Éifeacht Sliocht Cistanche Tubulosa ar Fheidhm Atáirgthe Fireann i bhFrancaigh Diaibéiteacha Streptozotocin–Nicotinamide-Ⅰ

1. Réamhrá

Is coinníoll é diaibéiteas mellitus (DM) ina bhfuil méadúleibhéil glúcóissan fhuil mar gheall ar neamhéifeachtúlacht an briseán chun go leor inslin a tháirgeadh, nó neamhábaltacht an chomhlachta é a úsáid go héifeachtach. De réir an WHO, d'ardaigh líon na ndaoine a bhfuil diaibéiteas orthu ó 108 milliún i 1980 go 422 milliún in 2014 [1]. Tá ceithre phríomhchatagóir ann: réamh-diaibéiteas (céim roimh diaibéiteas), cineál 1 (nuair a theipeann ar an briseán inslin a tháirgeadh), cineál 2 (teipeann ar an gcomhlacht inslin a úsáid), agus diaibéiteas gestational (a tharlaíonn le linn toirchis). Tarlaíonn strus ocsaídiúcháin mar gheall ar an éagothroime idir táirgeadh speiceas ocsaigin imoibríoch (ROS) agus frithocsaídeoirí [2] as a dtiocfaidh an riocht diaibéitis ar deireadh. Áirítear ar na deacrachtaí a bhaineann le diaibéiteas teip na duán, damáiste nerve, daille, stróc, taom croí, bás féatais, agus neamhthorthúlacht. [1]. Léiríonn staidéir go ndearnadh damáiste suntasach ar núicléis sperm, aigéad deoxyribonucleic (DNA), agus mitochondria in othair diaibéitis fireann [3]. Athróidh strus ocsaídiúcháin le linn iompar sperm próiseas an chórais atáirgthe fireann [4,5].

TUBULOSA CISTANCHE NÁDÚRTHA CHUN FEIDHM Gnéis A FHEABHSÚ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Tá an próiseas spermatogenesis á rialú ag an ais hypothalamus-pituitary-gonadal (HPG). Spreagann an hormón a scaoileann gonadotropin (GnRH) a tháirgtear ag an hypothalamus táirgeadh hormone luteinizing (LH) agus hormón a spreagann follicle (FSH). Faightear cealla Leydig in aice leis an tubule seminiferous agustháirgeadh testosteronefaoi ​​smacht LH. Spreagann FSH táirgeadh próitéin ceangailteach antigen (ABP) a chabhraíonn leis an hormone fireann a chur ar aghaidh. Mar sin, tagann neamhthorthúlacht agus fadhbanna eile chun cinn go príomha mar gheall ar an suaitheadh ​​a tharlaíonn san ais HPG. Cothaítear diaibéiteas i bhfrancaigh turgnamhacha má dhéantar an meascán de streptozotocin-nicotinamide a thabhairt. Is cumaisc cheimiceach é Streptozotocin atá tocsaineach do chealla a tháirgeann inslin sa briseán agus is vitimín intuaslagtha in uisce é nicotinamide a chosnaíonn na cealla ó dhamáiste iomlán [6].

Is speiceas planda fásach é Cistanche tubulosa ar a dtugtar "Rou Cong-Rong" [7] freisin. Is planda seadánacha neamh-chlóraifill é a fhásann go príomha ar fhréamh an chrainn Calotropis procera agus a dháileadh go forleathan i dtalamh arid Gansu, Qinghai, Xinjiang, Mhongóil, an Iaráin agus an India. Is é an t-ainm coitianta Cistanche tubulosa ná "Desert Hyacinth". Glactar leis go forleathan i míochaine traidisiúnta na Síne agus tugadh an t-ainm "Ginseng of the Desert". Úsáidtear go forleathan é sa réimse míochaine chun cóireáil a dhéanamh ar leucorrhea morbid, metrorrhagia profuse, galair duánach ainsealacha, constipation, impotence, agus infertility. Comhábhair cheimiceacha deIs éard atá i Cistanche tubulosa ná gliocóisídí feinileatánóideach neamh-ghalaithe(PHGanna), iridoids, lignans, olaí so-ghalaithe, alditols, oligosaccharides, agus polaisiúicrídí [8]. Léiríonn staidéir go bhfuilEchinacosideón luibh seo a chosnaíonn an fibroblast damáiste trí leibhéil ROS a rialáil [9]. Táirgeann an cumaisc seo gníomhaíochtaí frithocsaídeacha, vasorelaxation, agus frith-athlastach mar aon le cosc ​​​​neuroprotection agus oistéapóróis [10,11].

