Próitéin Ró-GTPase Myosin MYO9A a Ghníomhachtaigh Mar Ghin Iarrthóra Úrscéalta Le haghaidh Glomerulosclerosis Deighilteach Focal Monogenic

joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Qi Li1 , Ashima Gulati2,6 , Mathieu Lemaire3,7 , Timothy Nottoli4 , Allen Bale3 agus Alda Tufro1,5

1 An Roinn Péidiatraiceach, Rannóg Neifreolaíochta, Scoil Leighis Yale, New Haven, Connecticut, SAM; 2 Roinn an Leighis Inmheánaigh, Rannóg Neifreolaíochta, Scoil an Leighis Yale, New Haven, Connecticut, SAM; 3 Roinn na Géineolaíochta, Scoil an Leighis Yale, New Haven, Connecticut, SAM; 4 Ionad Eagarthóireachta Yale Gene, Scoil an Leighis Yale, New Haven, Connecticut, SAM; agus 5 Roinn na Cille agus na Fiseolaíochta Móilíneach, Scoil Leighis Yale, New Haven, Connecticut, SAM

EOCHAIRFHOCAL: FSGS; idirghníomhaíocht Myo9A-actin-calmodulin; leagan MYO9A; Gníomhaíocht RhoA

Glomerulosclerosis deighleogach fócasach(FSGS) podocytopathy as a dtagann cliseadh duánach, agus is minic nach mbíonn réiteach ar a gcúis mhóilíneach. Anseo, déanaimid cur síos ar chaillteanas annamh MYO9A d’fheidhm sóchán heitrisigeach nonsense (p.Arg701*) mar rud a d’fhéadfadh cur le galair i bpéire deartháireacha nó deirfiúracha le teaghlaighFSGS/próitéiniúir. Sainaithníodh leaganacha MYO9A a raibh tábhacht éiginn leo trí sheicheamhú uile-exome i gcohórt 94 othar bithóipse-chruthaithe le FSGS. Is myosin neamhchoitianta é MYO9A le fearann ​​Rho-GAP a rialaíonn cóimeáil acomhal cille epithelial, trasnaisc, agus cuachta actin agus díghníomhaíonn sé an próitéin GTPase beag atá ionchódaithe ag géine RHOA. Tá baint ag gníomhaíocht RhoA le rialáil cytoskeleton ar fhoirmiú snáithíní strus actin agus conarthacht actomyosin. Braitheadh ​​Myo9A i podocytes luch agus daonna in vitro agus in vivo. Forbraíodh lucha cnocáin ag iompar an p.Arg701* MYO9A (Myo9AR701X) ginte ag eagarthóireacht géine

proteinuria, effacement podocyte, agusFSGS. Nocht duáin agus podocytes ó lucha mutant Myo9AR701X/D leordhóthanacht haploin Myo9A, méadú ar ghníomhaíocht RhoA, laghdaigh idirghníomhaíocht Myo9A-actin-calmodulin, ceangaltán podocyte lagaithe, agus imirce. Tugann ár dtorthaí le fios gur comhpháirt úrnua é Myo9A den ghaireas cítocnámharlach podocyte a rialaíonn gníomhaíocht RhoA agus feidhm podocyte. Mar sin, déanann lucha cnag-isteach Myo9AR701X/þ an feinitíopa FSGS proband a athfhoilsiú, léiriú gur sóchán FSGS is cúis le p.R701X Myo9A i lucha, agus tugann siad le fios go bhféadfadh sócháin heitrisigeach caillteanas-feidhme MYO9A foirm nua de cheannasaíocht uathshómach daonna a chruthú. FSGS. Mar sin, sainaithint pataigineach MYO9A

malairtí i ndaoine aonair breise le teaghlaigh nó treallachFSGSis gá chun a fháil amach an méid a chuireann géine le galair.

Ráiteas Aistritheach

Aithníonn an obair seo sóchán caillteanas feidhme myosin 9A (MYO9A) i dteaghlach a bhfuil próitéinúria agus scléaróis glomerular deighleogach fócasach (FSGS) agusMYO9A leagantábhacht éiginnte i gcohórt FSGS. Myo9A lucha cnag isteach p.Arg701* forbraíonn sóchán próitéine agusFSGS, feinitíopa na bhfógraí a atáirgeadh. Soláthraíonn an tsamhail nua ainmhithe seo léargais mheicníocha nua ar fheidhmeanna Myo9A i podocytes agus cuireann sé ar chumas teiripí turgnamhacha a thástáil le haghaidh FSGS. Tugann sonraí le fios go bhféadfadh sócháin MYO9A caillteanas feidhme heitrisigeach cur leFSGSpataigineas. Tá sé beartaithe againn MYO9A a áireamh i bpainéil tástála géiniteacha FSGS.

Glomerulosclerosis deighleogach fócasach(FSGS) le lesion histologach is féidir a bheith ina chúis le galar duánach ag deireadh-chéim.1 Léiríonn staidéir ghéiniteacha gur podocytopathy den chuid is mó é FSGS, toisc go gcuireann podocytes an chuid is mó de na géinte tsóiteáin cúiseacha in iúl.2,3 Mar sin féin, níl cúis mhóilíneach FSGS anaithnid. i níos mó ná leath de na cásanna.3 Mar sin, tá sainaithint géinte breise is cúis le FSGS agus a bpataigineas móilíneach ábhartha go cliniciúil. Anseo sainaithnímid myosin 9A (MYO9A) mar ghéin iarrthóra úrscéal le haghaidh FSGS daonna trí sheicheamh iomlán-exome (WES). Is é sprioc fhoriomlán an staidéir seo a chinneadh an athraíonn an t-athróg MYO9A annamh a aithníodh in othair feidhm podocyte agus an bhfuil sé ina chúis le FSGS in vivo. Ionchódaíonn MYO9A myosin neamhchoinbhinsiúnach, neamh-mhatánach nach raibh baint aige le galar duánach daonna roimhe seo.4 Tuairiscíodh sócháin MYO9A in othair airtreagripóis agus siondróm miotaséineach ó bhroinn.5,6 Is teaghlach de mhótair mhóilíneacha iad na mioisín a nascann actin chun fórsa agus gluaiseacht a ghiniúint agus a fhreastalaíonn ar chillíní iolracha. feidhmeanna, lena n-áirítear rialú gluaiseachta agus cruth, gáinneáil orgánail, agus comharthaíocht.7–9 Tuairiscíodh go bhfuil sócháin Myosin IIA (MYH9) agus myosin 1E (MYO1E) ina gcúis le galar glomerular agus cúlaitheach uathsómach FSGS.10-12 Aicme-9 cuimsíonn myosins MYO9A agus MYO9B a chuirtear in iúl ag cealla epithelial agus imdhíonachta, faoi seach.9,13 Is iad a ngnéithe sainiúla ceann amháin próiseasach a ghluaiseann ar F-actin agus fearann ​​eireaball gníomhachtaithe próitéin triphosphatase Rho-guanosine (Rho-GAP) a dhíghníomhaíonn. RóA. Cuirtear Myo9A mRNA in iúl i epithelium ependymal na hinchinne agus san epithelia testis, scamhóg, agus duáin.4 Forbraíonn lucha cnagála Myo9A hidreacephalus forásach, hidronephrosis éadrom, agus tubulopathy.14,15 In vitro Rialaíonn Myo9A tionól acomhal cille epithelial agus imirce cille comhchoiteann. 9 Rud atá tábhachtach, is leor Myo9A chun filiméid actin a thrasnasc agus a chúngú a spreagann bunú líonraí actin.16

Modhnaíonn RhoA dinimic actin podocyte agus coinníonn sé tréscaoilteacht glomerular.17 Tarlaíonn galar glomerular mar thoradh ar shuaitheadh ​​ar ghníomhaíocht Rho-guanosine triphosphatase (Rho-GTPase) i podocytes (athbhreithnithe i Mouawad et al.18). Is cúis le sócháin d’éifeachtóirí iartheachtacha (INF2)19 agus rialtóirí díthiomsaithe défhosfáit ró-guanóisín alfa (ARHGDIA)3 agus Rho-GAP24 (ARHGAP24) 20 proteinuria agus FSGS. Mar sin, mionchoigeartú arGníomhaíocht Rho-GTPaseríthábhachtach chun gnáth-fheinitíopa podocyte in vivo a chothabháil. 18

Tuairiscímid anseo gur próitéin podocyte úrnua é MYO9A, agus nuair a shóchnaítear i lucha í mar thoradh ar phróitéiniúir, ídiú próisis coise (FPE), agus FSGS, ag macasamhlú an fheinitíopa daonna a bhaineann leis an leagan p.Arg701* MYO9A. Nochtann ár dtorthaí ábharthacht Myo9A i podocytes, léiríonn siad go rialaíonn Myo9A podocyte RhoA, agus soláthraíonn siad an chéad fhianaise go bhfuil p.Arg701* Myo9A ina chúis le mífheidhmiú podocyte trí mhainneachtain rialáil diúltach a dhéanamh ar RhoA agus idirghníomhaíocht Myo9A-actin-calmodulin a laghdú.

cistéirféidirchóireáil galar duáinfeabhasfeidhm duánach

MODHANNA

WES

Rinneadh WES de shamplaí DNA ó 2 deirfiúracha agus 94 ábhar cohóirt ón Triail Chliniciúil Focal Deighilteach Glomerulosclerosis (FSGS-CT; NCT00135811) ag Ionad Yale um Anailís Géanóm agus Saotharlann Cliniciúil DNA Yale ar ardáin Illumina.21–26 An FSGS- Cohórt CT Ceistíodh tacar sonraí WES chun é a aithintMYO9A leaganle mionscortha minicíochta ailléil #{{{0}}.01 faoin gcéad le haghaidh leagan heitrisigeach agus #0.1 faoin gcéad do leagan homaisigeach agus comhdhúile heitrisigeach, arna measúnú ag baint úsáide as scóir bithfhaisnéisíochta MetaSVM, 27 SIFT, 28, agus CADD29. Deimhníodh leaganacha MYO9A le seicheamhú Sanger. Painéal géine de 64 géinte is cúis le FSGS bunaithe ar an OMIM, Inheritance Mendelian Online in Man, bunachar sonraí (omim.org), agus litríocht a bhaineann le "FSGS," "glomerular proteinuria," nó "siondróm nephrotic" (nó meascán de úsáideadh na téarmaí seo) chun leaganacha ábhartha a aithint.

