otqTeanga
Baile / Eolas / Ábhar

Eolas

Díolúine Chosanta arna Spreagadh ag DNA i gCoinne Ionfhabhtaithe SARS CoV-2 i Hamsters

Nov 17, 2023

Teibí

Is gá atá ag teacht chun cinn do shláinte phoiblí dhomhanda é vacsaíní éifeachtúla a fhorbairt in aghaidh COVID-19. Príomhsprioc don vacsaín COVID-19 is ea an spíc-phróitéin de ghéarshiondróm riospráide coróinvíreas 2 (SARS-CoV-2). Chun freagairt thapa a thabhairt ar ráig na paindéime SARS-CoV-2, is rogha nua í vacsaín atá bunaithe ar aigéad núicléasach, seachas an vacsaín víreas neamhghníomhaithe traidisiúnta nó an vacsaín próitéin athchuingreach. Anseo, tuairiscímid vacsaín DNA ina bhfuil an ghéin spíc le seachadadh trí leictreamhairiú. Rinneadh na géinte spíceacha de SARS-CoV agus SARS-CoV-2 codon a optamú le haghaidh slonn cille mamaigh agus ansin rinneadh iad a chlónáil isteach i veicteoirí slonn cille mamaigh, ar a dtugtar pSARS-S agus pSARS2-S, faoi seach. Deimhníodh léiriú próitéine spike ag immunoblotting tar éis léiriú neamhbhuan i gcealla HEK293T. Tar éis an imdhíonta, bailíodh séiream le haghaidh anailísí antashubstainte a bhaineann go sonrach le hantaiginí agus le haghaidh anailísí titer antasubstainte a neodrú. Fuaireamar amach gur chothaigh imdhíonadh pSARS-S agus pSARS{2-S2-S leibhéil chosúla antasubstaintí i gcoinne S2 de SARS-CoV-2. I gcodarsnacht leis sin, níor spreag imdhíonadh pSARS ach antasubstaintí i gcoinne an fhearainn ceangailteach de chuid SARS-CoV-2. Fuaireamar amach freisin go bhféadfadh imdhíonadh pSARS2-S, ach ní imdhíonadh pSARS-S, leibhéil an-arda d’antasubstaintí a neodrú i gcoinne SARS-CoV-2 a chothú. Rinneamar anailís bhreise ar fhreagairtí T-chealla próitéin-shonracha SARS-CoV-2 S agus fuaireamar amach go raibh na freagraí imdhíonachta claonta i dtreo Th1. Rud atá tábhachtach, d’fhéadfadh imdhíonadh pSARS i hamsters imdhíonacht chosanta a chothú i gcoinne dúshlán SARS-CoV-2 in vivo. Tugann na sonraí seo le fios go bhféadfadh an vacsaíniú DNA a bheith ina chur chuige dóchasach chun cosaint a thabhairt i gcoinne COVID-19.


Desert ginseng—Improve immunity (23)

sochair cistanche-neartú chóras imdhíonachta

Achoimre Údair

Leanann SARS-CoV-2 le sláinte dhomhanda a chur i mbaol, agus is tosaíocht phráinneach é forbairt na vacsaíne SARS-CoV-2 chun stop a chur leis an eipidéim COVID. Anseo, d’fhorbraíomar vacsaíní DNA ina raibh an ghéin spíce ó SARS-CoV-2 agus a seachadadh trí leictreaphrú. Thugamar faoi deara gur spreag an vacsaín DNA freagairt ghreannmhar fhadtéarmach i gcoinne SARS-CoV-2, agus chuir na hantasubstaintí serum a fuarthas bac go héifeachtach ar cheangal SARS-CoV-2 RBD dá ghabhdóir iontrála (ACE2). Is é an rud is tábhachtaí ná gur spreag an vacsaín DNA freagairtí imdhíonachta láidir T1-chlaonta i gcoinne SARS-CoV-2, rud a d’fhéadfadh éifeacht chosanta a sholáthar le fo-iarmhairtí ísle. Mar fhocal scoir, léirigh muid gur bhronn an vacsaín SARS-CoV-2 éifeachtúlacht chosanta i gcoinne ionfhabhtú SARS-CoV-2 i hamstair na Siria. Thug ár dtorthaí le tuiscint go bhféadfadh vacsaíniú DNA a bheith ina chur chuige úsáideach chun an paindéim COVID a rialú go luath amach anseo.

Réamhrá

Bhí tionchar eacnamaíoch suntasach ag an ngalar ionfhabhtaíoch COVID-19 atá ag teacht chun cinn, de bharr géar-ghéar-coronavirus a bhaineann le siondróm riospráide géar 2 (SARS-CoV-2), ar thíortha a ndeachaigh an ráig galair orthu in 2019–2020 [1]. Ar fud an domhain, tá níos mó ná 118 milliún cás de COVID-19 deimhnithe, agus fuair níos mó ná 2.6 milliún duine bás de COVID-19, faoi Mhárta 2021 [2]. Is é an ráta báis cásanna domhanda thart ar 2.2%. Cé go bhfuil an ráta básmhaireachta de SARS-CoV-2 níos ísle ná ráta ionfhabhtaithe MERS-CoV agus SARS-CoV, tá a in-tarchurtha níos airde. Ceadaíodh roinnt vacsaíní COVID-19 lena n-úsáid chun cinn i mí na Nollag 2020, ach tá an phaindéim COVID-19 fós ina bhagairt idirnáisiúnta ó shin i leith na scríbhneoireachta seo.

Desert ginseng—Improve immunity (23)

cistanche tubulosa-feabhas a chur ar chóras imdhíonachta

Is é próitéin Spike (S) an próitéin dromchla coronavirus atá freagrach as próisis cheangail víreas leis an einsím tiontaithe angiotensin 2 (ACE2), iontráil cille, agus comhleá membrane víreas-chealla chun RNA víreasach a scaoileadh isteach i gcealla óstacha. I measc na bpróitéiní struchtúracha SARS-CoV, is é an próitéin spike an antaigin ceannasach a chothaíonn antasubstaintí neodraithe [3]. Bunaithe ar staidéir roimhe seo ar SARS agus MERS, tá sé cruthaithe go n-eascraíonn vacsaíní próitéine-bhunaithe antasubstaintí neodraithe agus freagairtí imdhíonachta cealla T ar coronaviruses agus go gcosnaíonn siad ainmhithe ó dhúshlán víreas [4, 5]. Mar gheall ar ard-imdhíon-ghineach próitéine S, d’fhéadfadh sé a bheith ina sprioc féideartha d’fhorbairt vacsaíne SARS-CoV-2 [5–7]. D’fhéadfaí iarrthóirí vacsaíne COVID{0}} a fhorbairt trí úsáid a bhaint as víreas neamhghníomhaithe, comhpháirteanna víreasacha athchuingeacha nó sintéiseacha, víreas athchuingreach, nó mRNA víreasach nó DNA. Tá an cur chuige deiridh go háirithe tarraingteach mar is féidir DNA víreasach a tháirgeadh go tapa agus go héasca ar fud an domhain gan córas slabhra fuar. Ina theannta sin, d'fhéadfadh DNA go hiomlán sintéiseach a dhíorthaítear ón seicheamh ionchódú an phróitéin víreasach freagairtí imdhíonachta humoral agus cille-idirghabhála i gcoinne pataiginí [8, 9].

Is ardán vacsaín idéalach é an vacsaín DNA le roinnt buntáistí, lena n-áirítear dearadh agus táirgeadh éasca, cobhsaíocht ag raon teochta, agus costas táirgthe íseal. Mar sin, tá an t-ardán vacsaíne DNA oiriúnach do mhonarú tapa agus ar scála mór le linn ráigeanna galair thógálacha. Thuairiscigh staidéir roimhe seo gur féidir le vacsaíní DNA freagairtí ceallacha agus humoral a spreagadh go héifeachtach i gcoinne pataiginí i múnlaí dúshláin [10]. Ina theannta sin, léirigh staidéir chliniciúla le déanaí gur iarrthóirí sábháilte agus éifeachtacha iad vacsaíní DNA chun galair thógálacha a chóireáil nó a chosc, amhail VEID-1, víreas Zika, víreas Ebola, MERS-CoV, agus víris fliú [11]. De réir mar a leathnaigh paindéim COVID{0}} ar fud an domhain agus go mór, thuairiscigh staidéir le déanaí gur tharraing vacsaíní DNA freagairtí a bhaineann go sonrach le hantaiginí T-chealla agus gur neodraigh siad antasubstaintí agus ainmhithe cosanta breise ar dhúshlán SARS-CoV-2 [12, 13].

