Cistanche:Cuireann Echinacoside Fás Cille Adenocarcinoma Pancreatach faoi Chosc Trí Apoptóis a Spreagadh Trí Chonair Kinase Próitéin-ghníomhaithe Mitogen

Teagmháil: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Ríomhphost:audrey.hu@wecistanche.com

WEI Wang, JINBIN LUO, YINGHUI LIANG agus XINFENG LI

Teibí.

Tá aird faighte ag cur i bhfeidhm cliniciúil táirgí nádúrtha a dhíorthaítear ó leigheas traidisiúnta na Síne i gceimiteiripe ailse.Echinacoside(ECH), ceann de na feinileatánóidí, atá scoite amach ó na gaisCistanche(leigheas luibhe Síneach) tá éifeachtaí fíocháin-chosanta agus frith-apoptotic ar an néarchóras lárnach. Mar sin féin, tá sé do-fheicthe den chuid is mó an bhfuil gníomhaíocht siadaí-shochtaithe ag ECH. Sa staidéar reatha, léiríodh gur féidir le ECH bac suntasach a chur ar iomadú cealla adenocarcinoma pancreatach trí tháirgeadh speiceas ocsaigine imoibríoch a spreagadh agus acmhainneacht membrane mitochondrial a shuaitheadh ​​agus mar sin apoptosis a spreagadh. Ina theannta sin, léiríodh go raibh ECH(Echinacoside)represses fás cille meall trí ghníomhaíocht MAPK mhodhnú. Mar fhocal scoir, nochtann an staidéar seo feidhm nua de ECH(Echinacoside) maidir le forbairt ailse a chosc, agus tugann sé le tuiscint go bhféadfadh úsáid ECH a bheith ina straitéis cheimiteiripeach fhéideartha le haghaidh ailse.

Réamhrá

Maolaíonn an cosán um shochtadh meall p53 trí ionduchtú an tsuppressor siadaí, ARF díghrádú p53 idirghabhálaithe E3-luiche ligáis nóiméad dúbailte (MDM) (3). Is meicníocht uathrialaithe, féinchosanta é seo a chuireann cosc ​​ar chealla ó chlaochlú urchóideach. Go háirithe, is féidir le p53 gníomhaíocht Myc a athbhrú trí ghníomhachtú go tras-scríobhach, mar shampla, miR-145 a dhíríonnMycmRNA le haghaidh tosta aistriúcháin (4,5), rud a fhoirmíonn lúb rialála aiseolais diúltach.

Is í an straitéis is simplí agus is éifeachtaí chun ailse a chóireáil ná na cealla ailse a mharú. Léirítear go gcuireann na drugaí frith-ailse a úsáidtear go coitianta, mar shampla cisplatin (6), actinomycin D (7), agus adriamycin (8) bac ar fhás siadaí trí apoptosis a chur chun cinn. Le déanaí, léirigh fianaise atá ag fás go léiríonn roinnt táirgí nádúrtha agus díorthaigh ó phlandaí, go háirithe ó phlandaí íocshláinte a úsáidtear i leigheas traidisiúnta na Síne (TCM), feidhm siadaí-shochtadh trí aslú apoptosis na gceall ailse agus go bhfuil an cumas acu cur i bhfeidhm cliniciúil. i teiripe ailse (9). Mar shampla, tá an emodín anthraquinone nádúrtha scoite amach ó go leor cineálacha cealla ailse (10,11). Camptothecin, a dhíorthaítear ón 'crann sásta' Síneach,Camptotheca acuminate, is táirge nádúrtha luachmhar é a chuireann bac ar ligation DNA tar éis briseadh snáithe topo I-idirghabhála (12). I staidéar siarghabhálach eile ar chohórt daonra-bhunaithe ar 729 othar san iomlán a raibh ailse chíche chun cinn acu, tugadh le tuiscint gur féidir le teiripe TCM cur le cóireáil ailse. As an gcohórt seo, bhí 115 othar ina n-úsáideoirí TCM agus níor úsáid 614 othar TCM. Léirigh an anailís multivariate, i gcomparáid le neamh-úsáideoirí, go raibh baint ag úsáid TCM le riosca laghdaithe go suntasach de bhásmhaireacht gach cúise (13). Léirigh na torthaí thuasluaite go léir gur leigheas comhlántach agus malartach tábhachtach é TCM is féidir a úsáid chun ailse a chóireáil.