Giniúint lucha knockin Myo9AR701X

Ghineamar Myo9AR701X lucha cnag-isteach le CRISPR/Cas9-eagarthóireacht ghéineasaithe.30 Tá modhanna iomlána san áireamh sna Modhanna Forlíontacha. Baineadh úsáid as comhghleacaithe bruscair de chineál fiáin Myo9AR701X, fireannach agus baineann, tar éis prótacail arna gceadú ag an gCoiste um Chúram agus Úsáid Ainmhithe Ionad Taighde Ainmhithe Yale.

Histeolaíocht/IF

Próiseáladh bithóipse duán daonna agus duáin luiche le haghaidh histeolaíocht, imdhíonfhluaraiseacht (IF), agus micreascópacht leictreoin tarchurtha (TEM) mar a thuairiscítear. Ba iad antasubstaintí príomhúla luch frith-MYO9A (clón 4C11; Abnova, Taipei, Taiwan), coinín frith-podocin (P0372; Sigma, St. Louis, MO), coinín frith-laminin (L9393; Sigma), coinín frith-aquaporin2 (PAS). -78809; Invitrogen, Carlsbad, CA), agus frith-megalin coinín; bhí 33 antasubstaint thánaisteach Alexa Fluor-488 agus 594-comhchuingeach (Invitrogen). Fuarthas íomhánna trí úsáid a bhaint as micreascóp comhfhócasach Olympus IX71 (Olympus Corp, Shinjuku, an tSeapáin) nó Leica SP5-Spectral (Leica Camera, Wetzlar, an Ghearmáin).

Imdhíonblot/imdhíon-fhrasadh

Réitíodh próitéiní le leictreafóiréis glóthach dodeicil sulfáit-polyacrylamide sóidiam agus imdhíonblotáilte mar a thuairiscítear roimhe seo; 31,32 le frith-MYO9A (clón 4C11), actin (A2066; Sigma), calmodulin (EP799Y; Abcam, Cambridge, UK), glyceraldehyde{{ 9}}fosfáit dehydrogenase (6C5; Millipore Corp, Burlington, MA), RhoA (67B9; Teicneolaíocht Comharthaíochta Cille, Beverly, MA) antasubstaintí príomhúla. Rinneadh coimmunoprecipitation mar a thuairiscítear,34,35 le frith-MYO9A antashubstaint polachlónúil coinín (A305-702AM; Bethyl Laboratories, Montgomery, TX), agus imdhíonblotting ina dhiaidh sin

cisteán le haghaidh glomerulosclerosis deighleogach Focal

PCR cainníochtúil

Trascríobhadh RNA iomlán droim ar ais ag baint úsáide as trealamh Sintéise iScript cDNA (Saotharlanna Bith-Rad, Hercules, CA), méadaithe le primers iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad), agus Myo9A imoibriú slabhra polaiméire (PCR): 50 TCTGAGAAGTAGCAGGAATGC-30 agus 50- AGAACCACAGCTCTGAAA-30 ag baint úsáide as CFX96-Teagmháil-Fíor-Ama-PCR (Bith-Rad). Normalaíodh myo9a mRNA go GAPDH mRNA leis an modh 2-DDCt, mar a thuairiscítear.36

micreascópacht TEM/imdhíonleictreon

Rinneadh TEM mar a thuairiscítear.32 Maidir le immunogold EM, socraíodh duán luch fiáin de chineál, múchadh, blocáladh crió-ghearrthacha ultra-tanaí, agus goraíodh iad le antashubstaint phríomhúil frith-MYO9A (clón 4C11). Ba é an antashubstaint thánaisteach ná IgG frith-luch coinín, ba é an comhchuingeach óir gabhar-frith-coinín 10 nm ór. Rinneadh na codanna a iarshocrú, a dhathú agus a scrúdú ar FEI Tecnai Biotwin (LaB6, 80 kV) TEM.

Aonrú podocyte bunscoile agus measúnachtaí feidhmiúla

Rinneadh podocytes a leithlisiú ó duáin de chineál fiáin agus Myo9AR701X/þ mar a thuairiscítear34 gan mórán modhnuithe. Rinneadh 37,38 measúnuithe greamaitheachta mar a thuairiscítear agus a cainníochtaíodh ag baint úsáide as staining criostail Violet.37

Myo9A cnag síos

Spreagadh cnagadh Myo9A (Myo9AKD) i podocytes lucha neamhbhásaithe de chineál fiáin ag baint úsáide as RNA cur isteach beag Myo9A (siRNA) (L-006539-ON-TARGETplus, Dharmacon; Horizon Discovery, Cambridge, UK) de réir threoracha an déantóra. Podicítí agus podocytes neamhaistrithe arna n-aistriú le siRNA neamh-spriocdhírithe (D-001810-10-Rialú Neamh-Spriocdhírithe ON-TARGETplus, Dharmacon) a bhí mar rialuithe.

Figure 1 | Heterozygous nonsense MYO9A mutation in a family with focal segmental glomerular sclerosis (FSGS)/proteinuria. (a) A novel heterozygous single base-pair mutation that leads to a stop codon in exon 14 of MYO9A c.C2101T: p.R701X (p.Arg701*) in a patient with proteinuria and FSGS. Nucleotide sequence traces show the C>T sóchán roinnte ag probhanna, deirfiúr agus máthair (barr, léirithe ag *) agus seicheamh cineál fiáin (WT) ón athair (bun), bunaithe ar sheicheamh tagartha daonna MYO9A NM_006901.4. (b) Léiríonn bithóipse duán ón bplóg FSGS agus insíothlú éadrom idir-stitial (aigéad peiriadach – stain Schiff, formhéadú bunaidh X 400). (c) Léiríonn an teaghlach géinitíopa leithscaradh géinitíopa-feinitíopa: daoine aonair a bhfuil malairt na bpróitéine/FSGS agus MYO9A p.R701X (siombailí soladacha), cineál fiáin (siombail folamh), nó géinitíopa anaithnid MYO9A (léirithe ag #). (d) Fearainn próitéine de chineál fiáin MYO9A (NP9.2): folaíonn fearann ​​mótair (liath) lúb 2 (buí) agus suíomh ceangailteach calmodulin (dearg), fearann ​​muineál (gorm), fearann ​​eireaball (bándearg). ) lena n-áirítear fearann ​​(glas) próitéiní gníomhachtaithe trí-guanóisín (Rho-GAP); tá teorainneacha fearainn léirithe ag uimhir iarmhair aimínaigéad; Críochnaíonn p.R701X MYO9A tuartha laistigh den suíomh ceangailteach calmodulin i lúb 2, gan na fearainn muineál agus eireaball, léiríonn réiltíní suíomh missenseMYO9A leagande shuntas anaithnid aitheanta. (e) Caomhnú éabhlóideach iarmhair aimínaigéad arna athrú ag missense MYO9A (ar lean)

Fíor 1|(ar lean) sócháin a aithníodh in othair le FSGS: MYO9A iarmhair athraithe p.D156G (p.Asp156) agus p.E765D (p.Glu765) (saigheada dearga) caomhnaithe go mór trí phylogeny. Uimhreacha aontachais: H. sapiens (NP_008832.2), M. musculus (NP_766606.2), R. norvegicus (NP_599162.1), G. gallus (XP Úsáideadh _015134553.1), D. rerio (E7EZG2.1), agus X. tropicalis (XP_002934596.2) le haghaidh ailíniú seicheamh iolrach MYO9A le Clustal Omega, EMBL-EBI (Bitheolaíocht Mhóilíneach Eorpach Saotharlann – An Institiúid Eorpach Bithfhaisnéisíochta, https://www.ebi.ac.uk/ Tools/MSA/clustalo/). Chun breathnú ar an íomhá seo a bharrfheabhsú, féach le do thoil ar an leagan ar líne den alt seo ag www.kidney-international.org.

Gníomhaíocht RhoA

Tomhaiseadh RhoA Gníomhach le measúnacht tarraingt anuas Ró-ghníomhachtú (Millipore) de réir threoracha an déantóra.39 Braitheadh ​​RhoA Gníomhach trí imdhíonadh.40

Anailís staitistiúil

Rinneadh anailís ar na sonraí trí úsáid a bhaint as bogearraí GraphPad Prism 8 (San Diego, CA) le tástáil t Mic Léinn gan péireáil le ceartúchán Welch nó anailís Welch ar athraithis, de réir mar ba chuí. Measadh go raibh P < 0.05="" suntasach="" go="">

TORTHAÍ

Aithint leaganacha MYO9A in othair le proteinuria agus FSGS

WES21 identified a rare truncating MYO9A mutation in 2 siblings diagnosed with FSGS/proteinuria at 15 and 14 years of age (Figure 1a), presenting with asymptomatic proteinuria w1 to 2 g/d, normal blood pressure, normal renal ultra-sounds, and estimated glomerular filtration rate of 72 and 96 ml/min per 1.73 m2, respectively. Renal biopsy performed on the index case showed FSGS, mild interstitial fifibrosis, and no tubular abnormalities (Figure 1b). The proband's disease progressed over 3 years: estimated glomerular filtration rate decreased to 46 ml/min per 1.73 m2 and proteinuria >2 g/ d while his sister's estimated glomerular filtration rate and proteinuria remained stable. Relevant family history includes a maternal uncle with chronic kidney disease of unknown etiology, a mother with a history of proteinuria and a healthy father, and no consanguinity (Figure 1c). WES revealed a shared nonsense heterozygous MYO9A (NM_006901 c.2101C>T, p.Arg701* ) in the siblings (Figure 1a). This rare MYO9A variant was identified in 1 of 113,632 alleles tested in the Genome Aggregation Database, or gnomAD (http://gnomad. broadinstitute.org), the allele frequency of 8.8 X 10–6. The parents' genotype revealed that only the mother is heterozygous for c.2101C>T, p.Arg701* MYO9A athraitheach, a thugann le fios go bhfuil ceannasacht uathshómach ar an sóchán (Fíor 1c). Níl géinitíopa ó uncail na máthar a bhfuil galar duáin ainsealach ar fáil. Táthar ag súil go gcaillfidh MYO9A p.Arg701* (p.R701X) feidhm mar gheall ar mheath mRNA neamh-idirghabhálaithe nó trí theascadh i lúb 2 d'fhearann ​​cinn MYO9A (Fíor 1d) atá ag teastáil chun Myo9A chun actin a thrasnasc .16 Léiríonn Tábla Forlíontach S1 gach leagan atá roinnte ag na siblíní. Níor aimsíodh aon sócháin i FSGS nó géinte is cúis le siondróm nephrotic a tuairiscíodh go dtí seo i gceachtar de na deirfiúracha (Tábla Forlíontach S2). Go bhfios dúinn, is í seo an chéad tuarascáil a nascann caillteanas feidhme MYO9A sóchán le galar duánach daonna.

