Conas a Tionchar ag Cistanche Deserticola Polysaccharide ar Ionsú Cnámh?

Déan teagmháil le: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Attenuatesosteoclastogenesis polysaccharide Cistanche deserticola agus ionsú cnámh trí shannadh RANKL agus táirgeadh speiceas ocsaigin imoibríoch a chosc

Amhrán Dezhi et al

Is galar meitibileach é oistéapóróis arb iad is sainairíonna é osteopenia agus meath cnámh-mhicreastruchtúr. Is iad oistéaclaistí na príomhchealla éifeachtóra a dhíghrádaíonn cnámh-maitrís agus mar thoradh ar a bhfeidhm neamhghnácha déantar oistéapóróis a fhorbairt. Cuireann carnadh speiceas ocsaigin imoibríoch (ROS) le linn meitibileacht cheallacha iomadú agus difreáil osteoclast chun cinn, dá bhrí sin, ag imirt ról tábhachtach in oistéapóróis.Cistanchefásachpolaisiúicríd(CDP) le frith-mheas,frith-athlastach, agus gníomhaíocht frithocsaídeach. Mar sin féin, níl tionchar osteoclasts CDPon soiléir. Sa staidéar seo, baineadh úsáid as staining fosfatase aigéad tartrate-resistant, imdhíonfluaraiseacht, imoibriú slabhra tras-trascríobh droim ar ais-polaiméiráis, agus anailís westernblot chun a léiriú go bhfuil CDP.(Cistanchefásachpolaisiúicríd)osteoclastogenesis coiscthe agus resorption hidroxyapatite. Ina theannta sin, CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)chuir sé bac freisin ar léiriú géinte marcála osteoclast lena n-áirítear Ctsk, Mmp9, agus Acp5, agus ní raibh aon éifeacht aige ar ghníomhachtú gabhdóra ar léiriú fachtóir núicléach κB (RANK). Léirigh anailísí meicniúla an CDP sin(Cistanchefásachpolaisiúicríd)Méadaíonn sé léiriú na n-einsímí frithocsaídeacha chun táirgeadh ROS trí mheán RANKL a mhaolú in osteoclasts agus cuireann sé bac ar fhachtóir núicléach cealla T gníomhachtaithe agus gníomhachtaithe kinase próitéine mitogen-activated. Molann na torthaí seo go bhféadfadh CDP a bheith mar dhruga iarrthóra chun cóireáil a dhéanamh ar oistéapóróis de bharr gníomhaíocht iomarcach oistéaclaist.

EOCHAIRFHOCALathshlánú cnámh,Cistanchefásachpolaisiúicríd, MAPK, osteoclast, speiceas ocsaigin imoibríoch

1|RÉAMHRÁ

Tá ról ríthábhachtach ag an gcothromaíocht idir foirmiú cnámh, arna idirghabháil ag osteoblasts, agus aisghabhála cnámh, arna idirghabháil ag osteoclasts, maidir le hoiméastáis meitibileach cnámh a chothabháil (Manolagas, 2000; Zhuet al., 2018). Nuair a sháraíonn ionsú cnámh foirmiú cnámh, tarlaíonn oistéapóróis, arb iad is sainairíonna é mais chnámh laghdaithe agus damáiste micreastruchtúrach cnámh (Ikeda, 2008). Is galar coitianta é oistéapóróis i ndaoine scothaosta agus i mná iar-menopausal agus níl a phaitigineas soiléir go hiomlán (Cooper & Melton, 1992). Is é easnamh estrogen príomhchúis oistéapóróis (Manolagas, O'Brien, & Almeida, 2013). Ina theannta sin, is féidir speiceas ocsaigine imoibríoch (ROS) a tharlú trí ghníomhaí gabhdóra de ligand factorκB núicléach (RANKL) agus tá baint acu le foirmiú osteoclast (Yip et al., 2005), agus mar sin féadfaidh siad cur le forbairt oistéapóróis (Manolagas, 2010). Fuarthas amach i roinnt staidéir go méadaíonn easnamh Nrf2-frithocsaídeach leibhéil ROS agus go gcuireann sé idirdhealú osteoclast spreagtha RANKL chun cinn (Hyeon, Lee, Yang, & Jeong, 2013). Dá bhrí sin, ba cheart laghdú a dhéanamh ar tháirgeadh ROS le linn difreála osteoclast a mheas mar straitéis theiripeach chun oistéapóróis a chóireáil.

