CUID Ⅰ: Éifeacht Sliocht Cistanche Tubulosa ar Fheidhm Atáirgthe Fireann i bhFrancaigh Diaibéiteacha Streptozotocin-Iontartha Nicotinamide
Mar 04, 2022
Teagmháil: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Ríomhphost:audrey.hu@wecistanche.com
Zwe-Ling Kong ® Athira Johnson® Fan-Chi Ko, Jia-Ling He agus Shu-Chun Cheng
Coimriú:Is neamhord ainsealach é diaibéiteas arb é is sainairíonna é hyperglycemia mar gheall ar leibhéil laghdaithe insulin nó neamhéifeachtúlacht an fhíocháin chun é a úsáid go héifeachtach. Tugtar toradh mór ar diaibéiteas ar neamhthorthúlacht agus cuireann sé isteach ar an gcóras atáirgthe fireann trí lagú sperm agus mífheidhmiú gonadal a chur faoi deara.Cistanche tubulosaIs planda seadánacha é a bhfuil an cumas cuimhne, díolúine agus cumas gnéasach a fheabhsú, impotence a laghdú, agus constipation a íoslaghdú. Bhí an staidéar seo dírithe ar imscrúdú a dhéanamh ar éifeachtaí frith-athlastacha agus cosanta echinacoside (ECH) iSliocht Cistanche tubulosa(CTE) ar chóras atáirgthe fireann na bhfrancach diaibéitis. Rinneadh measúnú ar éifeachtaí frithocsaídeacha, frith-athlastacha agus cosanta CTE trí mhodhanna in vitro agus in vivo araon. Léiríonn na torthaí in vitro gur chuir an ECH bac ar tháirgeadh speiceas ocsaigin imoibríoch (ROS) agus gur fheabhsaigh sé léiriú próitéine Star, CYP11A1, CYP17A1, agus HSD17p3. Rinneadh an anailís in vivo le trí dháileog echinacoside (ECH) (80, 160, agus 320 mg/kg) in CTE. San iomlán, riaradh 0.571 mg/kg de rosiglitazone (RSG) mar rialú dearfach. Spreagadh diaibéiteas ag streptozotocin (STZ) (65 mg/kg) agus nicotinamide (230 mg/kg) i gcomhar le aiste bia ard-saill (45 faoin gcéad). Dheimhnigh na staidéir in vivo gur fheabhsaigh an ECH leibhéil siúcra fola, friotaíocht inslin, friotaíocht leptin, agus sárocsaídiú lipid. Is féidir leis kisspeptin 1 (KiSS1), gabhdóir GPR 54-chúpláilte le próitéin G, suppressor comharthaíochta cytokine 3 (SOCS-3), agus sirtuin 1 (SIRT1) abairt aigéad ribonucleic ribonucleic (mRNA) a chur ar ais sa hypothalamus agus gnéas a aisghabháil. leibhéal hormóin. Mar sin, dheimhnigh an staidéar seo éifeachtaí frithocsaídeacha, frith-athlastacha agus steroidogenesis CTE.
Eochairfhocail:diaibéiteas; neamhthorthúlacht ;Sliocht Cistanche tubulosa (CTE); echinacoside (ECH); gníomhaíocht frith-athlastach; gníomhaíocht frithocsaídeach; éifeachtaí steroidogenesis
Cóireáil diaibéiteas:Sliocht Cistanche tubulosa(CTE)
1. Réamhrá
Is coinníoll é Diaibéiteas mellitus (DM) ina bhfuil leibhéil mhéadaithe glúcóis san fhuil mar gheall ar neamhéifeachtúlacht an briseán chun go leor inslin a tháirgeadh, nó neamhábaltacht an chomhlachta é a úsáid go héifeachtach. De réir an WHO, d'ardaigh líon na ndaoine a bhfuil diaibéiteas orthu ó 108 milliún i 1980 go 422 milliún in 2014 [1]. Tá ceithre phríomhchatagóir ann: réamh-diaibéiteas (céim roimh diaibéiteas), cineál 1 (nuair a theipeann ar an briseán inslin a tháirgeadh), cineál 2 (teipeann ar an gcomhlacht inslin a úsáid), agus diaibéiteas gestational (a tharlaíonn le linn toirchis). Tarlaíonn strus ocsaídiúcháin mar gheall ar an éagothroime idir táirgeadh speiceas ocsaigin imoibríoch (ROS) agus frithocsaídeoirí [2] as a dtiocfaidh an riocht diaibéitis ar deireadh. Áirítear ar na deacrachtaí a bhaineann le diaibéiteas teip na duán, damáiste nerve, daille, stróc, taom croí, bás féatais, agus neamhthorthúlacht. [1]. Léiríonn staidéir go ndearnadh damáiste suntasach ar núicléis sperm, aigéad deoxyribonucleic (DNA), agus mitochondria in othair diaibéitis fireann [3]. Athróidh strus ocsaídiúcháin le linn iompar sperm próiseas an chórais atáirgthe fireann [4,5].