Analysis of WES data from 94 FSGS patients (from the FSGS-CT cohort)41 identifified 5 unrelated individuals with heterozygous MYO9A missense variants (Table 1) meeting a minor allele frequency cutoff #0.01%; 2 of these individuals' MYO9A variants, p.Asp156Gly and p.Glu765Asp (Figure 1d), are predicted to be deleterious by at least 2 bioinformatics scores: MetaSVM, SIFT, and CADD >18;27–29 meastar na 3 leagan missense eile a bheith neamhurchóideach bunaithe ar 3 scór réamh-mheastacháin bhithfhaisnéisíochta. Is dócha go mbeidh feidhm ábhartha ag na aimínaigéid a chuirtear in ionad i leaganacha p.Asp156Gly agus p.Glu765Asp toisc go gcaomhnaítear na hiarmhair seo trí éabhlóid (Fíor 1e). D'aithníomar freisin othar amháin a raibh malairt athraitheach MYO9A aige (p.Arg2283His) nár chomhlíon ár gcritéir mhionmhinicíochta ailléil a tuairiscíodh roimhe seo i siondróm myasthenia ó bhroinn.6 Ní raibh aon sócháin pataigineacha nó malairtí díobhálacha i ngéinte FSGS/NS/proteinuria ina gcúis leo (Tábla Forlíontach S2 ) a aithníodh sna 5 dhuine aonair a raibh leaganacha MYO9A acu.

Léiriú MYO9A i podocytes agus galar glomerular

Braitheadh ​​abairt próitéin Myo9A trí imdhíonadh i duáin luiche agus i podocytes luch agus daonna (Fíor 2a). Dheimhnigh imdhíon-cheimic léiriú cíteaplasma MYO9A i podocytes daonna (Fíor 2b). Déantar Myo9A imdhíonghníomhach a bhrath le micreascópacht IF i glomeruli luiche, áit a ndéanann sé colocalize go páirteach le podocin (Fíor 2c). Sainmhíníonn lipéadú dúbailte agus micreascópacht chomhfhócasach logánú Myo9A feadh ghné sheachtrach an scannáin íoslaigh glomerular (GBM) go docht tadhlach nó comhlárnacha le podicín (Fíor 2d) agus laminín (Fíor 2e). Léiríonn Immunogold EM logánú beacht Myo9A. Déantar cáithníní óir a dháileadh i cíteaplasma an phróisis chos agus comhlacht cille podocyte (Fíor 2f agus g, Fíor Forlíontach S1B agus D). Tá diaphragms scoilte neamhlipéadaithe go haonfhoirmeach. Ní léiríonn cealla mesangial agus endothelial aon lipéadú suntasach. Braitear cáithníní óir freisin i gcealla tubule cóngaracha (Fíor Forlíontach S1C).

Chun a mheas an gcuirtear isteach ar léiriú Myo9A i ngalar glomerular, rinneamar scrúdú ar 2 mhúnla luiche a bhaineann le proteinuria raon nephrotic.31,32 Léiríonn lucha a fhorbairt le siondróm nephrotic de bharr overexpression Vegfa31 laghdú glomerular Myo9A (Fíor 3a). Ar an gcaoi chéanna, laghdaítear glomerular Myo9A i lucha le glomerulosclerosis diaibéitis chun cinn streptozotocin-idirghabhála mar gheall ar ró-eisiúint Vegfa,32 i gcomparáid le Myo9A a braitheadh ​​​​i lucha diaibéitis nach bhfuil ró-bhrú Vegfa (Fíor 3b) agus lucha neamh-diaibéitis (Fíor 2c). Tugann logánú próiseas coise podocyte Myo9A agus Myo9A glomerular laghdaithe sa dá mhúnla galair phróitéineach le fios go bhféadfadh ról a bheith ag Myo9A i bhfeidhm bhacainn scagacháin glomerular.

Tábla 1|Athraitheacha Missense MYO9A a aithníodh i gcohórt othar FSGS-CT

p.D156G, p.Asp156Gly; p.E765D, Glu765Asp; p.M2384V, p.Met2384Val; p.P1704S, p.Pro1704Ser; p.T389M, Thr389Met. Athróga scagtha ag mionmhinicíocht ailléil # 0.01 faoin gcéad , n ¼ 94 sampla tar éis anótála ANNOVAR.

lucha MYO9AR701X arna n-eagarthóireacht le géin chun FSGS a fhorbairt

Chun a chinneadh an bhfuil sóchán nonsense p.Arg701* (p.R701X) MYO9A ina chúis le galar glomerular i lucha ghineamar lucha p.Arg701* (ar a dtugtar Myo9AR701X anseo anseo) le CRISPR/Cas9-eagarthóireacht géine idirghabhála.30 Heterozygous Táirgeann Myo9AR701X/þ lucha mutant (Fíor 4a) laonna mutant inmharthana ar bhealach Mendelian, rud a léiríonn nach bhfuil an sóchán marfach ó thaobh na suathachta. Forbraíonn mutants homozygous hidreacephalus forásach (Fíor Forlíontach S2), ataxia, agus taomanna agus faigheann beagnach gach duine bás roimh 3 seachtaine d'aois, i gcuimhne do lucha Myo9A-null. go haosacht.

Forbraíonn gach lucha mutant Myo9AR701X FPE agus proteinuria, cé go bhfuil siad ag aoiseanna éagsúla. Léiríonn mutants homozygous Myo9AR701X/R701X glomeruli dysmorphic, dilatation feadánacha, agus castaí próitéine ar mhicreascópacht éadrom ag 2 sheachtain d'aois (Fíor 4b, Fíor Forlíontach S3A). Nochtann TEM de 2-duáin tsóiteáin Myo9AR701X/R701X seachtaine d'aois FPE fairsing, GBM tiubh agus neamhrialta, agus easpa scairt scoilte, a bhfuil acomhail greamaitheacha curtha ina n-ionad (Fíor 4d). I gcodarsnacht leis sin, taispeánann mutants 2-heitrisigeacha seachtain d’aois Myo9AR701X/þ gnáth-histaeolaíocht duánach agus ultrastruchtúir bhacainn scagacháin glomerular (Fíor 4c agus e), nach féidir a aithint ó chomhábhair bhruscair den chineál fiáin (Fíor 4f), arna dhearbhú ag cainníochtú na bpróiseas coise. (FP/mm GBM) (Fíor 4g). Braitear Albuminuria i samplaí fuail ó lucha mutant heitrisigeacha agus homozygous Myo9AR701X araon trí leictreafóiréis glóthach dodecyl sulfáit-polyacrylamide sóidiam (Fíor 4h) ag 2 sheachtain d'aois.

Ag 4 mhí d'aois, taispeánann lucha heitrisigeach Myo9AR701X/þ FSGS ar mhicreascópacht éadrom (Fíor 5a agus g) agus nochtann TEM FPE (saigheada bán), scairt neamhghnácha scoilte (saigheada gearra dubha), GBM neamhrialta, agus leathnú mesangial (Fíor 5b) . Léiríonn cainníochtú próiseas coise FPE suntasach i Myo9AR701X/þ i gcoinne duán fásta de chineál fiáin (Fíor 5c). Tá an feinitíopa glomerular seo an-chosúil leis an bhfeinitíopa a breathnaíodh i bithóipse duánach an phróbhanda (Fíor 1b). Tá cóimheasa i bhfad níos airde ag lucha heitrisigeacha fásta Myo9AR701X/þ albaimin-creatinine i bhfual ná i lucha de chineál fiáin de chineál aois-mheaitseála (Fíor 5d) agus níl aon fhianaise ann go bhfuil polyuria nó cailliúint meáchain acu (Fíor 5e agus f). Ar scrúdú tréimhsiúil aigéad-Schiff, léiríonn duáin fásta Myo9AR701X/þ FSGS de dhéine éagsúla (saigheada, Fíor 5g) agus easpa atrophy feadánacha agus dilatation nó infiltrates interstitial. Aimsíonn dé-lipéadú agus micreascópacht chomhfhócasach Myo9A i bhfeadáin chóngaracha, imeallach go meigilín (cinn saigheada, Fíor 5h, agus k), ach ní bhraitear Myo9A i ndeighleoga nephron distal a léiríonn aquaporin2 (Fíor 5h agus i). Is féidir lipéadú an dá mharcóir feadánacha i Myo9AR701X/þ fásta a aithint ó dhuáin fhiáine trí mhicreascópacht chomhfhócasach (Fíor 5h agus k agus i agus l). I gcodarsnacht leis sin, laghdaítear staining Myo9A i bhfeadáin chóngaracha agus i glomeruli i Myo9AR701X/þ (Fíor 5h agus i) i gcoinne duáin de chineál fiáin (Fíor 5k agus l). Léiríonn na torthaí seo le chéile gur sóchán Myo9A i lucha is cúis leis an FSGS é p.Arg701*, a athchaomhnaíonn an feinitíopa agus an oidhreacht uathshómach cheannasach den leagan heitrisigeach MYO9A p.Arg701* a aithníodh sa phrobhanna.

Conas a dhéanann p. Arg701* Myo9A sóchán aslú FSGS?