Díorthaítear oistéaclaistí ón lineage monocyte nó macraphagehematopoietic agus is iad na cealla ilnúiclithe amháin a fheidhmíonn ath-ionsú cnámh (Teitelbaum, 2000). Dá bhrí sin, tá tábhacht mhór ag baint le taighde a bhaineann le foirmiú osteoclast chun cóireálacha éifeachtacha a fhorbairt do ghalair meitibileachta cnámh (Lorenzo, 2017). Is cítocíní tábhachtacha iad fachtóir a spreagann coilíneacht macrophage (M-CSF) agus RANKL, arna dtáirgeadh ag osteoblasts agus cealla T gníomhachtaithe, a rialaíonn osteoclastogenesis (Kim & Kim, 2016; Teitelbaum & Ross, 2003). Spreagann RANKL léiriú fachtóir núicléach na gcealla T gníomhachtaithe (NFATc1), atá ina fhachtóir trascríobh criticiúil atá gníomhach le linn foirmiú osteoclast (Ishidaet al., 2002). Cuireann NFATc1 gníomhachtaithe chun cinn léiriú géinte marcála osteoclast cosúil le fosfatase aigéad tartrate-resistant (TRAcP) agus cathepsin K (CTSK) a rialaíonn osteoclastogenesis agus feidhm osteoclast (Balkan et al., 2009; Crottiet al., 2008).

Cistanchefásachpolaisiúicríd(CDP) scoite amach ó na gais feola deCistancheagus tá rialáil imdhíonachta, frith-tumor, frith-aging, agus éifeachtaí cógaseolaíochta eile aige (Guo et al., 2016; Jia, Guan, Guo, & Du, 2012). CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)Bhí éifeacht coisctheach aige ar tháirgeadh ocsaíd nítreach (NO) spreagtha ar lipopolysaccharide i gcealla mousemicroglial (cealla BV-2; Nan et al., 2013). Ina theannta sin, tá sliocht saibhir aphenylthanoid (ECD) deCistanched'fheabhsaigh cumas snámha na lucha trí laghdú a dhéanamh ar dhamáiste matán, moill a chur ar charnadh lachtaigéad, agus feabhas a chur ar stóráil fuinnimh (Cai et al., 2010). Mar sin féin, ní fios fós éifeachtaí CDP ar fheidhm agus ar ghníomhaíocht osteoclast.

Sa staidéar seo, léirigh muid go CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)cuireann sé bac ar dhifreáil RANKL-ionduchtaithe-asteoclast agus resorption cnámh. Ba é an bun-mheicníocht ná an CDP sin(Cistanchefásachpolaisiúicríd)feabhsaíonn sé léiriú na n-einsímí frithocsaídeacha chun táirgeadh ROS a mhaolú, agus ansin cuireann sé cascáidí comharthaíochta RANKL-activatedNFAT agus próitéin kinase próitéin mitogen-gníomhach (MAPK) faoi chois. Tugann na torthaí seo le fios go CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)d’fhéadfaí é a úsáid chun oistéapóróis a chóireáil de bharr an iomarca ath-ionsú cnámh oistéaclaíoch.

2|ABHAIR AGUS MODHANNA

2.1|Ábhair

CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)(íonacht > 98 faoin gcéad ) a ceannaíodh ó Solarbio (Beijing, an tSín) agus ullmhaithe ag tiúchan stoic de 1 mM i saline maolánach fosfáit (PBS). Tá antasubstaintí sainiúil do c-Fos, CTSK, GSR, TRX1, NOS2, TRAF6, RANK, NFATc1, ERK, JNK, p38, fosfarylated (p)-ERK, p-p38, p-JNK, agus -actin fuarthas ó Santa Biteicneolaíocht Cruz (San Jose, CA). Táirgeadh antasubstaintí do V-ATPase d2 mar a cuireadh síos cheana (H. Feng et al., 2009). Fuarthas an córas measúnaithe 3-(4,5-dimethylthiazol-2-il)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS) agus luciferase ó Promega (Sydney, An Astráil). Ceannaíodh M-CSF athchuingreach ó R&D Systems (Minneapolis, MN). Cuireadh próitéin GST-rRANKL athchuingreach in iúl agus íonaithe mar a thuairiscítear roimhe seo (Xu et al., 2000).

