Clónáil Géine, Aithint Fheidhmeach, Anailís Struchtúrtha agus Slonn Sintéise Siúcrós Ó Cistanche Tubulosa Ⅱ

Torthaí agus anailís

1 Mianadóireacht agus clónáil ghéinte synthase shiúcrós i Cistanche tubulosa

The amino acid sequence of the identified Arabidopsis thaliana sucrose synthase AtSus1 was used as a template[16], and sequence alignment was performed in the Cistanche tubulosa transcriptome database by local Blastp. At the same time, two sucrose synthase gene sequences with FPKM values greater than 10 were screened out in combination with transcriptome gene annotation and gene expression abundance data, which were named CtSus and CtSus1, respectively. The comparative transcriptome data of different parts of Cistanche (haustoria, underground parts and aerial parts) were further analyzed. The distribution of chemical components in different parts of Cistanche plants has been studied in depth. The results showed that glycoside compounds represented by phenylethanoid glycosides in Cistanche are mainly present in its underground parts, with the highest content in the haustoria[22]. In the early stage of this study, the content of phenylethanoid glycosides in plant materials used for comparative transcriptome sequencing of different parts was also determined, confirming that the content of phenylethanoid glycosides in different parts of Cistanche tubulosa was different in the following manner: haustorium>underground part>>chuid aerga.

Mar sin, normalaigh Z-Score luachanna leibhéal slonn FPKM an dá ghéinte synthase shiúcrós iarrthóra a fuarthas sa scagadh tosaigh i sonraí tras-sgrìobhaidh codanna éagsúla de Cistanche tubulosa agus rinneadh anailís dhifreálach (Fíor 1A). Léirigh na torthaí go raibh an leibhéal léirithe is airde ag géine CtSus sa haustorium, agus bhí an leibhéal slonn sa chuid faoi thalamh níos airde ná sin sa chuid aer, a bhí ag teacht le patrún carntha comhdhúile glycosíde i gcodanna éagsúla de Cistanche tubulosa, agus bhí leibhéal slonn na géine CtSus1 san haustorium íseal. Mar sin, bunaithe ar na torthaí thuas, roghnaíodh an ghéine CtSus le haghaidh aimpliú seicheamh ina dhiaidh sin, léiriú exogenous agus sainaithint fheidhmiúil. Ag baint úsáide as Cistanche tubulosa cDNA mar theimpléad, fuarthas táirge banna aonair ag ~ 2500 bp tar éis aimpliú PCR (Fíor 1B). Aisghabhadh an táirge PCR ó fhoirmiú agus ligíodh é go dtí an veicteoir clónála, agus fuarthas réigiún códaithe fad iomlán na sprice trí sheicheamhú. Ba é fad an tseichimh CtSus ná 2418 bp.

Fíor 1 Iniúchadh agus clónáil géine ar CtSus ó C. tubulosa agus anailís bhithfhaisnéiseach ar phróitéin a ionchódaithe. A: Leibhéil slonn na ngéinte CtSus agus CtSus1 i gcodanna éagsúla de C. tubulosanormalized mar Z-Scóir bunaithe ar a luachanna FPKM; B: Aimpliú géine CtSus; M: marcóir DNA;C: Fearann ​​coimeádach próitéin CtSus arna thuar ag SMART; D: Ailíniú seicheamh iolrach de CtSus agus sintéis shiúcrós aitheanta ó phlandaí eile lena n-áirítear Arabidopsis thaliana, Solanumtuberosum agus Albuca bracteata. Tá an fearann ​​sintéise siúcrós agus an fearann ​​aistrithe siúcra léirithe ag boscaí dearga agus gorm, faoi seach; E: Anailís phylogenetic ar CtSus agus siúcrósynthases ó phlandaí eile; F: Anailís SDS-PAGE ar an slonn heitreolaíoch de CtSus ag baint úsáide as veicteoir Cold™ I in E. coli. Lána 1: Marcóir próitéin; Lána 2: Codán supernatant; Lána 3: Codán deascadh. Taispeánann an tsaighead dhearg an próitéin CtSus. G: Coilíneacht PCR de chlón amháin ina bhfuil an dá phlasmid dhá chomh-chomhchuí. M: marcóir DNA; 1: pET-28a-UGT71BD1; 2: pCold™ I-CtSus