D’úsáideamar Myo9AR701X lucha cnag-isteach chun pataigineas móilíneach FSGS de bharr sóchán p.Arg701* MYO9A a scrúdú. Laghdaíonn léiriú Myo9A i duáin Myo9AR701X knockin go suntasach i heitrisiogótaí agus tá sé neamhbhraite i homozygotes ag IF (Fíor 6a) agus imdhíonadh (Fíor 6b agus c). Rinneamar PCR cainníochtúil chun a mheas an dtarlaíonn nó nach dtarlaíonn haploinsufficiency idirghabháil ag nonsense mRNA decay42 i Myo9AR701X / þ mutants. Tá slonn Myo9A mRNA sna duáin Myo9AR701X/þ w50 faoin gcéad níos ísle ná i duáin de chineál fiáin (48.3 ± 5.6 faoin gcéad; P <0.0001) (fíor="" 6d),="" atá="" ag="" teacht="" le="">

Laghdaíonn Myo9A a idirghníomhaíocht le actin agus calmodulin

Scrúdaíomar cibé an athraíonn neamhdhóthanacht Myo9A idirghníomhú Myo9A-actin-calmodulin. Deimhníonn turgnaimh coimmunoprecipitation i gcomparáid le cineál fiáin agus duáin Myo9AR701X/þ agus podocytes idirghníomhaíocht Myo9A le actin agus le calmodulin agus léiríonn siad go laghdaítear idirghníomhaíocht Myo9A leis an dá phróitéin faoi w50 faoin gcéad i Myo9AR701X/þ duáin mutant agus podocytes (Fíor 6e agus f), a laghduithe cosúil leis an Myo9A fad iomlán. I gcodarsnacht leis sin, tá leibhéil slonn actin agus calmodulin fós slán (ionchur, Fíor 6e, agus f). Chun anailís a dhéanamh ar idirghníomhaíochtaí Myo9A maidir le léiriú laghdaithe, spreagamar w50 faoin gcéad Myo9AKD i podocytes lucha de chineál fiáin neamhbhásaithe ag baint úsáide as siRNA, arna measúnú ag PCR cainníochtúil agus imdhíonadh (Fíor 7a agus b), agus ansin rinneamar turgnaimh coimmunoprecipitation. Laghdaíonn Myo9AKD idirghníomhaíocht Myo9A-actin-calmodulin go comhréireach le slonn Myo9A (Fíor 7c). Le chéile, léiríonn torthaí coimmunoprecipitation go laghdaíonn sóchán heitrisigeach p.Arg701* Myo9A agus Myo9AKD flúirse Myo9A agus mar sin a idirghníomhú le actin agus calmodulin. Toisc go ndéanann Myo9A tras-naisc actin ag cóimheas molar 1:1,16 tugann ár sonraí le fios go bhféadfadh laghdú ar Myo9A i podocytes heitrisigeach Myo9AR701X/þ bac a chur ar thrasnascadh agus cuachadh actin trí mheán Myo9A.

Fíor 2|(ar lean) chuig podicín (glas) ar a thaobh GBM (cinn saighde). Léiríonn inset formhéadú níos airde. Barraí=25 mm. (e) Léiríonn micreascópacht chomhfhócasach Myo9A ag smálú go dlúth nó comhtheagmhálach le lannáin (glas) feadh ghné sheachtrach an GBM (insets agus ceann saighde). Barraí=25 mm. (f, g) Logánú micreascópachta leictreoin imdhíonachta de Myo9A i glomeruli na nduán fiáin de chineál luch: breathnaítear cáithníní óir (saigheada dubha) i gcorp na gceall podocyte (POD) agus cíteaplasma próisis na coise (FP), feictear roinnt cáithníní óir ag an mbonn FP in aice leis an membrane íoslach glomerular ach ní ag scairteanna scoilte. Barraí ¼ 500 nm. Chun breathnú ar an íomhá seo a bharrfheabhsú, féach le do thoil ar an leagan ar líne den alt seo ag www.kidney-international.org.

Méadaíonn sóchán Myo9AR701X gníomhaíocht Rho-A

Thomhaiseamar gníomhaíocht RhoA ag baint úsáide as measúnacht tarraingt anuas i lucha mutant Myo9AR701X agus fiáin de chineál, ag díriú ar Myo9AR701X/þ heitrisigeach chun léargas meicníoch a sholáthar ar an bhfeinitíopa daonna p.Arg701* MYO9A. Méadaítear RhoA gníomhach go suntasach i Myo9AR701X/þ duáin iomlána (Fíor 8a), glomeruli scoite (Fíor 8b), agus podocytes príomhúla (Fíor 8c), i gcomparáid leis na samplaí rialaithe de chineál fiáin comhfhreagrach. Tá méid an mhéadaithe GTP-RhoA i samplaí Myo9AR701X/þ sa raon ó w60 faoin gcéad i glomeruli iargúlta go dtí w2-fillte sna duáin iomlána agus i podocytes (Fíor 8a–c). Tá RhoA Gníomhach beagán níos airde i nduáin homaisigeacha ná mar atá sna duáin heitrisigeacha tsóiteáin ach níl an difríocht suntasach (Fíor 8a). Le chéile, léiríonn na turgnaimh seo go bhfuil Myo9AR701X ina chúis le gníomhaíocht RhoA méadaithe

Athraíonn sóchán Myo9AR701X/D agus Myo9AKD iompar podocyte

Chun measúnú a dhéanamh ar éifeacht idirghníomhaíocht lagaithe Myo9A-actin agus gníomhaíocht RhoA méadaithe a braitheadh ​​​​i podocytes mutant Myo9AR701X/þ ar a bhfeidhm, thomhaiseamar greamaitheacht podocyte agus motility ag baint úsáide as measúnachtaí ceangail agus imirce, ag déanamh comparáide idir cineál fiáin agus podocytes bunscoile mutant i gcoinníollacha rialaithe agus ar aghaidh. Cosc ar chomharthaíocht RhoA le inhibitor kinase Rho-choibhneasta Y27632. Léiríonn na turgnaimh seo go soiléir go gcuireann Myo9AR701X/þ isteach ar shoghluaisteacht podocyte (Fíor 8d; Fíor Forlíontach S4) agus ceangaltán podocyte (Fíor 8e) ar bhealach a bhraitheann ar ghníomhaíocht RhoA. Chun éifeachtúlacht haploinsithe Myo9A ar fheidhm podocyte a mheas go díreach, rinneamar measúnachtaí ceangail agus imirce i gcomparáid le podocytes lucha de chineál fiáin le podocytes Myo9AKD ag léiriú w50 faoin gcéad Myo9A mRNA agus próitéin (Fíor 7a agus b). D'fheidhmigh podocytes nach raibh cóireáilte le siRNA mar rialú breise orthu. Laghdaíonn Myo9AKD ceangaltán podocyte agus imirce go suntasach, an locht céanna a breathnaíodh i podocytes Myo9AR701X/þ (Fíor 8f agus g). I dteannta a chéile, léiríonn sonraí meicniúla go n-eascraíonn sóchán heitrisigeach p.Arg701* Myo9A go bhfuil leordhóthanacht haploin Myo9A as a dtagann laghdú ar idirghníomhaíocht Myo9A-actin-calmodulin agus méadú ar RhoA gníomhach sna duáin, go sonrach i podocytes. Léirímid, le chéile, go gcuireann na meicníochtaí seo isteach ar fheidhm podocyte, arna léiriú ag ceangaltán laghdaithe agus motility in vitro agus trí láithreacht proteinuria in vivo.

PLÉ

Aithníonn an staidéar seo Myo9A mar chomhpháirt nua den ghaireas podocyte cítea-chnámharlaigh a mbíonn tionchar aige ar fheidhm podocyte trí ghníomhaíocht RhoA a rialáil go diúltach. Déanaimid cur síos ar shóchán neamhchoitianta MYO9A (p.Arg701*) a bhaineann le

FSGS teaghlaigh/próitéiniúir agus a léiriú go bhfuil an sóchán seo ina chúis le loit cosúil le FSGS i lucha, ag tabhairt léargas ar mheicníocht an ghalair.

Tacaíonn ár dtorthaí leis an nóisean gur géine iarrthóra FSGS é MYO9A agus gur malairt athraitheach é p.Arg701* MYO9A a bhaineann le FSGS daonna, bunaithe ar threoirlínte Choláiste Géineolaíocht Leighis Mheiriceá chun cúisíocht a chur i leith trí úsáid a bhaint as halgartaim tuartha géine, minicíochtaí ailléil, samhlacha ainmhithe turgnamhacha. , agus measúnachtaí feidhmiúla.43,44 Níl aon sócháin ag na siblíní proband a bhfuil p.Arg701* MYO9A acu i ngéinte is cúis le FSGS ar eolas go dtí seo agus ní léiríonn siad aon fhianaise a thugann le tuiscint go bhfuil cúiseanna tánaisteacha le FSGS. Comhbhailítear an t-athraitheach seo i gcomhchineál beag tar éis patrún ceannasach uathshómach oidhreachta agus sainléiriú athraitheach. Tá MYO9A p.Arg701* tuartha mar mhalairt de chaillteanais feidhme, níl sé in easnamh ó exomes rialaithe, agus tá minicíocht ailléil aige<0.0001 in="" population="" databases,="" in="" compliance="" with="" american="" college="" of="" medical="" genetics="" standards="" to="" support="" pathogenicity="" and="" consistent="" with="" parameters="" used="" in="" a="" recent="" comprehensive="" report="" on="" genetic="" contributions="" to="" fsgs.43–45="" moreover,="" loss-of-function="" observed/expected="" upper="" bound="" fraction="" for="" myo9a="" is="" 0.3,="" suggestive="" of="" low="" tolerance="" to="" gene="" inactivation="" with="" a="" constraint="" similar="" to="" genes="" known="" to="" cause="" autosomal="" dominant="" fsgs="" (e.g.,="" wt1,="" 0.25="" or="" inf2,="">

Shainaithin scagthástáil WES ar chohórt mór leanaí agus daoine fásta óga FSGS neamhghaolmhara41 2 othar le malairtí missense heitrisigeacha neamhchoitianta MYO9A (p.Asp156Gly agus p.Glu765Asp). Baineann an dá leagan missense MYO9A le hiarmhair an-chaomhnaithe, tá mionmhinicíochtaí ailléil acu<0.01%, are="" predicted="" to="" be="" deleterious="" and="" have="" not="" previously="" been="" associated="" with="" human="" disease.="" three="" additional="" myo9a="" missense="" variants="" (thr389met,="" p.pro1704ser,="" p.met2384val)="" identified="" in="" this="" fsgs="" cohort="" were="" deemed="" benign="" by="" bioinformatics="" scores.="" these="" 5="" individuals="" do="" not="" carry="" mutations="" in="" known="" fsgs-causing="" genes.="" for="" clinical="" purposes,="" these="" missense="" variants="" should="" be="" considered="" variants="" of="" unknown="" significance="" given="" the="" absence="" of="" experimental="" data="" evaluating="" how="" they="" impact="" myo9a="" function.43,44="" to="" our="" knowledge,="" no="" myo9a="" mutation="" has="" been="" proven="" to="" cause="" a="" specific="" human="" disease="" by="" american="" college="" of="" medical="" genetics="" guidelines.43,44="" association="" of="" compound="" heterozygote="" missense="" myo9a="" variants="" (p.g2282e="" and="" p.y203c)="" with="" arthrogryposis="" was="" reported="" in="" 1="" patient,5="" and="" compound="" heterozygote="" or="" homozygote="" missense="" myo9a="" variants="" (p.r1517h/p.r2283h="" and="" p.d1698g,="" respectively)="" were="" described="" in="" association="" with="" congenital="" myasthenia="" syndrome.6="" a="" nonsense="" homozygous="" myo9a="" (p.r513x)="" was="" associated="" with="" severe="" ventriculomegaly="" and="" fetal="" demise.47="" elegant="" expression="" studies="" support="" a="" role="" for="" myo9a="" at="" the="" neuromuscular="" junction="" and="" its="" intriguing="" regulation="" of="" agrin="" secretion="" and="" actin="">