2.2|Cultúr cille

Fuarthas cealla RAW264.7 (cealla macraphage luch) ó Bhailiúchán Cultúir Cineál Meiriceánach (ATCC, Manassas, VA) agus saothraithe i meán riachtanach íosta modhnaithe (Thermo FisherScientific, Scoresby, An Astráil) arna fhorlíonadh le 10 faoin gcéad bólachta féatais, 2 mM de L-glutamine , 100 U/ml peinicillin, agus 100 ug/ml de streptomycin (meán iomlán). Rinneadh monaicítí díorthaithe smeara (BMManna) a leithlisiú ó lucha C57BL/6J 6 seachtaine d’aois, a bhí euthanaithe de réir nósanna imeachta arna gceadú ag Coiste Eitice Ainmhithe Ollscoil Iarthar na hAstráile (RA/3/100/1244). deighilte saor ó fhíocháin bhoga agus sruthaíodh an smior ón femur agus an tibia, a saothraíodh ansin i meán iomlán i láthair M-CSF (50 ng/ml).

2.3|Measúnacht osteoclastogenesis

Plátáladh BMManna isteach i bplátaí saothraithe 96-tobar ag dlús 6 × 103 cealla in aghaidh an tobair agus déileáladh leo le meán iomlán ina raibh M-CSF (50 ng / ml) agus GST-rRANKL (100 ng / ml), i láthair nó in éagmais. tiúchain éagsúla CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd). The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells (>aithníodh trí núicléas) mar oistéaclaistí.

2.4|Measúnachtaí citotocsaineachta

Síolaíodh BMManna isteach i bplátaí 96 tobar ag 6 × 103 cill in aghaidh an tobair agus fágadh iad thar oíche chun cloí leo. An lá dár gcionn, gor na cealla le tiúchain éagsúla CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd). Tar éis 48 uair eile, cuireadh an tuaslagán MTS (20 µl/tobar) leis agus gor é le cealla ar feadh 2 uair. Socraíodh an absorbanceat 490 nm le léitheoir microplate (MultiscanSpectrum; Thermo Labsystems, Chantilly, VA.

2.5|Staining imdhíonfluaraiseacha

Síolaíodh BMManna ag dlús 6 × 103 cealla in aghaidh an tobair i láthair M-CSF (50 ng/ml) thar oíche. Spreagadh cealla ansin le M-CSFand GST-rRANKL (100 ng/ml) go dtí gur foirmíodh osteoclasts aibí. Ansin déileáladh le teisteoclastanna le tiúchain éagsúla CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)ar feadh 48 uair an chloig roimh shocrú le 4 faoin gcéad paraformaldehyde, permeabilizing le 0.1 faoin gcéad Triton X-100-PBS, agus blocáil le 3 faoin gcéad albaimin serum buaibheach i PBS.Gor cealla ullmhaithe le rhodamine-chomhchuingeach phalloidin do 45 nóiméad sa dorcha le stain le haghaidh F-actin. Ansin nite cealla le PBS, núicléis frithdhaite le 4′,6-diamidino-2-feinilindól (DAPI), agus gléasta le clúdaigh chlúdaigh do mhicreascópacht chomhfhócasach.

2.6|Measúnacht ar ionsú hiodrocsapatite

Chun gníomhaíocht osteoclast a thomhas spreagadh BMManna (1 × 105 in aghaidh an tobair) saothraithe ar phlátaí atá brataithe le collagen sé-tobar (BD Biocoat; ThermoFisher Scientific) le GST-rRANKL (100 ng / ml) agus M-CSF (50 ng / ml). ) go dtí gur gineadh osteoclasts aibí (Zhou et al., 2016). Ansin scoiteadh cealla go réidh ón tuaslagán díthiomsaithe cille plateusing (Sigma-Aldrich) agus cuireadh líon comhionann oistéaclaistí aibí ar thoibreacha aonair plátaí 96-tobar brataithe inhidrocsapatite (Corning Osteoassay, Corning, NY). Goradh osteoclasts aibí i meán ina raibh GST-rRANKL agus M-CSF le nó gan CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)ag na comhchruinnithe sonraithe. Tar éis 48 uair an chloig, bhí leath de na toibreacha dhaite go himdhíon-histochemically le haghaidh gníomhaíochta TRAcP, mar a thuairiscítear thuas, toasses a dhéanamh ar líon na gceall ilnúicléithe in aghaidh an tobair. Rinneadh na toibreacha a bhí fágtha a thuar ar feadh 10 nóiméad chun cealla a bhaint agus chun na limistéir athshorbtha a cheadú. Tógadh grianghraif de limistéir athchóirithe faoi mhicreascópacht chaighdeánach éadrom agus úsáideadh na bogearraí Image J (Institiúidí Náisiúnta Sláinte, Bethesda, MD) chun céatadán an limistéir hiodrocsaapaitít a d'athshocraíonn na hoistéaclasta a chainníochtú.

