Teagmháil:jerry.he@wecistanche.com

Yuto Mitsuhata1, Takaya Abe2, Kazuyo Misaki3, Yuna Nakajima1, Keita Kiriya1,

Miwa Kawasaki4, Hiroshi Kiyonari2, Masatoshi Takeichi4*, Mika Toya1,4,5,6*&

Masamitsu Sato1,6,7

Is féidir le Cistanche feabhas a chur ar fheidhm na duáin

Eagraíonn cealla epithelial sraith ordaithe de mhicritiúibíní neamhlárnacha, a bhfuil a foircinn lúide á rialú ag CAMSAP3. Ní thuigtear ról na microtubules seo i bhfeidhmeanna epithelial, áfach. Anseo, léirímid go bhfuil anduáinforbraíonn lucha ina bhfuil Camsap3 mutatedcystsag na feadáin convoluted proximal (PCTanna). Bhí PCTanna dilated go mór sa tsóiteáinduáin, agus léirigh siad freisin iomadú cille feabhsaithe. Sna PCTanna seo, tháinig ramhrú ar chealla epithelial mar aon le suaitheadh ​​eagair mhicritiúibile chomh maith le struchtúir áirithe fo-cheallacha mar phróisis idirdhigiteacha basalacha. Ina theannta sin, gníomhaíodh YAP agus PIEZO1, ar a dtugtar rialtóirí mechanosensitive do mhúnlú agus iomadú cille, sna cealla PCT mutant seo. Tugann na barúlacha seo le tuiscint go bhfuil líonraí microtubule idirghabhála CAMSAP3 - tábhachtach chun airíonna meicniúla cearta na gcealla PCT a chothabháil, agus go spreagann a gcaillteanas dífhoirmiúchán agus iomadú cille trí mheicneo-bhraiteoirí a ghníomhachtú, rud a fhágann caolú PCTanna.

Is comhpháirteanna móra na n-orgán éagsúla iad cealla epithelial. Léiríonn Tey polaraíocht apical-go-basal atá nasctha lena bhfeidhmeanna, mar ionsú agus secretion. I gcealla epithelial difreáilte, tá formhór na micritiúbúl neamhlárnach agus tá siad ailínithe feadh na haise apical-go-basal1-3. Is ball é CAMSAP3 den teaghlach próitéine a bhaineann le speictrin-rialaithe calmodulin (CAMSAP)/Nezha/Patronin agus tá sé tábhachtach don eagraíocht micrea-feadán epithelial4–8 . Ceanglaíonn agus cobhsaíonn CAMSAP3 foircinn lúide na micritiúbules4,6,9. I gcealla an stéig bheag i lucha, tá CAMSAP3 comhchruinnithe ar réigiúin cortical apical, ag ancaireacht foircinn lúide na micritiúibíní neamhlárnacha chuig na suíomhanna seo10,11, agus mar thoradh air sin foirmítear eagair mhicritiúbúl atá dírithe ar an treo apicobasal agus na foircinn móideacha curtha in iúl go bunúsach. . Mar sin féin, cailltear an saineagraíocht microtubule seo i lucha a bhfuil géine mutant orthu a ionchódaíonn Camsap3 teasctha (Camsap3dc/dc lucha), ina scriostar an fearann ​​ceangailteach micrea-feadán C-críochfort. Tá lochtanna cíteolaíochta éagsúla ag cealla epithelial stéig sna lucha seo, lena n-áirítear airde cille laghdaithe agus orgánailíní míshuite mar an núicléas agus Golgi10. In ainneoin suaitheadh ​​mór den sórt sin san ailtireacht incheallach, coimeádann na cealla epithelial bileoga déthoiseacha gnáth-bhreathnaithe10,12, agus ní raibh aon lochtanna fiseolaíocha soiléire ar na hintíní mutated.

feadáin (PCTanna), lúb Henle, feadáin dronnacha distal, agus ducht bailithe. Is éard atá i bhfo-struchtúir Tese nephron ná sraith amháin epithelium, a fheidhmíonn le haghaidh scagachán, ath-ionsú, agus secretion.

A duánach cistIs lesion paiteolaíocha coitianta de naduáin. Tá an lesion chisteach inathraithe; foirmíonn cysts fócasacha nó iolracha ar thaobh amháin nó go déthaobhach sna duáin, rud a léiríonn céim éagsúil de na hairíonna 13-15. Roinnt chisteach ó bhroinnduánachgalair, lena n-áirítear polycysticduángalair (PKD), galar duáin glomerulocystic (GCKD) agus cystic medullaryduángalar (MCKD), is eol a bheith ina chúis le iolrachduánachcysts sna duáin déthaobhacha. I PKD, déantar cysts a dháileadh go haonfhoirmeach ar an orgán iomlán lena n-áirítear PCTanna, ach forbraíonn GCKD agus MCKD cysts i capsúil Bowman agus i nduchtanna bailithe (go príomha ag an réigiún medulla), faoi seach16–19 .

Maidir le PKD, is eol dhá phríomhchúis: 1) sócháin sa ghéin Pkd1 nó Pkd2, agus 2) sócháin i ngéinte a theastaíonn le haghaidh bithghineasa cileiam príomhúil. Ionchódaíonn Pkd1 agus Pkd2 polycystin1 agus polycystin2, faoi seach, ar bealaí neamhroghnacha iad20 a logálann ag roinnt urranna ceallacha lena n-áirítear na cilia príomhúla21,22 . I lucha a iompraíonn foirm mutant de PKD1 nó PKD2, ní logántaíonn próitéiní polycystin go cilia23. I measc na ngéinte a theastaíonn le haghaidh bithghineasa cilia príomhúla tá If88 agus Kif3a, a bhfuil baint acu le hiompar infhéitheach24–26 . Mar thoradh ar sócháin sna géinte seo freisinduánachgalair chisteach24-27 . Cé go bhfuil an gaol idir an dá chosán cúiseach seo casta23, baineann cosán amháin a léiríodh go spreagtar PKD leis an éifeachtóir comharthaíochta Hippo Yap28 . I lucha mutant Pkd1, cuirtear an comhghníomhaí trascríobh YAP/TAZ agus a éifeachtóir c-Myc i ngníomh agus cuireann siad cystogenesis28 chun cinn. Mar sin féin, na meicníochtaí is bun le forbairt polycysticduáinfós anaithnid den chuid is mó.

Sa staidéar reatha, rinneamar imscrúdú ar róil CAMSAP3 iduánstruchtúr agus feidhm. Léiríonn ár gcuid tuairimí go gcuireann CAMSAP3 logánaithe apically le treoshuíomh ceart microtubules neamh-lárnach chomh maith le bunú na hailtireachta intracellular cealla epithelial i PCTs, mar a breathnaíodh sa stéig bheag. Murab ionann agus an epithelia intestinal, áfach, CAMSAP3mífheidhmneamhghnáchaíochtaí ar leibhéal na n-orgán sna duáin dhéthaobhacha ba chúis leis - is é sin, foirmiú cyst i PCTanna. Mar thoradh ar chailliúint fheidhm CAMSAP3 cuireadh rialtóirí mechanosensitive a ghníomhachtú a chabhraíonn le sláine fíocháin a chaomhnú de ghnáth. Tugann ár staidéar le fios go bhfuil CAMSAP3-eagraíocht mhicritiúbúl neamh-lárnach trí mheán CamsAP tábhachtach chun airíonna meicneo-íogaire PCTanna a chothabháil, agus cruthaítear cyst réigiúnach sa duán mar gheall ar chailliúint an chórais seo.