lucha le gortú scamhóg géarmhíochaine (16,17). Chomh maith leis sin, ECH(Echinacoside)Tá sé léirithe go bhfuil éifeachtaí cosanta ar fhíochán nerve agus feabhas a chur ar neamhoird iompraíochta i múnlaí murine de ghalar Parkinson (18). Go háirithe, fuarthas amach go gcuireann ECH iomadú cille chun cinn agus go gcuireann sé bac ar apoptosis i gcealla MODE-K epithelial intestinal luch (19). Go dtí seo, áfach, níor tugadh aird níos lú ar ról féideartha ECH i gcosc ailse.

Sa staidéar seo, rinneadh iniúchadh an bhfuil tionchar ag cóireáil ECH ar fhás agus ar iomadú cille meall agus an bhfuil ECH(Echinacoside)spreagann sé apoptosis, ardaíonn sé táirgeadh speiceas ocsaigin imoibríoch (ROS) agus laghdaítear acmhainneacht membrane mitochondrial (MMP), agus dá bhrí sin cuireann sé bac ar fhás cille siadaí. Ina theannta sin, bhí sé mar aidhm ag an staidéar seo na meicníochtaí móilíneacha atá freagrach as cosc ​​ar fhás ceall trí mheán ECH a shainaithint.

Ábhair agus modhanna

cill líne, imoibrí, agus antasubstaintí.Saothraíodh cealla adenocarcinoma pancreatic SW1990 (ATCC, Manassas, VA, USA) i meán Eagle modhnaithe Dulbecco agus forlíonta le 10 faoin gcéad de shéiream bó féatais, peinicillin 50 U/ml agus 0.1 mg/ml streiptimícin ag 37˚C in a. 5 faoin gcéad CO2 atmaisféar humidified. ECH(Echinacoside)ceannaíodh ó Jrdun Biotechnology Corp. (Shanghai, an tSín). Ceannaíodh antasubstaintí i gcoinne AKT, P-AKT, ERK, P-ERK, JNK, p-JNK, P38, p-P38, agus GAPDH ó Cell Signaling Technology (Danvers, MA, SAM); ceannaíodh frith-Bax agus frith-Bcl-2 ó Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, SAM); agus ceannaíodh frith-Casase-3 ó Abcam (Shanghai, an tSín).

cill inmharthanachtmeasúnacht. Chun ráta fáis cille siadaí a mheasúnú, baineadh úsáid as trealamh Comhairimh Cille{{{0}} (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD, USA) de réir threoracha an déantóra. Síolaíodh fionraí ceall ag 5,000 cill in aghaidh an tobair le cóireáil ECH ar feadh 0, 12, 24, 48 nó 72 h i 96 -phlátaí saothraithe tobair. Cinneadh cosc ​​ar fhás cille trí imoibrí WST-8 a chur leis ón trealamh CCK-8 ag tiúchan deiridh de 10 faoin gcéad le gach tobar, agus tomhaiseadh ionsú na samplaí ag 450 nm ag baint úsáide as léitheoir micreaphláta (Multiskan MK3; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA).

Hoechst 33342 staining.Cóireáladh cealla (comhfluence 60 faoin gcéad) le Hoechst 33342 (Institiúid Biteicneolaíochta Beyotime, Haimen, an tSín) ag tiúchan deiridh de 1µg/ml, gortha i gorlann 37˚C ar feadh 15 nóiméad, nite le saline maolánach fosfáit faoi dhó, fosaithe i paraformaildéad 4 faoin gcéad ar feadh 30 nóiméad ag teocht an tseomra, agus suite ar shleamhnáin. Breathnaíodh athruithe moirfeolaíocha na núicléis cille faoi mhicreascóp fluaraiseachta (Olympus BX51, Melville, NY, USA). Bhí na gnáthnúicléis cruinn agus dhaite gorm éadrom, fad is a bhí na núicléis apoptotic crapadh agus dath gorm geal orthu.