Bhí sé mar aidhm ag an staidéar seo imscrúdú a dhéanamh ar éifeacht naSliocht Cistanche tubulosaina bhfuil ECH ar mhífheidhm atáirgthe an fhrancaigh diaibéiteach streiptezotocin-nicotinamide-spreagtha.

2. Ábhair agus Modhanna

2.1. Ábhair

Ceannaíodh ECH agus CTE ó Sinphar Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Taiwan). Ceannaíodh táirgí deiridh glycation casta (AGEanna) ó Biovision (San Francisco, CA, SAM). Ceannaíodh línte cille LC-540 agus TM3 ón Institiúid Taighde agus Forbartha Tionscal Bia (Hsinchu, Taiwan). Ceannaíodh francaigh fireann Sprague-Dawley (SD) cúig seachtaine d'aois ó Ionad Ainmhithe na Saotharlainne Náisiúnta (Taipei, Taiwan). Ceannaíodh Feed Lab Diet® ó PMI Nutrition International, Inc. (Taipei, Taiwan). Fuarthas 2,2-défheinile-1-phiccrylhydrazil (DPPH) ó Sigma (St. Louis, MO, SAM). Ceannaíodh meatánól agus 4-(2-hiodrocsaitil)-1-aigéad píobaireatán-atáinesulfónach (HEPES) ó Sigma freisin. Fuarthas meán Eagle/F12 modhnaithe Dulbecco agus trypsin-EDTA ó GIBCO (Nua-Eabhrac, NY, SAM). 3-(4, 5-démheitilthiazol-2-il)-2, 5-bróimíd défheiniltetrasóiliam (MTT), déchlóraim-dé-hidrea-fhluaraiséin (DCFH-DA), ceannaíodh sulfocsaíd dimethyl (DMSO), agus tetrazolium nitroblue (NBT) ó Sigma. Fuarthas feisteáin einsímeacha glúcóis ó Kyokutoseiyaku, Tóiceo, an tSeapáin. Ceannaíodh feisteáin inslin ELISA ó Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Uppsala, an tSualainn). Fuarthas Imoibrí Eastóscadh Próitéine Fíocháin T-PER ó Thermo Scientific (Chicago, IL, SAM). Ceannaíodh antasubstaintí polaclónacha frithdhaonna/Luch/Francach B NF-κB ó Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, SAM. Gabhdóir Frith-Luch/Rat le haghaidh antashubstaintí polachlónacha ard-tháirgí gliocrónacha (RAGE), antashubstaintí polachlónacha frith-Duine/Luch/Rat Star, agus antasubstaintí monachlónacha frithdhuine/Luch/Rat P{30}}Ceannaíodh antasubstaintí monachlónacha A1 ó Gene. Tex (Irvine, CA, SAM). Fuarthas antasubstaintí polachlónacha Frithdhaonna/Luch/Rat CYP11A1 ó Theicneolaíocht Comharthaíochta Cille (Beverly, PA, SAM). Ceannaíodh imoibrí Easy-Blue ó Invitrogen, Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA, SAM). Fuarthas Agarose agus marcóir DNA 100 bp ó Promega, Corporation (Madison, WI, USA). Ceannaíodh Kit Mini Fíocháin Lipid RNeasy ó QIAGEN, Hilden, an Ghearmáin.

TUBULOSA CISTANCHE NÁDÚRTHA CHUN FEIDHM Gnéis A FHEABHSÚ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.2. Modhanna

2.2.1. Anailís In Vitro

LC{{0}} agus TM3 Cultúir na gCeall: Saothraíodh na línte cille LC-540 ag 37 ◦C i meán Réitigh Chothrom Salainn Earle (EBSS) arna fhorlíonadh le décharbónáit sóidiam (1.5 g/L), L-glutamine (2 mM), aimínaigéid neamhriachtanacha (0.1 mM), pyruvate sóidiam (1.0 mM), agus séiream bó féatais (FBS) (10%) in a gorlann 5% CO2 (gorlann CO2, Napco 5410, Taiwan). Saothraíodh an líne chill TM3 i meán Eagle modhnaithe Dulbecco (DMEM) arna fhorlíonadh le glúcós (4.5 g/L), piriváit sóidiam (0.5 mM), L-glutamine (2.5 mM), décharbónáit sóidiam (1.2 g/L), {{ 28}}(2-hiodrocsaitil)-1-aigéad píobaireatánethanesulfónach (HEPES, 15 mM), agus séiream lao féatais (FCS, 10%) nó séiream capaill (5%) ag 37 ◦C i 5% gorlann CO2.