Torthaí

Cistfoirmiú iduáinde lucha mutant Camsap3. Léirigh anailís feinitíopach ar lucha mutant Camsap3dc/dc é sinduáini lucha aosta (~ 2 bhliain d'aois) Camsap3dc/dc bhí hipertróf agus mídhath ar lucha (Fíor 1a). Chun anailís bhreise a dhéanamh ar mhínormáltachtaí in Camsap3dc/dcduáin, scrúdaíomar lucha níos óige. Ag an lá iarbhreithe 21 (P21), bhí gnáthchuma ar na duáin Camsap3dc/dc. Mar sin féin, léirigh alting na duáin struchtúir chisteach ag na réigiúin cortical (Fíor 1b agus Forlíontach Fíor. S1a), mar atá deimhnithe ag ríomh an t-innéacs chisteach, arb é an cóimheas idir na limistéir ina bhfuil cystic le limistéar iomlán na duáin (Fíor. 1c). Scrúdaigh muid suthanna mutant chun a chinneadh nuair a thosaíonn cysts a fhoirmiú le linn forbartha, a léirigh comhartha de foirmiú cyst méadaithe ag thart ar lá suthach 17.5 (E17.5) (Fíor Forlíontach S1a, saigheada). Ag P0, bhí cysts cortical inaitheanta go héasca (Fíor Fhorlíontach S1a, saigheada), agus mhéadaigh a méid agus a n-uimhir faoi P21 (Fíor 1b, Fíor Forlíontach S1a, saigheada). De réir mar a d'fhás lucha níos sine, bhí feinitíopaí chisteach níos soiléire, cé go raibh éagsúlacht ag baint le méid foirmiú na gcistin i measc na ndaoine aonair (Fíor 1c agus Fíor Forlíontach S1b). Ina theannta sin, bhí an cóimheas idir duán agus meáchan coirp níos airde do lucha Camsap3dc/dc ná lucha de chineál fiáin (WT) thar a saolré (Fíor 1d agus Fíor Forlíontach S1c, d). Léirigh na duáin Tus, Camsap3dc/dc foirmiú cyst, a feabhsaíodh le himeacht ama, rud a d'eascair hipertróf sna seanduáin.

Cuireann lucha Camsap3dc/dc in iúl CAMSAP3 (CAMSAP3-dc)10 atá teasctha ag fearann ​​C-críochfort, a d'fhéadfadh baint a bheith aici le feinitíopa chisteach breathnaithe duán na luiche. Chun an fhéidearthacht seo a fhiosrú, ghineamar luch Camsap3–/– (Camsap3-null) (Fíor Forlíontach S2a,b) (féach freisin Modhanna go mion). Bhí na lucha seo freisinduáinle cysts iolracha, agus bhí a bhfeinitíopa do-aitheanta ón gceann a breathnaíodh i lucha Camsap3dc/dc; go háirithe, níor léirigh lucha heitrisigeacha (Camsap3 móide /–) aon chomharthaí de na duáin ilchisteacha (Fíor Forlíontach S2c).

Foirmiú cyst i PCTanna de Camsap3dc/dcduáin. Chun a chinneadh cé na struchtúir a tháinig chun bheith cisteach sa tsóiteáinduáin, rinneamar imdhíonadh trí mhír néaróin ar feadh trí phróitéin, is iad sin Megalin (áitíonn sé go PCTanna), comh-transporter Na plus /Cl- (feadáin chonbhlúite distal), agus aquaporin-2 (duchtanna a bhailiú). Léirigh torthaí te gur tharla dilation go heisiach ag feadáin Megalin-dearfach ag P21 (Fíor 1e agus Fíor Forlíontach. S1e), rud a léiríonn go raibh cystogenesis teoranta do PCTanna. Déantar PCTanna a fhoroinnt i dtrí mhír, is iad sin S1, S2 agus S3, agus rinneamar idirdhealú eatarthu trí imdhíonacht a dhéanamh do na hiompróirí glúcóis SGLT1 agus SGLT2, a logálann ag deighleoga S3 agus S1/S2, faoi seach29,30 . Marcáladh feadáin te dilated amháin ag SGLT2 (Fíor 1f), rud a léiríonn go dtarlaíonn cystogenesis ag na codanna S1/S2. I lucha tsóiteáin níos sine, áfach, leathnaigh foirmiú cyst go capsule an Bowman (Fíor 1g).

Ailtireacht cheallacha neamheagraithe i PCTanna chisteacha. Chun lochtanna ar leibhéal ceallacha i PCTanna chisteacha a iniúchadh, rinneamar iad a scrúdú ar dtús trí mhicreascópacht leictreoin a scanadh, agus fuarthas amach go raibh daonra deduánachtháinig méadú suntasach ar fheadáin sna duáin Camsap3dc/dc (Fíor 2a), cé go raibh éagsúlacht ag baint le méid an at ó shuíomh go suíomh an fheadáin. Léirigh tras-ailt, ag codanna swelled de tubule, go raibh a lumen leathnaithe chomh maith le tanú na ciseal epithelial comhdhéanta na feadáin (Fig. 2a). Cainníochtú ag baint úsáide as hematoxylin agus samplaí dhaite eosin dheimhnigh gur laghdaíodh airde cille sna feadáin dilated (Fíor 2b), ach méadaíodh imlíne apical gach cille (Fíor. 2c), rud a léiríonn go raibh na cealla mutant fatter ná iad siúd i WTduáin.

An chéad uair eile rinneamar scrúdú ar cé acu an raibh tionchar ag sóchán Camsap3 ar ailtireacht cille agus/nó ar struchtúir fho-cheallacha PCTanna. Léirigh imdhíonadh le haghaidh DPP IV, marcóir membrane apical, agus le haghaidh Na plus /K plus -ATPase, marcóir membrane basothaobhach, go raibh polaraíocht iomlán na gceall gnáth i ngachduánachcill tubule de Camsap3dc/dc

Fíor 1. Foirmiú cyst i feadáin convolute cóngarach Camsap3dc/dcduáin. (a) Moirfeolaíocht na nduán de lucha WT ( móide / móide ) agus Camsap3 mutant (Camsap3dc/dc) ag P666. (b) smáthú H&E ar na duáin WT agus Camsap3dc/dc ag P21. Cysts iolrach déanta i cortex na duáin Camsap3dc/dc. (c) Athrú ar innéacs cisteach lucha WT agus Camsap3dc/dc le himeacht ama. Scrúdaíodh 9 lucha le haghaidh WT nó Camsap3dc/dc. Féach ar ÁBHAR AGUS MODHANNA chun an t-innéacs cisteach a shainmhíniú. (d) Cóimheas na duáin le meáchan coirp. Scrúdaíodh 11 lucha le haghaidh WT nó Camsap3dc/dc. (e) Imdhíonadh le haghaidh marcóirí feadáin convolute cóngaracha (PCT) (Megalin), feadáin dronuilleoige (DCT), comh-iompróir NaCl, agus duchtanna bailithe (CD) (aquaporin-2; AQP2) in WT agus Camsap3dc/ dcduáinag P21. Taispeánann íomhánna den radharc méadaithe de Megalin Megalin díláraithe i gcealla cisteach sna duáin Camsap3dc/dc, mar a léiríonn an ceann saighde. Léiríonn línte briste agus leanúnacha corrlach apical agus basal na cille, faoi seach. (f) Imdhíonadh do mharcóirí na míre S1/S2 (SGLT2, glas) agus mír S3 (SGLT1, dearg) sna duáin WT agus Camsap3dc/dc ag P21. Léiríonn íomhánna den radharc méadaithe ar SGLT2 déine comhartha SGLT2 laghdaithe i gcealla cisteach sna duáin Camsap3dc/dc, mar a léirítear ag cinn saighde. (g) Moirfeolaíocht an glomerulus ag P21 agus P487. Léiríonn cinn saighde an glomerulus dilated. Féach freisin Fíoracha S1 agus S2.

Fíor 2. Ailtireacht cheallacha neamheagraithe i gcealla PCT chisteach. (a) Scanadh íomhánna micreascópachta leictreon ▸