Fluaraiseacht-gníomhachtaithe cill sórtáil (FACS) anailísí.Chun apoptosis a mheasúnú, baineadh úsáid as an trealamh braite fluorescein isothiocyanate (FITC)-Iarscríbhinn V Apoptosis (BD Biosciences, Shanghai, China) de réir threoracha an mhonaróra. Go hachomair, niteadh cealla 5x10 le PBS fuar-oighear, athchuireadh iad i maolán ceangailteach 0.1 ml (Institiúid Biteicneolaíochta Beyotime), agus stainníodh iad le 10 ml de Annexin V comhchuingeach FITC (10 mg/ml) agus 10 ml iaidíd próipidiam (PI) (50 mg/ml). Tar éis goir ar feadh 15 nóiméad ag teocht an tseomra sa dorchadas agus maolán ceangailteach 400 ml a chur leis, rinneadh anailís ar na cealla trí chitoiméadar sreafa (C6; BD Biosciences, Shanghai, An tSín).

Tomhas de imoibríoch ocsaigine speiceas (ROS).Chun meastóireacht a dhéanamh ar tháirgeadh ROS, baineadh úsáid as an trealamh Measúnaithe Speiceas Ocsaigin Imoibríoch (Biteicneolaíocht bhríomhar, Beijing, an tSín) de réir threoracha an mhonaróra. Go hachomair, lománaíodh cealla (cumar 80 faoin gcéad) agus nite le PBS sula staining iad leis an tuaslagán dihydroethidium (DHE) (Institiúid Biteicneolaíochta Beyotime). Rinneadh anailís ar chealla ansin trí anailísí cítiméadracha sreafa.

Tomhas de miteachondrial membrane poitéinseal (MMP).

Baineadh úsáid as trealamh Measúnaithe eistear meitile tetramethylrhodamine (TMRM) (ImmunoChemistry Technologies, Bloomington, MN, SAM) chun na hathruithe ar MMP a bhrath. Go hachomair, baineadh cealla (cumar 80 faoin gcéad), nite le PBS agus dhaite le TMRM ar feadh 15-20 nóiméad i gorlann 37˚C. Ansin nite cealla uair amháin le PBS agus cuireadh faoi anailísí cítiméadracha sreafa.

Imdhíonadhanailísí. Baineadh na cealla (cumar 80 faoin gcéad) agus lísíodh iad i maolán RIPA (Biteicneolaíocht Jrdun) comhdhéanta de 50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 faoin gcéad NP-40, 1 faoin gcéad sóidiam aigéad deocsacholic agus 0.1 faoin gcéad SDS agus coscairí proteasome nua-chur leis. Baineadh úsáid as cainníochtaí comhionanna de lysate cille soiléir le haghaidh anailíse immunoblotting mar a thuairiscítear roimhe seo (20).

Staidrimh anailís.Sloinntear sonraí cainníochtúla mar an meán ± diall caighdeánach. Rinneadh difríochtaí staitistiúla a mheas trí thástáil t Mic Léinn gan péireáil ag baint úsáide as bogearraí staidrimh SPSS 15.0. p<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Torthaí

ECH (Echinacoside)shochtadh meall cillfás. Cé go bhfuil sé tuairiscithe go ECH(Echinacoside)taispeánann sé ról cosanta trí chosc a chur ar apoptosis agus comharthaí athlastacha i gcealla sómacha, mar chealla epithelial néarónach agus intestinal (16-19), tá sé doiléir fós an rialaíonn ECH fás agus iomadú cille ailse. Chun é seo a thástáil, rinneadh measúnú marthanais cille trí chóireáil cealla SW1990, díorthaithe ó adenocarcinoma pancreatic grád II, le dáileoga toirtmheasctha de ECH mar a thaispeántar i bhFíor 1. Go háirithe, léiríodh go gcuireann ECH siar go suntasach ar iomadú cille siadaí i dáileog. -spleách le linn tréimhse cultúir 5-lá (Fig. 1).ECH truicearapoptóis. Toisc go bhfuil caillteanas apoptosis ar cheann de na meicníochtaí móra cúiseacha atá mar bhonn le iomadú neamhrialaithe cealla ailse pancreatic (21), rinne an staidéar seo sraith turgnaimh chun a chinneadh an spreagann ECH apoptosis. Ar an gcéad dul síos, trí núicléis na gcealla meall a dhathú le Hoechst 33342, léiríodh go mbíonn apoptosis mar thoradh ar ECH ar bhealach dáileog-spleách (Fíor 2A). Ina theannta sin, rinneadh anailísí FACS ag baint úsáide as ruaimniú Annexin V/PI chun éifeacht apoptotic ty ECH a dheimhniú tuilleadh (Fíor 2 B). Ba é meánchéatadán na gcealla apoptotic ná 1.1 faoin gcéad faoi ghnáthchoinníollacha cultúir, agus mhéadaigh an céatadán seo go suntasach go 10.6, 21.4 agus 51.3 faoin gcéad mar fhreagra ar chóireáil ECH ar bhealach dáileog-spleách (Fíor 2 C). Léiríonn na torthaí seo, mar aon leis an measúnú inmharthanachta cille a thaispeántar i bhFíor 1, go gcuireann cóireáil ECH faoi chois iomadú cealla meall trí apoptosis a spreagadh.