2.7|Measúnachtaí tuairisceora Luciferase

Chun imscrúdú a dhéanamh ar ghníomhachtú trascríobh NFATc1, aistríodh cealla RAW264.7 go cobhsaí le tógáil tuairisceora luciferasere-fhreagrach NFATc1 (Cheng et al., 2018; van der Kraan et al., 2013). .5 × 105 cill in aghaidh an tobair agus réamhchóireáilte le tiúchain éagsúla CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)ar feadh 1 uair. Tar éis na réamhchóireála, spreagtar cealla le GST-rRANKL (100 ng/ml) ar feadh 24 h, agus tomhaiseadh gníomhaíocht luciferase ag baint úsáide as an gcóras measúnaithe tuairisceora luciferase de réir phrótacal an mhonaróra (Promega).

2.8|Anailís chainníochtúil frithghníomhú slabhrach ais-trascríobh-polaiméire (RT-PCR).

Rinneadh RNA iomlán a leithlisiú ó chealla ag baint úsáide as imoibrí Trizol de réir phrótacal an déantóra (Thermo Fisher Scientific). Rinneadh DNA comhlántach a shintéisiú ag baint úsáide as transcriptase droim ar ais víreas leoicéime Moloney murine le 1 ug de theimpléad RNA agus primers oligo-dT. Rinneadh aimpliú imoibrithe Polymerasechain ar sheichimh shonracha ag baint úsáide as an gclár seo a leanas: 94 céim ar feadh 5 nóiméad, agus 30 timthriall de 94 céim ar feadh 40 s, 60 céim ar feadh 40 s, agus 72 céim ar feadh 40 s, agus céim síneadh deiridh 5 nóiméad ag 72 céim . Taispeántar an fhaisnéis mhionsonraithe maidir le primers sonracha i dTábla 1.Ríomhadh leibhéil RNA teachtaire coibhneasta trí normalú go dtí léiriú na géine coimeádta Hmbs.

2.9|Anailís blot an Iarthair

Saothraíodh BMManna i meán iomlán le M-CSF i bpláta sé tobar agus spreagtha le GST-rRANKL (100 ng/ml) do na hamanna sonraithe. Réitíodh cealla i maolán lysis radai-imdhíonachta agus réitíodh próitéiní le leictreafóiréis glóthach dodeicile sulfáit-polaicrylamide sóidiam agus aistríodh chuig seicní polai(fluairíd vinilideéine) (GE Healthcare,Silverwater, An Astráil). Cuireadh bac ar na seicní i mbainne bearrtha 5 faoin gcéad ar feadh 1 uair an chloig agus ansin scrúdaíodh iad le hantasubstaintí príomhúla sonracha éagsúla agus iad ag croitheadh ​​go bog thar oíche ag 4 chéim. Níodh na scannáin agus ina dhiaidh sin gortha iad le antasubstaintí tánaisteacha comhchuingeacha horseradish peroxidase. Braitheadh ​​imoibríocht antashubstainte ansin le cemiluminescencereagent feabhsaithe (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) agus léirshamhlaithe le Image-quant LAS 4000 (GE Healthcare).

2. 10|Brath ROS incheallach

Braitheadh ​​leibhéil ROS incheallach ag baint úsáide as trealamh measúnaithe braite ROS ceallach diacetate 2′,7′-déchlorofluorescein (Abcam, Melbourne, an Astráil). Saothraíodh BMManna (5 × 103 cealla in aghaidh an tobair) i bplátaí toibreacha 96 agus déileáladh leo le RANKL (100 ng / ml), M-CSF (50 ng / ml), agus CDP ar feadh 72 uair. Rinneadh leibhéil ROS intracellular a thomhas ag baint úsáide as diacetate2′,7′-dichlorofluorescein, a ocsaídíonn go fluaraiseacha DCF i láthair ROS. Níodh cealla i maolán Hank agus goradh sa dorchadas ar feadh 30 nóiméad le 10 µM de DCFH‐DA. Fuarthas íomhánna trí úsáid a bhaint as micreascópacht chomhfhócasach.