Tá an próiseas spermatogenesis á rialú ag ais hypothalamus-pituitary-gonadal (HPG). Spreagann an hormón a scaoileann gonadotropin (GnRH) a tháirgtear ag an hypothalamus táirgeadh hormone luteinizing (LH) agus hormón a spreagann follicle (FSH). Faightear cealla Leydig in aice leis an tubule seminiferous agus táirgeann siad testosterone faoi rialú LH. Spreagann FSH táirgeadh próitéin ceangailteach antigen (ABP) a chabhraíonn leis an hormone fireann a chur ar aghaidh. Mar sin, tagann neamhthorthúlacht agus fadhbanna eile chun cinn go príomha mar gheall ar an suaitheadh a tharlaíonn san ais HPG. Spreagann riarachán an mheascáin de streptozotocin-nicotinamide diaibéiteas i bhfrancaigh turgnamhacha. Is cumaisc cheimiceach é Streptozotocin atá tocsaineach do chealla p a tháirgeann inslin sa briseán agus is vitimín intuaslagtha in uisce é nicotinamide a chosnaíonn na cealla p ó dhamáiste iomlán [6].
Is speiceas planda fásach é Cistanche tubulosa ar a dtugtar "Rou Cong-Rong" [7] freisin. Is planda seadánacha neamh-chlóraifill é a fhásann go príomha ar fhréamh an chrainn Calotropis Procera agus a dháileadh go forleathan i dtír arid Gansu, Qinghai, Xinjiang, Mhongóil, an Iaráin agus an India. Is é an t-ainm coitianta Cistanche tubulosa ná "Desert Hyacinth". Glactar leis go forleathan i míochaine traidisiúnta na Síne agus tugadh an t-ainm "Ginseng of the Desert". Úsáidtear go forleathan é sa réimse míochaine chun cóireáil a dhéanamh ar leucorrhea morbid, metrorrhagia profuse, galair duánach ainsealacha, constipation, impotence, agus infertility. Comhábhair cheimiceacha deCistanche tubulosacomhdhéanta de gliocóisídí feanileatánóideach neamh-so-ghalaithe (PHGanna), iridoids, lignans, olaí so-ghalaithe, alditols, oligosaccharides, agus polaisiúicrídí [8]. Léiríonn staidéir go gcosnaíonn echinacoside ón luibh seo an fibroblast damáiste trí leibhéil ROS a rialáil [9]. Táirgeann an cumaisc seo gníomhaíochtaí frithocsaídeacha, vasorelaxation, agus frith-athlastach mar aon le cosc neuroprotection agus oistéapóróis [10,11].
Bhí sé mar aidhm ag an staidéar seo imscrúdú a dhéanamh ar anéifeacht sliocht Cistanche tubulosaina bhfuil ECH ar mhífheidhm atáirgthe an fhrancaigh diaibéiteach streiptezotocin-nicotinamide-spreagtha.