Cinneadh ar Inmharthanacht na Cille deEchinacoside (ECH): 3-(4, 5-démheitilthiazol-2-il)-2,5- dífheiniltetrazolium bróimíd (MTT) imoibrí le haghaidh measúnú inmharthanachta cille. Coigeartaíodh an tiúchan cille go 2 × 105 cill / mL i 96-phláta tobair. Ansin, cuireadh 20 µL de ECH (caolaithe i 2% de mheán) leis agus gor ar feadh 24 h ag 37 ◦C i gorlann 5% CO2. Níos déanaí, cuireadh 100 µL d'imoibrí MTT leis agus gor é ar feadh 4 h ag 37 ◦C faoi choinníollacha dorcha. Tomhaiseadh an t-ionsúcht ag 570 nm (léitheoir ELISA, Dynatech MR5000, Kloten, an Eilvéis).

Inmharthanacht choibhneasta cille (%)=[(Sampla ag 570 nm − folamh ag 570 nm)]/[(Acontrol ag 570 − Bán ag 570)] × 100.

Measúnacht Laghdaithe Nitroblue Tetrazolium (NBT) agus 2,2-défheinile-1-picrylhydrazil (DPPH) Measúnacht: Athraíodh líon na gceall go 1×1{{10}6 chealla/ mL. Ansin, cuireadh 50 mg/mL de ECH, resveratrol (RES), agus táirgí deiridh chun cinn glycation (AGEs) (rialú) leis agus comhshaothraíodh iad ar feadh 18 h ag 37 ◦C. Ansin, cuireadh 0.3 mL de thuaslagán NBT (0.1 mg/mL NBT, 5% FBS, agus 3% sulfoxide dimethyl (DMSO) tuaslagtha i 10 mL DMEM) agus gor ag 37 ◦C i 5% CO2 ar feadh 1 h). Tar éis lártheifneoraithe (ag 800 × g ar feadh 3 nóim) baineadh an súthach agus cuireadh 200 µL DMSO leis agus croitheadh ​​é ar feadh 5 nóiméad in oscillator ultrasonaic (Delta Ultrasonach Glantóir D 200, Keelung, Taiwan). Tomhaiseadh an ionsúchán ag 630 nm. Maidir le measúnacht radacach DPPH, glacadh le Trolox (in alcól 95%) mar an caighdeán. Ansin, meascadh 75 µL de thuaslagán DPPH 0.5 mM le 25 µL de shamplaí agus ligeadh dó imoibriú ag teocht an tseomra in áit dorcha ar feadh 30 nóiméad. Croitheadh ​​an meascán agus tomhaiseadh an ionsúchán ag 517 nm.

Speicis Ocsaigin Imoibríocha (ROS) Anailís Ábhar: Athraíodh uimhir na cille go 2 × 105 cill/mL i 12-phláta tobair ina raibh 2% FBS. Ansin, cuireadh 50 µL/mL de ECH, RES, agus AGEs leis an pláta agus gor ag 37 ◦C ar feadh 24 h. Tar éis 24 h, cuireadh 20,70 -déchlorofluorescein-diacetate (DCFH-DA) leis agus gor é ag 37 ◦C ar feadh 30 nóiméad. Tar éis lártheifneoraithe (400 × g, 5 min), baineadh an súthach agus nite na cealla faoi dhó le seile maolánach fosfáit (PBS). Tar éis sin, cuireadh cealla ar fionraí i 1 mL de PBS agus socraíodh leibhéil ROS trí úsáid a bhaint as cíteaiméadar sreafa (Sreabhadh Cytometer, Becton Dickinson, CA, SAM).