Is é an príomhdhúshlán a bhaineann le vacsaíní DNA ná droch-éifeachtúlacht an tseachadta DNA isteach i gcealla chun antaigin a léiriú agus, dá réir sin, droch-éifeachtúlacht na vacsaíní. Chun éifeachtúlacht seachadta DNA a mhéadú, is féidir modhanna fisiceacha nó modhanna ceimiceacha a úsáid. Áirítear ar na modhanna fisiceacha sruth aeir ardbhrú (ie, Biojector), seachadadh DNA atá brataithe le cáithníní óir trí ghunna géine, eagar microneedle, agus electroporation (EP). Áirítear leis na modhanna ceimiceacha liposomes, virosomes, nanoparticles, agus peptídí treáiteach cille [14]. I ráig víreas Zika in 2015, forbraíodh vacsaín DNA Zika a seachadadh trí leictreaphróisiú ina thriail chliniciúil chéim 1 laistigh de 7 mí [15]. Méadaíonn EP in éineacht le vacsaíniú DNA go mór éifeachtúlacht na vacsaíní DNA [16–18]. Mar gheall ar thorthaí rathúla na dturgnaimh ainmhithe tar éis vacsaínithe DNA le EP, forbraíodh go leor gléasanna leictreamhairiúcháin éagsúla do dhaoine, lena n-áirítear Cellectra® (Inovio Inc., SAM) agus TriGrid® (Ichor Medical Systems, USA).

Déanann an staidéar seo cur síos ar vacsaíniú DNA le EP ar féidir leis freagairtí neodraithe antashubstainte agus Th1-chlaonta imdhíonachta a chothú. Ghin hamsters a imdhíonadh leis an teicníc seo antasubstaintí a neodraigh in aghaidh SARS-CoV-2. Ina theannta sin, léirigh na hamsters imdhíonta imdhíonacht chosanta i ndúshlán víreas SARS-CoV-2.

Modhanna

Ráiteas Eitice

D'fhaomh an Coiste Institiúideach um Chúram agus Úsáid Ainmhithe (IACUC) den NHRI (Prótacal Uimh: NHRI-IACUC-109077-A) gach prótacal turgnamhach ainmhithe.

Línte Cille

Saothraíodh líne chill na nduán suthach daonna HEK293T i meán Eagle modhnaithe Dulbecco (DMEM, GIBCO) arna fhorlíonadh le séiream bó féatais féatais 10% (FBS, HyClone), 100 U/mL peinicillin/streiptimícin (GIBCO) agus 2 mM L-glutamine. (GIBCO). Saothraíodh cealla Vero i meán M199 (GIBCO) le 5% FBS ag 37 céim .

Toirtmheascadh Víreas

Fuarthas leagan SARS-CoV-2 (hCoV-19/Taiwan/4/2020 agus hCoV-19/Taiwan/78/2020 (athraitheach D614G))) ó na Lárionaid um Rialú Galar (CDC). ) sa Téaváin. Méadaíodh an víreas i gcealla Vero a fhástar i meán M199 agus forlíonta é le 2 ug/mL TPCK-trypsin (Sigma) ag 37 céim . Cinneadh an titer víreas i dtéarmaí na dáileog ionfhabhtaíoch cultúr fíocháin 50% (TCID50) ag baint úsáide as modh caighdeánach [19]. Go hachomair, síolaíodh cealla Vero (2.4 × 104 cealla / in aghaidh an tobair) i 96-plátaí tobair agus saothraíodh iad i meán M199 le 5% FBS ag 37 céim ar feadh 24 h chun monolayer a dhéanamh. An lá dár gcionn, ullmhaíodh caoluithe sraitheach 10-huaire, agus cuireadh an víreas caolaithe (100 μL/tobar) le monaiteoirí cille Vero le hocht macasamhail in aghaidh an chaolaithe. Tar éis 4 lá goir ag 37 céim , taifeadadh na héifeachtaí cíteapatacha víreas-spreagtha (CPE) i ngach tobar, agus cuirtear na torthaí in iúl mar TCID50/mL de réir mhodh Reed agus Muench. Rinneadh na turgnaimh go léir le SARS-CoV-2 sa tsaotharlann bithshábháilteachta leibhéal 3 (BSL-3) agus d’fhaomh CDC na Téaváine iad.

Desert ginseng—Improve immunity (10)

sochair cistanche-neartú chóras imdhíonachta

Cliceáil anseo chun táirgí Cistanche Feabhsú Díolúine a fheiceáil

【Iarr tuilleadh】 Ríomhphost:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Tógáil Plasmid agus Tréithriú

Optamaíodh na seichimh DNA a ionchódaíonn SARS-Spike lán-fhad (uimhir aontachais GenBank DQ412574) agus SARS-CoV-2 spike (uimhir aontachais GenBank: MN908947) le haghaidh úsáid códáin luiche agus rinne GenScript Biotech iad a shintéisiú. Chomh maith leis sin, rinne PCR blúirí éagsúla S (tRBD, tRBDTM, tSARS2-S, tSdTM) a thógáil agus a aimpliú ina n-aonar. Fochlónadh na géinte go léir isteach sa veicteoir pVAX1 a úsáidtear go cliniciúil agus an t-ord Kozak ionchorpraithe i ndeireadh 5 'de na géinte. Rinneadh an plasmid a chlaochlú go DH5 E. coli le haghaidh aimpliú plasmid. Baineadh agus íonaíodh plasmid ag baint úsáide as córas colúin Qiagen saor ó endotoxin (EndoFree Plasmid Mega Kit).

Sloinneadh Neamhbhuan Agus Blot an Iarthair

Aistríodh cealla HEK293T leis na plasmid DNA léirithe ag baint úsáide as imoibrí PolyJet™ (SignaGen Laboratories) de réir phrótacal an mhonaróra. Ag 24 uair an chloig tar éis an aistrithe, baineadh lísáití cille agus cuireadh faoi leictreafóiréis iad ar 8% SDS-PAGE. Aistríodh na próitéiní ansin go seicní PVDF agus blotadh iad le hantasubstaint polaclónach frith-spike coinín (40592-T62, Sino Biological). Baineadh úsáid as antasubstaintí frith-choinín comhchuingeacha Horseradish peroxidase (HRP) mar antasubstaint thánaisteach. Léiríodh próitéiní sonracha ar an scannán ag imoibrí ECL (Thermo Scientific).

Imdhíonadh Ainmhithe

Fuarthas lucha BALB/c, C57BL/6, agus hamstairí Siria ó Lárionad Náisiúnta um Pórú agus Taighde Ainmhithe na Saotharlainne (Taipei, Taiwan). Baineadh úsáid as lucha nó hamsters idir 6 agus 12 seachtaine d'aois. Rinneadh vacsaíniú ar lucha nó hamstair ainéistéisithe le 100 μL de thuaslagán ina raibh DNA léirithe i gceann eatramh seachtaine 3-, agus ina dhiaidh sin leictreaphlátála le leictreafóireoir BTX (ECM830) ag baint úsáide as leictreoidí eagair dhá shnáthaid (5-trastomhas mm (5-) BTX 45–0121)). Rinneadh leictreaphrú ionmhatánach ag voltas tairiseach 75 V le 10 bíoga ag eatraimh 50 msec/pulse agus eatraimh 100 msec idir bíoga. Bailíodh samplaí fola de lucha agus hamstair trí shampláil fola submandibular nó retroorbital, faoi seach. Coinníodh gach ainmhí ag Ionad Saotharlainne Ainmhithe na nInstitiúidí Náisiúnta um Thaighde Sláinte (NHRI) agus coinníodh iad de réir prótacail institiúideacha um chúram ainmhithe.

Imdhíonadh

Chinn ELISA láithreacht antasubstaintí S-shonracha i sera. Go hachomair, brataíodh 50 μL de phróitéin athchuingreach 4 ug/mL (Sino-Bitheolaíoch) i 0.1 M maolán carbónáit (pH 9.5) ar 96-mhicrphlátaí toibreacha trí gor thar oíche ag 4 céime . Nite plátaí brataithe faoi dhó le 0.05% Tween 20 i PBS agus ansin bac le 3% BSA i PBS ag teocht an tseomra ar feadh 2 uair an chloig. Cuireadh séiream caolaithe ó ainmhithe imdhíonta i bhfeidhm ar thoibreacha ag teocht an tseomra ar feadh 2 uair an chloig. Tar éis IgG frith-luch gabhar comhchuingeach HRP (Thermo Scientific) nó IgG frith-hamstar gabhair comhchuingeach HRP (Arigo Biolaboratorie) a chur leis, forbraíodh an mheasúnacht trí úsáid a bhaint as SureBlue TMB 1-Component Peroxidase Substrate (KPL). Tomhaiseadh an t-ionsúcht ag baint úsáide as léitheoir ELISA ag 450 nm.