Cistanche tubulosa
2. Ábhair agus Modhanna
2.1.Ábhair
Ceannaíodh ECH agus CTE ó Sinopharm Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Taiwan). Ceannaíodh táirgí deiridh glycation ard (AGEanna) ó Biovision (San Francisco, CA, SAM). Ceannaíodh línte cille LC-540 agus TM3 ón Institiúid Taighde agus Forbartha Tionscal Bia (Hsinchu, Taiwan). Ceannaíodh francaigh fireann Sprague-Dawley (SD) cúig seachtaine d'aois ó Ionad Ainmhithe na Saotharlainne Náisiúnta (Taipei, Taiwan). Ceannaíodh Feed Lab Diet® ó PMI Nutrition International, Inc. (Taipei, Taiwan). Fuarthas 2,2-défheinile-1-phiccrylhydrazil (DPPH) ó Sigma (St. Louis, MO, SAM). Ceannaíodh meatánól agus 4-(2-hiodrocsaitil)-1-aigéad píobaireatán-atáinesulfónach (HEPES) ó Sigma freisin. Fuarthas meán Eagle/F12 modhnaithe Dulbecco agus trypsin-EDTA ó GIBCO (Nua-Eabhrac, NY, SAM). 3-(4, 5-démheitilthiazol-2-il)-2, 5-bróimíd défheiniltetrazolium (MTT), déchlóra-dé-hidrea-fhluaraiséin (DCFH-DA), ceannaíodh sulfocsaíd dimethyl (DMSO), agus tetrazolium nitroblue (NBT) ó Sigma. Fuarthas feisteáin einsímeacha glúcóis ó Kyokutoseiyaku, Tóiceo, an tSeapáin. Ceannaíodh feisteáin inslin ELISA ó Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Uppsala, an tSualainn). Fuarthas Imoibrí Eastóscadh Próitéine Fíocháin T-PER ó Thermo Scientific (Chicago, IL, SAM). Fachtóir núicléach Frithdhuine/Luch/Francach-kappa B Ceannaíodh antasubstaintí polachlónacha NF-kB ó Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, SAM. Gabhdóir Frith-Luch/Rat le haghaidh antashubstaintí ilchlónacha ard-ghlicínithe (RAGE), antasubstaintí polachlónacha frith-Daonna/Luch/Rat Star, agus antasubstaintí monachlónacha frith-Duine/Luch/Rat P{30}}Ceannaíodh antasubstaintí monachlónacha A1 ó Gene Tex. (Irvine, CA, SAM). Fuarthas antasubstaintí polachlónacha Frithdhaonna/Luch/Rat CYP11A1 ó Theicneolaíocht Comharthaíochta Cille (Beverly, PA, SAM). Ceannaíodh an t-imoibrí éasca-Gorm ó Invitrogen, Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA, SAM). Fuarthas Agarose agus marcóir DNA 100 bp ó Promega, Corporation (Madison, WI, USA). Ceannaíodh Kit Mini Fíocháin Lipid RNeasy ó QIAGEN, Hilden, an Ghearmáin.
2.2.Modhanna
2.2.1. Anailís In Vitro
LC{{0}} agus Cultúir Cealla TM3: Saothraíodh na línte cille LC-540 ag 37 OC i meán Réitigh Chothromaithe Salainn Earle (EBSS) arna fhorlíonadh le décharbónáit sóidiam (1.5 g/L), L. -glutamine (2 mM), aimínaigéid neamhriachtanacha (0.1 mM), pyruvate sóidiam (1.0 mM), agus séiream bó féatais (FBS) (10 faoin gcéad) i gceann 5 faoin gcéad gorlann CO2 (gorlann CO2, Napco 5410, Taiwan). Saothraíodh an líne chill TM3 i meán Eagle modhnaithe Dulbecco/s (DMEM) arna fhorlíonadh le glúcós (4.5 g/L), piriváit sóidiam (0.5 mM), L-glutamine (2.5 mM), décharbónáit sóidiam (1.2 g/L), 4-(2-hiodrocsaieitil)-1-aigéad píobaireatáneisulfónach (HEPES, 15 mM), agus séiream lao féatais (FCS, 10 faoin gcéad ) nó séiream capaill (5 faoin gcéad) ag 37 OC i gceann 5 faoin gcéad gorlann CO2.