COMHOIBRÍONN HETIAN DICHEN CISTANCHE CULTIVATES BAESES LE hOLLSCOIL PEKING

Seirbhís Tacaíochta Wecistanche-An t-onnmhaireoir cistanche is mó sa tSín:

Ríomhphost:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Teil:+86 15292862950

Cliceáil le haghaidh TUILLEADH SONRAÍ

2 Anailís bhithfhaisnéisíochta ar ghéine CtSus agus a phróitéin ionchódaithe

2.1 Anailís ar airíonna fisiciceimiceacha CtSus agus réamh-mheas ar struchtúr fearainn trasmembrane

Rinneadh anailís ar airíonna fisiciceimiceacha próitéin ionchódaithe CtSus ag baint úsáide as bogearraí ar líne ProtParam. Tá 805 aimínaigéad sa phróitéin, le foirmle mhóilíneach C4189H6548N1104O1187S28 agus mais mhóilíneach choibhneasta de 92266.44; is é an pointe isleictreach teoiriciúil ná 6.00; is é 35.45 an comhéifeacht éagobhsaíochta II, arb é próitéin chobhsaí é; is é −0.187 an meán hidreafhileacht foriomlán (GRAVY), ar próitéin hidreafilic é. Baineadh úsáid as MHMM 2.0 chun an fearann ​​transmembrane de shiúcrós synthase CtSus a thuar, agus léirigh na torthaí nach bhfuil aon fhearann ​​​​trasmembrane ag an próitéin atá ionchódaithe ag an géine seo.

COMHOIBRÍONN HETIAN DICHEN CISTANCHE CULTIVATES BAESES LE hOLLSCOIL PEKING

2.2 Struchtúr coimeádach CtSus agus ailíniú seicheamh a thuar

Baineadh úsáid as na bogearraí ar líne SMART chun fearainn choimeádacha próitéin CtSus a thuar (Fíor 1C). Tá dhá fhearann ​​coimeádach sa phróitéin. Is é an críochfort N (aimínaigéid 8 go 553) an fearann ​​siúcrós synthase, ar féidir leis imoibriú inchúlaithe UDP agus siúcrós a chatalú chun UDP-glúcóis agus D-fruchtós a ghiniúint; Baineann an C-terminus (aimínaigéid 557 go 739) leis an bhfearann ​​​​glycosyltransferase (Fíor 1D). Baineadh úsáid as bogearraí DNAMAN chun an seicheamh próitéin CtSus a ailíniú leis an seicheamh aimínaigéad siúcrós synthase i mbunachar sonraí NCBI (Tábla 2). Léirigh na torthaí gur léirigh seicheamh aimínaigéad CtSus cosúlacht ard le seichimh shintéis shiúcrós ó phlandaí eile. Ba é 94.78% an chosúlacht is airde idir CtSus agus an seicheamh synthase siúcrós ó sesame (Sesamum indicum), agus bhí an chosúlacht leis na sraitheanna synthase siúcrós ó phlandaí eile os cionn 65% freisin, rud a léiríonn go bhfuil ardleibhéal seicheamh ag an synthase siúcrós ó phlandaí. caomhnú.

Tábla 2 Cosúlachtaí seicheamh aimínaigéad idir CtSus agus sintéis shiúcrós aitheanta ó phlanda eile

