin gan serum (Superblock, ScyTek Laboratories, Logan, UT, USA). Goradh na sleamhnáin thar oíche ag 4uC le antashubstaint mhonaclónach luch HD5(8C8) (1:2{{10}}0; Abcam) nó antiserum polaclónach coinín(1:500) agus antashubstaint biotinylated frith-ilfhiúsach truailleánaithe ina dhiaidh sin. Streptavidin/HRP (Saotharlanna ScyTek). Forbraíodh rannóga ag baint úsáide as teitreaclóiríd diaminobenzidine 0.1 faoin gcéad le sárocsaíd hidrigine 0.02 faoin gcéad agus frithdhaite le hematoxylin. Goradh rannóga rialuithe diúltacha le séiream neamh-imdhíonachta in ionad antashubstaint HD5.

Imdhíonfluaraiseacht

Rinneadh imdhíonfluaraiseacht lipéadaithe faoi dhó chun cuidiú le slonn HD5 a logánú saduán. Rinneadh lipéadú faoi dhó ar an ducht bhailithe do phríomhchealla a bhfuil antashubstaintí aquaporin frith-daonna polaclónacha gabhar (Biteicneolaíocht Santa Cruz, Santa Cruz, CA, SAM) [41] air. Lipéadaíodh lúb Henle faoi dhó le antashubstaint uromodulin frith-dhaonna frith-daonna luiche (Sigma-Aldrich) agus rinneadh lipéadú faoi dhó ar an bhfeadán proximal le aquaporin polaclonalatihuman gabhar-1 (Santa Cruz) [41,42]. Frith-ghobhar polaclónach asal Rhodamine (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, SAM), frith-luch gabhar rhodamine (Saotharlanna Taighde Jackson), agus frith-choinín polaclónach asal FITC (Santa Cruz) mar antasubstaintí tánaisteacha.

Ullmhaíodh gach cuid mar a leagtar amach thuas. Goradh iad le meascán d’fhrithsheannas luiche in aghaidh HD5 (1:200)(Abcam), AQP-2 (1:500), uromodulin (1:500), AQP-1 (1:400) atroom teocht ar feadh 90 nóiméad. Cuireadh an antashubstaint thánaisteach i bhfeidhm ar feadh 90 nóiméad ag teocht an tseomra agus suiteáladh na codanna ag baint úsáide as meáin gléasta le DAPI. Baineadh úsáid as serum neamh-imdhíonachta mar rialú diúltach. Scrúdaíodh na sleamhnáin le micreascóp aLeica DM4000B agus grianghraf digiteach ag baint úsáide as ceamara/bogearraí Spot RT (Diagnostic Instruments, SterlingHeights, MI, USA).

ELISA

Link Biotin Antibody Libeling Kit, Novus Biologicals) antashubstaint mhonaclónach luch ar feadh 2 uair ag teocht an tseomra, streptavidin-capall raidis peroxidase (Biolegend, San Diego CA, SAM) ar feadh 30 nóiméad. Tar éis gor le tuaslagán tsubstráit TMB ar feadh 15 nóiméad (Kem-En-Tec Diagnostics), cuireadh deireadh leis an imoibriú le réiteach STOP (Teicneolaíocht Comharthaíochta Cille, Danvers, MA, SAM) agus léigh sé ag tonnfhad 450 nm. Roinneadh comhchruinnithe HD5 ó mheasúnú ELISA ar fhual-chréaitín chun cóimheasa caighdeánaithe HD5-go-creatinine(mg/mg) fual a bhunú chun cuntas a thabhairt ar chaolú fuail mar a thuairiscítear thuas.

Tagairtí

1. Weichhart T, Haidinger M, Horl WH, Saemann MD (2008) Coincheapa reatha na meicníochtaí cosanta móilíneacha atá i bhfeidhm le linn ionfhabhtú conradh urinary. Iris Eorpach um Imscrúdú Cliniciúil 38 Supl 2: 29–38.

2. Zasloff M (2007) Peptídí frithmhiocróbacha, díolúine dúchasach, agus an conradh urinary steiriúil de ghnáth. J Am Soc Nephrol 18: 2810–2816.

3. Lehrer RI, Lichtenstein AK, Ganz T (1993) Defensins: peptides frithmhiocróbach agus cíteatocsaineacha de chealla mamaigh. Annu Rev Immunol 11: 105–128.

4. Valore EV, Ganz T (1992) Próiseáil iar-aistrithe ar chosantóirí i gcealla mialóideacha daonna neamhaibí. Fuil 79: 1538–1544.