Fíor 3|Léiriú glomerular Myo9A i múnlaí luch galar glomerular. (a) Siondróm nephrotic forbraíochta de bharr ró-eisimirce Vegfa31: léiríonn imdhíonfhluaraiseacht Myo9A (dearg) i glomeruli ó lucha gnáth, neamhspreagtha 2-seachtain d’aois agus laghdaigh slonn Myo9A go soiléir i glomeruli ó lucha nephrotic a dhéanann ró-léiriú ar Vegfa, agus podocin (glas) gan athrú. (b) Diaibéiteas streptozotocin-spreagtha le nó gan ró-eisiúint Vegfa32: aimsíonn imdhíonfhluaraiseacht Myo9A (glas) i glomeruli ó dhuáin dhiaibéiteacha neamhspreagtha (rialú DM) agus laghdaigh Myo9A imdhíon-imoibríocha go suntasach i glomeruli ó lucha diaibéitis a ró-bhrú Vegfa (glomerulosced diaibéiteach) a fhorbraíonn diaibéitis 40, taispeánann 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (gorm) núicléis ón dá chuid le glomeruli imlínithe (líne bhán hatáilte). Barraí=50 mm. Chun breathnú ar an íomhá seo a bharrfheabhsú, féach le do thoil ar an leagan ar líne den alt seo ag www. duáin-idirnáisiúnta.

Figure 4 | Genotype and phenotype analysis of knockin Myo9AR701X mice at 2 weeks of age. (a) Sanger sequencing traces and deduced amino acid sequences from exon 14 are shown from mutant mice: heterozygous (Het) Myo9AR701X/þ (top), homozygous (Hom) Myo9AR701X/R701X (middle), and wild-type (WT) littermate (bottom). C>Cuireann T sóchán ionad ar ionchódú CGA Arg (R) le TGA, stopchód a thuar go gcuirfear deireadh le haistriúchán ag aimínaigéad 701. (b) Taispeántar glomeruli neamhghnácha, dilatation feadánach, agus teilgin próitéine le stain aigéad tréimhsiúil ionadaíoch – stain Schiff ó 2-duáin shóiteáin homozygous Myo9AR701X/R701X seachtaine d’aois. Barra=20 mm. (c) Aigéad peiriadach ionadaíoch – Léiríonn smal Schiff ó 2-duán heitrisigeach Myo9AR701X/þ seachtaine d’aois gnáth-histol. Barra=20mm. (d) Léiríonn micreascópacht leictreoin tarchuir ionadaíoch ó 2-Myo9AR701X/R701X glomerulus seachtaine d'aois éascadh ollmhór próiseas na coise (saigheada bána), easpa scairt scoilte, acomhail greamaitheacha (saigheada dubha) ina n-ionad, agus íoslach glomerular tiubhaithe, neamhrialta membrane (GBM). Barra =1mm. (e) Léiríonn micreascópacht leictreoin tarchuir ionadaíoch ó 2-heitrisigeach Myo9AR701X/þ seachtain d’aois, gnáthphróisis na coise (saigheada tanaí dubha) agus gnáth-dhiaphragms scoilte (saigheada tanaí bána). Barra =1mm. (f) Léiríonn micreascópacht leictreoin tarchurtha ó 2-bhruscar WT seachtain d'aois gnáth-bhacainn scagacháin glomerular: próisis tanaí chos nasctha ag scairteanna scoilte, cealla inothelial fuinneoga (ECanna), agus GBM tanaí. Barra =1mm. (g) Cainníochtú íslithe próisis coise ag 2 sheachtain d'aois: léiríonn duáin homozygous Myo9AR701X/R701X próisis níos lú ná próisis leathchosa (FPanna)/mm GBM ná WT nó bruscair heitrisigeach Myo9AR701X/þ, rud a thugann le fios dianphróiseas na coise. P < 0.0001="" (anailís="" athraitheas).="" (h)="" léiríonn="" samplaí="" fuail="" réitigh="" leictreafóiréis="" glóthach="" dodeicil="" sulfáit-polyacrylamide="" gorm="" stainse="" gorm="" coomassie="" de="" albaiminiúir="" (alb)="" i="" myo9ar701x/r701x="" (="" móide="" )="" agus="" myo9ar701x/þ="" (þ/="" móide="" ),="" agus="" tá="" fual="" wt="" saor="" ó="" albaimin.="" feidhmíonn="" albaimin="" serum="" bó="" (10="" mg)="" mar="" rialú="" meáchain="" mhóilíneach.="" pod,="" podocyte.="" chun="" breathnú="" ar="" an="" íomhá="" seo="" a="" bharrfheabhsú,="" féach="" le="" do="" thoil="" ar="" an="" leagan="" ar="" líne="" den="" alt="" seo="" ag="">

Fíor 5|Anailís feinitíopa lucha heitrisigeacha fásta{{20}}1X/D. (a) Léiríonn stain aigéadach tréimhsiúil ionadaíoch-Schiff (PAS) ó 4-duán Myo9AR701X/þ de mhí d'aois glomerulus le scléaróis glomerular deighleogach fairsing agus iomadú méiseangach. Barra=50 mm (b) Léiríonn micreascópacht leictreoin tarchuir ionadaíoch ó 4-duán Myo9AR701X/þ de mhí d'aois éascadh fairsing próiseas na coise (saigheada bána), ionadú páirteach scairt scoilte (saigheada tanaí dubha) ag acomhail chloí. (saigheada dubha tiubha). Barra =2 mm (c) Cainníochtú íslithe próisis coise i lucha fásta Myo9AR701X/þ mutant: 4 mhí d'aois heitrisigeach (Het) Myo9AR701X/ þ taispeáin 2.2±0.06 FP/mm, i gcomparáid le cineál fiáin (WT ) 3.7±0.13 FP/mm. ****P<0.0001. (d)="" urine="" (u)="" albumin/creatinine="" (creat)="">

Figure 5 | (continued) ratio at 4 months of age is higher in Myo9AR701X/þ (Het, red dots) than in WT mice (black dots). ***P>0.001. (e) Níl difríocht idir toirt na fual (24 uair) agus (f) meáchan coirp i lucha WT (n=18) agus Myo9AR701X/þ (Het, n=16). (g,j) stain ionadaí PAS ó Myo9AR701X/þ (g) agus WT (j) duáin: (g) taispeánann sé scléaróis fócasach luath (saigheada) agus iomadú mesangial in 2 glomeruli, gnáth-feadán droma le droma agus gan aon infiltrates; (j) a thaispeánann glomeruli gnáth agus feadáin i duáin WT. Barraí=50 mm. (h,k) Micreascópacht chomhfhócasach ar fhluaraiseacht imdhíonachta Myo9A/ Megalin: (h) léiríonn duán Myo9AR701X/þ comhartha teoranta Myo9A (dearg) (cinn saighde) i gcealla feadánacha cóngaracha atá lipéadaithe le meigilín (glas), ní dhéantar na feadáin chóngaracha a chaolú; (k) Léiríonn duán WT Myo9A (cinn saighde) níos flúirseach atá tadhlach le meigilín i gcealla tubule cóngaracha. Barraí=25 mm. (i,l) Micreascópacht chomhfhócasach d’imdhíonfhluaraiseacht Myo9A/Aquaporin2 (AQP2): (i) Léiríonn duáin Myo9AR701X/þ teoranta Myo9A (dearg) sna glomerulus (cinn saighde), ní bhraitear Myo9A i ndeighleoga neifrónacha distal atá lipéadaithe le AQP2 (glas) , nach bhfuil dilated; (l) Léiríonn duán WT staining Myo9A sa glomerulus agus smálú AQP2 i míreanna nephron distal. Barraí=25 mm. CE, cill endothelial; FP, cíteaplasma próisis chos; GBM, membrane íoslach glomerular. Chun breathnú ar an íomhá seo a bharrfheabhsú, féach le do thoil ar an leagan ar líne den alt seo ag www.kidney-international.org.

Fíor 6|Myo9A abairt agus idirghníomhú Myo9A-actin-calmodulin i Myo9AR701X cnag-i duáin agus podocytes. (a) Aimsíonn imdhíonfluaraiseacht Myo9A glomerular agus podocin: Tá imdhíonacht glomerular Myo9A (dearg) láidir i nduáin de chineál fiáin (WT), laghdaítear go suntasach i Myo9AR701X/þ glomeruli, agus ní bhraitear i Myo9AR701X/R701X glomeruli; logálann podocin (glas) go podocytes i lucha go léir; Taispeántar colocalization páirteach podocyte-Myo9A trí chumasadh (buí). Barraí=50 mm. (b) Imdhíonadh: laghdaítear slonn slán Myo9A (280 kDa) go thart ar leath sna duáin Myo9AR701X/þ (heitrisigeach [Het]) agus ní bhraitear é i Myo9AR701X/R701X (homosygous [Hom]) duáin, * bandaí níos lú<75 kda)="" are="" considered="" nonspecific,="" w50="" kda="" bands="" correspond="" to="" igg="" heavy="" chain="" in="" all="" genotypes.="" (c)="" myo9a/actin="" quantification="" (mean±sd),="" n="3" independent="" experiments,="" pool="" from="" 3="" mice="" each.=""><0.001. (d)="" quantitative="" polymerase="" chain="" reaction="" (qpcr):="" myo9a="" mrna="" expression="" normalized="" to="" gapdh="" mrna,="" fold="" change="" (mean±sd),="" n="3" independent="" experiments,="" n="3" individual="" mice="" each.="">< 0.0001.="" (e,f)="" coimmunoprecipitation="" (ip)="" of="" kidney="" lysates="" (e)="" and="" primary="" podocytes="" (f)="" show="" decreased="" myo9a-actin-calmodulin="" interaction="" in="" myo9ar701x/þ="" (het)="" proportionally="" to="" the="" reduced="" myo9a="" expression="" (input);="" note="" input="" of="" actin="" and="" calmodulin="" is="" equal="" in="" both="" genotypes.="" ab,="" antibody.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">