2.3 Anailís phylogenetic

Baineadh úsáid as an gcrann fylogenetic a tógadh le bogearraí MEGA chun anailís a dhéanamh ar an ngaol fíolaigineach idir an t-siontas siúcrós CtSus ó Cistanche tubulosa agus sintéis shiúcrós ó phlandaí eile. Taispeántar na torthaí i bhFíor 1E. Léiríonn sintéisí siúcrós ó phlandaí craobhacha éabhlóideacha ar leith i ndícotanna (réigiúin I agus II) agus monacótaí (réigiún III). Tá CtSus sa bhrainse dicot, agus tá na seichimh a bhaineann go dlúth le CtSus go léir ó phlandaí Lamiaceae (Is planda Lamiaceae Orobanchaceae é Cistanche tubulosa), cé go bhfuil an brainse eile comhdhéanta go príomha de phlandaí Solanales, rud a léiríonn tuilleadh caomhnú agus homaleolaíocht. de ghéinte synthase shiúcrós de bhunadh plandaí in éabhlóid plandaí san ord céanna. Ina measc, is é an siúcrós synthase PrSus (AEN79500.1) ó Phelipanche ramosa de phlanda Orobanchaceae an ceann is gaire do CtSus.

3 Slonn exogenous agus anailís ghníomhaíochta ar CtSus

3.1 Slonn exogenous géine CtSus

Aistríodh na plasmidí pET-28a-CtSus, pET-24b-CtSus agus pCold™ I-CtSus arna bhfíorú trí sheicheamhú isteach sa slonn inniúil E. coli Transetta (DE3), agus rinneadh scagadh ar na clóin deimhneacha trí choilíneacht PCR le haghaidh fíorú seicheamhaithe. Ba é an IPTG teocht íseal do léiriú próitéine a tharlódh na tréithchineálacha slonn athchuingreach a fuarthas, agus bailíodh na baictéir trí lártheifneoiriú. Cuireadh an maolán lysis leis chun na baictéir a bhriseadh chun an sásán agus an deascán a fháil, agus rinneadh SDS-PAGE lena bhrath. Léirigh na torthaí nuair a úsáideadh pET-28a agus pET-24b mar veicteoirí slonn, níor cuireadh CtSus in iúl in E. coli, agus nuair a úsáideadh pCold™ I mar veicteoir slonn, CtSus soiléir braitheadh ​​banna próitéine athchuingreach sa réigiún ~100 kDa, a bhí ag teacht lena mhais mhóilíneach choibhneasta tuartha go teoiriciúil de 92.2 kDa (Fíor 1F).

COMHOIBRÍONN HETIAN DICHEN CISTANCHE CULTIVATES BAESES LE hOLLSCOIL PEKING

3.2 Claochlú lánchealla

D'fhonn feidhm chatalaíoch CtSus a fhíorú roimh ré, tógadh brú comh-léirithe de CtSus agus géine glycosyltransferase UGT71BD1. Clónáladh agus aithníodh UGT71BD1 ó Cistanche tubulosa agus is UDP-glucosyltransferase é a fhéadfaidh glacadh go forleathan le comhdhúile aramatacha cosúil le gliocóisídí feanilethanoid, cineálacha éagsúla flavonoids, stilbene agus coumarin mar ghabhdóirí agus imoibriú glucosylation an tsubstráit a chatalú ag baint úsáide as UDP-glúcósáit ghrúpa feanólach. mar dheontóir an tsiúcra[18]. Is féidir le tabhairt isteach CtSus go teoiriciúil UDP-glúcóis deontóra glycosyl níos leordhóthanach a sholáthar don imoibriú glucosylation catalyzed ag UGT71BD1, rud a chuireann cothromaíocht imoibriúcháin chun cinn chun bogadh i dtreo foirmiú táirgí glycosylation, rud a mhéadaíonn an táirgeacht táirgí glycosylation. Athraíodh an pCold™ I-CtSus plasmid agus an pET-28a-UGT71BD1 plasmid ag an am céanna go dtí an slonn inniúil E. coli Transetta (DE3). Rinne PCR an choilíneachta scagadh ar chlóin aonair ina raibh an dá phlasmid athchuingreach, agus fuarthas tréithchineálacha slonn athchuingreach dearfach trí sheicheamhú a fhíorú (Fíor 1G). Ionduchaíodh an comhléiriú déghéine in vitro, agus úsáideadh an brú slonn singil pET-28aUGT71BD1 mar ghrúpa rialaithe. Fíoraíodh gníomhaíocht CtSus maidir le giniúint deontóra UDP-glúcóis a chatalú trí chlaochlú iomlán na gcealla. Léirigh torthaí HPLC agus mais-speictriméadracht ardtaifigh, nuair a rinneadh imoibriú claochlaithe iomlán cille le aesculetin 1 agus resveratrol 2 mar fhoshraitheanna, go bhfuarthas giniúint táirgí soiléire glycosylation tar éis 24 h de chlaochlú, mar a thaispeántar i bhFíor 2.