Cinneadh ar Inmharthanacht Cille Echinacoside (ECH): 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-il)-2,{5}} bróimíd défheiniletrasóiliam (MTT) imoibrí a úsáidtear le haghaidh measúnú inmharthanachta cille. Coigeartaíodh an tiúchan cille go 2 x 105 cill / mL i 96-phláta tobair. Ansin, cuireadh 20 卩L de ECH (caolaithe i 2 faoin gcéad de mheán) leis agus gor ar feadh 24 h ag 37 OC i gorlann 5 faoin gcéad CO2. Níos déanaí, cuireadh 100 卩L d'imoibrí MTT leis agus gor é do 4hat37 OC faoi choinníollacha dorcha. Tomhaiseadh an t-ionsúcht ag 570 nm (léitheoir ELISA, Dynatech MR5000, Kloten, an Eilvéis).
Restive CeH viabiHiy ( faoin gcéad )=[(Sampla ag 570 nm — Fán ag 570 nm)]/[(Arialú ag 570 — Fán ag 570)] x 100.
Measúnacht Laghdaithe Nitroblue Tetrazolium (NBT) agus 2,2-défheinile-1-Measúnú picrylhydrazil (DPPH): Athraíodh líon na gceall go 1 × 1{{1{0}6 cealla/mL . Ansin, cuireadh 50 mg/mL de ECH, resveratrol (RES), agus táirgí deiridh glycation ardleibhéil (AGEs) (rialú) leis agus comhshaothraíodh iad ar feadh 18 h ag 37OC. Ansin, cuireadh 0.3 ml de thuaslagán NBT (0.1 mg / ml NBT, 5 faoin gcéad FBS, agus 3 faoin gcéad sulfocsaíd démheitil (DMSO) tuaslagtha i 10 ml DMEM) agus gor ag 37 OC i 5 faoin gcéad CO2 ar feadh 1 h. Tar éis lártheifneoraithe (ag 800 xg ar feadh 3 nóiméad) baineadh an sásar agus cuireadh 200 卩L DMSO leis agus croitheadh é ar feadh 5 nóiméad in oscillator ultrasonaic (Delta Ultrasonach Glantóir D 200, Keelung, Taiwan). Tomhaiseadh an ionsúchán ag 630 nm. Maidir le measúnacht radacach DPPH, glacadh le Trolox (in alcól 95 faoin gcéad) mar an caighdeán. Ansin, meascadh 75 卩L de thuaslagán DPPH 0.5 mM le 25 卩L de shamplaí agus ceadaíodh imoibriú ag teocht an tseomra in áit dorcha ar feadh 30 nóiméad. Croitheadh an meascán agus tomhaiseadh an ionsúchán ag 517 nm.
Speicis Ocsaigin Imoibríocha (ROS) Anailís Ábhar: Athraíodh uimhir na cille go 2 x 105 cill/mL i 12-phláta tobair ina raibh 2 faoin gcéad FBS. Ansin, cuireadh 50 卩L/ml de ECH, RES, agus AGEs leis an pláta agus gor ag 37 OC ar feadh 24 h. Tar éis 24 h, cuireadh 2Z, 7Z-dichlorofluorescein-diacetate (DCFH-DA) leis agus gor ag 37 OC ar feadh 30 nóiméad. Tar éis lártheifneoraithe (400x g, 5 min), baineadh an súiteán agus nite na cealla faoi dhó le saline maolánach fosfáit (PBS). Tar éis cealla a chur ar fionraí i 1 mL de PBS agus socraíodh leibhéil ROS trí úsáid a bhaint as cíteaiméadar sreafa (Sreabhadh Cytometer, Becton Dickinson, CA, SAM).