5. Liu L, Zhao C, Heng HH, Ganz T (1997) Tá na béite-chosantaí daonna-1 agus alfa-chosantaí ionchódaithe ag géinte cóngaracha: tá comhshinsear ag dhá theaghlach peiptíde a bhfuil topology déshuilfíde acu. Géanómaíocht 43: 316–320.

6. Valore EV, Park CH, Quayle AJ, Wiles KR, McCray PB, Jr., et al. (1998) Béite-chosanta daonna-1: peptide frithmhiocróbach d’fhíocháin urogenital. J Clin Invest 101: 1633–1642.

7. Schroeder BO, Wu Z, Nuding S, Groscurth S, Marcinowski M, et al. (2011) Léiríonn laghdú bannaí disulfide gníomhaíocht fhrithmhiocróbach cumhachtach béite-chosanta daonna 1. Nádúr 469: 419–423.

8. Lehmann J, Retz M, Níos deacra J, Krams M, Kellner U, et al. (2002) Léiriú béite-chosanta daonna 1 agus 2 sna duáin a bhfuil ionfhabhtú baictéarach ainsealach orthu. BMC Infect Dis 2: 20 .

9. Bevins CL (2006) Cosantóirí cille Paneth: príomh-mhóilíní éifeachtóra díolúine dúchasach. Idirbhearta na Sochaí Bithcheimiceach 34: 263–266.

10. Quayle AJ, Porter EM, Nussbaum AA, Wang YM, Brabec C, et al. (1998) Sloinneadh géine, imdhíonlonnú, agus secretion defensin daonna-5 i gconair atáirgthe baineann an duine. Am J Pathol 152: 1247–1258.

11. Porter E, Yang H, Yavagal S, Preza GC, Murillo O, et al. (2005) Nochtann próifílí cosanta ar leith i Neisseria gonorrhoeae agus urethritis Chlamydia trachomatis idirghníomhaíochtaí núíosacha cille-neutrophil epithelial. Ionfhabhtaigh Imdhíonacht 73: 4823-4833.

12. Com E, Bourgeon F, Evrard B, Ganz T, Colleu D, et al. (2003) Léiriú cosaintí frithmhiocróbacha i gconair atáirgthe fireannaigh francaigh, lucha agus daoine. Bitheolaíocht atáirgeadh 68: 95–104.

13. Porter EM, Polannaigh MA, Lee JS, Naitoh J, Bevins CL, et al. (1998) Leithlisiú cosantóirí stéigeacha daonna ó fhual neobladder ileal. Litreacha FEBS 434: 272–276.

14. Townes CL, Ali A, Robson W, Pickard R, Hall J (2011) Tá caoinfhulaingt na mbaictéar tar éis atreorú urinary nasctha le gníomhaíocht peiptíde frithmhiocróbach. Úireolaíocht 77: 509 e501–508.

15. Wang AP, Su YP, Wang S (2010) Gníomhaíocht antobaictéarach agus meicníocht na cosanta alfa daonna athchuingreach 5 i gcoinne tréithchineálacha cliniciúla atá frithsheasmhach in aghaidh antaibheathach. Afr J Micribhiol Res 4: 626–633.

16. Gropp R, Frye M, Wagner TO, Bargon J (1999) Cuireann cosaintí epithelial isteach ar ionfhabhtú adenoivíreach: impleacht do ghéinteiripe trí adenovirus. Géinteiripe daonna 10:957–964.

17. Smith JG, Nemerow GR (2008) Meicníocht neodraithe adenovirus ag alfa-chosaintí an Duine. Óstach cille & miocrób 3: 11–19.

18. Dugan AS, Maginnis MS, Jordan JA, Gasparovic ML, Manley K, et al. (2008) Cuireann alfa-chosaintí daonna bac ar ionfhabhtú víreas BK trí virions a chomhiomlánú agus trí bhac a chur le ceangal na gcealla óstaigh. Iris na ceimice bitheolaíche 283: 31125–31132.

19. Zhang D, Liu ZH, Liao QP, Ma JM, Sun YF, et al. (2009) Staidéar ar dhíolúine áitiúil d’ionfhabhtuithe sa chonair ghiniúna íochtair. Is féidir le Zhonghua a bheith i do shaol 44: 13–15.

20. Quayle AJ (2002) An freagra imdhíonachta dúchasach agus luath ar dhúshlán pataigin sa chonair ghiniúna baineann agus ról lárnach na gceall epithelial. Iris na himdhíoneolaíochta atáirgthe 57: 61-79.