Fíor 2 Bith-chlaochlú lánchealla ar fhoshraith 1 nó 2 trí bhrú athchuingreach a chothaíonn UGT71BD1 nó brú athchuingreach ag cothú cúplála UGT71BD1 le CtSus, faoi seach. A: HPLCchromatograms de bhith-chlaochlú uile-chill an tsubstráit 1. Ba é 360nm an tonnfhad braite; B: HRESI-MS agus MS2spectra de tháirge 1a; C: Crómatagram HPLC de thrasfhoirmiú uile-chealla fhoshraith 2; Ba é 330 nm an tonnfhad braite. D: speictream HRESI-MS de tháirgí 2a agus 2b

Nuair a úsáideadh 1 (m/z 179.034 4 [M+H]+, foirmle mhóilíneach C9H6O4) mar fhoshraith, buaic chrómatagrafach an táirge 1a (m/z 41.087 2 [M+H] +, fuarthas amach foirmle mhóilíneach tuartha C15H16O9) ag 5.39 min, a bhí comhsheasmhach le ionsú UV an tsubstráit agus an táirge rialaithe. Ag an am céanna, braitheadh ​​buaic na blúirí de m/z 179.033 4 [M+H]+ sa speictream MS2 de 1a, a tháirgtear trí 1a ag cailleadh móilín glúcóis (162 Da), rud a léiríonn gurbh é 1a táirge fhoshraith 1 a bhí ceangailte le móilín glúcóis. Ríomhadh an ráta comhshó tríd an limistéar buaic a chomhtháthú. Fuarthas amach gurb é 71.87% an ráta comhshó de chealla iomlána UGT71BD1 a chatalaíonn foshraith 1 chun táirge glycosylated 1a a ghiniúint, agus mhéadaigh cur leis CtSus ráta comhshó an imoibrithe go 95.84%, a bhí 1.3 uair níos mó ná an grúpa rialaithe. Nuair a bhí an tsubstráit cumaisc 2 (m/z 227.072 5 [MH]-, foirmle mhóilíneach C14H12O3), beanna crómatagrafacha an táirge 2a (m/z 389.123 4 [MH]-, móilíneach tuartha foirmle C20H22O8) agus 2b (m/z 575.175 9 [M + Na]+, foirmle mhóilíneach tuartha 26H32O13) aimsíodh ag 10.32 agus 6.52 min, faoi seach, a bhí ag teacht le hionsú UV tréithiúil an tsubstráit agus an táirge rialaithe. Braitheadh ​​buaic blúire ag 227.071 3 [MH]-, a tháirgtear nuair a cailleadh móilín glúcóis amháin (162 Da), rud a thugann le fios gurbh é 2a táirge fhoshraith 2 a bhí ceangailte le móilín glúcóis amháin. Trí chomparáid a dhéanamh leis na sonraí sa litríocht [18] agus an fhaisnéis tuar mais-speictriméadrachta, socraíodh go raibh táirge 2b mar thoradh ar fhoshraith 2 ceangailte le dhá mhóilín glúcóis. Ríomhadh an ráta comhshó trí úsáid a bhaint as an mbuaiclimistéar comhtháite. Fuarthas amach go bhféadfadh cur leis CtSus ráta comhshó imoibriú glycosylation substráit 2 a mhéadú ó 64.01% go 78.51%, ina measc tháinig méadú ar tháirgeacht táirge monaisiúicríde 2a ó 45.09% go 63.58%, agus toradh táirge déshiúicríde 2b. athraithe ó 18.92% go 14.93%.