Is féidir le Cistanche feabhas a chur ar fheidhm na duáin

de WT agus Camsap3dc/dcduáinag P21. Feadán duánach i Camsap3dc/dcduáingo páirteach ata. (b) Cainníochtú airde cille sa cortex [ móide / móide , n=121 cealla; dc/dc (dilated), n=128 cealla; dc/dc (neamh-dilated), n=66 cealla]. Léiríonn barraí earráide SD ***p<0.001, t-test.="" see="" materials="" and="" methods="" for="" the="" defnition="" of="" dilated="" and="" non-dilated="" tubules.="" (c)="" quantifcation="" of="" cell="" width="" in="" the="" cortex="" [+="" +="" ,="" n="26" tubules;="" dc/="" dc="" (dilated),="" n="8" tubules;="" dc/dc="" (non-dilated),="" n="14" tubules].="" error="" bars="" indicate="" s.d.="" ***p=""><0.001, t-test.="" (d)="" cell="" polarity="" markers="" were="" visualized:="" dpp="" iv="" (apical="" marker)="" and="" na+/k+-atpase="" (basal="" marker).="" te="" localization="" of="" cell="" polarity="" markers="" in="" camsap3dc/dc="" kidney="" is="" overall="" normal.="" te="" arrowhead="" indicates="" basal="" plasma="" membranes,="" whose="" invagination="" is="" not="" normal.="" (e)="" apical="" structures="" (actin="" and="" ezrin)="" and="" the="" golgi="" were="" visualized.="" arrowheads="" indicate="" disrupted="" structures="" such="" as="" the="" lack="" of="" actin="" signal="" and="" misplacement="" of="" the="" golgi.="" broken="" and="" continuous="" lines="" indicate="" the="" apical="" and="" basal="" margin="" of="" the="" cell,="" respectively,="" in="" d="" and="" e.="" (f)="" transmission="" electron="" microscopy="" images="" of="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p21.="" subcellular="" defects="" such="" as="" a="" fattened="" nucleus="" and="" misaligned="" mitochondria="" are="" observed="" in="" camsap3dc/dc="" kidneys.="" arrowheads="" indicate="" invaginated="" basal="" membranes.="" note="" that="" their="" extensive="" invagination="" is="" suppressed="" in="" camsap3dc/dc.="" asterisks="" denote="" mitochondria.="" drawings="" are="" the="" traced="" invagination="" in="" electron="" microscopy="" images.="" (g)="" quantifcation="" of="" the="" shape="" of="" the="" nucleus="" [+="" +="" ,="" n="72" cells;="" dc/dc="" (dilated),="" n="72" cells;="" dc/dc="" (non-dilated),="" n="71" cells].="" (h)="" immunostaining="" for="" acetylated="" tubulin,="" a="" marker="" for="" the="" primary="" cilium,="" in="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p21.="" te="" primary="" cilium="" was="" present="" in="" both="" wt="" and="" camsap3dc/dc="">duáin. (i) Líon na gcilia príomhúla ag FCPanna. Ríomhadh líon na gcilia príomhúla ag baint úsáide as fad imlíne apical tras-ailt PCT, chomh maith le líon na gcilia agus na núicléas príomhúil. [ móide / móide , N=340 cealla, 63 trasghearradh de PCT, Líon na gcilia príomhúla=268; dc/dc, N=221 cealla, 29 trasghearradh de PCT, Líon na gcilia príomhúla=133].

lucha (Fig. 2d). I gcodarsnacht leis sin, cé go carntha Megalin ag na réigiúin apical i gcealla WT, idirleata sé isteach sa cíteaplasma i roinnt de na cealla cystic Camsap3dc/dc (Fíor. 1e dearcadh méadaithe, agus Fíor. 2d). Thug staining fhluaraiseachta do F-actin, a charnann ag ard-dlús i microvilli apical, le fios go raibh na microvilli neamh-eagraithe ó am go chéile i gcealla sailleacha mutantduáin(Fíor 2e ceann saighde), arna dhaingniú ag micreascópacht leictreoin tarchurtha (Fíor 2f). Laghdaíodh nó cailleadh Ezrin, cuid den choimpléasc ERM a bhaineann leis an membrane plasma apical31, i gcealla cisteach Camsap3dc/dcduáin(Fíor 2e), rud a thugann le tuiscint go raibh cítoailtireacht neamhghnácha i gcealla mutant. Ina theannta sin, cé go bhfuil an gaireas Golgi Giantin-dearfach dáilte go ginearálta mar shnáitheanna tanaí in aice leis an núicléas i gcealla WT, tháinig an Golgi comhdhlúite uaireanta i gcealla Camsap3dc/dc (Fíor 2e). Nocht micreascópacht tarchurtha leictreon lochtanna breise focheallach i PCTanna dilated de Camsap3dc/dcduáin. I gcealla PCT WT, bhí miteachondria fadaithe, ag taispeáint treoshuíomh ordaithe feadh ais apico-basal na cille, ach i gcealla CCT cisteach, bhí claonadh ag mitochondria a bheith cruinn — gan aon treoshuíomh ordaithe a thaispeáint a thuilleadh (Fíor 2f). Sna cealla seo, bhí na stríoca basal dí-eagraithe freisin, rud a chaill a n-ionghabhálacha comhthreomhara agus domhain atá coitianta i gcealla WT (cinn saighde Fíor 2f agus líníocht rianaithe), mar a léirítear freisin trí imdhíonadh do Na plus /K plus -ATPase (Fíor . cinn saighde 2d). Thairis sin, bhí ramhrú núicléis sna cealla chisteach, i gcomparáid lena cruth cruinn i gcealla WT (Fíor 2f, g). Bhí cilia bunscoile inbhraite ar thaobh luminal na gcealla PCT sa dá WT agus duáin mutant (Fíor 2h, i), murab ionann agus an cás do lucha mutant atá lochtach do ciliogenesis, is cúis duáin polycystic24-27, le tuiscint go bhfuil lagú ciliogenesis. ní hé an chúis is dócha leis an

feinitíopaí ilchisteacha breathnaithe i lucha Camsap3dc/dc. Le chéile, léirigh na breathnuithe sinmífheidhmde CAMSAP3 cuireann sé isteach ar ailtireacht fhocheallach cealla chisteach PCT.

Léiríonn lucha camsap3dc/dc roinnt lochtanna fiseolaíocha. Ansin rinneamar scrúdú an raibh aon lochtanna fiseolaíocha ar na duáin Camsap3dc/dc. Léirigh staidéir imdhíon-icéiteolaíochta te go Megalin, a fheidhmíonn mar multiligand endocytic receptor32,33, claonadh chun idirleata isteach sa cíteaplasma na cealla PCT Camsap3dc/dc (Fig. 1e ceann saighde, agus Fíor. 2d), i gcodarsnacht lena logánú apical soiléir i Cealla WT PCT. Ina theannta sin, cé go bhfuil an t-iompróir glúcóis SGLT2, atá freagrach as 90 faoin gcéad d'ath-ionsú glúcóis29, logánaithe go príomha ag réigiúin apical de chealla Camsap3dc/dc (mar a fheictear freisin i gcealla WT), tháinig laghdú ar dhéine na comhartha i réigiúin áirithe feadáin chisteach. Cinn saighde Fíor 1f), rud a thugann le tuiscint go bhféadfadh tionchar diúltach a bheith ar fhiseolaíocht na feadáin mutant. Roimhe sin, rinneamar tástálacha fuail agus fola, ag baint úsáide as P396- chun P424-sean lucha. Léirigh tástálacha fuail go raibh claonadh eiseacha iomarcacha K móide , Mg2 móide , agus nítrigin úiré i lucha Camsap3dc/dc (Fíor Fhorlíontach S3a). Léirigh tástálacha fola níos diongbháilte go raibh leibhéil i bhfad níos ísle K móide agus Mg2 móide ag lucha Camsap3dc/dc i gcomparáid le lucha WT nó Camsap3 móide /dc, cé nár braitheadh ​​aon athrú ar leibhéil nítrigine úiré agus glúcóis (Fíor Forlíontach S3b). . Ní raibh difríocht idir leibhéil creatiníne fual agus fola idir WT agus lucha mutant (Fíor Forlíontach S3c). Mar sin, níor thugamar faoi deara ach lochtanna fiseolaíocha páirteacha i lucha Cam sap3dc/dc.

Eagraíocht microtubule iduánachcealla epithelial tubule. Ós rud é go dtagann míshuaimhneas ar mhicritiúibíní i gcealla epithelial an stéig bheag10,12 mar thoradh ar shóchán Camsap3, rinneamar scrúdú féachaint an dtarlaíonn sé seo freisin iduáncealla epithelial. Chuireamar tús imdhíonta -tubulin in éineacht le Megalin. Go háirithe, i duáin WT agus Camsap3dc/dc, léirigh feadáin Megalin-diúltacha, is é sin, feadáin convoluted distal nó duchtanna bailithe, déine imdhíon-imdhíonachta tubulin níos láidre ná mar a breathnaíodh do -tubulin i PCTanna Megalin-dearfach (Fíor 3a, b). . Mar a fuarthas sa stéig bheag10, rinne CAMSAP3 logánú apically i ngach cealla epithelial de WTduáin, ag forluí ar fhoirceann aipeach na micritiúbúl atá ailínithe feadh na haise apico-bhunúsach (Fíor 3c ar chlé). Bhí cealla epithelial duánach Camsap3dc/dc beagán imdhíon-dearfach freisin do CAMSAP3 ach ag suíomhanna neamhrialta (Fíor 3c ar dheis, cinn saighde), rud a thugann le tuiscint go gcoimeádtar CAMSAP3 mutated sna cealla, ar ancaire do roinnt struchtúr neamhaitheanta. I gcealla cisteach na nduán tsóiteáin, bhí an raon microtubules tangled agus neamheagraithe (Fíor 3c ar dheis), mar a breathnaíodh i gcealla intestinal lucha Camsap3dc/dc10 . I gcealla neamhchisteacha, áfach, níor cuireadh isteach ar eagraíocht microtubule