Neodrú Ionfhabhtaithe Víreas SARS-CoV-2

Síolaíodh cealla Vero (2.4×104 chealla/tobar) i 96-plátaí tobair ar feadh 24 h chun monashraith a dhéanamh. Rinneadh réamhchóireáil ar sera preimmune agus antisera i gcoinne próitéin SARS-CoV-2 S ag 56 céim ar feadh 30 nóiméad chun substaintí coisctheacha víreasacha neamhshonracha teas-labile a scriosadh. Caolaíodh an séiream go caolú tosaigh 1/20 le meán M199, cuireadh isteach i dtobar ina raibh 200 TCID50 de víreas SARS-CoV-2 i dtoirt 0.2 mL, agus ansin goraíodh é ag 37 céim ar feadh 2 h. Ina dhiaidh sin, rinneadh an meascán víreas-séiream a ionaclú ar mhonaiteoirí cille Vero agus é a ghoradh ag 37 céim . Ullmhaíodh cuadruplicates do gach caolú serum. Taifeadadh na tréithe CPE i ngach tobar tar éis 4-5 lá goir. Bhí an titer neodraithe comhréireach leis an caolú is airde de serum a chuir cosc ​​​​ar ionfhabhtú i 50% d'ionaclaithe ceathair-dhúbailte.

Comórtas ACE2 ELISA

Comórtas ACE2 Rinneadh ELISA trí úsáid a bhaint as an bhFrith-SARS-CoV-2 Trealamh Measúnachta Séareolaíochta Títer Antashubstaint Neodraithe (ACROBiosystems) de réir an phrótacail mholta. Go hachomair, 96-brataithe plátaí toibreacha le 0.5 ug/mL SARS-CoV-2-S RBD próitéin thar oíche ag 4 céim . Níodh an pláta agus cuireadh bac air le maolán blocála ag 37 céim ar feadh 1.5 uair an chloig. Tar éis trí nite, cuireadh ACE2 biotinylated daonna (0.12 ug/mL) leis na toibreacha, agus caolaíodh na samplaí séiream ina dhiaidh sin agus gor ag 37 céim ar feadh 1 uair an chloig. Chun cuar caighdeánach a ghiniúint, úsáideadh antashubstaint neodraithe frith-SARS-CoV-2 mar a sholáthraíonn an trealamh mar thagairt. Nigh an pláta, agus cuireadh réiteach oibre streptavidin-HRP le gach tobar ar feadh 1 uair ag 37 céim . Ansin nite an pláta, agus forbraíodh an measúnú trí gor le tuaslagán oibre tsubstráit TMB ag 37 céim ar feadh 20 nóiméad. Stopadh an t-imoibriú le réiteach stad curtha ar fáil. Tomhaiseadh an t-ionsúcht ag baint úsáide as léitheoir ELISA ag 450 nm. Cuireadh gníomhaíocht iomaíoch antasubstaintí serum in iúl mar an leibhéal comhfhreagrach antasubstainte tagartha.

Measúnacht Táirgthe Cytokine

Rinneadh measúnú ar fhreagraí T-chealla ag baint úsáide as cytokine ELISA. Plátáladh splenocytes ó lucha imdhíonta ag dlús 5×106 cealla in aghaidh an tobair i 24-phlátaí toibreacha. Spreagadh na cealla le 5 ug/mL athchuingreach SARS-CoV-2 próitéin Spike (ACROBiosystems) ag 37 céim ar feadh 3 lá. Baineadh an súthaire agus rinneadh é a mheas le haghaidh táirgeadh cítocín. Rinne ELISA cainníochtú ar Luch IL-2, IL-5, IL-13, agus IFN- ag baint úsáide as an tacar antashubstaintí meaitseála (Invitrogen) de réir threoracha an déantóra.

Dúshlán Ainmhithe

Rinneadh imdhíonadh ionmhatánach ar hamstair na Siria (n=8 in aghaidh an ghrúpa) trí instealladh snáthaide le DNA plasmideach (100 ug/ainmhí), agus ina dhiaidh sin rinneadh leictreaphrú BTX mar a luadh thuas. Ag ceithre seachtaine tar éis an vacsaínithe dheireanaigh, tugadh dúshlán do na hamsters go hinmheánach le 105 TCID50 SARS-CoV-2 (hCoV-19/Taiwan/4/2020) i 50 μL faoi ainéistéise isoflurane. Taifeadadh a meáchan coirp (n=4 in aghaidh an ghrúpa) gach lá ar feadh 9 lá tar éis an dúshláin. Rinneadh ceithre hamsters i ngach grúpa a íobairt ar an 3ú lá tar éis an dúshláin maidir le cainníochtú ualach víreasach. Chun an t-ualach víreasach sa scamhóg a chinneadh, rinneadh fíocháin scamhóg chlé a homogenized i 2 ml de PBS ag baint úsáide as Dissociator gentleMACS® (Miltenyi Biotec). Tar éis lártheifneoraithe ag 600 xg ar feadh 5 nóiméad, baineadh an forshnáthán soiléirithe le haghaidh toirtmheasctha víreas beo (measúnacht TCID50) agus cainníochtú víreasach RNA.

Cainníochtú Ualach Víreasach RNA

Baineadh sástóir soiléirithe d’fhíochán scamhóg aonchineálaithe clé ó hamstairí ionfhabhtaithe SARS-CoV-2- chun ualach víreasach a bhrath. Rinneadh eastóscadh RNA ar fheitheoir fíocháin a bhí lísithe le TRIzol LS (Ambion), agus úsáideadh 10 ng den RNA mar theimpléad le haghaidh imoibrithe RT-qPCR. Rinneadh RT-qPCR ar Chóras PCR Fíor-Ama QuantStudio 6 Flex (ABI) ag baint úsáide as an trealamh qRT-PCR Uilíoch Aon-Chéim KAPA PROBE FAST (KR1282, Roche) le primers agus tóireadóirí a bhaineann go sonrach le SARS-CoV-2 (E_Sarbeco Ar Aghaidh: ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT, E_Sarbeco Droim ar ais: ATATTGCAGCAGTACGCACACA, E{14}}Tóraigh Sarbeco: FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BHQ1) [20].

Cistanche deserticola—improve immunity (7)

Buntáistí cistanche tubulosa- an córas imdhíonachta a neartú

Anailís staitistiúil

Gineadh sonraí staidrimh trí úsáid a bhaint as bogearraí GraphPad Prism. Chinn an tástáil dhá earball Mann-Whitney tábhacht staitistiúil na dtorthaí difreálach idir grúpaí turgnamhacha. Measadh go raibh difríochtaí suntasacha staitistiúla má bhí an p-luach Níos lú ná nó cothrom le 0.05.

Torthaí

Tógáil Plasmid agus Léiriú Antigen ar Iarrthóirí Vacsaín

Gineadh cúig leagan de SARS-CoV-2 agus tógáil SARS-CoV amháin ina raibh blúirí éagsúla de DNA ionchódaithe próitéin spike (Fíor 1A). Toisc go raibh comhghaol láidir idir slonn antaigin agus éifeachtúlacht na vacsaíne, dhearamar blúirí spike próitéine éagsúla, lena n-áirítear RBD (aa319-aa541), RBD go TM (aa{319-aa1236), nó Spike le fearann ​​trasmembrane (TM). scriosadh (aa13-aa1213), le seicheamh ceannaire gníomhachtaithe plasminogen fíocháin daonna (tPA) a d'fhéadfadh méadú a dhéanamh ar an secretion antaiginí [21]. Is féidir leis an bhfearann ​​​​RBD go TM an fearann ​​S2 a choinneáil, rud atá tábhachtach chun an struchtúr sé-helix a fhoirmiú le haghaidh comhleá cille [22, 23]. Seo a leanas na tógálacha seo: S lánfhad SARS-CoV (pSARS-S) agus SARS-CoV-2 (pSARS2-S), spíc lánfhad le seicheamh ceannaire na fíocháin-plasminogen activator (ptSARS2-S), réigiún RBD (ptRBD), fearann ​​RBD go trasmembrane (ptRBDTM) agus spike le scriosadh an fhearainn trasmembrane (PTSD). Aistríodh veicteoirí, pSARS-S, agus pSARS2-S isteach i gcealla HEK293T agus cuireadh in iúl iad. Rinne SDS-PAGE anailís ar na lysates cille. D'fhéadfaí an fad iomlán S a bhrath ag an meáchan móilíneach comhfhreagrach (Fíor 1B). Braitheadh ​​an t-athróg S de SARS2-CoV-2 le seicheamh ceannaire de ghníomhaitheoir fíocháin-plasminogen le hantasubstaint polachlónúil frith-spíce. Léiríodh sna sonraí gur breathnaíodh gach malairt de réir an mheáchain mhóilíneach ionchasaigh (Fíor 1C). Bhí leibhéil slonn na malairtí ptSARS2-S, ptRBDTM, agus ptSdTM cosúil le chéile, agus bhí slonn ptRBD níos airde i ngach leagan.