2. 11|Anailísí staidrimh

Tá na sonraí go léir ionadaíoch ar thrí thurgnamh ar a laghad a rinneadh intrialach mura gcuirtear a mhalairt in iúl. Cuirtear sonraí in iúl mar mheán ± SD. Baineadh úsáid as anailís aontreo ar athraithis agus tástálacha Mac Léinn–Newman–Keulspost hoc ina dhiaidh sin chun tábhacht na ndifríochtaí idir torthaí a chinneadh, agus measadh go raibh p < 0.05="">

3|TORTHAÍ

3.1|Coscann CDP RANKL-ionduchtaitheoclastogenesis agus comhleá osteoclast

Chun a chinneadh an bhfuil CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)in ann foirmiú osteoclast RANKL-spreagtha a chosc, rinneamar measúnacht osteoclastogenesis den chéad uair ag baint úsáide as BMManna luch (Liu et al., 2013; Song et al., 2016). Déileáladh le BMManna le RANKL agus M-CSF ar feadh 5 lá le comhchruinnithe méadaithe CDP. Laghdaigh CDP líon na gceall ilnúicléithe TRAcP-dearfach nuair a tháinig tiúchan CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)bainte amach 5 µM nó níos airde (Fíor 1a,b). CDP a mheas(Cistanchefásachpolaisiúicríd)tocsaineacht agus deimhnigh nach raibh na torthaí seo ina léiriú ar bhás nó ar líon na gceall, rinneamar measúnacht MTS. Cuireadh cóireáil ar BMManna le RANKL agus M-CSF ar feadh 48 uair le dáileoga éagsúla CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd). Ní raibh aon éifeacht ag CDP ar iomadú BMM ag an tiúchan de 15 µMór níos lú (Fíor 1c).

Chun éifeachtaí CDP a thástáil(Cistanchefásachpolaisiúicríd)maidir le comhleá osteoclast, tionscnaíodh osteoclasts le cóireáil RANKL agus M-CSF, le dáileoga éagsúla CDP nó gan iad.(Cistanchefásachpolaisiúicríd). Rinneadh oistéclastanna a dhathú le rhodamine-phalloidinand DAPI chun líon na núicléas in aghaidh an oistéaclasta a mheas (Fíor 2a).(Cistanchefásachpolaisiúicríd)cóireáil (5–10 µM; Fíor 2b,c). Dá bhrí sin, CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)Bhí éifeachtaí coisctheacha aige ar osteoclastogenesis de bharr RANKL agus ar chomhleá osteoclast ar bhealach dáileog-spleách.

3.2|CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)maolaíonn sé gníomhaíocht aisghabhála osteoclastichidroxyapatite de bharr RANKL

Rinneadh measúnacht ar ionsú hiodrocsapatite chun éifeacht CDP a bhrath(Cistanchefásachpolaisiúicríd)ar fheidhm osteoclast (Fíor 3a). Tar éis gorlann 24, níor tháinig aon athrú ar líon na n-oistéaclasta in aghaidh an tobair agus laghdaíodh an limistéar ath-ionsú hiodrocsapatite go suntasach trí chóireáil le CDP 5 agus 10 µM i gcomparáid le grúpaí rialaithe (Fíor 3b,c). Léiríonn na torthaí sin an CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)tá éifeachtaí coisctheacha láidre aige ar fhoirmiú osteoclast agus ar ghníomhaíocht osteoclastresorption gan aon éifeachtaí citotocsaineacha.

3.3|CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)inhibits osteoclast marcóir géineexpression

Imscrúdú breise a dhéanamh ar éifeachtaí coisctheacha CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)ar osteoclastogenesis agus resorption cnámh osteoclastic, déileáladh le BMMs le RANKL agus M-CSF ar feadh 5 lá le tiúchain éagsúla CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)Rinneadh .RT-PCR ansin chun léiriú géinte osteoclastmarker a bhrath. Chuir CDP bac ar léiriú Nfatc1, fachtóir trascríobh ríthábhachtach le linn osteoclastogenesis(Cistanchefásachpolaisiúicríd)ar mhodh dáileog-spleách (Fíor 4a). Ina theannta sin, CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)(5 agus 10 µM) íosrialáil slonn na ngéinte a bhaineann le hathionsú cnámh, lena n-áirítear Mmp9, Ctsk, agus Acp5 (Fíor 4b–d).