Fíor 3. Microtubules i gcealla epithelial tubule duánach. (a) Imdhíonadh do -tubulin, Megalin, agus núicléis sna duáin WT agus Camsap3dc/dc ag P21. (b) Cainníochtú déine -tubulin i PCT agus DCT/CD na nduán WT (PCT, n=28 feadáin; DCT/CD, n=18 feadáin) agus duáin Camsap3dc/dc (PCT, n { {8}} feadáin; DCT/ CD, n=9 feadáin). Léiríonn barraí earráide SD ***p<0.001, t-test.="" (c)="" immunostaining="" for="" α-tubulin,="" camsap3,="" and="" dapi="" in="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p21.="" arrowheads="" indicate="" camsap3-dc="" proteins="" anchoring="" to="" unidentifed="" structures.="" te="" apical="" localization="" of="" camsap3="" was="" absent="" in="" camsap3dc/dc="" cells.="" see="" also="" figure="">

i bhfad fiú in éagmais CAMSAP3 feidhmiúil, a d’fhéadfadh a mhíniú cén fáth nár léirigh na cealla seo neamhghnáchaíochtaí cíteolaíochta. Ina theannta sin, léirigh cealla epithelial duán Camsap lochtanna comhchosúla microtubule ach amháin i gcealla chisteach (Fíor Forlíontach S2d). I dteannta a chéile, léirigh na torthaí seo go n-imríonn CAMSAP3 ról maidir le heagrú apico-basal microtubules a chothabháil ach amháin le haghaidh fodhaonra de chealla epithelial duánach.

Iomadú cille feabhsaithe i PCTanna Camsap3dc/dc. Tá dlúthbhaint ag foirmiú cyst sna duáin le iomadú feabhsaithe cille duánach34. Chun a thástáil cibé an athraíodh iomadú cille i duáin Camsap3dc/dc, rinneamar comparáid idir iomadú cealla PCT idir WT agus duáin mutant trí chomh-imdhíonadh do Megalin agus Ki-67, marcóir le haghaidh iomadú cille. Ki-67–is annamh a breathnaíodh cealla dearfacha i PCTanna na nduán WT, ach bhí siad le feiceáil go héasca i gcealla PCT na nduán Camsap3dc/dc. Mar sin féin, braitheadh ​​Ki-67 i bhfeadáin neamh-dilated agus dilated araon (Fíor 4a,b), rud a léiríonn nach raibh aon chomhghaol idir iomadú cille agus foirmiú cyst. Tus, CAMSAP3mífheidhmchuir sé iomadú cille chun cinn, ach ní raibh baint ag an bpróiseas seo i gcónaí le foirmiú cyst.

Athruithe ar logánú YAP agus mióisín neamh-mháin atá nasctha le dífhoirmiú cille. Is gníomhaí tras-scríofa é YAP a rialaíonn iomadú cille35 chomh maith le múnlú cille meicniúil teannas-spleách36 . Cuirtear YAP i ngníomh mar aon lena logánú núicléach sna duáin de lucha easnamhacha Pkd, samhail de PKD37, agus cuireann gníomhachtú Yap chun cinn iomadú cille agus dilation feadánacha sna duáin28 . Dá bhrí sin rinneamar tástáil ar cibé acu an raibh YAP gníomhachtaithe freisin i PCTanna na duáin Camsap3dc/dc. Nocht imdhíonadh do YAP a logánú cíteaplasmach i PCTanna na nduán WT. Go hiontach, tháinig YAP comhchruinnithe i núicléis PCTanna Camsap3dc/dc, ach amháin ina gcodanna dilated (Fíor 5a), mar a dheimhnigh cainníochtú (Fig. 5b), rud a thugann le tuiscint gur tharla an t-athdháileadh YAP breathnaithe mar fhreagra ar athrú cille. deilbhíocht seachas CAMSAP3mífheidhmper se.

Is éifeachtóir le sruth é YAP ar chonair Hippo, a rialaítear le leideanna meicniúla38 . Go deimhin, bhí cuma shínte ar chealla chisteach i duáin Camsap3dc/dc, rud a thugann le tuiscint go mb’fhéidir go raibh siad faoi lé teannas méadaithe.

Fíor 4. Iomadú cille i PCTanna Camsap3dc/dc. (a) Imdhíonadh do Ki-67, Megalin, agus DAPI sna duáin WT agus Camsap3dc/dc ag P22. Léiríonn cinn saighde cealla Ki-67-dearfach i bhfeadáin chisteach. (b) Céatadán de chealla Ki-67-dearfach laistigh de chealla epithelial PCT [ móide / móide , n=700 cealla; dc/dc (dilated), n=224 cealla; dc/dc (neamh-dilated), n=396 cealla]. Léiríonn barraí earráide SD *p<0.05,>

Dá bhrí sin rinneamar imscrúdú ar cibé acu ar tharla aon athruithe meicniúla i gcomhthráth le foirmiú cyst. Toisc gur próiseas teannas-íogair é gníomhachtú neamh-muscle myosin II39, rinneamar measúnú ar dháileadh slabhra solais myosin 2 (MLC2), a bhfuil baint aige le gníomhachtú myosin II, sna duáin. Cé gur scaipeadh MLC2 isteach sa cíteaplasma i gcealla tubule WT, bhí sé comhchruinnithe in aice leis na codanna apical de chealla chisteach i duáin Camsap3dc/dc (cinn saighde Fíor. 5c), rud a thugann le tuiscint go raibh na cealla seo faoi réir fórsa teanntachta. Níor léirigh cealla i PCTanna neamhdilated tiúchan MCL2 den sórt sin. Bhí torthaí tese i gcomhréir leis an smaoineamh go dtéann YAP isteach sa núicléas nuair a shíntear cealla go meicniúil40,41 .

Athruithe ar dháileadh PIEZO1 i PCTanna Camsap3dc/dc. Chun tástáil bhreise a dhéanamh an bhfuil cealla chisteach faoi lé fórsa sínte, rinneamar scrúdú ar dháileadh subcellular PIEZO1, cainéal ian meicneo-íogair42-45, toisc gur gnáth-mharcóir é seo do stráice meicniúil; Aistríonn logánú PIEZO1 ón scannán plasma/cíteaplasma go dtí an clúdach núicléach nuair a bhraitheann sé comharthaí stráice46 . Léirigh imdhíonadh do PIEZO1 go raibh PIEZO1 logánaithe den chuid is mó i gcíteaplasma na gcealla WT PCT, ach go raibh a logánú forluí leis an núicléas i gcealla cisteach de PCTanna Camsap3dc/dc (Fíor 6a). Mhol imdhíonadh do YAP agus PIEZO1 i gcodanna seicheamhach freisin go raibh a logánú núicléach ag an am céanna ag PCTanna dilated (Fíor Forlíontach S4, cinn saighde). Ar an láimh eile, i PCTanna Camsap3dc/dc neamhdilated, d'fhéach dáileadh PIEZO1 cíteaplasmach (Fíor 6a). Mar sin féin, léirigh breathnuithe dlúth ar na híomhánna imdhíonfhionraí chomh maith le cainníochtú go raibh claonadh ag a logánú núicléach méadú go pointe áirithe, i gcomparáid le cealla WT (Fíor 6a, b). Tus, murab ionann agus YAP, is cosúil go dtosaíonn PIEZO1 a ghníomhachtú roimh dhífhoirmiú inbhraite cealla i PCTanna Camsap3dc/dc.