Fig 1. Design and expression of SARS-CoV and SARS-CoV-2 spike construct variants. (A) Schematic diagram of SARS-CoV and SARS-CoV-2 spike construct variants. tPA, leader sequence from tissue-plasminogen activator; TM, transmembrane domain. (B, C) Western blot analysis of spike protein. HEK293T cells were transfected with the indicated plasmids (vector, pSARS-S, pSARS2-S, and S variants fused with the tPA leader sequence). The cell lysates were collected and probed with an anti-spike antibody, and an anti-β-actin antibody was used as an internal control.


Fíor 1. Leaganacha tógála spíc SARS-CoV agus SARS-CoV-2 a dhearadh agus a chur in iúl.

(A) Léaráid scéimreach de leaganacha tógála spíc SARS-CoV agus SARS-CoV-2. tPA, seicheamh ceannaire ó ghníomhaí fíocháin-plasminogen; TM, fearann ​​trasmembrane. (B, C) anailís blot an Iarthair ar phróitéin spike. Aistríodh cealla HEK293T leis na plasmids léirithe (veicteoir, pSARS-S, pSARS2-S, agus leaganacha S comhleádh le seicheamh ceannaire an tPA). Bailíodh na lísáití cille agus scrúdaíodh iad le hantasubstaint frith-spike, agus úsáideadh antashubstaint frith- -actin mar rialú inmheánach.

Imdhíonacht Iarrthóirí Vacsaín

Chun imdhíon-ghineacht na malairtí éagsúla a scrúdú, rinneadh instealladh ionmhatánach ar lucha BALB/c faoi dhó ag eatramh seachtaine 3-le 100 ug de veicteoir, pSARS-S, agus pSARS2-S ina dhiaidh sin leictreaphlátála in vivo (Fíor 2A). Bailíodh sera ag seachtaine 4 agus seachtaine 6 tar éis an chéad imdhíonta. Thaispeáin na sonraí go bhféadfadh séireataí ainmhithe imdhíonta pSARS-S agus pSARS2-S na réigiúin lánfhad S agus S2 de SARS-CoV-2 a aithint le titers antashubstainte IgG comhchosúla (Fíor 2B agus 2C). I gcodarsnacht leis sin, d’fhéadfadh séiream ó ainmhithe imdhíonta pSARS2-S na leibhéil arda antashubstainte frith-RBD (SARS-CoV-2) a ardú ag seachtain 4 agus seachtain 6 (Fíor 2D), i gcomparáid leis an ngrúpa pSARS-S. Dá réir sin, d’fhéadfadh séireataí ainmhithe imdhíonta pSARS ach ní ainmhithe imdhíonta pSARS-S ionfhabhtú SARS-CoV-2 a neodrú (Fíor 2E). Ba iad na meánteidil gheoiméadracha (log2) d’antasubstaintí neodraithe sa ghrúpa imdhíonta pSARS2-S ag seachtainí 4 agus 6 ná 9.3 agus 10.3, faoi seach. Thug na torthaí seo le fios nach féidir le himdhíonadh pSARS-S antasubstaintí tras-neodraithe a chothú i gcoinne ionfhabhtú SARS-CoV-2. Bhí na hantasubstaintí a bhain go sonrach le RBD ríthábhachtach chun gníomhaíocht i gcoinne ionfhabhtú SARS-CoV-2 a neodrú. Is féidir le S lán-fhad SARS-CoV-2 go deimhin leibhéil arda de na leibhéil antasubstainte a neodrú i gcoinne ionfhabhtú SARS-CoV-2.

Fig 2. Antibody response in mice after immunization with SARS-CoV and SARS-CoV-2 S DNA vaccines. (A) BALB/c mice (n = 4 per group) were intramuscularly immunized twice at a 3-week interval with 100 μg of indicated plasmid, followed by electroporation. Serum samples were collected at the indicated time points after the first immunization. (B-D, F, G) Antibodies against the SARS-CoV-2 full-length spike protein, S2 region, and RBD were evaluated by ELISA. (E, H) Vaccine-induced neutralizing antibody against SARS-CoV-2 was evaluated by neutralization assay. Antibody titers are presented as the mean ± SEM, and neutralization titers are expressed as the geometric mean with a 95% confidence interval. *p<0.05 by the Mann-Whitney test.

Fíor 2. Freagairt antasubstainte i lucha tar éis an imdhíonta le vacsaíní SARS-CoV agus SARS-CoV-2 S DNA.

(A) Rinneadh imdhíonadh ionmhatánach ar lucha BALB/c (n=4 in aghaidh an ghrúpa) faoi dhó ag eatraimh de 3-seachtaine le 100 ug de plasmid léirithe, agus leictrimhaireacht ina dhiaidh sin. Bailíodh samplaí séiream ag na pointí ama sonraithe tar éis an chéad imdhíonta. (BD, F, G) Rinne ELISA measúnú ar antasubstaintí i gcoinne próitéin spíc lán-fhad SARS-CoV, réigiún S2, agus RBD. (E, H) Rinneadh antashubstaint neodraithe de bharr vacsaíne i gcoinne SARS-CoV-2 a mheas trí mheasúnú neodrachta. Cuirtear titers antashubstainte i láthair mar mheán ± SEM, agus cuirtear na leibhéil neodrúcháin in iúl mar mheán geoiméadrach le eatramh muiníne 95%. *lch<0.05 by the Mann-Whitney test.

Chun tuilleadh fiosrúcháin a dhéanamh an féidir le hathsholáthar an tseichimh cheannaire méadú ar an secretion próitéine, d’úsáideamar seicheamh ceannaire ó ghníomhaí plasminogen fíocháin chun leaganacha éagsúla den phróitéin SARS-CoV-2 S a chomhleá. Tá réigiún RBD na próitéine SARS-CoV{-2 S i ngach leagan. Tar éis dhá dháileog de imdhíonadh DNA, rinneadh anailís ar an sera a bailíodh ag seachtaine 4 agus seachtaine 6 le haghaidh antasubstainte IgG agus titers antasubstainte a neodrú. D’eascair imdhíonadh le ptSARS2-S líon níos airde antashubstainte i gcoinne próitéin fad iomlán S ag seachtain 4 ná imdhíonadh ptRBD, ptRBDTM, agus ptSdTM (S1A Fíor). Bhí na titers antashubstainte frith-RBD den imdhíonadh ptRBD níos airde ná iad siúd d'imdhíonadh ptSARS2-S (1496.2 vs. 530.9, lch=0.057) ag seachtain 4 (S1B Fíor). Mar sin féin, chothaigh imdhíonadh ptRBD agus ptSARS2-S leibhéil chosúla d’antasubstaintí neodraithe ag seachtain 4 (S1C Fíor). Breathnaíodh na torthaí céanna san anailís sera seachtaine 6; Spreag an imdhíonadh ptRBD leibhéil níos airde antasubstaintí frith-RBD i gcomparáid le himdhíonadh ptSARS2-S (12589.3 vs. 1000.0, p=0.028) ach na leibhéil chéanna antasubstaintí neodraithe (9.3) vs. 9.6 (log2)) (Fíor 2F, 2G agus 2H). Toisc nár spreag na leaganacha seichimh ceannaire tPA titers antashubstainte neodraithe níos airde ná imdhíonadh pSARS, d’úsáideamar pSARS2-S le haghaidh tuilleadh imscrúdaithe.

Ceangal Iomaíoch Antashubstaintí Séiream Agus ACE2 le SARS-CoV-2 RBD

Chun scrúdú a dhéanamh ar chumas na n-antasubstaintí séiream cur isteach ar an idirghníomhaíocht ACE2-RBD, rinneamar measúnú séireolaíochta iomaíoch SARS-CoV-2. Sa mheasúnacht seo, cuireadh antasubstaintí serum le plátaí ELISA réamhbhrataithe le SARS-CoV-2 próitéin RBD, agus cuireadh próitéin ACE2 daonna leis ina dhiaidh sin. Úsáideadh antashubstaint neodraithe sonrach i gcoinne SARS-CoV-2 RBD mar thagairt. Mar a léirítear iFíor 3, antashubstaintí serum ó pSARS2-Rinne lucha imdhíonta S a bhí ceangailte leis an RBD agus chuir siad bac ar cheangal ACE2, a bhí comhionann le thart ar 353 ug/mL antashubstaint tagartha, cé go raibh an séiream pSARS-S comhionann le hantasubstaint tagartha 56 ug/mL. Dá bhrí sin, mhol ár sonraí go bhféadfadh imdhíonadh pSARS2-S antasubstaintí iomaíocha a chothú a chuireann bac éifeachtach ar cheangal SARS-CoV-2 RBD leis an ngabhdóir ACE2. Bhí an toradh seo comhsheasmhach le titer ELISA i gcoinne SARS-CoV2 RBD (Fíor 2D), agus tacaithe ag an staidéar ar an difríocht idir seichimh RBD idir SARS-CoV agus SARS-CoV-2 [24].