Aithint agus Anailís Chainníochtúil Próitéin: Baineadh próitéiní amach trí úsáid a bhaint as imoibrí eastóscadh próitéin (T-PER). Coigeartaíodh dlús na cille go 2 × 105 cealla/mL i 12-pláta tobair agus 50 µL/mL de ECH, RES, agus gabhdóir don fhrithghníomhaí ard-glication endproduct (RAGE), agus cuireadh AGEanna leis agus goraíodh iad. ag 37 ◦C i gorlann 5% CO2 ar feadh 24 h. Ina dhiaidh sin, cuireadh 400 µL de T-PER leis, scríobtar as na cealla é, agus lártheifneoiríodh é ag 125,000 × g ar feadh 20 nóiméad (4 ◦C). Bailíodh agus stóráladh an comhshnaidhm ag −80 ◦C (−80 ◦C reoiteoir, Nuaire, Plymouth, MN, SAM) le haghaidh tuilleadh anailíse. Baineadh úsáid as paca aigéid bhicinchoninic (BCA) chun próitéin a chainníochtú. Ansin, cuireadh 10 µL de thuaslagán cille caighdeánach agus 200 µL de imoibrí BCA le 8-plátaí tobair agus gor iad ag 37 ◦C i gorlann 5% CO2 ar feadh 30 nóiméad. Tomhaiseadh an ionsúchán ag 562 nm. Rinneadh anailís aitheantais próitéine trí leictreafóiréis glóthach dodeicile sulfáit sóidiam (SDS)-polyacrylamide (SDS-PAGE). Ullmhaíodh samplaí trí lysate próitéine a chur le maolán lódála próitéine agus rinneadh anailís ar bhloic thiar chun na próitéiní sonracha a bhrath.

2.2.2. Anailís In Vivo

Dearadh Múnla Ainmhithe: Ceannaíodh seasca {{{{0}} francach fireann seachtaine d'aois Sprague-Dawley (SD) ó Lárionad Náisiúnta Ainmhithe na Saotharlainne (Taipei, Taiwan). Bhí gach francach lonnaithe ina n-aonar i cages cruach dhosmálta díghalraithe faoi theocht rialaithe (23 ± 1 ◦C) agus taise (40-60%) le timthriall dorcha 12 h solais / 12 h. Cuireadh bia agus uisce ar fáil ad libitum. Bhí gach francach ceansaithe sa chéad seachtain agus tugadh aiste bia creimire saotharlainne 5001 mar phríomh-aiste bia. Lean na nósanna imeachta go léir caighdeán an Choiste Institiúideach um Chúram agus Úsáid Ainmhithe (Ceadú IACUC Uimh. 101026) de chuid Ollscoil Aigéan Náisiúnta Taiwan, Taiwan. Tar éis baile a dhéanamh, roinneadh na francaigh ina dhá ghrúpa: an grúpa rialaithe (Con) a chothaíodh aiste bia saotharlainne 5001, agus an grúpa diaibéitis a chothaíodh aiste bia ard-saill (HFD, 40%) don turgnamh iomlán. Tar éis dóibh a bheith cothaithe leis an HFD ar feadh 4 seachtaine, cuireadh streptozotocin (65 mg/kg) (STZ) ar fhrancaigh an ghrúpa diaibéitis chun diaibéiteas mellitus (DM) a spreagadh. Laistigh de 15 nóiméad tar éis STZ a instealladh, cuireadh nicotinamide (230 mg/Kg Meáchan Coirp) instealladh. Seachtain tar éis an insteallta, rinneadh tástáil lamháltais glúcóis ó bhéal (OGTT) chun ionduchtú rathúil diaibéitis mellitus (DM) a chinneadh. Tar éis sin, roinneadh na hainmhithe i sé ghrúpa: an rialú (chothaithe le aiste bia saotharlainne 5001); Grúpa DM (DM + 45 % HFD); Grúpa DMR (DM + rosiglitazone: 0.571 mg/kg BW) + 45 % HFD; Grúpa DME1 (DM + CTE: 80 mg/kg BW) + 45 % HFD; Grúpa DME2 (DM + CTE: 160 mg/kg BW) + 45 % HFD; agus grúpa DME4 (DM + CTE: 320 mg/kg BW) + 45 % HFD. Glacadh le Rosiglitazone (RSG) mar an rialú dearfach. Baineadh úsáid as trí dháileog de CTE (80, 160, agus 320 mg/kg) de réir mholadh treoirlínte meastóireachta feidhmiúla bia sláinte ó Riarachán Bia agus Drugaí Taiwan (TFDA). Tugadh cóireálacha go dtí deireadh an turgnaimh. Rinneadh na francaigh turgnamhacha go léir a íobairt tar éis 6 seachtaine. Rinneadh an fhuil a bailíodh ó na francaigh a lártheifneoiriú ag 3000 rpm ar feadh 15 nóiméad ag 4 ◦C. Scrúdaíodh an comhghaoltóir don anailís seo a leanas:

Cinneadh Iomlán Glúcóis, Triglyceride, agus Cholesterol: Rinneadh an cinneadh glúcóis trí threalamh einsímeacha glúcóis. Ansin, cuireadh 20 µL de shamplaí plasma fola leis na himoibrithe agus coinníodh iad ag 37 ◦C ar feadh 5 nóiméad. Socraíodh na tríghlicrídí iomlána agus an tiúchan iomlán colaistéaróil trí úsáid a bhaint as trealamh einsímeach tríghlicríde agus colaistéaról. Ansin, cuireadh 10 µL plasma fola leis na himoibrithe agus rinneadh an turgnamh de réir threoracha an déantóra. Tomhaiseadh an ionsúchán ag 510 nm.