Plé

Sa staidéar seo, fuaireamar amach go raibh caolú cealla PCT mar thoradh ar shóchán CAMSAP3 nó ar a chaillteanas, rud a d’fhág go raibh cuma chisteach ar na tras-ailt feadáin. Breathnaíodh comhartha cystogenesis cheana féin chomh luath agus is E17.5, le méadú de réir a chéile dilation le linn aosú agus a leathnú sa deireadh leis an capsule Bowman. Tháinig cealla epithelial sna réigiúin dilated níos tanaí, ag taispeáint lochtanna cíteolaíochta éagsúla, mar a breathnaíodh i gcealla an stéig bheag de lucha Camsap3dc/dc10,12 . Breathnaíodh roinnt lochtanna sainiúla duáin freisin, lena n-áirítear suaitheadh ​​​​ailínithe miteachondria agus patrúnú membrane plasma basal. Tharla athruithe TSE ag an am céanna le suaitheadh ​​ar shocrú na micritiúbúl, rud a thugann le tuiscint go bhfuil líonraí micrea-feadáin idirghabhála CAMSAP freagrach as gnátheagrú na struchtúr focheallach seo i gcealla PCT, mar a fhaightear i gcineálacha cille eile. Ar an láimh eile, cé gur dealraitheach go raibh CAMSAP3 curtha in iúl i ngach ceall epithelial tubule duánach, níor breathnaíodh feinitíopaí struchtúracha neamhghnácha ach amháin i PCTanna, rud a thugann le tuiscint go raibh meicníocht(aí) iomarcach ann chun líonraí micrea-fhiúbáin a chothabháil in éagmais CAMSAP3. D’fhéadfadh móilíní seachas CAMSAP3, amhail CAMSAPanna eile, a bheith rannpháirteach i gcothabháil sláine na ngréasán microtubule sna cealla seo. Bhí dlús microtubule réasúnta níos ísle ag cealla PCT ná cealla tubule eile. Is dócha gur éascaigh sé seo dífhoirmiúchán cille, mar go mb’fhéidir nár leor na líonraí microtubule a d’fhanfadh tar éis caillteanas CAMSAP3 a chothabháil.

an ailtireacht cille ceart. Fiú i gcealla PCT, áfach, is cosúil go bhfuil meicníochtaí ann a chúitíonn cailliúint CAMSAP3, toisc nár tharla dilation PCTanna go haonfhoirmeach.

Fíor 5. Logánú YAP agus myosin neamh-mhatán a bhaineann le dífhoirmiú cille. (a) Imdhíonadh do YAP, Megalin, agus DAPI sna duáin WT agus Camsap3dc/dc ag P22. Scanadh comharthaí fluaraiseachta DAPI agus YAP feadh na líne a tarraingíodh sna híomhánna méadaithe, agus léirítear na hathruithe spásúlachta ar dhéine an fhuaraitheachta i ndath gorm do DAPI agus glas do YAP. Léiríonn línte briste neas-achar an núicléis. Léiríonn cinn saighde suíomh an núicléis i gcealla ionadaíocha. (b) Cóimheas idir dhéine núicléach YAP agus déine YAP cíteaplasmach [ móide / móide , n=81 cealla; dc/dc (dilated), n =43 cealla; dc/dc (neamh-dilated), n=53 cealla]. Léiríonn ceapacha bosca luachanna an chéad cheathairíl, airmheánach agus tríú ceathairíl. ***p<0.001, t-test.="" (b)="" immunostaining="" for="" mlc2,="" actin,="" and="" dapi="" in="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p22.="" arrowheads="" indicate="" apical="" accumulation="" of="" mlc2="" in="" cystic="">

Fíor 6. Athrú ar dháileadh PIEZO1 i PCTanna Camsap3dc/dc. (a) Imdhíonadh do PIEZO1, Megalin, agus DAPI sna duáin WT agus Camsap3dc/dc ag P22. Scanadh comharthaí fluaraiseachta DAPI agus PIEZO1 feadh na líne a tarraingíodh sna híomhánna méadaithe, agus taispeántar na hathruithe spásúlachta ar dhéine fuaraiseachta i gorm le haghaidh DAPI agus glas le haghaidh PIEZO1. Léiríonn línte briste neas-achar an núicléis. Léiríonn cinn saighde suíomh an núicléis i gcealla ionadaíocha. (b) Cóimheas na déine piezo1 núicléach le déine piezo1 cíteaplasmach [ móide / móide , n=66 cealla; dc/dc (dilated), n =44 cealla; dc/dc (neamh-dilated), n=81 cealla]. Léiríonn ceapacha bosca luachanna an chéad cheathairíl, airmheánach agus tríú ceathairíl. ***p<0.001, **p=""><0.01, t-test.="" see="" also="" figure="">

Conas, mar sin, a dilaíodh PCTanna ar bhealach réigiúnach, agus ramhrú cealla epithelial ag gabháil leo? Go háirithe, bhí foirmiú cyst inbhraite ag E17.5, agus tá an t-am seo i gcomhchoibhneas le tosú táirgeadh fual primitive i lucha47 . Ar an ábhar sin, is féidir linn hipitéis a thabhairt gur fachtóir meicniúil féideartha é an 'fual fual' a chothaíonn caolú feadáin duánach. Is dócha go raibh cealla PCT a chaill an cítoshnámharlach micrea-feadán trí mheán CAMSAP níos so-ghabhálaí go meicniúil d'fhórsaí seachtracha, is é sin, níos dífhoirmithe, i gcomparáid le cealla WT PCT. Mar sin, d'fhéadfadh fórsaí a tháirgeann eun fuail sna feadáin duánach caolú feadáin a chur faoi deara, rud a chuirfeadh ramhrú orthu. D'fhéadfadh sé nach mbeadh fórsaí den sórt sin aonfhoirmeach, rud a fhágann go mbeidh céimeanna athraitheacha caolaithe feadh PCTanna. Ní gá a rá leis an smaoineamh seo meicníochtaí féideartha eile maidir le dilation PCT a eisiamh.

Léirigh ár gcuid tuairimí go bhfuil PIEZO1 á athlonnú ón gcíteaplasma go dtí an réigiún núicléach i gcealla PCT dilated na nduán Camsap3dc/dc, rud a thugann le tuiscint gur cuireadh an meicneoir seo i ngníomh mar fhreagra ar dhífhoirmiú cille, is dóichí gur 'síneadh' cealla mar a tuairiscíodh roimhe seo46 . Deimhníodh staid shínte na gceall PCT dilated ag an tuairim gur méadaíodh MLC2 ina réigiúin cortical. Léirigh ár n-anailís freisin go raibh PIEZO1 i ngníomh go pointe áirithe cheana féin i gcealla PCT neamh-dilated, rud a thugann le tuiscint go raibh fiú na cealla seo ag dul faoi athruithe meicniúla in ainneoin a gcuma gnáth. Cuireadh meicneoir eile, YAP, i ngníomh freisin i gcealla PCT, ach ba chosúil nach dtarlódh a ghníomhachtú ach i gcealla sínte.

Conas, mar sin, a chuireann na rialtóirí meicníogaireacha seo le dífhoirmiú cille, chomh maith le iomadú cille a cuireadh chun cinn in éagmais CAMSAP3? Tá sé léirithe go gcuireann gníomhachtú stráice-spreagtha PIEZO1 chun cinn iomadú cille i gcealla epithelial46, rud a thugann le tuiscint go n-oibríonn an mheicníocht seo freisin i gcealla PCT na duáin Camsap3dc/dc. Tá an smaoineamh seo ag teacht lenár mbreathnóireacht gur tharla iomadú cille feabhsaithe agus gníomhachtú páirteach PIEZO1 le chéile, fiú i gcealla neamhdilated PCTanna Camsap3dc/dc. Maidir le YAP, cuireadh moill ar a ghníomhachtú, níor léiríodh comhghaol soiléir le tosú an mhéadaithe ar iomadú cille. Tugtar YAP ní hamháin mar fhachtóir fáis cille ach freisin mar rialtóir hoiméastáis meicniúla, mar a léiríodh roimhe seo36,48 . Is féidir mar sin go bhféadfadh YAP, a athlonnaíodh isteach sa núicléas in éineacht le dífhoirmiú cealla PCT, feidhmiú chun a gcruth a rialú, is é sin, cruth damáiste na gceall seo a athbhunú. Seachas sin, d'fhéadfadh YAP comhoibriú le PIEZO1 chun iomadú ceall caolaithe a fheabhsú, mar is eol go bhfuil baint ag YAP le foirmiú duán ilchisteach trí iomadú cille a fheabhsú28 .