Fig 3. Competitive activity of immunized mouse sera against the RBD/ACE2 interaction. BALB/c mice (n = 4 per group) were intramuscularly immunized twice at a 3-week interval with 100 μg of vector, pSARS-S or pSARS2-S, followed by electroporation. Serum samples were collected at week 8 after the first immunization. Serum antibodies that compete with ACE2 for RBD binding were evaluated by competitive SARS-CoV-2 serology assay. The competitive activity of the mouse sera is expressed as the equivalent level of anti-RBD (SARS-CoV-2 spike protein) antibody (reference antibody). Antibody titers are presented as the mean ± SEM. *p<0.05 by the Mann-Whitney test.

Fíor 3. Gníomhaíocht iomaíoch sera luiche imdhíonta in aghaidh an idirghníomhaíocht RBD/ACE2.

Rinneadh imdhíonadh ionmhatánach ar lucha BALB/c (n=4 in aghaidh an ghrúpa) faoi dhó ag eatraimh de 3-seachtain le 100 ug de veicteoir, pSARS-S nó pSARS2-S, agus leictreaghníomhú ina dhiaidh sin. Bailíodh samplaí serum ag seachtaine 8 tar éis an chéad imdhíonta. Rinneadh measúnú ar antasubstaintí serum atá in iomaíocht le ACE2 le haghaidh ceangailteach RBD trí mheasúnacht séireolaíochta iomaíoch SARS-CoV-2. Cuirtear gníomhaíocht iomaíoch an sera luiche in iúl mar an leibhéal coibhéiseach d’antasubstaint frith-RBD (SARS-CoV-2 spike protein) (antasubstaint tagartha). Cuirtear leibhéil antasubstainte i láthair mar mheán ± SEM. *lch<0.05 by the Mann-Whitney test.

SARS-CoV-2 S Díolúine Fadtéarmach de bharr Vacsaín DNA Agus a Thairgtear Traschosaint i gCoinne SARS-CoV-2 Le Sóchán D614G

Go háirithe, breathnaíodh cothabháil fhadtéarmach ar líon na n-antasubstaintí IgG i gcoinne fad-S ag 20 seachtain tar éis an chéad imdhíonta (Fíor 4A). Shroich na meánteidil gheoiméadracha (log2) d'antasubstaint neodraithe SARS-CoV-2 10.8 ag seachtain 8 tar éis imdhíonta pSARS2-S, ag laghdú beagán go 9.1 ag seachtain 12 agus go 8.8 ag seachtain 20 (Fíor 4B). Thug na torthaí seo le tuiscint go dtugann imdhíonadh pSARS2-S freagra greannach fadtéarmach i gcoinne SARS-CoV-2. Ina theannta sin, spreag an vacsaín DNA pSARS leis an ngéinitíopa D614 freagairt antashubstainte neodraithe i gcoinne an víris ina bhfuil an sóchán D614G (Fíor 4C), atá cosúil le titers neodraithe i gcoinne an ghéinitíopa D614. Mar sin, tá pSARS2-S in ann traschosaint a thabhairt ar an leagan D614G is forleithne agus is ceannasach den SARS-CoV-2.

Fig 4. SARS-CoV-2 S DNA vaccine induced long-term humoral immunity and cross-protection against the SARS-CoV-2 with D614G mutation. BALB/c mice (n = 4 per group) were intramuscularly immunized three times at a 3-week interval with 100 μg of vector, pSARS-S or pSARS2-S, followed by electroporation. Serum samples were collected at the indicated time points after the first immunization. (A) Antibodies against the SARS-CoV-2 full-length spike protein were evaluated by ELISA. (B, C) Vaccine-induced neutralizing activity against SARS-CoV-2 with D614 or G614 genotypes was evaluated by neutralization assay. Antibody titers are presented as the mean ± SEM, and neutralization titers are expressed as the geometric mean with a 95% confidence interval. *p<0.05 by the Mann-Whitney test.

Fíor 4. Sa vacsaín SARS-CoV-2 S spreagtar díolúine humoral fadtéarmach agus traschosaint i gcoinne SARS-CoV-2 le sóchán D614G.

Rinneadh imdhíonadh ionmhatánach ar lucha BALB/c (n=4 in aghaidh an ghrúpa) trí huaire ag eatraimh 3-seachtaine le 100 ug de veicteoir, pSARS-S nó pSARS2-S, agus leictreaghníomhú ina dhiaidh sin. Bailíodh samplaí séiream ag na pointí ama sonraithe tar éis an chéad imdhíonta. (A) Rinne ELISA measúnú ar antasubstaintí i gcoinne na próitéine spíce lán-fhad SARS-CoV. (B, C) Rinneadh measúnú ar ghníomhaíocht neodraithe de bharr vacsaíne i gcoinne SARS-CoV-2 le géinitíopaí D614 nó G614 trí mheasúnacht neodraithe. Cuirtear titers antashubstainte i láthair mar mheán ± SEM, agus cuirtear na leibhéil neodrúcháin in iúl mar mheán geoiméadrach le eatramh muiníne 95%. *lch<0.05 by the Mann-Whitney test.

Ionduchtú Th{0}} Nó na2-Freagarthaí Claonta

Is féidir cealla T éifeacht CD4+ a fhoroinnt ina dhá phríomhfhothacar feidhme, Th1 agus Th2, bunaithe ar na cítocíní secreted ar ghníomhachtú. Táirgeann cealla Th1 cítocíní athlastacha (IFN- ) agus glacann siad páirt i bhfreagraí imdhíonachta cille-idirghabhála i leith baictéir agus víris infhéitheacha, ach cuidíonn cealla Th2 go príomha le cealla B antasubstaintí a tháirgeadh ach cuireann siad imdhíonacht eosinophil-idirghabhála (IL-5 agus IL{) chun cinn freisin. {9}}), agus freagraí greannacha nó ailléirgeacha mar thoradh air [25, 26]. Ina theannta sin, féadfaidh meicníochtaí Th2 cleithiúnaí cille cur le galar riospráide feabhsaithe a bhaineann le vacsaín (VAERD), mar atá léirithe ag staidéir ar iarrthóirí vacsaín SARS-CoV [27, 28], a thugann chun suntais go bhfuil freagairt chothromaithe T chealla ríthábhachtach d’fhorbairt shábháilte vacsaíne COVID{0}} [29]. Chun dul i ngleic leis an tsaincheist seo, tugadh imdhíonadh do lucha BALB/c agus C57BL/6 le veicteoir, pSARS-S agus pSARS2-S faoi dhó ag eatramh 3-seachtain. Rinneadh lucha a íobairt 7 lá tar éis an dara imdhíonta, agus spreagadh splenocytes le próitéin SARS-CoV-2 S (5 ug/mL) ar feadh 3 lá. I lucha BALB/c (Fíor 5A–5D), bhí an secretion de chitociní cineál Th1 IFN- (19641.3 pg/mL ± 8823.5) agus IL-2 (599.5 pg/mL ± 37.7) ard tar éis spreagadh le próitéin S sa pSARS2-S grúpa imdhíonta, ach braitheadh ​​leibhéil an-íseal de chitocíní de chineál Th2 IL-5 (18.1 pg/mL ± 11.8) agus IL-13 (567.2 pg/mL ± 166.2). Breathnaíodh torthaí cosúla i lucha C57BL/6, d’eascair grúpa imdhíonta pSARS2-S méid níos airde IFN- (33918.8 pg/mL ± 11646.1) agus IL-2 (800.3 pg/mL ± 109.5) ná sin de IL-5 (4.6 pg/mL ± 2.9) agus IL-13 (545.7 pg/mL ± 117.4) (Fíor 5E–5H). Thug na sonraí seo le tuiscint go bhféadfadh pSARS{0}}S freagairtí imdhíonachta claonta Th{1}}a spreagadh.

Fig 5. T cell response in mice after immunization with pSARS-S and SARS2-S DNA vaccines. BALB/c (A-D) and C57BL/6 (E-H) mice (n = 4 per group) were intramuscularly immunized twice at a 3-week interval with 100 μg of vector, pSARS-S or pSARS2-S, followed by electroporation. Splenocytes were collected at week 4 after the first immunization, and the levels of secreted IFN-γ (A, E), IL-2 (B, F), IL-5 (C, G), and IL-13 (D, H) were evaluated after restimulation with recombinant SARS-CoV-2 S protein. Antibody titers are presented as the mean ± SEM. *p<0.05 by the Mann-Whitney test.

Fíor 5. Freagairt chealla T i lucha tar éis an imdhíonta le vacsaíní DNA pSARS-S agus SARS2-S.