Aithint agus Anailís Chainníochtúil Próitéin: Baineadh próitéiní trí úsáid a bhaint as imoibrí eastóscadh próitéin (T-PER). Coigeartaíodh an dlús cille go 2 x 105 cealla/ml i 12-pláta tobair agus 50 卩L/mL de ECH, RES, agus gabhdóir don fhrithghníomhaí ard-glication endproduct (RAGE), agus cuireadh AGEanna leis agus gortha ag 37 OC i gorlann 5 faoin gcéad CO2 ar feadh 24 h. Ina dhiaidh sin, cuireadh 400 卩L de T-PER leis, scríobtar as na cealla iad, agus lártheifneoiríodh iad ag 125,000xg ar feadh 20 nóiméad (4 OC). Bailíodh agus stóráladh an comhshnaidhm ag -80 OC (-80 reoiteoir OC, Nuaire, Plymouth, MN, SAM) le haghaidh tuilleadh anailíse. Baineadh úsáid as trealamh aigéad bicinchoninic (BCA) le haghaidh cainníochtú próitéine. Ansin, cuireadh 10 卩L de thuaslagán cille caighdeánach agus 200 RL de imoibrí BCA le 8-plátaí tobair agus gor iad ag 37 O Cin, gorlann 5 faoin gcéad CO2 ar feadh 30 nóiméad. Tomhaiseadh an ionsúchán ag 562 nm. Rinneadh anailís aitheantais próitéine trí leictreafóiréis glóthach dodeicile sulfáit sóidiam (SDS)-polyacrylamide (SDS-PAGE). Ullmhaíodh samplaí trí lysáit próitéine a chur le maolán luchtaithe próitéine agus rinneadh anailís ar bhloic thiar chun na próitéiní sonracha a bhrath.
2.2.2.Anailís In Vivo
Dearadh Múnla Ainmhithe: Ceannaíodh seasca {{0} francach fireann seachtaine d'aois Sprague-Dawley (SD) ó Lárionad Náisiúnta Ainmhithe na Saotharlainne (Taipei, Taiwan). Bhí gach francach lonnaithe ina n-aonar i cages cruach dhosmálta díghalraithe faoi theocht rialaithe (23 土 1 céim ) agus taise (40-60 faoin gcéad) le timthriall dorcha 12 h solais / 12 h. Cuireadh bia agus uisce ar fáil ad libitum. Bhí gach francach ceansaithe sa chéad seachtain agus tugadh aiste bia creimire saotharlainne 5001 mar phríomh-aiste bia. Lean na nósanna imeachta go léir caighdeán an Choiste Institiúideach um Chúram agus Úsáid Ainmhithe (Ceadú IACUC Uimh. 101026) de chuid Ollscoil Aigéan Náisiúnta Taiwan, Taiwan. Tar éis domestication, roinntear francaigh ina dhá ghrúpa: an grúpa rialaithe (Con) a chothaíodh le aiste bia saotharlainne 5001, agus an grúpa diaibéitis a chothaíodh le aiste bia ard-saill (HFD, 40 faoin gcéad) don turgnamh iomlán. Tar éis dóibh a bheith cothaithe leis an HFD ar feadh 4 seachtaine, cuireadh streptozotocin (65 mg/kg) (STZ) ar fhrancaigh an ghrúpa diaibéitis chun diaibéiteas mellitus (DM) a spreagadh. Laistigh de 15 nóiméad tar éis STZ a instealladh, cuireadh nicotinamide (230 mg/Kg Meáchan Coirp) instealladh. Seachtain tar éis an insteallta, rinneadh tástáil lamháltais glúcóis béil (OGTT) chun ionduchtú rathúil Mellitus diaibéitis (DM) a chinneadh. Tar éis sin, roinneadh na hainmhithe i sé ghrúpa: an rialú (chothaithe le aiste bia saotharlainne 5001); Grúpa DM (DM móide 45 faoin gcéad HFD); Grúpa DMR (DM móide rosiglitazone: 0.571 mg/kg BW) móide 45 faoin gcéad HFD; Grúpa DME1 (DM móide CTE: 80 mg/kg BW) móide 45 faoin gcéad HFD; Grúpa DME2 (DM móide CTE: 160 mg/kg BW) móide 45 faoin gcéad HFD; agus grúpa DME4 (DM móide CTE: 320 mg/kg BW) móide 45 faoin gcéad HFD. Glacadh le Rosiglitazone (RSG) mar an rialú dearfach. Baineadh úsáid as trí dháileog de CTE (80, 160, agus 320 mg/kg) de réir mholadh treoirlínte meastóireachta feidhmiúla bia sláinte ó Riarachán Bia agus Drugaí Taiwan (TFDA). Tugadh cóireálacha go dtí deireadh an turgnaimh. Rinneadh na francaigh turgnamhacha go léir a íobairt tar éis 6 seachtaine. Bailíodh an fhuil ó na francaigh a lártheifneoiríodh ag 3000 rpm ar feadh 15 nóiméad ag 4 chéim.