3.4|Sochtann CDP gníomhaíocht NFATc1 agus léiriú próitéine iartheachtacha

Scrúdú a dhéanamh ar éifeacht an CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)maidir le gníomhaíocht NFATc1 de bharr RANKL, rinneadh measúnacht tuairisceora aluciferase. Cóireáil le CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd), tiúchain de 5 µM agus níos airde, bac suntasach ar ghníomhaíocht NFATc1 de bharr RANKL (Fíor 5a). Ina theannta sin, léirigh anailís blot an iarthair go CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)faoi ​​chois go suntasach léiriú próitéine de NFATc1 agus c-Fos i BMManna atá cóireáilte le RANKL agus M-CSF ar feadh 3 agus 5 lá (Fíor 5b). Thairis sin, rinneadh íosrialáil ar léiriú próitéiní a bhaineann le feidhm osteoclast, mar V-ATPase-d2 agus CTSK, i láithreacht CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)i gcomparáid le grúpaí rialaithe. Mar sin féin, ní raibh aon éifeacht ag CDP ar léiriú RANK (Fíor 5b).

3.5|Cuireann CDP léiriú na n-einsímí frithocsaídeacha chun cinn chun táirgeadh ROS a scamhadh le linn osteoclastogenesis de bharr RANKL

Chun iniúchadh a dhéanamh ar an meicníocht bhunúsach de chosc osteoclastogenesis CDP-spleách, déileáladh le BMMs le RANKL (100 ng / ml) agus M-CSF (50 ng / ml) mar aon le PBS nó CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)ar feadh 72 uair an chloig. Rinneamar scrúdú ar éifeacht CDP ar tháirgeadh ROS infhéitheach arna spreagadh ag RANKL. Méadaíodh leibhéil ROS incheallacha trí chóireáil RANKL, a mhaolaigh CDP (5 agus 10 µM; Fíor 6a). Laghdaíodh líon na gceall ROS-dearfach agus déine staining ROS le cóireáil CDP ar mhodh dáileog-spleách (Fíor 6b, c). Léirigh anailís blot an Iarthair go CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)chuir sé léiriú thioredoxin (TRX1) agus glutathione reductase (GSR) chun cinn agus ag an am céanna cuireadh an slonn ocsaíd nítreach induchtaithe synthase (NOS2) i BMManna ar cuireadh cóireáil orthu le RANKL agus M-CSF ar feadh 3 lá (Fíor 6d).

Chun CDP a fhiosrú tuilleadh(Cistanchefásachpolaisiúicríd)difreáil osteoclast faoi chois trí tháirgeadh ROS a laghdú, ansin chaitheamar le BMManna le sárocsaíd (10 µM) chun aithris a dhéanamh ar stádas ard ROS i gcealla. D'eascair BMManna ag RANKL agus M-CSF ar feadh 3 lá agus léirigh torthaí anailís westernblot agus RT-PCR gur chuir sárocsaíd chun cinn léiriú NFATc1 agus c-Fos i gcomparáid leis na grúpaí rialaithe. Ag teacht leis na torthaí i bhFíor 5, cuireadh léiriú NFATc1 agus c-Fos faoi chois ag CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)agus sháraigh sárocsaíd éifeacht coisctheach CDP (Fíor 6e,f). Thug na sonraí seo le fios go ndearna CDP athbhrú ar léiriú NFATc1 agus c-Fos trí tháirgeadh ROS a scamhadh.

3.6|CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)represses cosáin MAPK le linn osteoclastogenesis RANKL-spreagtha

Ansin, rinneamar imscrúdú ar éifeacht CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)cóireáil ar léiriú RANKL-mediatedTRAF6 agus gníomhachtú conair MAPK. Tar éis goir meán saor ó shéiream ar feadh 2 hr, spreagadh BMManna le RANKL, gan CDP, ar feadh 60 nóiméad. Ní raibh aon éifeacht ag spreagadh le CDP (10 µM) ar shloinneadh TRAF6 agus ar phosphorylation caolaithe de JNK2 agusERK1/2 ag 10 agus 20 nóiméad (Fíor 7). Ina theannta sin, chuir CDP bac suntasach ar fhosfarylation p38(Cistanchefásachpolaisiúicríd)cóireáil 60 nóiméad i gcomparáid le grúpaí rialaithe (Fíor 7). Léiríonn na sonraí seo an CDP sin(Cistanchefásachpolaisiúicríd)shochtann sé cosáin chomharthaíochta MAPK spreagtha ag RANKL, i gcomhréir lena éifeacht coisctheach ar fhoirmiú agus ar ghníomhaíocht osteoclast.