Rinneadh imdhíonadh ionmhatánach faoi dhó ar lucha BALB/c (AD) agus C57BL/6 (EH) (n=4 in aghaidh an ghrúpa) i gceann eatramh seachtaine 3- le 100 ug de veicteoir, pSARS-S nó pSARS{{ 8}}S, agus leictreaphrú ina dhiaidh sin. Bailíodh splenocytes ag seachtaine 4 tar éis an chéad imdhíonta, agus na leibhéil secreted IFN- (A, E), IL-2 (B, F), IL-5 (C, G), agus IL Rinneadh measúnú ar -13 (D, H) tar éis athspreagadh le próitéin SARS-CoV-2 athchuingreach. Cuirtear leibhéil antasubstainte i láthair mar mheán ± SEM. *lch<0.05 by the Mann-Whitney test.

Éifeachtúlacht Phróifiolacsach Vacsaíní DNA i gCoinne Dúshlán SARS-CoV-2

Chun éifeachtúlacht chosanta an vacsaínithe pSARS2-S a iniúchadh, tugadh imdhíonadh faoi dhó ar hamstair na Siria le 100 ug DNA ag eatramh seachtaine 3-agus tugadh dúshlán inmheánach dóibh leis an víreas SARS-CoV-2 ag seachtain 7 (Fíor 6A). Tar éis an imdhíonta, bailíodh sera seachtaine 4 agus seachtaine 6 le haghaidh titer antasubstainte frith-spike (IgG) agus anailísí titer antasubstainte a neodrú. Fuair ​​​​imdhíonadh le pSARS2-S leibhéil níos airde titers antashubstainte frith-Spike ná imdhíonadh ptRBD ag seachtain 4 (1584.9 vs. 50.1) agus seachtain 6 (1995.3 vs. 63.1) i hamsters (Fíor 6B). Ag teacht leis na titers antashubstainte frith-Spike, d'ardaigh séiream na hamstairí pSARS2-S-imdhíonta leibhéil antashubstainte neodraithe an-ard (6.5 ag seachtain 4 agus 6.4 ag seachtain 6 (log2)), ach d'ardaigh sera an veicteora- nó Ní raibh hamsters imdhíonta ptRBD (Fíor 6C). Tar éis an dúshláin le SARS-CoV-2, rinneadh monatóireacht ar mheáchan coirp an hamstar gach lá. Léirigh staidéir roimhe seo gur shroich an titer víreasach sna scamhóga hamster leibhéal ard ag 3 lá iar-dhúshlán [30]. Dá bhrí sin, rinneadh leath de na hamsters ó gach grúpa a íobairt ar lá 3 agus rinneadh anailís ar an ualach víreasach sa scamhóg. Tháinig laghdú de réir a chéile ar mheáchan coirp na hamsters atá vacsaínithe i veicteoir, agus b'ionann an céatadán de mheáchan coirp a cailleadh 11.1% ag 6 lá tar éis an dúshlán. I gcodarsnacht leis sin, thug imdhíonadh pSARS2-S cosaint do na hamsters ó mheáchain caillteanas coirp (Fíor 6D). Ina theannta sin, léirigh titers víreas tógálach agus líon na gcóipeanna víreasacha RNA sa ghrúpa pSARS2-S laghduithe log10 2.29 agus 1.37 i gcomparáid leis an ngrúpa rialaithe veicteora (Fíor 6E agus 6F). Thug na torthaí seo le tuiscint go dtugann imdhíonadh pSARS2-S cosaint ar ionfhabhtú SARS-CoV-2 i hamstair na Siria.

Fig 6. Prophylactic efficacy of SARS-CoV-2 S DNA vaccine in SARS-CoV-2-infected hamsters. (A) Time course of DNA vaccination and SARS-CoV-2 challenge. Syrian hamsters were intramuscularly immunized twice at a 3-week interval with 100 μg of control, pSARS-S or pSARS2-S, followed by electroporation. Serum samples were collected by retroorbital blood sampling at weeks 4 and 6 after the first immunization. At 4 weeks after the second immunization, Syrian hamsters were intranasally challenged with 105 TCID50 SARS-CoV-2. (B) Antibodies against the SARS-CoV-2 full-length spike protein were evaluated by ELISA. (C) Vaccine-induced neutralizing activity against SARS-CoV-2 was evaluated by neutralization assay. (D) Body weight change (%) of the hamsters was recorded every day after the SARS-CoV-2 challenge. Virus titers (E) and viral RNA copies (F) in the lungs of SARS-CoV-2-infected hamsters at 3 days post-challenge were determined by TCID50 assay and qRT-PCR, respectively. Antibody titers are presented as the mean ± SEM, and neutralization titers are expressed as the geometric mean with a 95% confidence interval. *p<0.05, ***p<0.001 by the Mann-Whitney test.

Fíor 6. Éifeachtacht phróifiolacsach na vacsaíne SARS-CoV-2 S DNA i hamstair ionfhabhtaithe.

(A) Cúrsa ama an vacsaínithe DNA agus dúshlán SARS-CoV-2. Rinneadh imdhíonadh ionmhatánach de chuid hamstair na Siria faoi dhó ag eatraimh 3-seachtaine le 100 ug rialaithe, pSARS-S nó pSARS2-S, agus leictrimhaireacht ina dhiaidh sin. Bailíodh samplaí serum trí shampláil fola retroorbital ag seachtainí 4 agus 6 tar éis an chéad imdhíonta. Ag 4 seachtaine tar éis an dara imdhíonta, tugadh dúshlán inmheánach do hamstair na Siria le 105 TCID50 SARS-CoV-2. (B) Rinne ELISA measúnú ar antasubstaintí i gcoinne na próitéine spíce lán-fhad SARS-CoV. (C) Rinneadh measúnú ar ghníomhaíocht neodraithe de bharr vacsaíne i gcoinne SARS-CoV-2 trí mheasúnacht neodraithe. (D) Taifeadadh athrú meáchan coirp (%) de na hamstair gach lá tar éis an dúshlán SARS-CoV-2. Cinneadh titers víreas (E) agus cóipeanna víreasacha RNA (F) sna scamhóga de hamsters ionfhabhtaithe SARS-CoV ag 3 lá tar éis an dúshlán ag measúnacht TCID50 agus qRT-PCR, faoi seach. Cuirtear titers antashubstainte i láthair mar mheán ± SEM, agus cuirtear na leibhéil neodrúcháin in iúl mar mheán geoiméadrach le eatramh muiníne 95%. *lch<0.05, ***p<0.001 by the Mann-Whitney test.

Plé

Seoladh níos mó ná 80 triail chliniciúil vacsaíne COVID-19, agus is céimeanna ríthábhachtacha iad staidéir imdhíon-ghineachta agus dúshláin víreasacha in ainmhithe i bpróisis forbartha vacsaíní. Tá dianfhorbairt déanta ar vacsaíní DNA le haghaidh ionfhabhtú SARS-CoV-2 le haghaidh cineálacha éagsúla cur chuige seachadta. Is cur chuige tuar dóchais inti é electroporation ar féidir leis feabhas a chur ar sheachadadh DNA agus ar antigenicity imdhíongens in vivo. Tá dhá staidéar vacsaíne DNA tuairiscithe, ag Yu et al. [13] agus Smith et al. [12]. Yu et al. found that rhesus macaques immunized with naked DNA encoding full-length S protein (without electroporation) exhibited >3.1 log10 laghduithe ar ualaí víreasacha i lavage bronchoalveolar tar éis dúshlán i gcomparáid le rialuithe. Smith et al. fuarthas amach go bhféadfadh imdhíonadh lucha agus muca guine le INO-4800 (ionchódú próitéin fad-iomlán S) le leictreapórú antasubstaintí a neodrú i gcoinne ionfhabhtú SARS-CoV-2 agus bac a chur ar phróitéin S ceangailteach leis an ngabhdóir ACE2 ach go bhféadfadh sé gan sonraí dúshlán ainmhithe a sholáthar. Sa tuarascáil seo, rinneamar measúnú ar leagan éagsúla d’iarrthóirí vacsaíne DNA agus fuaireamar amach gurb í an phróitéin S lán-fhad (pSARS2-S) an ceann is oiriúnaí do staidéar imdhíoneolaíoch breise. Cé go roinneann SARS-CoV agus SARS-CoV-2 homaleolaíocht 76% ina gcuid próitéiní S [31, 32], ní féidir le himdhíonadh pSARS-S antasubstaintí a aslú i gcoinne RBD na próitéine SARS-CoV-2 S nó titers antashubstainte a neodrú i gcoinne ionfhabhtú SARS-CoV-2 (Fíor 2). Go deimhin, tá ról tábhachtach ag antasubstaintí frith-RBD maidir le hionfhabhtú víreasach a bhlocáil. Mar sin féin, ghin imdhíonadh le RBD amháin (ptRBD) titers antashubstainte neodraithe arda i lucha ach ní i hamsters (Figs2Hagus6C). Rinneamar tuairimíocht go bhféadfadh an toradh seo a bheith mar gheall ar theip ar an peptide comhartha (gníomhaitheoir plasminogen fíocháin) chun secretion na próitéine RBD i hamsters a éascú. Teastaíonn tuilleadh staidéir ar an meicníocht mhionsonraithe amach anseo. Thugamar faoi deara freisin gur eascair an t-imdhíonadh ptRBDTM (ag ionchódú blúire ón RBD go dtí an fearann ​​transmembrane de S) le leibhéil neodrúcháin antashubstainte níos ísle ná an t-imdhíonadh ptRBD (Figs2HagusS1C). Féadfaidh na torthaí struchtúr éagobhsaí an phróitéin RBD-TM a léiriú. Chun imscrúdú breise a dhéanamh ar fhreagairtí imdhíonachta Th1/Th2, spreagadh splenocytes ó lucha imdhíonta le próitéin SARS-CoV-2 S. Fuaireamar amach gur tharraing imdhíonadh pSARS2-S2-S1-freagraí imdhíonacha láidre claonta le leibhéil níos airde rúndachta IFN tar éis spreagtha (Fíor 5), ach níor eascair an t-imdhíonadh pSARS-S ach le leibhéil ísle rúndachta IFN. Léirigh na sonraí seo nach bhfuil tras-imoibríocht na bhfreagraí cealla T idir an spike próitéin SARS-CoV agus SARS-CoV-2 ard (Fig 5). Ina theannta sin, léirigh measúnacht IFN- ELISPOT gur braitheadh ​​​​níos lú freagraí cealla T i gcoinne réigiún S1 i lucha C57BL/6 agus BALB/c a imdhíonadh le pSARS-S (S2 Fíor), a fhaigheann tacaíocht freisin ó staidéar Smith [12]. Thug na sonraí seo le fios go bhféadfadh sé nach gcuirfeadh an vacsaín SARS lánéifeacht chosanta ar fáil in aghaidh ionfhabhtú SARS-CoV-2. Tá forbairt vacsaíní DNA tábhachtach chun freagairt thapa a thabhairt ar an ionfhabhtú paindéimeach den choróinvíreas. Mar sin, d’fhéadfaí rath na vacsaíne DNA in aghaidh SARS-CoV-2 a chur i bhfeidhm ar ghalair thógálacha éiritheacha eile.