giniúint eitidiam a intercalates le DNA, baineadh úsáid as sa staidéar seo chun meastóireacht a dhéanamh ar tháirgeadh ROS. Fuarthas amach, cosúil le drugaí frith-ailse eile, go spreagann ECH táirgeadh ROS ar bhealach a bhraitheann ar dháileog mar a léirítear ag an déine fluaraiseachta ardaithe ar chóireáil ECH (Fíor 3).

ECH (Echinacoside)laghdaíonn MMP.Tá sé léirithe go bhfuil baint ag mífheidhm mitochondrial le hionduchtú apoptosis. Tá sé léirithe go n-osclaítear pore trasdula tréscaoilteachta mitochondrial chun dípolarú na hacmhainne trasmembrane agus scaoileadh fachtóirí pro-apoptotic (23). Dá bhrí sin, rinneadh tástáil an bhféadfadh ECH caillteanas MMP i gcealla meall a spreagadh trí mheasúnú TMRM a dhéanamh, ar cur chuige seanbhunaithe é, toisc go bhfuil déine fhluaraiseacht TMRM comhréireach leis an acmhainneacht membrane. Léiríodh go laghdaíonn cóireáil ECH go suntasach MMP ar bhealach dáileog-spleách (Fíor 4).ECH rialuithe meall cill fás tríd próitéin mitogen-ghníomhachtaithean bunús móilíneach le bás ceall meall ECH-idirghabhála, scrúdaíodh gníomhaíocht roinnt bealaí ríthábhachtacha comharthaíochta, mar shampla MAPK agus AKT (24,25), a rialaíonn marthanacht agus bás cille. Déantar na MAPKanna a chaomhnú go héabhlóideach, kinases próitéine Ser/Thr faoi threoir proline, lena n-áirítear kinases eischeallach rialaithe comharthaí (ERKs), c-Meitheamh NH2-cineál críochfoirt (JNKs) agus na baill teaghlaigh p38 a chuirtear i ngníomh trí thrí-. cascades comharthaíochta sraith kinase (26,27). Sa staidéar seo, rinneadh measúnú ar léiriú MAPKs agus AKT, chomh maith lena bhfoirmeacha fosfarlaithe gníomhachtaithe, agus tugadh le fios go gcuireann ECH gníomhaíocht JNK agus ERK1/2 faoi chois go suntasach, ach cuireann sé le gníomhaíocht p38 (Fíor 5). Go háirithe, léiríodh nach bhfuil tionchar ag cóireáil ECH ar ghníomhaíocht AKT, atá ríthábhachtach freisin maidir le iomadú cille (Fíor 5). Ina theannta sin, léiríodh go n-ardaíonn cóireáil ECH slonn Bax agus Caspase-3 agus ag laghdú slonn Bcl-2 (Fíor 5), atá ag teacht le Fíor 2. Mar sin, léiríonn na torthaí go bhfuil Spreagann ECH apoptosis cille meall tríd an gcosán MAPK.