We demonstrate Myo9A protein expression in podocyte cell lines and mouse kidney glomeruli and Myo9A subcellular localization in podocytes. Dual immunolabeling and confocal microscopy localized Myo9A along the external aspect of the GBM stained by laminin, tightly contiguous to podocin. Immunogold EM determined precisely Myo9A localization to the cytoplasm of foot processes and podocyte cell bodies, leaving slit diaphragms unlabeled. The apparent Myo9A mesangial localization in nonconfocal IF images was not confirmed by immunogold EM. Our findings are consistent with glomerular MYO9A immunohistochemical localization in human renal biopsies (www.proteinatlas.org/ ENSG00000066933-MYO9A/tissue/kidney). Myo9A was also detected in proximal tubules by IF and immunogold-EM, extending a previous report that did not detect Myo9A in glomeruli.15 The discrepancy in Myo9A tissue localization is probably due to different affinities of the primary antibodies used by Thelen et al.15 and in this study. Similar discrepancies in glomerular MYO9A staining of the same human renal biopsies were noticed using 2 affinity-purified polyclonal antibodies, the higher specificity antibody by protein array resulting in the stronger glomerular signal. Localization of Myo9A mRNA in the kidney by in situ hybridization has also been discrepant;4,15 Myo9A developmental regulation might be involved. RNA-sequencing data suggest Myo9A expression along with most nephron segments in mice and humans, raising the possibility that loss-of-function mutations may lead to phenotypes involving several cell types. Interestingly, we observed a clear decrease in glomerular Myo9A expression in 2 mouse models of proteinuria: developmental nephrotic syndrome and advanced diabetic disease. The latter is consistent with a >2-laghdú huaire ar léiriú Myo9A de réir eagair DNA a tuairiscíodh i bhfrancaigh diaibéiteacha Zucker.49 Le chéile, tugann sonraí slonn Myo9A le fios go bhféadfadh ról a bheith ag Myo9A sa bhacainn scagacháin glomerular.

Chun ábharthacht p.Arg701* MYO9A mutation nonsense in vivo a thuiscint ghineamar Myo9AR701X lucha cnag isteach trí eagarthóireacht géine. Forbraíonn mutants homozygous Myo9AR701X/R701X hidrocephalus forásach, rud a fhágann bás faoi 3 seachtaine d'aois cosúil le lucha Myo9A-null.14 Ag dhá sheachtain d'aois, nochtann na duáin homozygous Myo9AR701X/R701X feinitíopa glomerulo-feadánach trom: neamhghnáchaíochtaí fairsing FPE, GBM, agus ganntanas scoilt-dhiaphragms agus feadáin caolaithe, a bhaineann le halbaiminiúir. Thaispeáin lucha fásta Myo9A-null tubulopathy cóngarach, pola-uria, agus próitéine ar mheáchan íseal-mhóilíneach.15 Faraor, níor cuireadh aon sonraí ultrastructural glomerular san áireamh sa tuarascáil;15 ionadh 3- go 6-Myo9A mí d'aois -níl lucha nár ghéill do hidreacephalus forásach mar a thuairiscítear roimhe seo.14 Toisc nach mairfidh mutants homozygous Myo9AR701X/R701X go haosacht, ní féidir linn ach an feinitíopa glomerular luath a thuairiscítear anseo a fháil amach. D’fhéadfadh dilatation feadánach a breathnaíodh i 2-sóiteáin Myo9AR701X/R701X seachtaine d’aois fianaise luath a léiriú ar an tubulopathy a gcuirtear síos air i lucha Myo9A-null fásta.

Figure 8 | RhoA activity and podocyte function in Myo9AR701X kidneys and Myo9A knockdown (Myo9AKD) podocytes. (a–c) Active RhoA (guanosine triphosphate [GTP]–RhoA) is increased in Myo9A R701X mutants versus wild-type (WT): >2-fold in whole kidneys (a), w60% in isolated glomeruli (b), >2-huaire i podocytes príomhúla (c), blots an Iarthair ionadaíoch do n=3 go 4 thurgnamh neamhspleách, lísáití comhthiomsaithe ó 3 lucha an ceann, cainníochtú (meán±SD), anailís ar athraithis (ANOVA) (a ) nó t-tástáil gan phéire (b,c). *P<0.05,><0.001. (d)="" podocyte="" migration="" assay="" (wound="" assay)57:="" quantification="" of="" the="" migration="" area="" shows="" that="" myo9ar701x/þ="" (heterozygous="" [het])="" podocyte="" migration="" is="" decreased;="" preincubation="" with="" y26732="" partially="" abrogates="" the="" migration="" defect.="" ***p="" <="" 0.0005="" (anova),=""><0.0001 (unpaired="" student's="" t-test).="" (e)="" podocyte="" attachment="" assay="" shows="" decreased="" attachment="" of="" myo9ar701x/þ="" (het)="" podocytes;="" preincubation="" with="" y26732="" corrects="" the="" attachment="" defect.=""><0.0005 (anova).="" (d,e)="" data="" are="" mean±sd,="" n="3" to="" 4="" independent="" experiments,="" n="" ¼="" 3="" mice="" per="" genotype="" per="" experiment.="" (f)="" podocyte="" migration="" assay:="" small="" interfering="" rna="" (sirna)–mediated="" myo9akd="" decreases="" immortalized="" mouse="" podocytes="" migration=""><0.05, anova;=""><0.01, unpaired="" t-test),="" whereas="" migration="" of="" nontargeting="" (n-t)="" sirna-treated="" podocytes="" is="" not="" different="" from="" normal="" podocytes="" (wt).="" (g)="" attachment="" assay:="" myo9akd="" decreases="" immortalized="" mouse="" podocytes="" attachment,="" as="" compared="" to="" podocytes="" treated="" with="" nontargeting="" sirna="" and="" untreated="" wt="" podocytes.="" myo9akd="" data="" are="" mean±sd,="" n="" >="" 3="" independent="" experiments.=""><0.05,><0.01. hom,="" homozygous;="" ns,="" not="" significant;="" od,="" optical="">

Príomhthoradh an staidéir seo is ea go bhfuil lucha cnag-isteach heitrisigeach Myo9AR701X/þ gnáth go hiondúil ag am breithe ach go bhforbraíonn siad albuminuria, FSGS, agus podocyte FPE ag 4 mhí d'aois, rud a léiríonn gur sóchán is cúis le FSGS é p.Arg701* Myo9A i lucha fásta. Is díol suntais é go ndéanann athruithe histeolaíocha agus ultrastruchtúir na nduán tsóiteáin Myo9AR701X/þ na gnéithe diagnóiseacha a bhaineann le bithóipse duánach an phróbhanda a athchaipitliú. Ina theannta sin, forbraíonn lucha mutant Myo9AR701X/þ albaiminiúir shuntasach seachas albaiminiúir ollmhór, ag atáirgeadh an phróitéiniúir neamh-nephrotic a breathnaíodh sna siblíní proband agus i go leor othar FSGS a thosaíonn do dhaoine fásta. .15 Tá baint ag feadáin chóngaracha le mióisiní neamhghnáthaimh in ath-ionsú albaimin trína n-idirghníomhaíochtaí le Dab2 agus le cubilin, ach níor léiríodh go raibh baint ag Myo9A leis an bpróiseas seo.51 Níor bhraitheamar aon fhianaise ar tauopathies, mar shampla polúria, dilatation feadánach, atrophy , nó dáileadh neamhghnácha marcóirí feadánacha cóngaracha nó distal i lucha heitrisigeacha fásta Myo9AR701X/þ. Ní thacaíonn na sonraí seo leis an hipitéis go bhfuil an FSGS a breathnaíodh i Myo9AR701X/þ lucha mar thoradh ar bhac nó lochtanna feadánacha.

Go meicniúil, chinneamar go laghdaítear Myo9A mRNA agus próitéin Myo9A lán-fhad faoi w50 faoin gcéad , rud a thugann le tuiscint go láidir go bhfuil an sóchán mar thoradh ar haploinsufficiency Myo9A mar gheall ar nonsense-mediated mRNA lobhadh. Leanann an rialachán rialacha caighdeánacha um lobhadh mRNA nonsense-idirghabhála do shócháin teasctha atá suite in aghaidh an tsrutha roimh an exon deiridh.42,52 Ag teacht leis seo, breathnaíodh hidreacephalus agus bás roimh am i mutants homozygous Myo9AR701X/R701X a dhéanann aithris ar Myo9A lucha null.14 Chinneamar go raibh Laghdú w50 faoin gcéad ar léiriú próitéin Myo9A i Myo9AR701X/þ duáin mutant agus podocytes bunscoile chomh maith le i podocytes neamhbhásaithe Myo9AKD laghdú comhréireach ar an idirghníomhaíocht idir Myo9A, actin, agus calmodulin. Tacaíonn na torthaí seo leis an léirmhíniú gurb é leordhóthanacht haploin Myo9A an bonn don idirghníomhaíocht laghdaithe Myo9A-actin-calmodulin a breathnaíodh i mutants Myo9AR701X/þ.