De bharr na dtógálacha éagsúla a úsáideadh sna vacsaíní SARS-SoV-2 DNA, d’eascair leibhéil éagsúla de na titers antashubstainte a neodrú. Baineadh úsáid as an seicheamh ceannaire tPA chun léiriú antigen agus secretion i vacsaíní DNA a mhéadú [21, 33–35]. Mar sin féin, níor mhéadaigh seicheamh ceannaire an tPA go mór na titers antashubstainte sa tuarascáil seo. Chun éifeachtúlacht na vacsaíne a mhéadú tuilleadh, d’fhéadfaí seichimh ceannaire éagsúla a úsáid chun seicheamh ceannaire dúchais na próitéine spíc a athsholáthar. Baineadh úsáid as an seicheamh ceannaire IgE sa vacsaín DNA INO-4800 agus sa vacsaín MERS-CoV [5, 12]. Ina theannta sin, féadfaidh an seicheamh próitéin spike modhnaithe méadú ar imdhíon-ghineacht an vacsaín. Dearadh próitéin spíc chobhsaithe tríd an suíomh furin agus réigiúin eile a shóchánú chun struchtúr prefusion (S-2P) a ghiniúint a fhéadfaidh slonn na próitéine spíc a mhéadú ~10-huaire [36]. Ba cheart go ndéanfadh vacsaín DNA idéalach córas tógála agus seachadta DNA plasmid a bharrfheabhsú chun leibhéal slonn na próitéine a mhéadú.

Desert ginseng—Improve immunity

cistanche tubulosa-feabhas a chur ar chóras imdhíonachta

Tá samhlacha ainmhithe ríthábhachtach d’fhorbairt vacsaíne COVID-19. Baineadh úsáid as roinnt samhlacha ainmhithe chun éifeachtúlacht vacsaíní COVID a mheas, lena n-áirítear príomhaigh neamhdhaonna [13, 37], lucha trasgenacha ACE2 daonna [38], agus hamsters Siria [39]. Tá cosúlacht ard ag hamstar Siria ACE2 le ACE2 daonna, agus measadh go raibh a chleamhnas ceangailteach le próitéin S SARS-CoV-2 níos airde ná an luch ACE2 [40]. Sin é an fáth ar úsáideadh lucha trasgenacha ACE2 daonna mar mhúnlaí dúshláin SARS-CoV-2, ach ní lucha fiáine. Léirigh staidéir tarchuir SARS-CoV-2 gur féidir leis an víreas hamsters naive a ionfhabhtú go héifeachtach trí theagmháil dhíreach nó trí aerasóil [41]. Is féidir le hionfhabhtú intranasal SARS-CoV-2 pataigineas a mhacasamhlú agus a chothú i scamhóga hamstair na Siria [30]. This study and previous reports also showed that SARS-CoV-2 infection caused approximately a 10% reduction in the initial body weight of hamsters. Clinical manifestations of patients with COVID-19, including changes in smell and taste, and severe respiratory distress, might be accompanied by weight loss (>laghdú 5% ón mbunlíne), a bhain le ré galair níos faide [42]. Léiríonn na torthaí seo gur samhail ainmhithe oiriúnach é hamstar na Siria freisin chun vacsaíní COVID a mheas. Bunaithe ar infhaighteacht samhlacha ainmhithe, roghnaigh muid hamsters mar mhúnla dúshláin SARS-CoV-2 chun éifeachtúlacht vacsaíne a mheas. Thaispeáin ár sonraí gur féidir le himdhíonadh le pSARS2-S, ach ní ptRBD, leibhéil arda d’antasubstaint frith-Spike IgG a aslú agus titers antashubstainte a neodrú (Fíor 6B agus 6C). Dá réir sin, chruthaigh hamstairí pSARS2-S-imdhíonta, ach ní hamsters imdhíonta ptRBD, freagairtí imdhíonachta i gcoinne dúshlán SARS-CoV-2. Thugamar faoi deara go bhféadfadh imdhíonadh ptRBD leibhéil arda de leibhéil antasubstainte a neodrú i lucha a chothú ach ní i hamstairí. D’fhéadfadh na torthaí contrártha a bheith ann toisc nach gcuirtear RBD amháin in iúl go seasta i hamsters. Baineadh úsáid as an tsamhail hamstair freisin chun meastóireacht a dhéanamh ar an vacsaín adenovirus do sheiritíopa 26 (Ad26) veicteoir-bhunaithe COVID-19. Mar gheall ar imdhíonadh aonair leis an vacsaín veicteoir-bhunaithe Ad26 a léirigh spícphróitéin chobhsaithe SARS-CoV-2 a spreag freagairtí antasubstainte a neodrú agus a chosain in aghaidh ionfhabhtú SARS-CoV-2 spreagtha meáchain caillteanas, básmhaireacht pháirteach agus macasamhlú víreasach. sa scamhóg [39]. Léirigh na torthaí seo go bhfuil an tsamhail hamstair oiriúnach chun éifeachtúlacht vacsaíní COVID a mheas.

Tá go leor iarrachtaí forbartha vacsaíne SARS-CoV-2 bunaithe ar thaithí taighde MERS-CoV agus SARS-CoV. Ar fud an domhain, faomhadh roinnt vacsaíní COVID-19 lena n-úsáid chun cinn i mí na Nollag 2020, lena n-áirítear vacsaíní RNA- agus adenovirus veicteoir-bhunaithe COVID-19. Pléadh na buntáistí agus na míbhuntáistí a bhaineann le hardáin vacsaínithe éagsúla [43]. Féadfaidh vacsaíní veicteora adenovirus freagairtí imdhíonachta níos láidre a fháil ná vacsaíní DNA agus mRNA, ach d'fhéadfaí a n-éifeachtúlacht vacsaín a laghdú trí dhíolúine a bhí ann cheana i gcoinne veicteoirí Ad [44]. I gcomparáid le vacsaín DNA, tá teocht ultralow ag teastáil ón vacsaín mRNA le haghaidh stórála agus iompair [45]. Mar sin, d'fhéadfadh an vacsaín DNA a bheith ina ardán vacsaínithe féideartha, go háirithe le linn úsáide éigeandála.