Mian comhábhair éifeachtacha cistanche tubulosa
Scrúdaíodh an comhshnaidhm don anailís seo a leanas
Cinneadh Iomlán Glúcóis, Triglyceride, agus Cholesterol: Rinneadh an cinneadh glúcóis trí threalamh einsímeacha glúcóis. Ansin, cuireadh 20 sampla plasma fola leis na himoibrithe agus coinníodh iad ag 37 céim ar feadh 5 nóiméad. Socraíodh na tríghlicrídí iomlána agus an tiúchan iomlán colaistéaróil trí úsáid a bhaint as feisteáin einsímeacha triglyceride agus colaistéaról. Ansin, cuireadh 10 ^L plasma fola leis na himoibrithe agus rinneadh an turgnamh de réir threoir an mhonaróra. Tomhaiseadh an ionsúchán ag 510 nm.
Plasma iomlán glúcóis/tríghlicríd/colaistéaról (mg/dL)=(-ABlank)/(Caighdeánach - Ablank) x 200.
A sampla: Samplaí fola a ionsú, Ablank: Luach ionsú feiste gan sampla, A caighdeánach: Luach ionsúcháin an imoibrí caighdeánach, 200: imoibrí caighdeánach ag tiúchan 200 mg/dL.
Cinneadh Insulin, Leptin, agus Measúnaithe Múnla Homeostatach-Friotaíocht Insline (HOMA-IR): Socraíodh an leibhéal inslin le feisteáin inslin ELISA. Anseo, cuireadh 25 plasma fola leis na himoibrithe agus tomhaiseadh an t-ionsúcht ag 450 nm. Cinneadh an t-ábhar iomlán leptin trí úsáid a bhaint as trealamh measúnaithe imdhíonmhéadrach einsím leptin. Ansin, rinneadh anailís ar 100 plasma agus tomhaiseadh an t-ionsúcht ag 450 nm ag baint úsáide as léitheoir ELISA. Rinneadh an turgnamh ar fad de réir threoir an mhonaróra. Socraíodh an luach HOMA-IR ón gcothromóid measúnaithe samhail hoiméastáis=Tiúchan inslin plasma troscadh (mU/mL) x tiúchan glúcóis plasma troscadh (mmol/L)/22.5.
Sárocsaídiú Lipid Plasma: Anseo, rinneadh {{0}}.5 ml de phlasma fola a mheascadh le 1 mL d'imoibrí (15 faoin gcéad , w/v d'aigéad tríchlóraaicéiteach in 0.25 N aigéid hidreaclórach (HCl) ) agus 0.375 faoin gcéad , w/v aigéad thiobarbituric i 0.25 N HCl) agus a chur i ndabhach uisce (Folctha Uisce, BUCHI461, Zurich, An Eilvéis) ag 100 céim C ar feadh 15 nóiméad. Tar éis fuaraithe, cuireadh 1 ml de n-butanol leis, croitheadh go bríomhar, agus lártheifneoirithe ag 1500 xg ar feadh 10 nóiméad. Bailíodh an forshúchán agus tomhaiseadh an t-ionsúcht ag 532 nm [12].
Tiúchan malondialdehyde (MDA) (nM/mL)=[(ASample ag532 nm - Abán ag 532 nm)/ (Caighdeánach ag 532 nm - Bán ag 532 nm)] x 5.
Leibhéil Testosterone Plasma agus Hormone Luteinizing (LH) a Chinneadh: Baineadh úsáid as an trealamh testosterone ELISA chun leibhéal testosterone sa phlasma fola a thomhas. Baineadh úsáid as trealamh ATR chun an tiúchan LH a chinneadh. Ansin, cuireadh 50 卩L plasma leis agus bhí na ríomhanna bunaithe ar thiúchan an hormóin LH-RP-3 (caighdeánach). Rinneadh na céimeanna breise de réir threoracha an mhonaróra.