Toradh criticiúil na hoibre seo is ea go n-eascraíonn p.Arg701* Myo9A caillteanas feidhm Rho-GAP as a dtagann méadú ar RhoA gníomhach i nduáin iomlána Myo9AR701X, glomeruli scoite, agus podocytes príomhúla. Ina theannta sin, léiríonn podocytes mutant Myo9AR701X/þ ceangaltán laghdaithe agus motility atá ag brath ar RhoA. Laghdaíonn comharthaíocht Myo9A-GAP RhoA gníomhach agus níl mórán éifeacht aige ar mhéadú ar chaillteanas feidhme Rac1 agus Cdc42.9,53 Rho-GAPGníomhaíocht Rho-GTPaseagus mar thoradh ar ghortú podocyte, proteinuria, agus FSGS.3,18,20 Mar sin, féadfaidh iompar neamhghnácha podocytes mutant Myo9AR701X/þ cur le forbairt FPE agus FSGS le himeacht ama i lucha Myo9AR701X/þ. Tá ár sonraí comhsheasmhach leis an éifeacht tuairiscithe atá ag dírialú RhoA ar fheidhm podocyte in vivo agus in vitro. 54–56

Toisc go ndéanann Myo9A tras-naisc actin agus go spreagann sé bunú beart actin in vitro ag eatraimh rialta 36-nm trí idirghníomhú go comhoibríoch le actin agus calmodulin, meastar go bhfuil stoichiometry an idirghníomhaíochta ríthábhachtach. tras-naisc agus cuachta actin trí mheán Myo9A a laghdú, ag soláthar níos lú suíomhanna feadh filiméid actin ina dtarlaíonn díghníomhú RhoA, agus mar sin ag athrú dinimic actin sa gharchomharsanacht agus iompar podocyte ag an leibhéal ceallacha. D'athchóirigh an t-inhibitor kinase RhoA Y27632 go páirteach an locht ceangail agus imirce a tharlódh le Myo9AR701X/þ, rud a thugann le tuiscint go bhfuil éifeachtóirí breise iartheachtach RhoA, mar mDia1, i gceist. Mar mhalairt air sin, féadfaidh tras-naisc actin laghdaithe i Myo9AR701X/þ cur go díreach le ceangaltán podocyte agus imirce a lagú. D'fhéadfadh tionchar a bheith ag leordhóthanacht haploin Myo9A ar mheicníochtaí gáinneála freisin.7–9 Tá na meicníochtaí móilíneacha beachta trína rialaíonn Myo9A dinimic actin podocyte fós le soiléiriú. Go hachomair, d’aithníomar Myo9A mar chomhpháirt nua den ghaireas podocyte cítea-chnámharlaigh agus mar shóchán MYO9A nonsense a bhaineann le MYO9A mar ghéin iarrthóra do FSGS daonna, trí atáirgeadh an fheinitíopa proteinuria daonna/FSGS i Myo9AR701X/þ lucha cnag-isteach agus trí uathshómach. comhdháileadh ceannasach ar an bhfeinitíopa i gcineál beag. I dteannta a chéile, tugann sonraí le tuiscint go láidir gurb é leordhóthanacht haploin Myo9A an bonn móilíneach don fheinitíopa a breathnaíodh i lucha Myo9AR701X/þ fásta. Léiríomar go bhfuil lagú ar cheangaltán agus ar imirce i podocytes tsóiteáin Myo9AR701X/þ, lena mbaineann gníomhaíocht mhéadaithe RhoA agus laghdaigh idirghníomhú Myo9A-actin-calmodulin. Ós rud é go gcothaíonn Myo9A tras-nascadh agus cuachadh actin ag cóimheas molar 1:116 agus ár dtuairim go bhfuil Myo9AR701X/þ mar thoradh ar leordhóthanacht haploin, éifeachtúlacht podocyte, agus ragobair FSGS, táimid ag tuairimíocht go bhféadfadh Myo9A a bheith ríthábhachtach do ghnáthdhinimic actin podocyte, cosúil le cinn eile. próitéiní ceangailteach actin (ACTN4, INF2) arb eol dóibh a bheith ina gcúis le FSGS ceannasach go huathoibríoch i ndaoine fásta nuair a bhíonn siad sócháin. Tá gá le staidéir bhreise chun a shoiléiriú conas a idirghníomhaíonn Myo9A le próitéiní diaphragm podocyte RhoA, cítea-chnámharlaigh, agus scoilte, agus cibé an athraíonn lochtanna idirghabhála Myo9A i bhfoirmiú tras-naisc agus cuachta actin struchtúr cítocnámharlach podocyte. I measc na srianta a bhaineann leis an staidéar seo chun cúisíocht a bhunú tá an neamhábaltacht chun an géinitíopa géinitíopa proband a shíneadh agus an easpa cairde breise a bhfuil an sóchán céanna acu. Tá gá le tuilleadh staidéir chun ár dtorthaí WES a bhailíochtú in othair bhreise a bhfuil FSGS teaghlaigh nó treallach orthu roimh p.Arg701*MYO9A athraitheacha mheas mar ghalair agus is féidir an fhaisnéis seo a úsáid le haghaidh cinnteoireacht chliniciúil.

NOCHTADH

Níor dhearbhaigh na húdair go léir aon leasanna iomaíocha.

BUÍOCHAS

Thacaigh deontais ó na hInstitiúidí Náisiúnta Sláinte le AT (NIH-RO1DK109434) agus Lárionad Yale um Ghéanómaíocht Mendelach (NIH-U54-HG006504) leis an obair seo.

Gabhaimid buíochas le M. Saleem (Ollscoil Bristol, RA) as podocytes daonna neamhbhásaithe a sholáthar, G. Moeckel (Scoil Leighis Yale, Roinn na Paiteolaíochta) as íomhánna bithóipse a sholáthar, S. Ishibe Lab (Scoil an Leighis Yale, Roinn an Leighis/ Neifreolaíocht) le haghaidh comhairle ar leithlisiú podocyte agus measúnacht greamaitheachta, T. Ardito (Scoil Leighis Yale, An Roinn Paiteolaíochta) agus V. Kakade (Scoil an Leighis Yale, Roinn an Leighis/Néifreolaíochta) le haghaidh ranníocaíochtaí le IF

agus íomháú comhfhócasach, SueAnn Mentone (Scoil an Leighis Yale, Roinn na Cille agus na Fiseolaíochta Móilíneach) as rannchuidiú le staidéir EM,glomerulosclerosis deighleogach fócasachothair agus teaghlaigh, agus stór na hInstitiúide Náisiúnta um Diaibéiteas agus Galair Díleácha agus Duán (FSGS-CT, NCT00135811) as samplaí DNA a sholáthar.

ÁBHAR FORLÍONTACH

Comhad Forlíontach (PDF)

Modhanna Forlíontacha. Anailís sonraí WES agus bithfhaisnéisíochta, giniúint lucha Myo9AR701X knockin, agus modhanna mionsonraithe eile.

Fíor S1. Logánaíonn Immuno-EM slonn Myo9A chuig podocytes glomerular luiche agus epithelia tubular.

Fíor S2. Myo9AR701X/R701X is cúis le hidrocephalus forásach nua-naíoch.

Fíor S3. Histeolaíocht duánach iarbhreithe i lucha mutant Myo9AR701X.

Fíor S4. Measúnacht imirce podocyte (measúnacht créachta).

Tábla S1. Liosta de na leaganacha go léir arna roinnt ag siblíní proband.

Tábla S2. Liosta de 64 géinte FSGS-proteinuria-NS a cheistíodh sa chohórt FSGS-CT. Tagairtí Forlíontacha.

TAGAIRTÍ

1. Wiggins RC. Speictream na podocytopathies: dearcadh aontaithe ar ghalair glomerular. Duán Int. 2007; 71: 1205-1214.

2. Sadowski CE, Lovric S, Ashraf S, et al. Cúis aon-ghéine i 29.5 faoin gcéad de chásanna siondróm nephrotic steroid-resistant. J Am Soc Nephrol. 2015; 26: 1279–1289.

3. Gee HY, Saisawat P, Ashraf S, et al. Is cúis le sócháin ARHGDIA siondróm nephrotic trí chomharthaíocht lochtach RHO GTPase. J Clin Infheistiú. 2013; 123: 3243–3253.

4. Gorman SW, Haider NB, Grieshammer U, et al. Clónáil agus léiriú forbartha ar myosin neamhghnáthamh IXA (MYO9A) géine i réigiún siondróm Bardet-Biedl (BBS4) ag crómasóim 15q22- q23. Géanómaíocht. 1999; 59:150–160.

5. Bayram Y, Karaca E, Coban Akdemir Z, et al. Etiology mhóilíneach arthrogryposis i dteaghlaigh iolracha de bhunadh Tuircis den chuid is mó. J Clin Infheistiú. 2016; 126:762-778.

6. O'Connor E, Töpf A, Müller JS, et al. Sainaithint sócháin sa ghéine MYO9A in othair a bhfuil an siondróm myasthenic ó bhroinn orthu. Inchinn. 2016; 139: 2143-2153.

7. Máistreacht TA, Kendrick-Jones J, Buss F. Myosins: eagraíocht fearainn, airíonna mótair, róil fiseolaíocha, agus feidhmeanna ceallacha. Handb Exp Pharmacol. 2017; 235: 77-122.

8. Liu KC, Cheney RE. Myosins in acomhail cille. Bith-ailtireacht. 2012; 2:158–170.

9. Omelchenko T, Halla A. Rialaíonn Myosin-IXA imirce cille epithelial comhchoiteann trí ghníomhaíocht RhoGAP a dhíriú chuig acomhail chealla-chealla. Curr Biol. 2012; 22:278–288.

10. Sekine T, Konno M, Sasaki S, et al. Forbraíonn othair a bhfuil siondróim Epstein-Fechtner orthu de bharr sócháin MYH9 R702 galar duánach forásach próitéineach. Duán Int. 2010; 78:207–214.

11. Mele C, Iatropoulos P, Donatelli R, et al. Sócháin MYO1E agus glomerulosclerosis deighleogach fócasach teaghlaigh óige. N Béarla J Med. 2011; 365: 295-306.

12. Krendel M, Kim SV, Willinger T, et al. Cuireann cur isteach ar Myosin 1e díobháil podocyte chun cinn. J Am Soc Nephrol. 2009;20:86–94.

13. Bähler M, Elfrink K, Hanley PJ, et al. Feidhmeanna ceallacha myosins rang IX i epithelia agus cealla imdhíonachta. Biochem Soc Trans. 2011; 39: 1166-1168.

14. Abouhamed M, Grobe K, San IV, et al. Rialaíonn Myosin IXa difreáil epithelial, agus eascraíonn a easnamh i hidrocephalus. Cill Mol Biol. 2009; 20: 5074-5085.

15. Thelen S, AbouhamedM, Ciarimboli G, et al. Is rialtóir ar fheidhm tubule duáin é RhoGAPmyosin IXa. Am J Fisiol Duánach Fisiciúil. 2015; 309:F501–F513.

16. Saczko-Brack D, Warchol E, Rogez B, et al. Féin-eagrú líonraí actin ag myosin monaiméireach. Proc Natl Acad Med US A. 2016; 113: E8387–E8395.

17. Asanuma K, Yanagida-Asanuma E, Faul C, et al. Déanann Synaptopodin eagrú actin agus motility cille a rialú trí chomharthaíocht RhoA a rialáil. Nat Cell Biol. 2006; 8:485–491.

18. Mouawad F, Tsui H, Takano T. Ról Rho-GTPases agus a gcuid próitéiní rialála i bhfeidhm podocyte glomerular. Can J Physiol Pharmacol. 2013; 91:773-782.

19. Brown EJ, Schlöndorff JS, Becker DJ, et al. Is cúis le sócháin sa ghéine formin INF2 ná glomerulosclerosis deighleogach fócasach. Nat Géin. 2010; 42:72-76.