Fuaireamar amach go raibh leibhéil i bhfad níos ísle fola K móide agus Mg2 móide ag lucha Camsap3dc/dc, rud a thugann le tuiscint go bhféadfadh go mbeadh a n-duáin tar éis fulaingt ó fheidhmiú neamhghnách éigin. D’fhéadfadh baint leis an mínormáltacht seo idir lochtanna móra cíteolaíochta a thugamar faoi deara i seicní plasma apical agus basal cealla PCT, áit a bhfuil an t-innealra gníomhach iompair suite. Mar sin féin, ní féidir linn an fhéidearthacht a eisiamh go bhféadfadh codanna eile d'fheadáin duánach nó d'orgáin eile a bheith lochtach ó thaobh feidhme freisin, rud a d'fhágfadh an feinitíopa seo. Ina theannta sin, ní bhfuaireamar aon fhianaise go ndearnadh damáiste d'fheidhmeanna fltering an glomerulus, toisc go raibh leibhéil fola creatinine agus nítrigine úiré, a eisfheartar tríd an glomerulus, gnáth.

Is é PKD24–27 an toradh a bhíonn ar chur isteach ar bhithgenesis ciliiam príomhúil. I gcás sóchán Camsap3, ba chosúil nach raibh aon tionchar ag foirmiú cilia príomhúla. Léirigh staidéar le déanaí gur chuir caillteanas CAMSAP3 i gcealla epithelial il-ciliated nasal isteach ar fhoirmiú na mbeirteanna lárnacha microtubules san axoneme, rud a d'fhág go raibh motility aberrant i motile cilia49 . Cé go bhfuil na cilia príomhúla ar chealla epithelial neamh-ghluaiste agus nach bhfuil na péirí lárnacha microtubules50 acu, tá sé fós neamhchinnte an bhfuil an ciliam príomhúil i lucha mutant Camsap3 fós ag feidhmiú. In ainneoin na héiginnteachta seo, tá na neamhghnáchaíochtaí i mutants PKD agus Camsap3 an-difriúil, toisc go dtarlaíonn foirmiú cyst go haonfhoirmeach thar an duán iomlán sa chéad cheann, ach is imeacht áitiúil é sa dara ceann. Is dóichí go bhfuil an difríocht idir an t-alt seo mar gheall ar chúlraí móilíneacha ar leith an fhoirmiú cyst eatarthu.

Mar achoimre, taispeánann ár staidéar go bhfuil CAMSAP3 tábhachtach chun struchtúr agus feidhm feadáin duánach a chothabháil ag réigiúin chóngaracha, is dócha trí thionól micrea-feadáin neamhlárnóiseach a rialáil. Beidh gá le tuilleadh staidéir, áfach, chun tuiscint chríochnúil a fháil ar an gcaoi a gcuireann cailliúint an chórais eagraíochta microtubule seo isteach ar fheidhmeanna fiseolaíocha na duáin.

abhair agus modhanna

Rinneadh na turgnaimh go léir de réir na dtreoirlínte, na rialachán ábhartha, agus d'fhaomh an Lárionad RIKEN um Thaighde ar Dhinimiceas Bithchórais agus/nó Coiste Bithshábháilteachta Institiúideach Ollscoil Waseda.

lucha. Gineadh lucha Camsap3 mutant (Camsap3dc/dc) a úsáideadh sa staidéar seo inár staidéar roimhe seo10 (rochtain uimh. CDB0716K; http://www2.clst.riken.jp/arg/mutant faoin gcéad 20mice faoin gcéad 20list.html). Sna lucha sin, baineadh an réigiún C-críochfort de Camsap3, eadhon exons 14-17, agus dhearbhaíomar roimhe seo go gcuireann cealla luiche CAMSAP3 teasctha C-críochfort neamhfheidhmiúil (CAMSAP3-dc)10 in iúl. Sa staidéar seo, baineadh úsáid as lucha giniúna N4 agus 5 i dturgnaimh.

Gineadh lucha cnagála Camsap3 (Camsap3–/–) (uimhir aontachais CDB0033E), nach bhfuil an réigiún códaithe iomlán de 22-kb Camsap3 iontu, le CRISPR/Cas9-eagarthóireacht géanóm trí mheán leictreaphrú zygote51. Briefy, dearadh dhá RNA treorach agus oligodeoxynucleotide aon-snáithe (ssODN) chun an réigiún 22-kb a scriosadh, agus cuireadh suíomh EcoRI leis chun críche aitheantais do chur isteach rathúil i lucha mutant. Le haghaidh leictreaphrú, tugadh cRNAs, tracrRNA, ssODN agus próitéin Cas9 isteach sna siogóit C57BL/6. Tar éis electroporation, aistríodh na zygotes isteach i lucha baineann pseudopregnant ICR, agus rinneadh scagadh ar na lucha bunaitheoir trí PCR agus seicheamhú DNA. Fuarthas lucha bainte crann (#4, #10, #23), agus bhí an ailléil cnag-isteach deartha ag EcoRI ag duine acu (#23). Dhear CRISPRdirect na seichimh RNA treorach (https://crispr.dbcls.jp). Sintéisíodh na seichimh te crRNAs, tracrRNA, agus ssODN a úsáidtear le haghaidh eagarthóireacht genome mar seo a leanas: 5′-cRNA, 5′-UGA UCC CAC ACA UAU GCA GGg uuu uag agc uau gcu guu uug-3′, 3′-cRNA , 5′-CAGCCACCUCUGAUC UGACCguuuuagagcuaugcuguuuug-3′; tracrRNA, 5′-AAACAGCAUAGCAGUUAAAAUAAGGCUAGUCC

GUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU-3′; ssODN, 5′-TAGAACTTACTGTATAGTAAT

AGCCACAAACTCCATATGCATATTGTGAACTCCCCTGAATTCACCTGGCAAGAGATTCCAGACCAG

CTCTCCTCTCCTGGGCCTCCTCCCCCCCCACAT-3′ . Léiríonn na litreacha cás uachtair agus cás íochtair códú agus seichimh chúnta, faoi seach. Trasnaíodh líne Te luch #23 le C57BL/6 trí huaire, agus baineadh úsáid as lucha giniúna N3 i dturgnaimh.

D'fhormheas an Coiste Institiúideach um Chúram agus Úsáid Ainmhithe de chuid Lárionad RIKEN um Thaighde ar Dhinimiceas Bithchórais nó Ollscoil Waseda te turgnaimh a úsáideann lucha, agus rinneadh iad de réir prótacail a chuir na coistí sin ar fáil. Rinneadh an staidéar i gcomhréir leis na treoirlínte ARRIVE: https://arriveguidelines.org.

Géinitíopáil. Rinne PCR géinitíopáil do lucha. Maidir le lucha Camsap3dc/dc, d’úsáideamar primers a bhfuil cur síos orthu in Toya et al. (2016). Maidir le lucha Camsap3–/–, d’úsáideamar na primers seo a leanas chun cineál fiáin (WT) (P1/P2, 411 bp) nó Camsap3–/– (P1/P3, 614 bp) ailléil a bhrath (Fíor Forlíontach S2a,b) : P1, 5′- CATGTACCTACCACC ATCC-3′; P2, 5′- GGACCCTGGAGAGGCTTAG-3′; P3, 5′- GCAAGGCTGTAGTGAGCC-3′ . Níor méadaíodh réigiún te P1/P3 in WT faoi na coinníollacha PCR a úsáideadh.

Histology: Ullmhú na hailt fíocháin reoite. Rinneadh fíochán duáin scartha a fxed i 2 faoin gcéad paraform- aildéid (Termo Fisher) / 0.1 M sorbitol (Nacalai Tesque) / maolán PEM ar feadh 1 h ag teocht an tseomra. Is é an t-oideas do PEM ná: 100 mM PIPES (Nacalai Tesque), 5 mM EGTA (Nacalai Tesque), agus 5 mM MgCl2 (Wako), arna choigeartú go pH 6.9 le 2 M KOH. Tar éis fxation, rinsíodh an fíochán duáin trí huaire le PEM ar feadh 10 nóiméad. Deich, rinneadh cryoprotection le siúcrós / PEM: 15 faoin gcéad de shiúcrós i dtuaslagán PEM ar feadh 2 h ag 4 céim, agus ina dhiaidh sin 20 faoin gcéad de shiúcrós i dtuaslagán PEM thar oíche ag 4 céim, agus athsholáthar le 30 faoin gcéad de shiúcrós i réiteach PEM ar feadh ~ 2 h. ag 4 céim . Reoiteadh fíochán duáin te i gcomhdhúil OCT i múnla leabaithe (Polysciences, Inc.) i nítrigin leachtach agus stóráiltear é ag −80 céim . Sliseadh samplaí reoite ag tiús 5 µm le Criostat CM1850 (Leica). Coinníodh na codanna ar shleamhnáin ghloine ag −80 céim go dtí go stainníodh iad.