Plé

Chomh fada agus is eol dúinn, is é seo an chéad staidéar a léirigh go bhfuil feidhm shochtadh meall ag ECH trí apoptosis a spreagadh (Fíor 2), táirgeadh ROS a chur chun cinn (Fíor 3) agus dípolarú féideartha membrane mitochondrial a astú (Fíor 4). , rud a fhágann go dtiocfaidh cosc ​​​​ar fhás cille meall (Fíor 1). Ina theannta sin, léiríodh go dtarlaíonn bunús móilíneach bás cille meall trí mheán ECH trí bhealaí comharthaíochta MAPK a rialáil (Fíor 5). Léiríonn na torthaí seo feidhm nua ECH maidir le tumorigenesis a chosc agus mar sin tugann siad le tuiscint go bhféadfadh sé a bheith ina ghníomhaire iarrthóra do theiripe ailse.

Is féidir le formhór na ndrugaí frith-ailse apoptosis cille siadaí, senescence agus/nó gabháil timthriall cille a aslú, as a dtagann cosc ​​ar fhás cille siadaí agus iomadú. Is freagairt cheallacha é gabháil timthriall cille ar chomharthaí strus éadroma a ligeann do chealla DNA damáiste a dheisiú sula gcuirtear tús le sintéis nó mitosis DNA macasamhlaithe, ach tarlaíonn apoptosis agus senescence (gabháil timthriall cille buan) mar fhreagra ar chomharthaí struis a chuireann deireadh le cealla neamh-inathraithe nó urchóideacha ( 28,29). Mar sin, ní dhearnadh measúnú ach ar éifeacht apoptotic ECH ar chealla siadaí sa staidéar seo, toisc gur mórchritéar é cealla ailseacha a mharú chun cumas oibreán frith-ailse a mheas. Go háirithe, léiríodh go spreagann ECH léiriú naBax(Fíor 5), géine pro-apoptotic, arna ghníomhachtú go trasnánach ag an suppressor meall p53 (30). Mar sin, is fiú a thástáil an féidir le ECH cosán comharthaíochta p53 a ghníomhachtú. Más ea, d’fhéadfadh go mbeadh ECH in ann p53-gabháil thimthriall cille cleithiúnach, seanchas, apoptosis nó uathphagaireacht a fháil. Sa staidéar seo, léiríodh feidhm siadaí-shochtadh ECH i líne chill adenocarcinoma pancreatach SW1990. Mar sin féin, tá gá le staidéir bhreise a bhreathnaíonn ar línte cille ailse pancreatach níos mó. Tá sé léirithe go bhfuil baint ag sócháin sa RAS próitéin oncogenic agus an suppressor meall p53 le forbairt ailse pancreatach (31); áfach, níl aon sóchán p53 ag baint le líne chill SW1990, de réir bhunachar sonraí IARC p53 (http://p53.iarc.fr/CellLines.aspx). Mar sin, tá sé tábhachtach imscrúdú a dhéanamh an féidir le ECH difear a dhéanamh d'fhás agus do iomadú línte cille ailse pancreatacha eile le sócháin éagsúla p53. Ina theannta sin, bheadh ​​sé suimiúil a chinneadh an bhfuil ECH in ann apoptosis a chur chun cinn agus bac a chur ar fhás cineálacha eile siadaí.

Léiríodh go raibh ingearchló ROS agus laghdú MMP, a ba chúis le cóireáil ECH, riachtanach i ionduchtú apoptosis (22). Ina theannta sin, fuarthas amach gur féidir le ROS ocsaídiú na bpiocháin mitochondrial a aslú a chuireann le scaoileadh cíteochróim.c, idirmheánach in apoptosis, mar gheall ar chur isteach ar an MMP (22). Mar sin, tá sé fós le cinneadh an gcuireann ECH isteach ar an MMP go hindíreach trí ionduchtú ROS. Ina theannta sin, léiríodh go bhfuil baint ag strus ocsaídiúcháin as ROS le modhnú a dhéanamh ar iliomad comharthaí rialaithe fáis cille, lena n-áirítear p53, NF-κB, HIFs agus PI3K (32). Tá sé fós le cinneadh cé acu, agus má tá, conas a rialaíonn ECH na cosáin chomharthaíochta tábhachtacha seo. Go háirithe, is cúis le strus ocsaídiúcháin galair neurodegenerative éagsúla mar gheall ar an tomhaltas ard ocsaigine, córais frithocsaídeacha lag agus tréithe difreála críochfoirt lárchóras na néaróg (33). Mar sin féin, léirigh roinnt staidéir go bhfuil éifeachtaí cosanta agus frith-apoptotic ar fhíochán néarógach ag ECH. Maidir leis seo, tá sé réasúnta hipitéis a thabhairt go bhféadfadh ECH táirgeadh ROS a laghdú i gcealla néaracha difreáilte críochfoirt. Mar sin, tá sé fós le cinneadh an bhfuil rialáil táirgeadh ROS ag ECH ag brath ar stádas difreála na gceall. Mar sin, léiríonn na torthaí atá ann faoi láthair mar aon le staidéir eile gur féidir le ECH, an TCM a úsáidtear go forleathan, a bheith ina straitéis cheimiteiripeach thábhachtach, ní hamháin chun galair néar-mheathlúcháin a chóireáil ach freisin carcanóim urchóideacha.