3

COMHOIBRÍONN HETIAN DICHEN CISTANCHE CULTIVATES BAESES LE hOLLSCOIL PEKING

3.3 CtSus

íonú próitéin athchuingreach agus sainaithint gníomhaíochta catalaíoch einsím in vitro Mhol torthaí an turgnaimh comhshó cille iomláin go bhfuil an ghníomhaíocht ag CtSus chun táirgeadh UDP-glúcóis deontóra glúcóis gníomhach a chatalú. Chun an ghníomhaíocht chatalaíoch a fhíorú tuilleadh trí chatalú einsímeach in vitro, rinneadh an próitéin comhleá de ghéine CtSus i gcóras slonn pCold™ a dheighilt agus a íonú trí chrómatagrafaíocht chleamhnais. Léirigh na torthaí nuair a úsáideadh pCold™ I mar veicteoir slonn, gur cuireadh an próitéin athchuingreach in iúl i gcainníochtaí móra, ach sa deascán den chuid is mó. Nuair a úsáideadh pCold™ TF mar an veicteoir slonn, cuireadh géine CtSus in iúl i gcainníochtaí móra in E. coli (Fíor 3A). Rinneadh an próitéin chomhleá a íonú le crómatagrafaíocht cleamhnais HisTrap FF le haghaidh imoibriú einsímeach in vitro. Taispeántar na torthaí i bhFíor 3B. Nuair a úsáideadh siúcrós agus UDP mar fhoshraitheanna, i gcomparáid leis an ngrúpa rialaithe diúltach, braitheadh ​​buaic táirge nua ag 10.32 min. Bhí a chuid ama coinneála agus ionsú UV comhsheasmhach le UDP-glúcóis. Cruthaíodh go raibh an táirge UDP-glúcóis i gcomparáid leis an gcaighdeán. Mar sin féin, ós rud é go bhfuil clib intuaslagtha fachtóir truicear mór sa phróitéin chomhleá arna chur in iúl ag an veicteoir slonn pCold™ TF (is é méid próitéine an chlib ná 48 kDa), beidh tionchar mór aige ar ghníomhaíocht chatalaíoch na próitéine. Dá bhrí sin, rinneadh clib an phróitéin chomhleá a ghearradh tuilleadh ag einsím Factor Xa, agus íonaíodh an próitéin CtSus gan clibeanna exogenous (Fíor 3A). Cuireadh an phróitéin faoi réir catalaithe einsímeacha in vitro, agus léirigh na torthaí gur mhéadaigh toradh an UDP-glúcóis ó 3.53% go 10.66% (Fíor 3B). Dheimhnigh na torthaí thuas gníomhaíocht CtSus maidir le táirgeadh UDP-glúcóis a chatalú trí chatalú einsímeach in vitro, agus léirigh siad freisin go gcuidíonn láithreacht chlib cleamhnas mór le léiriú intuaslagtha CtSus, ach beidh tionchar suntasach aige freisin ar an in vitro. gníomhaíocht catalaíoch vitro na heinsíme.

Fíor 3 Slonn heitreolaíoch agus sainaithint fheidhmiúil CtSus. A: Anailís SDS-PAGE ar phróitéiní CtSus. Lána 1: Marcóir próitéin; Lána 2: CtSus athchuingreach le fachtóir truicear; Lána 3: Trigger13 scoilteadh clib fachtóir ag baint úsáide as Fachtóir Xa protease a thabhairt ar an próitéin CtSus lipéadaithe ag an tsaighead dearg. B: Measúnachtaí einsímeacha Invitro ag baint úsáide as próitéin chomhleá agus próitéiní CtSus saor ó fhachtóirí a spreagadh chun sintéis UDP-glúcóis a chatalú i láthair shiúcrós agus UDP, faoi seach, le caighdeán tagartha UDP-glúcóis. Baineadh úsáid as próitéin bruite mar ghrúpa rialaithe faoi na coinníollacha céanna. Ba é 260 nm an tonnfhad braite