Histeolaíocht: Ullmhú na hailt fíocháin leabaithe parafn. Rinneadh fíochán duáin scartha a fxed i dtuaslagán Super Fix (Kurabo) ar feadh 2 h ag teocht an tseomra, ansin aistríodh go 4 céim thar oíche. Nochtadh gach sampla do thrí thuaslagán uiscí eatánóil de thiúchan méadaithe ag teocht an tseomra: 30 faoin gcéad eatánól ar feadh 3{{20}} nóiméid faoi dhó, 50 faoin gcéad eatánól ar feadh 3{ {35}} nóim, agus faoi dheireadh 70 faoin gcéad eatánól ar feadh 30 nóim. Próiseáladh gach sampla le Próiseálaí Fíocháin ASP3{00 (Leica). Deich gcinn, bhí na samplaí fíocháin duáin leabaithe i gcéir parafn (Sakura Finetek) le EG1160 (Leica) agus stóráilte ag 4 céim . Gearradh samplaí leabaithe parafn ag tiús 6 µm le Micreatóim Rothlach RV24{0 (Yamato Kohki). Coinníodh na codanna ar shleamhnáin ghloine ag 4 céim go dtí go staining. Staining imdhíonachta. Tumadh rannóga duáin reoite i 0.1 faoin gcéad Triton X-100 (Nacalai Tesque) / PEM ar feadh 10 nóiméad ag teocht an tseomra. Rinneadh tréscaoilteach ar dheich samplaí trí 0.2 faoin gcéad Triton X-100 / PEM a chur i bhfeidhm ar feadh 10 nóiméad ag teocht an tseomra. Arís eile, tumadh samplaí in 0.1 faoin gcéad Triton X-100 / PEM ar feadh 10 nóiméad ag teocht an tseomra. Ansin, cuireadh bac ar shamplaí le 3 faoin gcéad albaimin serum buaibheach (BSA; Roche) / 0.1 faoin gcéad Triton X-100 / PEM ar feadh 30 nóiméad ag teocht an tseomra, agus imoibriú antashubstainte príomhúil ina dhiaidh sin ar feadh oíche ag 4 céim . Caolaíodh antasubstaintí príomhúla i 3 faoin gcéad BSA / 0.1 faoin gcéad Triton X-100 / PEM. Maidir le príomhantasubstaintí a ardaíodh i lucha, rinneadh blocáil bhreise le himoibrí blocála MOM (Saotharlanna Veicteoir) roimh bhlocáil i 3 faoin gcéad BSA / 0.1 faoin gcéad Triton X-100 / PEM. Caolaíodh Imoibrí Blocáil MOM i 0.1 faoin gcéad Triton X-100 / PEM agus cuireadh i bhfeidhm é ar na samplaí ar feadh 30 nóiméad ag teocht an tseomra. Tar éis cóireála MOM, nite samplaí le 0.1 faoin gcéad Triton X{-100 / PEM trí huaire ar feadh 5, 10 agus 15 nóiméad ag teocht an tseomra. Tar éis an phríomh-imoibrithe antashubstainte, nite samplaí ar feadh 15 nóiméad ag teocht an tseomra le 0.1 faoin gcéad Triton X-100 / PEM trí huaire. Rinneadh imoibriú antasubstainte tánaisteach ar feadh 2 h ag teocht an tseomra sa dorchadas. Caolaíodh antasubstaintí tánaisteacha i 3 faoin gcéad BSA / 0.1 faoin gcéad Triton X-100 / PEM. Tar éis an imoibrithe, nite samplaí le 0.1 faoin gcéad Triton X-100 / PEM trí huaire ar feadh 5, 10 agus 15 nóiméad ag teocht an tseomra agus séalaithe le VECTASHIELD Gléasta Meánach (Vec- tor Laboratories). Antasubstaintí agus imoibrithe. Bhí dhaite DNA le tuaslagán DAPI (Dojindo, D523, 1:1000). Bhí dhaite F-actin le phalloidin Alexa Fluor 594 (Termo Fisher, A12381, 1:400). Dathaíodh micritiúbúl le frith- -tubulin-FITC (DM1A; Sigma Aldrich, F2168, 1:200). Úsáideadh na príomhantasubstaintí seo a leanas: frith-Megalin gabhar (P-20; Santa Cruz Biteicneolaíocht, sc-16478, 1:200), comh-iompróir frith-NaCl coinín (MERCK, AB3533, 1:500 ), frith-aquaporin coinín-2 (abcam, AB3274, 1:400), frith-SGLT1 (M-19; Santa Cruz Biotech, sc-20582, 1:200) , coinín frith-SGLT2 (Novus Biologicals, NBP1-92384, 1:200), luch frith-ezrin (3C12; abcam, ab4069, 1:500), coinín frith-fathach (Covance, PRB-114 C, 1:700), frith-aPKC coinín (Santa Cruz Biteicneolaíocht, sc-216, 1:400), frith-DPP IV (Córais T&F, AF954, 1:100), frith-Na luiche móide /K móide -ATPase (abcam, ab7671, 1:100), tubulin frith-aicéitilithe luch (Sigma Aldrich, T6793, 1:200), coinín frith-CAMSAP3 (Tanaka et al., 2012, 1:400), luch tubulin frith-tyrosinated (Sigma Aldrich, T9028, 1:200), coinín frith-Ki-67 (SP6; abcam, ab16667, 1:250), coinín frith-YAP (Cill Comharthaíochta, #4912, 1:100 ), slabhra solais frith-myosin coinín 2 (Cell Signaling, #8505, 1:100), coinín frith-piezo1 (Novus Biologicals, N BP1-78446, 1:100), frith-E-cadherin francach (52, 1:400), agus frith-merlin coinín (Sigma Aldrich, HPA003097, 1:100). Baineadh úsáid as na hantasubstaintí tánaisteacha seo a leanas: don eochair Dylight 594–IgG frith-ghobhar comhchuingeach (Jackson, 1:500), gabhar Alexa Fluor 488/594–IgG frith-choinín comhchuingeach (Termo Fisher, A-11034, A -11037, 1:500), gabhar Alexa Fluor 488/594–IgG frith-luiche comhchuingeach (Termo Fisher, A-11029, A-11032, 1:500), agus gabhar Alexa Fluor IgG frith-rata comhchuingeach 488-(Termo Fisher, A-11006,

1:400). Fíoraíodh sainiúlacht cheangailteach na n-antasubstaintí frith-YAP (Cell Signaling, #4912) agus frith-PIEZO1 (Novus Biologicals, NBP1-78446) a úsáideadh sa staidéar le hobair roimhe46,53 . Staining hematoxylin agus eosin (S&E). Cuireadh sleamhnáin ghloine le hailt duáin ar phláta 55 céim ar feadh 30 min chun an parafn a shíneadh. Tumadh samplaí ansin i xiléin ar feadh 15 nóiméad faoi dhó agus ina dhiaidh sin tumadh i sraith eatánól 70-100 faoin gcéad: eatánól 100 faoin gcéad ar feadh 5 nóiméad faoi dhó, 90 faoin gcéad eatánól ar feadh 5 nóiméad, 80 faoin gcéad eatánól ar feadh 5 nóiméad, agus 70 faoin gcéad. eatánól ar feadh 5 nóiméad. Tar éis sruthlaithe in uisce ar feadh 20 nóiméad agus i H2O driogtha/dí-ianaithe (ddH2O) ar feadh 1 nóiméad, rinneadh samplaí a dhathú i dtuaslagán hematoxylin Mayer (Wako) ar feadh 5 nóiméad. Tumadh samplaí i ddH2O faoi dhó, ansin sruthlaigh iad le ddH2O ar feadh 10 nóiméad. Arís tumadh na samplaí i ddH2O agus ansin dathaíodh iad i dtuaslagán eosin (Merck) ar feadh 2 nóiméad. Le haghaidh níocháin, tumadh samplaí i ddH2O ar feadh 30 s, agus ina dhiaidh sin tumoideachas i sraith de 70-100 faoin gcéad eatánól agus xiléin: eatánól 70 faoin gcéad ar feadh 5 s, eatánól 80 faoin gcéad ar feadh 5 s, 90 faoin gcéad eatánól ar feadh 5 s, 100 faoin gcéad eatánól ar feadh 5 s faoi dhó, agus xiléin ar feadh 10 min. Ar deireadh, séalaithe samplaí i gliocról. Micreascóip. Fuarthas íomhánna le Micreascóp Fluaraiseachta Uile-i-Aon BZ-X710 (Keyence) nó micreascóp comhfhócasach scanadh léasair LSM880 (Zeiss). I gcás BZ-X710, ba iad na lionsaí oibiachtúla a úsáideadh ná Nikon CFI Plan Apo λ 2 × , 10 × , 40 × , 100 × agus Nikon CFI Plan Fluor 4 × . Próiseáladh na híomhánna a fuarthas le bogearraí BZ-X Analyzer. Feistíodh Te LSM880 le micreascóp inbhéartaithe Axio Observer Z1 le lionsa cuspóir tumoideachais ola Plan- Apochromat 63 × /1.40 NA (Zeiss). Próiseáladh agus anailísíodh íomhánna ag baint úsáide as ImageJ agus Adobe Photoshop CC2019. Anailís innéacs chisteach. Rinne ImageJ anailís ar innéacs cisteach ag úsáid íomhánna daite H&E de chuid chothrománach na duán. Mar thomhas ar an limistéar ina bhfuil cyst, rianaíodh imlíne an lumen feadánacha dilated ag baint úsáide as an bhfeidhm "Roghanna Saorláimhe", agus rinneadh a limistéar a thomhas leis an bhfeidhm "Beart". Rinneadh obair tis do gach cysts laistigh den chuid duáin, agus cuireadh réimsí na gcist go léir le chéile chun an limistéar ina bhfuil an cyst a chinneadh. Tomhaiseadh limistéar iomlán na nduán ar an mbealach céanna. Rinneadh imlíne sheachtrach na duán a rianú ag baint úsáide as an bhfeidhm "Roghanna Saorláimhe", agus rinneadh measúnú ar a limistéar. Ar deireadh, rinneamar an t-innéacs cisteach a ríomh tríd an limistéar ina bhfuil cyst a roinnt ar limistéar iomlán na nduán.