Le déanaí, tugadh aird níos mó ar úsáid TCM i dteiripe ailse. Tá acmhainneacht táirgí nádúrtha ó phlandaí míochaine a úsáidtear i TCM aitheanta ag an bpobal eolaíoch fiú sa domhan thiar (9). Tá gá le hiarrachtaí chun bun-mheicníochtaí gníomhaíochta na dtáirgí nádúrtha seo a shoiléiriú, rud a d'fhéadfadh a bheith ina chúis le leigheasanna éifeachtacha agus sábháilte a fhorbairt le haghaidh teiripe ailse.

Mar fhocal scoir, léirigh an staidéar reatha feidhm coisctheach siadaí ECH agus mionléirítear ann freisin an bonn móilíneach de shochtadh siadaí ECH-idirghabhála, rud a thugann le tuiscint gur féidir cur i bhfeidhm cliniciúil féideartha ECH i dteiripe ailse.

Buíochas

Bhí an staidéar seo maoinithe agus tacaithe ag Príomhchlár Taighde Eolaíoch FMU (deontas uimh. 09ZD014). Ba mhaith leis na húdair buíochas a ghabháil le Biomedworld (Shanghai, an tSín) as a gcabhair leis an lámhscríbhinn a chur in eagar.

Tagairtí

1. Hanahan D agus Weinberg RA: Saintréithe ailse: An chéad ghlúin eile. Cill 144: 646-674, 2011.

2. Alderton GK: Trascríobh: Éifeachtaí trascríobh MYC. Nat Rev Ailse 14:513, 2014 .

3. Zindy F, Eischen CM, Randle DH, Kamijo T, Cleveland JL, Sherr CJ agus Roussel MF: Rialaíonn comharthaíocht Myc tríd an súthadóir meall ARF p53-apoptosis cleithiúnach agus neamhbhásmhaireacht. Genes Dev 12: 2424-2433, 1998.

4. Sachdeva M, Zhu S, Wu F, Wu H, Walia V, Kumar S, Elble R, Watabe K agus Mo YY: p53 represses c-Myc trí ionduchtú an suppressor meall miR-145. Proc Natl Acad Sci USA 106: 3207-3212, 2009.

5. Liao JM, Cao B, Zhou X agus Lu H: Léargais nua ar fheidhmeanna p53 trína sprioc-micrRNAs. J Mol Cell Biol 6: 206-213, 2014.

6. Zamble DB agus Lippard SJ: Cisplatin agus deisiú DNA i ceimiteiripe ailse. Treochtaí Biochem Sci 20: 435-439, 1995.

7. Kleeff J, Kornmann M, Sawhney H agus Korc M: Iondaíonn Actinomycin D apoptosis agus cuireann sé bac ar fhás cealla ailse pancreatic. Int J Cancer 86: 399-407, 2000.

8. Tacar O, Sriamornsak P agus Dass CR: Doxorubicin: Nuashonrú ar ghníomhaíocht mhóilíneach frith-ailse, ar thocsaineacht agus ar chórais núíosacha seachadta drugaí. J Pharm Pharmacol 65: 157-170, 2013.

9. Efferth T, Li PC, Konkimalla VS agus Kaina B: Ó leigheas traidisiúnta na Síne go teiripe ailse réasúnach. Treochtaí Mol Med 13: 353-361, 2007.