Plasma iomlán glúcóis/tríghlicríd/colaistéaról (mg/dL)=(Asample − ABlank)/(Caighdeánach − ABlank) × 200.

Sampla: Samplaí fola a ionsú, ABlank: Luach ionsúcháin feiste gan sampla, Caighdeán: Luach ionsúcháin an imoibrí chaighdeánaigh, 200: imoibrí caighdeánach ag tiúchan 200 mg/dL.

Inslin, Leptin, agus Measúnacht Mhúnla Hoiméastatach – Cinneadh maidir le Frithsheasmhacht Insline (HOMA-IR):Socraíodh an leibhéal inslin le feisteáin ELISA insulin. Anseo, 25µCuireadh L plasma fola leis animoibrithe, agus tomhaiseadh an ionsúchán ag 450 nm. Socraíodh ábhar iomlán leptin trí úsáid a bhaint as atrealamh measúnaithe imdhíonmhéadrach einsím leptin.Ansin, 100µRinneadh anailís ar L plasma agus ar an ionsúchána thomhas ag 450 nm ag baint úsáide as léitheoir ELISA. Rinneadh an turgnamh ar fad de réirtreoracha an mhonaróra. Cinneadh an luach HOMA-IR ón tsamhail hoiméastáiscothromóid mheasúnaithe=Tiúchan inslin plasma troscadh (mg/mL)× glúcóis plasma troscadhtiúchain (mmol/L)/22.5.

Sárocsaídiú Lipid Plasma: Anseo, meascadh {{0}.5 ml de phlasma fola le 1 mL d'imoibrí (15%, w/v d'aigéad tríchlóraaicéiteach in 0.25 N aigéad hidreaclórach (HCl) ) agus 0.375%, w/v aigéad thiobarbituric i 0.25 N HCl) agus a chur i ndabhach uisce (Folctha Uisce, BUCHI 461, Zürich, An Eilvéis) ag 100 ◦C ar feadh 15 nóiméad. Tar éis an fhuaraithe, cuireadh 1 ml de n-butanol leis, croitheadh ​​​​go bríomhar, agus lártheifneoirithe ag 1500 × g ar feadh 10 nóiméad. Bailíodh an súiteán agus tomhaiseadh an t-ionsúcht ag 532 nm [12].

Tiúchan malondialdehyde (MDA) (nM/mL)=[(Sampla ag 532 nm − Bándearg ag 532 nm)/ (Caighdeán ag 532 nm − Bán ag 532 nm)] × 5.

caighdeánach ag 532 nm − Bán ag 532 nm)] × 5. Leibhéil Testosterone Plasma agus Hormone Luteinizing (LH) a Chinneadh: Baineadh úsáid as an trealamh testosterone ELISA chun leibhéal testosterone sa phlasma fola a thomhas. Baineadh úsáid as trealamh ATR chun an tiúchan LH a chinneadh. Ansin, cuireadh 50 µL plasma leis agus bhí na ríomhanna bunaithe ar thiúchan an hormóin LH-RP-3 (caighdeánach). Rinneadh na céimeanna breise de réir threoracha an mhonaróra.

Cinneadh an Fhachtóra Mheall Necróis (TNF)- agus Tiúchan Interleukin-6 (IL-6): Caolaíodh an antashubstaint a gabhadh 250 uair sa mhaolán brataithe, curtha le 96- pláta tobair (100 µL/tobar), agus coinnithe ag 4 ◦C ar feadh oíche. Rinneadh an comhshnámh a asú agus a ní cúig huaire le maolán níocháin (1 uair PBS, 0.05% Tween 20). Tar éis gor (1 h) le 200 µg de chaolaitheoir measúnachta, nigh na cealla 5 huaire le maolán níocháin agus cuireadh 100 µL de thuaslagán caighdeánach TNF nó samplaí tástála le gach tobar agus goraíodh iad ar feadh 2 h. Tar éis níocháin, cuireadh 100 µL d’antasubstaintí braite IL leis agus gor iad ar feadh 1 h ag teocht an tseomra. Rinneadh an súthaire a asú agus a ní 5 huaire. Ansin, cuireadh 480 µL de einsím avidin-horseradish peroxidase (HRP) leis agus gor ar feadh 30 nóiméad ag teocht an tseomra. Rinneadh an súthaire a asú agus a ní cúig huaire le maolán níocháin. Ansin, cuireadh 100 µL de thuaslagán tsubstráit leis agus gor ar feadh 15 nóiméad ag teocht an tseomra. Níos déanaí, cuireadh 50 µL de thuaslagán stad (aigéad fosfarach 1M) le gach tobar agus tomhaiseadh an t-ionsúcht ag 450 nm.