Tugann ár staidéar le fios go bhféadfaí vacsaín DNA a fháil le húsáid ag an duine. D'fhéadfadh staidéir bhreise imscrúdú a dhéanamh ar éifeachtúlacht an vacsaín DNA seo a sheachadtar ag baint úsáide as instealladh intradermal (ID), atá níos áisiúla d'iarratas cliniciúil, toisc go bhfuil an tsnáthaid le haghaidh instealladh IM thart ar 18 mm domhain i ndaoine agus go mbíonn tionchar aige ar níos mó fíocháin ná instealladh ID ag EP. Ina theannta sin, ba cheart éifeachtúlacht vacsaíne a thástáil i lucha aosta mar mhúnla do dhaoine scothaosta, toisc go gcuirtear isteach go mór ar an daonra seo agus iad ionfhabhtaithe le SARS-CoV-2. Léirigh staidéir roimhe seo go raibh baint ag freagairt cille Th2 le galar riospráide feabhsaithe (VAERD) tar éis vacsaínithe víreas neamhghníomhaithe a vacsaíniú i gcoinne RSV [46], víreas na bruitíní [47], agus SARS-CoV [27, 48]. I gcodarsnacht leis sin, tá cásanna níos lú déine de SARS-CoV mar thoradh ar ionduchtú freagra cille Th1 a thuairisciú [49]. Mar sin, tugann na freagairtí imdhíonachta láidre claonta Th1-a chothaíonn an vacsaín DNA le fios nach dócha go mbeidh fo-iarmhairtí ina saincheist mhór [50]. Ina theannta sin, ardaíodh imní faoi vacsaíní próitéin-bhunaithe mar gheall ar úsáid a bhaint as salann alúmanaim nó aidiúvaigh de chineál eibleachta ola-in-uisce, as a dtagann Th{4}}freagraí imdhíonachta claonta agus a mhéadaíonn fo-iarmhairtí féideartha [51, 52]. Go hachomair, d’fhéadfadh ról mór a bheith ag an vacsaín DNA COVID-19 maidir leis an bpaindéim COVID-19 a rialú go luath amach anseo.

Tagairtí

  1. Pak A, Adegboye OA, Adekunle AI, Rahman KM, McBryde ES, Eisen DP. Iarmhairtí Eacnamaíocha na Ráige COVID{0}}: An Gá le hUllmhacht Eipidéime. Sláinte Poiblí Tosaigh. 2020; 8:241. meán lae: 325743072. An Lárionad um Eolaíocht agus Innealtóireacht Chórais (CSSE) [Idirlíon]. Deais COVID-19. Ollscoil Johns Hopkins. [luaite 2021 11 Feabhra]. Ar fáil ó:
  2. 3.Buchholz UJ, Bukreyev A, Yang L, Lamirande EW, Murphy BR, Subbarao K, et al. An méid a chuireann próitéiní struchtúracha an choróinvíris géarshiondróm riospráide géar le díolúine cosanta. Proc Natl Acad Sci US A. 2004; 101(26):9804–9. pm: 152 10961
  3. 4. Yang ZY, Kong WP, Huang Y, Roberts A, Murphy BR, Subbarao K, et al. Spreagann vacsaín DNA neodrú coronavirus SARS agus díolúine cosanta i lucha. Dúlra. 2004; 428(6982):561–4. pm: 15024391
  4. 5. Muthumani K, Falzarano D, Reuschel EL, Tingey C, Flingai S, Villarreal DO, et al. Cothaíonn vacsaín DNA próitéin frith-spike comhdhearcadh sintéiseach díolúine cosanta i gcoinne coronavirus siondróm riospráide an Mheán-Oirthir i bpríomhaigh neamhdhaonna. Sci Transl Med. 2015; 7(301):301r132. meán lae: 26290414
  5. 6. vacsaíní Krammer F. SARS-CoV-2 á bhforbairt. Dúlra. 2020; 586(7830):516–27. pm: 32967006
  6. 7. Khalaj-Hedayati A. Díolúine Chosanta i gcoinne Iarrthóirí Vacsaín Fo-aonad SARS Bunaithe ar Phróitéin Spike: Ceachtanna d'Fhorbairt Vacsaín Coronavirus. J Immunol Res. 2020; 2020: 7201752. meán lae: 32695833
  7. 8.Lu B, Tao L, Wang T, Zheng Z, Li B, Chen Z, et al. Freagraí imdhíonacha greannacha agus ceallacha arna dtionscnamh ag 3a vacsaín DNA in aghaidh géarshiondróm riospráide géar (SARS) nó coróinvíreas cosúil le SARS i lucha. Imdhíonacht Clin Vacsaín. 2009; 16(1):73–7. Meán Fómhair: 18987 164
  8. 9.Bower JF, Yang X, Sodroski J, Ross TM. Díothú antasubstaintí a neodrú le vacsaíní DNA a chuireann in iúl do víreas easpa imdhíonachta intuaslagtha cobhsaithe daonna de chineál 1 trimmers glycoprotein cumhdach comhchuingeach go C3d. J Víreas. 2004; 78(9): 4710–9. meán lae: 15078953
  9. 10. Zakhartchouk AN, Viswanathan S, Moshynskyy I, Petric M, Babiuk LA. Optamú vacsaín DNA i gcoinne SARS. DNA Cell Biol. 2007; 26(10):721–6. Meán Fómhair: 17665998
  10. 11.Gary GA, Weiner DB. Vacsaín DNA: tá an príomh-am ann anois. Curr Opin Immunol. 2020; 65:21–7. meán lae: 32259744
  11. 12. Smith TRF, Patel A, Ramos S, Elwood D, Zhu X, Yan J, et al. Imdhíonacht iarrthóra vacsaíne DNA le haghaidh COVID-19. Cumann Nat. 2020; 11(1):2601. meán lae: 32433465
  12. 13.Yu J, Tostanoski LH, Peter L, Mercado NB, McMahan K, Mahrokhian SH, et al. Cosaint vacsaín DNA i gcoinne SARS-CoV-2 i macaques rhesus. Eolaíocht. 2020; 369(6505): 806–11. Meán Fómhair: 32434945
  13. 14.Jorritsma SHT, Gowans EJ, Grubor-Bauk B, Wijesundara DK. Modhanna seachadta chun glacadh ceallacha agus imdhíon-ghineacht vacsaíní DNA a mhéadú. Vacsaín. 2016; 34(46):5488–94. meán lae: 27742218
  14. 15. Kudchodkar SB, Choi H, Reuschel EL, Esquivel R, Jin-Ah Kwon J, Jeong M, et al. Freagairt mhear ar ghalar ionfhabhtaíoch atá ag teacht chun cinn—Ceachtanna a foghlaimíodh ó fhorbairt vacsaín DNA shintéiseach a dhíríonn ar an víreas Zika. Miocróib Infect. 2018; 20(11–12):676–84. meán lae: 2955534516.Adam L, Tchitchek N, Todorova B, Rosenbaum P, Joly C, Poux C, et al. Síniú Móilíneach agus Ceallach Dúntach sa Chraiceann Roimh Fhreagraí Cille T Fad-Mharthacha tar éis Vacsaínithe DNA Leictreabraithe. J Imdhíon. 2020; 204(12):3375–88. meán lae: 32385135
  15. 17. Lín F, Shen X, McCoy JR, Mendoza JM, Yan J, Kemmerrer SV, et al. Gléas fréamhshamhail nua do sheachadadh vacsaín DNA feabhsaithe leictrimhíochaine don chraiceann agus don mhatán araon. Vacsaín. 2011; 29(39):6771–80. pm: 21199706
  16. 18. Williams M, Ewing D, Blevins M, Sun P, Sundaram AK, Raviprakash KS, et al. Imdhíon-ghineacht feabhsaithe agus éifeachtúlacht chosanta vacsaín tetravalent dengue DNA ag baint úsáide as electroporation agus seachadadh intradermal. Vacsaín. 2019; 37(32):4444–53. meán lae: 31279565
  17. 19. Ramakrishnan MA. Titer críochphointe 50% a chinneadh ag baint úsáide as foirmle simplí. Domhanda J Virol. 2016; 5(2):85–6. meán lae: 27175354
  18. 20.Corman VM, Landt O, Kaiser M, Molenkamp R, Meijer A, Chu DK, et al. Coróinvíreas núíosach 2019 (2019-nCoV) a bhrath trí RT-PCR fíor-ama. Euro Surveill. 2020. pm:31992387
  19. 21. Kou Y, Xu Y, Zhao Z, Liu J, Wu Y, Tú Q, et al. Feabhsaíonn seicheamh comhartha gníomhachtaithe plasminogen fíocháin (tPA) imdhíon-ghineacht na vacsaíne MVA-bhunaithe i gcoinne eitinn. Immunol Lett. 2017; 190:51–7. meán lae: 28728855
  20. 22. Xia S, Zhu Y, Liu M, Lan Q, Xu W, Wu Y, et al. Meicníocht chomhleá de 2019-nCoV agus coscairí comhleá a dhíríonn ar fhearann ​​HR1 i bpróitéin spíc. Cill Mol Imdhíon. 2020; 17(7):765–7. meán lae: 32047258
B’fhéidir gur mhaith leat freisin