4|PLÉ

Mheall Cistanche, ar a dtugtar "ginseng Desert," go mór aird le déanaí mar gheall ar a chumas díolúine a mhodhnú agus gníomhú cosanta ag dul in aois agus strus ocsaídiúcháin (Jia et al., 2012; Snytnikovaet al., 2012). Tá sé léirithe go gcuireann gliocóisídí arna n-ionadú feinilpropanoid, na comhpháirteanna móra gníomhacha de Cistanche, bac ar NOghníomhaíocht i macrófagáin (Ahn, Chae, Chin, & Kim, 2017). Ina theannta sin, aCistanchelaghdaigh sliocht strus ocsaídiúcháin i miócairdiam athfhruiliú tar éis an ischemia agus bhí ról suntasach aige i gcosc ar bhealaí apoptotic as a dtiocfaidh cardioprotection (Yu, Li, & Cao, 2016). Mar chomhpháirt thábhachtach de Cistanche,CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)tá éagsúlacht feidhmeanna cógaseolaíochta aige. Fuair ​​​​ár staidéar reatha amach go ndearna CDP athbhrú ar dhifreáil osteoclast gníomhachtaithe RANKL agus gníomhachtú trí tháirgeadh ROS a mhaolú chomh maith le gníomhachtú NFAT agus MAPK.

Mar phosphatase aigéadach, tá TRAcP ann i gcealla éagsúla agus tá sé flúirseach in osteoclasts agus macrophages alveolar (Snipes, Lam, Dodd, Gray, & Cohen, 1986). Is einsím tréithiúil d’osteoclasts é TRAcP agus tá dlúthbhaint ag a léiriú le feidhm osteoclast, a mheastar a bheith mar tháscaire ar ghníomhaíocht osteoclast agus ar ionsú cnámh (Minkin, 1982). Inour staidéar, CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)bac ar líon na gcealla TRAcP-dearfach, rud a thugann le fios gur chuir CDP bac ar osteoclastogenesis de bharr RANKL(Cistanchefásachpolaisiúicríd). Braitheann díghrádú maitrís cnámh ag osteoclasts ar chatepsin K (CTSK) agus MMPanna (Gruber, 2015). Anseo, rinne CDP íosrialáil suntasach ar léiriú géinte feidhmiúla osteoclast mar Mmp9, Ctsk, agus Acp5.

Rialaíonn ilbhealaí comharthaíochta idirdhealú agus feidhm oistéaclasta (Boyle, Simonet, & Lacey, 2003). Tar éis ceangal le RANK, earcaíonn RANKL próitéin oiriúntóra TRAF6 chun léiriú NFATc1 a ghníomhachtú, rud atá ina fhachtóir trascríobh tábhachtach le haghaidh foirmiú osteoclast, a dhéanann difear do léiriú géine osteoclast-shonrach, lena n-áirítear TRAcP agus CTSK (X. Feng, 2005; Takayanagi et al., 2002). Sa staidéar seo, fuair muid amach go CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)ní raibh aon éifeacht aige ar léiriú RANK agus TRAF6 in osteoclasts.Mar sin féin, CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)bac ar ghníomhachtú NFATc1 de bharr RANKL le linn osteoclastogenesis BMManna. Thairis sin, léiríodh gur chuir ROS, arna dtáirgeadh ag mitochondria i bpróiseas seachadta leictreoin, iomadú agus difreáil osteoclastanna agus díghrádú maitrís cnámh rialaithe chun cinn (Ha et al., 2004). Fuair ​​​​staidéar le déanaí gur spreag RANKL allmhairiú núicléach Bach1 agus maolaíodh táirgeadh einsím frithocsaídeach trí mheán Nrf2, rud a chuir le léiriú ROS intracellular agus osteoclastogenesis i lucha (Kanzaki et al., 2017). Ina theannta sin, tháinig méadú ar ghiniúint ROS incheallach trí fhoirmiú agus gníomhaíocht fheabhsaithe homocysteine ​​osteoclast (Koh et al., 2006). Fuair ​​​​ár staidéar amach gur laghdaigh CDP carnadh ROS in osteoclasts trí chosc a chur ar léiriú NOS2 agus léiriú einsímí frithocsaídeacha a chur chun cinn, mar shampla TRX1 agus glutathione reductase. NFATc1.Fuair ​​muid freisin gur sháraigh sárocsaíd éifeacht coisctheach léiriú CDPon NFATc1. Mar sin, tugann ár sonraí le fios go gcuireann CDP bac ar charnadhROS chun léiriú NFATc1 a chosc, agus ansin chun foirmiú agus feidhm a athbhrú.