Cinneadh Fachtóir Neacróis Mheall (TNF)-a agus Interleukin-6 (IL-6) Tiúchan: Caolaíodh an antashubstaint a gabhadh 250 uair i maolán brataithe, curtha le {{4} }pláta tobair (100 卩L/tobar), agus coinnithe ag 4 céim C ar feadh oíche. Rinneadh an comhshnámh a asú agus a ní cúig huaire le maolán níocháin (1 uair PBS, 0.05 faoin gcéad Tween 20). Tar éis gor (1 h) le 200 ^ g de chaolaitheoir measúnachta, nite na cealla 5 huaire le maolán níocháin agus cuireadh 100 ^L de TNF - tuaslagán caighdeánach nó samplaí tástála le gach tobar agus goraíodh iad ar feadh 2 h. Tar éis níocháin, cuireadh 100 RL d'antasubstaintí braite IL leis agus gor iad le haghaidh 1 hata teocht an tseomra. Rinneadh an súthaire a asú agus a ní 5 huaire. Ansin, cuireadh 480 RL de einsím avidin-horseradish peroxidase (HRP) leis agus gor iad ar feadh 30 nóiméad ag teocht an tseomra. Rinneadh an súthaire a asú agus a ní cúig huaire le maolán níocháin. Ansin, cuireadh 100 RL de thuaslagán tsubstráit leis agus gor é ar feadh 15 nóiméad ag teocht an tseomra. Níos déanaí, cuireadh 50 RL de thuaslagán stad (aigéad fosfarach 1M) le gach tobar agus tomhaiseadh an t-ionsúcht ag 450 nm.
An leas a bhaint as Cistanche Echinacoside: Frith-ocsaídiúcháin
Anailís ar Pharaiméadair Sperm agus Táistis
Bailiúchán Samplach Sperm: Rinneadh an bailiúchán samplaí sperm de réir an mhodha a tuairiscíodh roimhe seo i [13]. Bailíodh an speirm ón ollnóva agus úsáideadh é le haghaidh tuilleadh anailíse.
An Líon Sperm, Motility Sperm, agus Sperm Neamhghnácha: Ríomhadh líon na sperm ag baint úsáide as an tuaslagán gorm haemocytometer agus trypan. Ansin, rinneadh 100 RL de leacht sperm a mheascadh le réiteach gorm trypan, agus ríomhadh líon na sperm, motility, agus sperm neamhghnácha ag baint úsáide as hemocytometer agus micreascóp [14].
Laghdú Nitro gorm Tetrazolium NBT agus Sárocsaídiú Lipid Sperm agus Testis: Rinneadh anailís ar shárocsaídiú lipid agus laghdú NBT de réir an nós imeachta céanna d'anailís plasma.
Cinneadh Superoxide Dismutase (SOD) agus Gníomhaíocht Cataláis: Rinneadh anailís ar ghníomhaíocht Superoxide dismutase (SOD) trí úsáid a bhaint as trealamh RANSEL. Anseo, {{0}}.0Cuireadh 5 ml d'aonchineálachtaí testicular le 1.7 mL de thuaslagán imoibrithe (0.05 mM xanthine, 0.025 mM 2-({{ {9}}iaidíféinil)- 3-(4-níotrfeinil)-5-clóiríd feiniletrasóliam (INT)). Tar éis meascadh, cuireadh 0.25 ml xanthine oxidase (80 U/L) leis agus imoibriú ag teocht an tseomra ar feadh 30 s ag teocht an tseomra. Tomhaiseadh an ionsúchán ag 505 nm. Socraíodh tiúchan próitéine an homogenáit testicular ag trealamh measúnaithe próitéin Bio-Rad DC agus ríomhadh a ghníomhaíocht shonrach (próitéin U/mg). Cinneadh an ghníomhaíocht catalase (CAT) de réir modh a tuairiscíodh roimhe seo [15].