TUBULOSA CISTANCHE NÁDÚRTHA CHUN FEIDHM Gnéis A DHEISIÚ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Anailís ar Pharaiméadair Sperm agus Táistis

Bailiúchán Samplach Sperm: Rinneadh an bailiúchán samplaí sperm de réir an mhodha a tuairiscíodh roimhe seo i [13]. Bailíodh an speirm ón ollnóva agus úsáideadh é le haghaidh tuilleadh anailíse.

An Líon Sperm, Motility Sperm, agus Sperm Neamhghnácha: Ríomhadh líon na sperm ag baint úsáide as an tuaslagán gorm haemocytometer agus trypan. Ansin, rinneadh 100 µL de leacht sperm a mheascadh le tuaslagán gorm trypan agus ríomhadh líon na sperm, motility, agus sperm neamhghnácha ag baint úsáide as hemocytometer agus micreascóp [14].

Laghdú Nitro gorm Tetrazolium NBT agus Sárocsaídiú Lipid Sperm agus Testis: Rinneadh anailís ar shárocsaídiú lipid agus laghdú NBT de réir an nós imeachta céanna d'anailís plasma.

Cinneadh Superoxide Dismutase (SOD) agus Gníomhaíocht Cataláis: Rinneadh anailís ar ghníomhaíocht Superoxide dismutase (SOD) trí úsáid a bhaint as trealamh RANSEL. Anseo, {{0}}.0Cuireadh 5 ml d'aonchineálachtaí testicular le 1.7 mL de thuaslagán imoibrithe (0.05 mM xanthine, 0.025 mM 2-({{ {9}}iaidíféinil)- 3-(4-níotrófeanól)-5-clóiríd feiniletrasóiliam (INT)). Tar éis meascadh, cuireadh 0.25 mL xanthine oxidase (80 U/L) leis agus imoibriú ag teocht an tseomra ar feadh 30 s. Tomhaiseadh an ionsúchán ag 505 nm. Socraíodh tiúchan próitéine an homogenáit testicular ag trealamh measúnaithe próitéin Bio-Rad DC agus ríomhadh a ghníomhaíocht shonrach (próitéin U/mg). Cinneadh an ghníomhaíocht catalase (CAT) de réir modh a tuairiscíodh roimhe seo [15].

H&E (Hematoxylin agus Eosin) Staining

Bhí an táis sáithithe i 10% de formalin ar feadh 24 h agus a stóráil ag 4 ◦C. Bhí na fíocháin sa mhicreamhéid agus ceangailte leis an sleamhnán. Tar éis a shocrú (95% meatánól + 5% aigéad aicéiteach), tumtha na sleamhnáin i hematoxylin ar feadh 3 nóiméad, nite le huisce reatha ar feadh 5 nóiméad, agus ansin iad sáithithe le 50%, 70%, agus 90% alcól le haghaidh nóiméad amháin. Tar éis sin, bhí na sleamhnáin dhaite le eosin ar feadh 10 s agus sáithithe in alcól 100% ar feadh nóiméad amháin go dtí go raibh sé faded. Ar deireadh, bhí an sleamhnán sáithithe i xiléin ar feadh nóiméad amháin. Níos déanaí, bhí an sleamhnán aer-triomaithe agus séalaithe. Cuireadh an feadán daite i micreascóp codarsnachta de chéim inbhéartaithe (Micreascóp Difríochta Céim Inbhéartaithe, Olympus CK-2, Tóiceo, an tSeapáin) chun an mhoirfeolaíocht a bhreathnú.

Anailís ar an Hypothalamus

Aithníodh na seichimh ghéine luch KISS1, G-próitéin-chúpláilte (GPR) 54, suppressor comharthaíochta cytokine 3 (SOCS-3), agus sirtuin 1 (SIRT1) ó bhunachar sonraí géine an NCBI (An Lárionad Náisiúnta um Fhaisnéis Biteicneolaíochta). agus dearadh primer ar leith ag baint úsáide as Primer 5.0 PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, USA.). Tá na primers a úsáideadh sa turgnamh liostaithe i dTábla 1.