20. Akilesh S, Suleiman H, Yu H, et al. Díghníomhaíonn Arhgap24 Rac1 i podocytes luiche, agus tá baint ag foirm mutant le glomerulosclerosis deighleogach fócasach teaghlaigh. J Clin Infheistiú. 2011; 121: 4127-4137.

21. Choi M, Scholl I, Ji W, et al. Diagnóis ghéiniteach trí ghabháil iomlán exome agus seicheamhú DNA comhthreomhar ollmhór. Proc Natl Acad Sci US A. 2009; 106:19096–19101.

22. Choi M, Scholl UI, Yue P, et al. Kþ sócháin cainéil in adenomas a tháirgeann aldosterone adrenal agus Hipirtheannas oidhreachtúil. Eolaíocht. 2011; 331:768–772.

23. Bamshad MJ, Shendure JA, Valle D, et al. Na hIonaid do Ghéanómaíocht Mendelian: tionscnamh nua ar mhórscála chun na géinte is bun le riochtaí neamhchoitianta Mendelian a shainaithint. Am J Med Gen. 2012; 158A: 1523-1525.

24. Li H, Durbin R. Ailíniú gearr léamh tapa agus cruinn le claochlú Burrows-Wheeler. Bithfhaisnéisíocht. 2009; 25: 1754-1760.

25. McKenna A, Hanna M, Banks E, et al. Foireann Uirlisí Anailíse Géanóim: creat MapReduce chun anailís a dhéanamh ar shonraí seicheamhaithe DNA den chéad ghlúin eile. Genome Res. 2010; 20: 1297-1303.

26. Yang H, Wang K. Anótáil athraitheach genomic agus beartú tosaíochta le ANNOVAR agus wANNOVAR. Prótacal Nat. 2015; 10: 1556-1566.

27. Dong C, Wei P, Jian X, et al. Comparáid a dhéanamh idir comhtháthú modhanna réamh-mheasta díobhálach do SNVanna neamh-chomhchiallacha i staidéir seicheamhaithe uile-exome. Hum Mol Genet. 2015; 24: 2125-2137.

28. Sim NL, Kumar P, Hu J, et al. Freastalaí gréasáin SIFT: éifeachtaí ionadú aimínaigéad ar phróitéiní a thuar. Aigéid Núicléacha Res. 2012; 40:W452–W457.

29. Rentzsch P, Witten D, Cooper GM, et al. CADD: ag tuar dochrach na malairtí ar fud an ghéinim dhaonna. Aigéid Núicléacha Res. 2019; 47:D886–D894.

30. Yang H, Wang H, Jaenisch R. Lucha géinmhodhnaithe a ghiniúint ag baint úsáide as innealtóireacht ghéanóm CRISPR/Cas-mediated. Prótacal Nat. 2014;9:1956–1968.

31. Veron D, Bertuccio CA, Marlier A, et al. Fachtóir fáis endothelial soithíoch podocyte (Vegf₁₆₄) overexpression is cúis le glomerulosclerosis nodular dian i múnla luch de chineál 1 diaibéiteas. Diabetology. 2011; 54: 1227-1241.

32. Veron D, Reidy K, Marlier A, et al. Ionduchtú ró-expression podocyte VEGF164 ag céimeanna éagsúla forbartha is cúis le nephrosis ó bhroinn nó siondróm nephrotic steroid-resistant. Am J Pathol. 2010; 177: 2225-2233.

33. Zou Z, Chung B, Nguyen T, et al. Endocytosis receptor-mediated a nascadh agus comharthaíocht cille: fianaise ar phróitéalú meigilín intramembrane rialaithe sa tubule cóngarach. J Biol Ceimic. 2004; 279: 34302-34310.

34. Bertuccio C, Veron D, Aggarwal PK, et al. Gabhdóir fachtóir fáis endothelial soithíoch 2 idirghníomhú díreach le naisc neifrín comharthaí VEGF-A le actin i podocytes duáin. J Biol Ceimic. 2011; 286: 39933-39944.

35. Veron D, Aggarwal PK, Velazquez H, et al. VEGF a bhaineann go sonrach le podocyte-go gcothaíonn gnóthachan feidhme glomerulosclerosis nodúlach i lucha eNOS null. J Am Soc Nephrol. 2014; 25: 1814-1824.

36. Reidy KJ, Aggarwal PK, Jimenez JJ, et al. Is é an toradh a bhíonn ar sheimeafairin podocyte iomarcacha-3A ná galar glomerular a bhaineann le hidirghníomhaíocht plexinA1-neifrín. Am J Pathol. 2013; 183: 1156-1168.

37. Tian X, Kim JJ, Monkley SM, et al. Tá talin1 a bhaineann le podocyte ríthábhachtach chun bacainní scagacháin glomerular a chothabháil. J Clin Infheistiú. 2014; 124: 1098-1113.

38. Ni L, Saleem M, Mathieson PW. Cultúr podocyte: cleasanna na trádála. Neifreolaíocht (Carlton). 2012; 17:525–531.

39. Ren XD, Kiosses WB, Schwartz MA. Rialáil an phróitéin bheag GTP-cheangailteach Rho trí ghreamaitheacht cille agus an chiteischnámharlaigh. EMBO J. 1999; 18:578–585.

40. Duvall L, Rashmi P, Lopez-Rivera E, et al. Rialaíonn díghrádú próitéamaíoch Nck1 ach ní Nck2 gníomhachtú RhoA agus dinimic actin. Cumann Nat. 2013; 4: 2863.

41. Kopp JB, Winkler CA, Zhao X, et al. Gnéithe cliniciúla agus histeolaíocht apaipoprotein l1-nephropathy gaolmhar sa Triail Chliniciúil FSGS. J Am Soc Nephrol. 2015; 26: 1443-1448.

42. Kurosaki T, Maquat LE. Sracfhéachaint ar mheath mRNA neamh-idirghabhála i ndaoine. J Cill Sci. 2016; 129:461-467.

43. MacArthur DG, Manolio TA, Dimmock DP, et al. Treoirlínte maidir le himscrúdú a dhéanamh ar chúise leagan seicheamh i ngalar daonna. Dúlra. 2014; 508:469–476.

44. Richards S, Aziz N, Bale S, et al. Caighdeáin agus treoirlínte maidir le hathróga seichimh a léirmhíniú: moladh comhdhearcach ó Choláiste Meiriceánach Géineolaíocht agus Géanómaíocht Leighis agus an Association for Molecular Pathology. Géin Med. 2015; 17:405–424.

45. Wang M, Chun J, Genovese G, et al. Ranníocaíochtaí na n-athraithe géine neamhchoitianta le FSGS teaghlaigh agus treallach. J Am Soc Nephrol. 2019; 30: 1625-1640.

46. ​​Karczewski KJ, Francioli LC, Tiao G, et al. Rinneadh an speictream srianta sócháin a chainníochtú ó éagsúlacht i 141,456 duine. Dúlra. 2020; 581: 434-443.

47. Maddirevula S, Alzahrani F, Al-Owain M, et al. Dearbhú uathshaidhm agus tréchur ard ar iarrthóireacht ghéinte galar. Géin Med. 2019; 21:736-742.

48. O'Connor E, Phan V, Cordts I, et al. Tá baint ag easnamh MYO9A i néaróin mótair le secretion laghdaithe agrin neuromuscular. Hum Mol Genet. 2018; 27: 1434-1446.

49. Sárközy M, Zvara A, Gyémant N, et al. Bíonn tionchar ag siondróm meitibileach ar phatrún léiriú géine cairdiach ag an leibhéal tras-scríofa i bhfrancaigh fireann ZDF. Diabetol Cardiovasc. 2013; 12:16.

50. Lepori N, Zand L, Sethi S, et al. Feinitíopa cliniciúil agus paiteolaíoch ar chúiseanna géiniteacha glomerulosclerosis deighleogach fócasach i ndaoine fásta. Clin Duán J. 2018; 11:179–190.

51. Eshbach ML, Weisz OA. Endocytosis glacadóir-idirghabhála sa tubule proximal. Annu Rev Fisiol. 2017; 79:425–448.

52. Bouligand J, Delmer B, Croí AC, et al. Leordhóthanacht haploiníochta gabhdóra glucocorticoid teaghlaigh ag meathlú mRNA idirghabhála gan chiall, hipearpláis adrenal agus farasbarr mianraíocorticoid dealraitheach. PLoS a hAon. 2010;5. e13563.

53. Yi F, Cong R, Ren J, et al. Luathaíonn Myo9b-RhoGAP Noncanonical hidrealú GTP RhoA trí mheicníocht dé-arginine-finger. J Mol Biol. 2016; 428: 3043–3057.

54. Tian D, Jacobo SM, Billeáil D, et al. Rialú freasúil ar dhinimic actin agus motility cille ag cainéil TRPC5 agus TRPC6. Comhartha Sci. 2010; 26:3. ra77.

55. Wang L, Ellis MJ, Gomez JA, et al. Meicníochtaí an phróitéinuria arna spreagadh ag GTPases Rho. Duán Int. 2012; 81:1075–1085.

56. Kistler AD, Altintas MM, Reiser J. Podocyte GTPases rialaíonn dinimic scagaire duáin. Duán Int. 2012; 81:1053–1055.

57. Cory G. Measúnacht scratch-créachta. Modhanna Mol Biol. 2011; 769:25-30.

Kidney International (2021) 99, 1102–1117; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2020.12.022

Cóipcheart ª 2021, Cumann Idirnáisiúnta na Neifreolaíochta. Arna fhoilsiú ag Elsevier Inc. Is alt rochtana oscailte é seo faoin gceadúnas CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Comhfhreagras: Alda Tufro, An Roinn Péidiatraiceach/Néifreolaíochta, Scoil Leighis Ollscoil Yale, 333 Sráid Cedar, New Haven, Connecticut 06520, SAM. R-phost: alda.tufro@yale.edu 6 Cleamhnacht reatha: Neifreolaíocht, Ospidéal Náisiúnta na Leanaí, Washington, DC, SAM. 7 Cleamhnas reatha: Neifreolaíocht, Ospidéal do Leanaí Breoite, Ollscoil Toronto, Toronto, Ontario, Ceanada. Arna fháil 21 Bealtaine 2020; athbhreithnithe an 4 Nollaig 2020; glacadh leis an 10 Nollaig 2020; foilsithe ar líne 4 Eanáir 2021