H&E (Hematoxylin agus Eosin) Staining
Bhí an testis sáithithe i 10 faoin gcéad de formalin ar feadh 24 h agus a stóráil ag 4 céim C. slisnithe na fíocháin isteach i méid micrea agus ceangailte leis an sleamhnán. Tar éis a shocrú (95 faoin gcéad meatánóil móide 5 faoin gcéad aigéad aicéiteach), tumtha na sleamhnáin i hematoxylin ar feadh 3 min, nite le huisce reatha ar feadh 5 min, agus ansin iad sáithithe le 50 faoin gcéad, 70 faoin gcéad, agus 90 faoin gcéad alcól ar feadh nóiméad amháin. Tar éis sin, bhí na sleamhnáin dhaite le eosin ar feadh 10 s agus sáithithe i 100 faoin gcéad alcól ar feadh nóiméad amháin go dtí go faded sé. Ar deireadh, bhí an sleamhnán sáithithe i xiléin ar feadh nóiméad amháin. Níos déanaí, bhí an sleamhnán aer-triomaithe agus séalaithe. Cuireadh an feadán daite i micreascóp codarsnachta céime inbhéartaithe (Micreascóp Difríochta Céim Inbhéartaithe, Olympus CK-2, Tóiceo, an tSeapáin) chun an mhoirfeolaíocht a urramú.
Anailís ar an Hypothalamus
Aithníodh na seichimh ghéine luch KISS1, G-próitéin-chúpláilte (GPR) 54, suppressor comharthaíochta cítocine 3 (SOCS-3), agus sirtuin 1 (SIRT1) ó bhunachar sonraí géine an NCBI (An Lárionad Náisiúnta um Fhaisnéis Biteicneolaíochta). agus dearadh primer ar leith ag baint úsáide as Primer 5.0 PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, USA.). Tá na primers a úsáideadh sa turgnamh liostaithe i dTábla 1.
Eastóscadh aigéad ribonúicléach (RNA) ón Hypothalamus. Rinneadh eastóscadh RNA ó hypothalamus na hinchinne trí úsáid a bhaint as an Mini Kit Fíocháin Lipid RNeasy. Rinneadh na mRNAs a fuarthas a thomhas go cainníochtúil trí thrascríobh droim ar ais (RT) agus imoibriú slabhra polaiméireáis (PCR). Stóráladh an DNA molta a fuarthas ó anailís RT ag -20 céim le húsáid níos déanaí. Rinneadh anailís ar imoibriú slabhrúil polaiméaráise (PCR) ar an DNA asbhainte ag baint úsáide as Taq polymerase. Ansin, tógadh 5~10 ^L den táirge PCR agus rinneadh anailís orthu trí leictreafóiréis ar choilóideach agar 1.5 faoin gcéad. Tógadh an íomhá i gcóras íomháithe UVP BioDoc-It. Tógadh aigéad deocsairibonúicléach comhlántach droim ar ais (cDNA) agus rinneadh PCR ag baint úsáide as an IQ SYBR Green Supermix Kit. Níos déanaí, rinneadh anailís air le iQTM 5 Optical System Software. Baineadh próitéiní amach trí úsáid a bhaint as imoibrí eastóscadh próitéin (T-PER). Ansin, cuireadh 20 mg de homogenate testicular le 400 ^L de T-PER agus lártheifneoiriú (Lártheifneoir Ardluais, Hettich CR-12, Tuttlingen, an Ghearmáin) ag 4 céim (125,000 xg) le haghaidh 20 nóim. Bhí an modh seo a leanas cosúil le "anailís aitheantais agus cainníochtaithe ar phróitéin" anailís in vitro.
2.3.Anailís Staidrimh
Cuireadh na torthaí turgnamhacha in iúl mar an meándiall caighdeánach 土 (Meán 土 SD) agus rinneadh anailís ar na sonraí trí úsáid a bhaint as bogearraí Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.0, IBM, Armonk, New York, NY, USA. Rinneadh anailís aontreo ar an éagsúlacht (ANOVA) ar na difríochtaí idir na grúpaí. Rinne tástáil Duncan anailís ar chomparáidí iolracha de ghrúpaí éagsúla ag luach p < 0.05="" mar="" an="" leibhéal="">