Eastóscadh aigéad ribonúicléach (RNA) ón Hypothalamus. Rinneadh eastóscadh RNA ó hypothalamus na hinchinne trí úsáid a bhaint as an Mini Kit Fíocháin Lipid RNeasy. Rinneadh na mRNAs a fuarthas a thomhas go cainníochtúil trí thrascríobh droim ar ais (RT) agus imoibriú slabhra polaiméireáis (PCR). Stóráladh an DNA comhlíonta a fuarthas ó anailís RT ag −20 ◦C lena úsáid níos déanaí. Rinneadh anailís imoibriú slabhrúil polaiméaráise (PCR) ar an DNA asbhainte ag baint úsáide as Taq polymerase. Ansin, tógadh 5~10 µL den táirge PCR agus rinneadh anailís air trí leictreafóiréis ar choilóideach agar 1.5%. Tógadh an íomhá i gcóras íomháithe UVP BioDoc-It. Tógadh aigéad deocsairibonúicléach comhlántach droim ar ais (cDNA) agus rinneadh PCR ag baint úsáide as an IQ SYBR Green Supermix Kit. Níos déanaí, rinneadh anailís air le iQTM 5 Optical System Software. Baineadh próitéiní amach trí úsáid a bhaint as imoibrí eastóscadh próitéin (T-PER). Ansin, cuireadh 20 mg de homogenate testicular le 400 µL de T-PER agus lártheifneoiriú (Lártheifneoir Ardluais, Hettich CR-12, Tuttlingen, an Ghearmáin) ag 4 ◦C (125,000× g ) ar feadh 20 nóiméad. Bhí an modh seo a leanas cosúil le "anailís aitheantais agus cainníochtaithe ar phróitéin" in vitro anailís.

2.3. Anailís staitistiúil

Cuireadh na torthaí turgnamhacha in iúl mar an meán ± diall caighdeánach (Meán ± SD) agus rinneadh anailís ar na sonraí trí úsáid a bhaint as bogearraí Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.0, IBM, Armonk, New York, NY, USA. Rinneadh anailís aontreo ar an éagsúlacht (ANOVA) ar na difríochtaí idir na grúpaí. Rinne tástáil Duncan anailís ar chomparáidí iolracha de ghrúpaí éagsúla ag luach p < 0.05 mar an leibhéal suntasach.

3. Torthaí

3.1. Anailís In Vitro

3.1.1. Comparáid idir Gníomhaíochtaí Frithocsaídeacha ECH, CTE, agus RES

Fadtéarmach high strus ocsaídiúcháin agus athlasadh ainsealach na príomhchúiseanna le diaibéitisaimhréidh [16]. Cuimsíonn CTEanna éagsúlagliocóisídí feinileatánóideach mar echinacoside(ECH) agus acteoside, leis an acmhainneacht le haghaidh gníomhaíochta frithocsaídeach [17]. scavenging radacach DPPHRinneadh measúnacht chun gníomhaíocht frithocsaídeach ECH a mheas. Trolox agus resveratrol(3,5,4'-trihydroxystilbene, RES) mar an rialú caighdeánach agus dearfach faoi seach. Mar a thaispeántari bhFíor1, léirigh ECH gníomhaíocht scavenging radacach níos fearr agus bhí an ghníomhaíocht i bhfad níos airdená rialú dearfach (RES).

3.1.2. Inmharthanacht Cille ECH ar LC-540 agus TM3 Cealla Leydig

Rinneadh measúnacht MTT chun inmharthanacht na gceall de thiúchan éagsúla ECH a mheas. LC-540 Léirigh cealla Leydig agus cealla TM3 Leydig níos mó ná 80% den inmharthanacht tar éis cóireáil a fháil le ECH (Fíor 2). I gcomparáid leis na tiúchain eile, léirigh tiúchan 100-µM (caoluithe 100 µM i 2% FBS) de ECH inmharthanacht cille níos fearr i gcealla TM3 Leydig. Léirigh an toradh nach gcuireann an tiúchan méadaithe ECH aon tocsaineacht shuntasach leis na cealla.