Baineann ERK, JNK, agus p38 leis an teaghlach MAPK, a bhfuil baint aige freisin le rialáil na difreála osteoclast (Seger & Krebs, 1995). Gníomhaíonn RANKL an cosán MAPK trí phosphorylation of ERK, JNK, agus p38 (Mizukami et al., 2002). Thaispeáin muid an CDP sin(Cistanchefásachpolaisiúicríd)athbhrú ar fosfarylation RANKL-idirghabhála na bpríomhphróitéin sa chonair MAPK, rud a chuireann le héifeacht coisctheach CDPon léiriú géinte marcála osteoclast. Go bhfios dúinn, is é seo an chéad staidéar a léiríonn éifeachtaí coisctheacha CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)ar tháirgeadh ROS, NFAT, agus gníomhachtú MAPK, a ionadaíonn meicníochtaí nua gníomhaíochta CDP in vitro.

Go hachomair, léirigh muid an CDP sin(Cistanchefásachpolaisiúicríd)maolaíonn sé osteoclastogenesis agus ionsú hiodrocsapatite, agus slonn na géinte marcála osteoclast lena n-áirítear Ctsk, Mmp9, agus Acp5. CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)inchaite chun táirgeadh ROS trí mheán RANKL a chosc, chomh maith le gníomhachtú NFAT agus MAPK (Fíor 8). Le chéile, tugann ár dtorthaí le fios go bhfuil an CDP sin(Cistanchefásachpolaisiúicríd)féadfaidh sé ionadaíocht a dhéanamh ar dhruga iarrthóra chun cóireáil a dhéanamh ar riochtaí a bhaineann le osteoclast in éineacht le ró-tháirgeadh ROS.

FIGIÚR 8 Léaráid scéimreach den CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)feidhm i difreáil osteoclast. CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)cuireann sé cosc ​​ar tháirgeadh ROS arna spreagadh ag RANKL, chomh maith le gníomhachtú NFATc1 agus MAPK, mar sin cosc ​​ar osteoclastogenesis. CDP,Cistanchefásachpolaisiúicríd; MAPK, kinase próitéine gníomhachtaithe mitogen; NFATc1, fachtóir núicléach de chill T gníomhachtaithe; RANKL, gníomhaí receptor fachtóir núicléach κBligand; ROS, speiceas ocsaigin imoibríoch [Is féidir an figiúr datha a fheiceáil atwileyonlinelibrary.com]

BUÍOCHAS

Thacaigh Fondúireacht Eolaíochta Dúlra na Síne (81572164), an Clár Náisiúnta Taighde agus Forbartha Príomhtheicneolaíochta na Síne (2017YFC1103300), Bunús Eolaíochta Nádúrtha Cúige Guangxi (2016GXNSFAA380295), agus Tionscadal Taighde Eolaíochta agus Teicneolaíochta Ollscoil GuangxiProvince (KY2015) leis an staidéar seo. ). Faigheann sé tacaíocht i bpáirt freisin ag Tionscadal Plean Forbartha Taighde agus Teicneolaíochta GuangxiScientific (GKG13349003, 1598013-15), Ciste Bonneagair Taighde Leighis & Sláinte Iarthar na hAstráile, Fondúireacht Airtrítis na hAstráile, Duaiseanna Comhoibrithe Taighde Ollscoil Iarthar na hAstráile (UWA), agus na hAstráile Sláinte agus Leighis An Chomhairle Taighde (NHMRC, Uimh. 1107828 agus 1027932).

COIMHLINTÍ LEASA

Dearbhaíonn na húdair nach bhfuil aon choinbhleachtaí leasa ann

Ó:'Cistanchefásachpolaisiúicrídmaolaíonn sé osteoclastogenesis agus ionsú cnámh trí chomharthaíocht RANKL agus táirgeadh speiceas ocsaigin imoibríoch a chosc le Dezhi Song et al

---©2018 Wiley Periodicals, Inc. wileyonlinelibrary.com/journal/jcp J Cell Physiol. 2018; 233: 9674-9684