Sainmhíniú feadáin caolaithe agus feadáin neamhchaolaithe. Sa taighde seo, sainíodh feadáin a bhfuil achar lúman acu ar mó é ná nó cothrom le 500 µm2 mar “dilated”, agus iad siúd a bhfuil achar lumen de<500 µm2="" have="" been="" defned="" as"non-dilated".="" when="" selecting="" a="" "dilated"="" tubule="" in="" camsap3dc/dc="" samples,="" we="" frst="" visually="" picked="" up="" a="" cyst="" that="" was="" not="" recognized="" in="" wt="" samples="" and="" then="" roughly="" measured="" its="" lumen="" area="" using="" imagej.="" if="" the="" value="" was="" ≧500="" µm2,="" it="" was="" regarded="" as="">

Micreascópacht leictreon. Maidir le micreascópacht leictreon, scrúdaíodh lucha fireann P21. Ullmhaíodh samplaí le haghaidh scanadh micreascópachta leictreachais de réir Takahashi-Iwanaga54 le modhnuithe áirithe, mar seo a leanas. Rinneadh ainéistéisiú ar lucha le hiseagúrán agus perfused le 2 faoin gcéad (w/ toirt) formaildéad agus 2.5 faoin gcéad (toirt/toirt) glutaralde- híde i 0.1 M maolán cacodilate, pH 7.4. Gearradh gach duán i gciúbanna a bhí tumtha sa fxative céanna thar oíche, agus ansin rinsíodh le 0.1 M maolán cacodyllate. Aistríodh samplaí te fxed trí thuaslagán uiscí 30 faoin gcéad de shulfocsaíd démheitil go 60 faoin gcéad de shulfocsaíd démheitile, agus ansin bristeadh iad i leacht N2 . Rinladh samplaí briste le 0.1 M maolán cacodylate agus cuireadh i 6 N NaOH ar feadh 1{{30}}–2{0 nóim ag 60 céim . Tar éis maothú i dtuaslagán NaOH, rinsíodh gach sampla le 0.1 M maolán cacodylate ina raibh 0.05 faoin gcéad Tween 20 agus postfxed le 1 faoin gcéad OsO4 i 0.1 M maolán cacodylate ar oighear ar feadh 2 h. Ba iad seo a leanas na samplaí postfxed: (1) sruthlaithe le ddH2O agus a chur i 1 faoin gcéad thiocarbohydrazide uiscí ar feadh 20 nóiméad ag teocht an tseomra, agus (2) rinsed le ddH2O agus postfxed arís i 1 faoin gcéad OsO4 i 0.1 M maolán cacodylate ar feadh 1 h ag teocht an tseomra. . Tar éis céimeanna (1) agus (2) a athdhéanamh, riníodh na samplaí le ddH2O, agus dhaite le tuaslagán aicéatáit úráinile 0.5 faoin gcéad thar oíche ag teocht an tseomra. Rinsíodh bloic fíocháin te le ddH2O agus díhiodráitíodh iad trí shraith grádaithe eatánóil, aistríodh iad go aicéatáit isopentyl, agus triomaíodh pointe ríthábhachtach iad ag baint úsáide as CO2 leachtach. Rinneadh na heiseamail triomaithe a ghalú le hosmium agus scrúdaíodh iad le micreascóp leictreoin scanadh JSM-5600LV ag voltas luasghéaraithe 10 kV. Próiseáladh na híomhánna le Adobe Photoshop.

Le haghaidh micreascópachta leictreoin tarchurtha, rinneadh ciúbanna duán scartha a fxed ar feadh 2 h ar a laghad in 2 faoin gcéad (w/ toirt) formaildéad agus 2.5 faoin gcéad (toirt/toirt) glutaraildéad i 0.1 M maolán cacaidileat ag teocht an tseomra. Níodh na samplaí le 0.1 M maolán cacadylate agus postfx le 1 faoin gcéad OsO4 in {{10}}.1 M maolán cacadylate ar oighear ar feadh 2 h. Ansin nite samplaí le ddH2O agus dathaíodh iad thar oíche le 0.5 faoin gcéad aicéatáit úráinile uiscí ag teocht an tseomra. Díhiodráitíodh samplaí daite te le sraith grádaithe eatánóil, aistríodh go ocsaíd próipiléine é, agus leabaíodh é in Polybed 812 (Polysciences). Gearradh ailt ultrathin le scian diamanta, daite faoi dhó le aicéatáit úráinile agus chiotráite luaidhe, agus breathnaíodh ag voltas luasghéaraithe 100 kV ag baint úsáide as micreascóp leictreon tarchurtha (JEM-1010; JEOL) atá feistithe le ceamara gléas muirear-chúpláilte ( samhail BioScan 792; Gatan). Próiseáladh na híomhánna le Adobe Photoshop.

Tástáil fuail agus tástáil fola. Chun comparáid a dhéanamh le lucha Camsap3dc/dc, úsáideadh lucha WT ( móide / móide ) agus heitrisigeach (móide /dc) mar rialuithe sna measúnachtaí seo. Ní léiríonn lucha heitrisigeacha aon chomharthaí de Camsap3mífheidhm10agus tá eagair apico-bhunúsacha de mhicritiúibíní eagraithe acu. Bhí lucha 56-60 seachtain d’aois.

Coinníodh lucha i gcliabhán meitibileach (TECNIPLAST). Bailíodh samplaí fuail gach lá ar feadh cúig lá as a chéile, agus coinníodh na samplaí a bailíodh ag −80 céim . Ar deireadh, meascadh na samplaí fve go léir do gach luch ionas gur léirigh an meascán fnal riocht meánach gach luiche thar an tréimhse sin.

Maidir le bailiú fola, riarann ​​lucha {{0}}.02 mL ainéistéise in aghaidh gach graim meáchan coirp. Ba é comhdhéanamh anestéise Domitor (ZENOAQ) 30 µL, Midazolam (Sandoz) 80 µL, Vetorphale (Meiji Seika Pharma) 100 µL, agus 0.9 faoin gcéad uiscí NaCl go 1 mL. Bailíodh fuil le puncture cairdiach. Chun hemolysis a sheachaint, cuireadh an steallaire isteach go réidh agus é a tharraingt amach. Coinníodh gach sampla fola ag teocht an tseomra ar feadh 1 h chun téachtadh. Ansin lártheifníodh gach sampla (10,000×g, 25 céim , 15 nóim), agus bailíodh agus stóráladh séiream ag −80 céim . Rinne Oriental Yeast Co. anailís ar gach sampla fuail agus fola.