3.1.3. Éifeacht ECH ar Tháirgeadh Sárocsaíde AGE-Induced by NBT Assay in LC-540 agus TM3 Leydig Cells

Déanann AGEanna damáiste ocsaídiúcháin sa chorp mar gheall ar ocsaídiú glúcóis agus foirmiú fréamhacha saor in aisce mar O2-, fréamhacha hiodrocsaile, agus grúpaí carbóinile [18]. Tar éis a bheith spreagtha le 50 ug/mL de AGEanna, cuireadh cóireáil ar na cealla LC-540 (Fíor 3a) agus TM3 (Fíor 3b) le ECH agus RES (5 μM agus 10 μM an ceann). Léirigh na torthaí gur tháinig méadú ar tháirgeadh anion superoxide sa ghrúpa rialaithe (AGEanna spreagtha), ach laghdaíodh táirgeadh anion superoxide tar éis an ghrúpa rialaithe (AGEanna spreagtha), ach laghdaigh táirgeadh anion superoxide tar éis táirgeadh superoxide agus cosanta. na cealla ó dhamáiste ocsaídiúcháin. I gcás cealla LC-540, léirigh 10 µM ECH gníomhaíocht beagnach cosúil leis an ngnáthghrúpa. Laghdaíodh an táirgeadh superoxide sa dá chealla le méadú ar thiúchan ECH agus RES araon.

TUBULOSA CISTANCHE NÁDÚRTHA CHUN FEIDHM Gnéis A FHEABHSÚ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.1.4. Éifeacht ECH ar Tháirgeadh H2O2 i gCealla Leydig AGE-Stimulated

Rinneadh measúnacht DCFH-DA chun láithreacht speiceas ocsaídiúcháin a bhrath. Tar éis dul isteach sna cealla, déantar an dath fluaraiseacha DCFH-DA a ocsaídiú ag H2O2 intracellular agus foirmíonn sé dichlorofluorescein (DCF). Mar a léirítear i bhFíor 4, bhí méadú suntasach ar tháirgeadh H2O2 intracellular sa ghrúpa spreagtha ag AGE (rialú) ach laghdaigh cur leis 10 µM ECH agus RES táirgeadh H2O2 i gcealla go suntasach. Mar thoradh ar riaradh 10 µM ECH níor tháinig ach thart ar 47.1% de tháirgeadh H2O2, i bhfad níos ísle ná sa ghrúpa rialaithe.

3.1.5. Éifeacht ECH ar RAGE agus NF-κB Leibhéil Slonn Próitéin in AGE-spreagtha LC-540 Cealla Leydig

Rinneadh anailís ar bhloic an iarthair chun láithreacht RAGE i gcealla LC-540 Leydig a dhearbhú. Léiríodh éifeacht ECH ar leibhéil léirithe próitéin RAGE (Fíor 5a) agus NF-κB (Fíor 5b) i gcealla Leydig spreagtha ag AGEs i bhFíor 5. Léirigh na torthaí gur tharraing tiúchan 50 µg/mL de AGEanna RAGE níos airde agus NF- Laghdaigh slonn κB i gcealla LC-540 agus tiúchan 10 µM de ECH agus RES go suntasach slonn RAGE agus NF-κB. Bhí léiriú NF-κB i bhfad níos ísle in RES agus ECH ná i bhfrithghníomhaithe RAGE. Mar sin, dhearbhaigh na torthaí gur laghdaigh an ECH an leibhéal athlasadh trí leibhéal RAGE agus NF-κB a laghdú.

3.1.6. Éifeacht ECH ar chonair Sintéise Testosterone i gcealla AGE-spreagtha LC-540 Leydig.

Braitheann próiseas spermatogenesis agus neamhthorthúlacht fireann ar láithreacht testosterone. Mar a léirítear i bhFíor 6, tháinig laghdú suntasach ar na slonn ar phróitéiní Star (Fíor 6a), CYP11A1 (Fíor 6b), CYP17A1 (Fíor 6c), agus HSD17 3 (Fíor 6d) in LC spreagtha ag AGE{{11 }} Cealla Leydig (grúpa rialaithe). Méadaíodh go suntasach na léirithe ar phróitéiní Star, CYP11A1, CYP17A1, agus HSD17 3 nuair a cuireadh an antagonist RAGE, RES, agus ECH leis. Chonacthas an léiriú méadaithe ar phróitéiní Star agus CYP11A1 sna grúpaí cóireáilte ECH- agus RES araon. Bhí leibhéal na cainte CYP17A1 beagnach mar a chéile sna grúpaí RES agus ECH. Bhí slonn na próitéine HSD17 3 i gcealla Leydig atá cóireáilte le ECH i bhfad níos airde ná iad siúd i gcealla cóireáilte antagonist RES agus RAGE. Léirigh léiriú méadaithe ar phróitéiní Star, CYP11A1, CYP17A1, agus HSD17 3 gnáththáirgeadh testosterone.