Inrochtaineacht Chromatin Agus Slonn MicroRNA i gCealla Sinsearach Nephron Le linn Forbairt Duán

Tuilleadh eolais:ali.ma@wecistanche.com

Andrew Clugston^1,2,3, Andrew Bodnar^2,3, Débora Málta Cerqueira^2,3, Yu Leng Phua^2,5,6, Alyssa Lawler^8,9,10, Kristy Boggs⁷, Andreas Pfenning^8,10, Jacqueline Ho^2,3*agus Dennis Kostka^1,4*

¹Roinn na Bitheolaíochta Forbartha, Scoil an Leighis Ollscoil Pittsburgh, Pittsburgh, PA, SAM²Ionad Taighde Rangos, Ospidéal Leanaí UPMC, Pittsburgh, Pittsburgh, PA, SAM³An Roinn Péidiatraiceach, Rannóg na Neifreolaíochta, Scoil an Leighis Ollscoil Pittsburgh, PA, SAM⁴Roinn na Bitheolaíochta Ríomhaireachta & Córais agus Ionad Pittsburgh do Bhitheolaíocht agus Leigheas Éabhlóideach, Scoil an Leighis Ollscoil Pittsburgh, Pittsburgh, PA, SAM⁵Rannóg na Míochaine Géiniteacha agus Géanómaíochta, An Roinn Péidiatraiceach, Ospidéal Leanaí UPMC, Pittsburgh, Pittsburgh, PA, SAM⁶Roinn na Paiteolaíochta, Saotharlann Géineolaíochta Bithcheimiceach Cliniciúil, Ospidéal Leanaí UPMC, Pittsburgh, Pittsburgh, PA, SAM⁷An Roinn Péidiatraiceach, Rannóg na Gaistreintreolaíochta, na Heipiteolaíochta, agus an Chothaithe, Scoil an Leighis Ollscoil Pittsburgh, Pittsburgh, PA, SAM.⁸Bitheolaíocht Ríomhaireachtúil,⁹Eolaíochtaí Bitheolaíochta, agus¹⁰Institiúid Néareolaíochta, Ollscoil Carnegie Mellon, Pittsburgh, PA, SAM

Teibí

Eascraíonn nephrons mamaigh ó dhaonra decealla nephron progenitor, agus cuireann athruithe i tras-scríbhinní na gceall seo le scor nephrogenesis, cinntitheach tábhachtach d'uimhir nephron. Chun léiriú microRNA (miRNA) a thréithriú agus réigiúin toimhdeacha cis-rialála a aithint, bhailigh muid cealla giniúna nephron ón luchduáinag lá suthach 14.5 agus náid lá iarbhreithe agus measúnú ar léiriú RNA beag agus crómatin inrochtana trasposase. Braitheadh ​​​​muid abairt 1,104 miRNA (114 le hathruithe slonn), agus 46,374 réigiúin inrochtana chromatin (2,103 le hathruithe inaccessibility). Ar fud an ghéinóim, cuireann ár sonraí béim ar phróisis cosúil le difreáil cheallacha, imirce cille, idirghníomhaíochtaí maitrís eischeallacha, agus cosáin chomharthaíochta forbraíochta. Ina theannta sin, sainaithníonn siad eilimintí cis-rialála is iarrthóirí nua le haghaidh Eya1 agus Pax8, an dá ghéin a bhfuil ról acu i idirdhealú cille giniúna néaróin. Ar deireadh, déanaimid nasc idir miRNAs a athraíonn slonn, lena n-áirítear let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a-2-3p, agus miR{{). 20}}p, le heilimintí cis-rialála iarrthóra agus spriocghéinte. Leagann na hanailísí seo béim ar lóis cis-rialála toimhdeacha nua do miRNA i sleachta nephron.

Réamhrá

Aonad feidhme anduánan nephron, a fhreastalaíonn ar dhramhaíl a scagadh agus gnáth-homeostasis uisce, aigéad-bun, agus leictrilítí sa chorp a chothabháil. Athraíonn líon na nephron go forleathan i ndaoine (go hiondúil idir dhá chéad míle agus níos mó ná milliún nephrons (Hughson et al., 2003)) agus bunaítear é roimh bhreith i ndaoine (thart ar an lá iarbhreithe 2-3 i lucha (Hartman et al. ., 2007; Hinchliffe et al., 1991)). Ní féidir le nephrons athghiniúint tar éis breithe, agus tá baint ag dearlaice nephron laghdaithe le riosca méadaithe galar duáin ainsealach agus Hipirtheannas (Bertram et al., 2011). Tá líon na nephron, ina dhiaidh sin, cinnte go mór mór ag daonra cealla ar a dtugtarcealla nephron progenitor(Cebrian et al., 2014b). Sna céimeanna deiridh deduánforbartha, méadaíonn progenitors nephron a gclaonadh chun idirdhealú a dhéanamh, rud a ídíonn a ndaonra de réir a chéile agus marcanna deireadh le nephrogenesis (Hartman et al., 2007; Rumballe et al., 2011; Volovelsky et al., 2018). Tá impleachtaí suntasacha ag baint le tuiscint a fháil ar na meicníochtaí a rialaíonn scor nephrogenesis maidir le dearlaice nephron a chinneadh agus an baol galar duáin ina dhiaidh sin.

I rithduánforbartha, féin-athnuachana Cited1 móide /Six2 móide sleachta nephron a tharlódh chun a bheith ina ghineadóirí den scoth faoi Lua1-/Six2 plus, agus ina dhiaidh sin iad a dhifreáil go Wnt4-ag cur veistíní duánacha in iúl mar fhreagra ar Wnt9b/ -catenin (McMahon et al., 2016; Rumballe et al., 2011). I measc na n-athruithe tras-scríbhinne intreacha i sleachta nephron luath i gcoinne déanach tá géinte agus cosáin a mbíonn tionchar acu ar aosú gascheall, go háirithe, mTor agus a repressor hamartin (S. Chen et al., 2015; Volovelsky et al., 2018). Go deimhin, meastar go ndéanann Hamartin dí-íogaireacht a dhéanamh ar progenitors nephron chun comharthaí féin-athnuachana, agus ar an mbealach seo cuireann sé le scor nephrogenesis (S. Chen et al., 2015). Ag teacht leis an smaoineamh go bhfuil claonadh níos mó ag progenitors nephron luath chun féin-athnuachan a dhéanamh ar an tuairim go bhfuil inrochtaineacht chromatin saibhrithe do shuímh cheangailteach fachtóirí lárnacha tras-scríobh progenitor néarchóras, lena n-áirítear Six2 agus Wt1 i gcomparáid le sleachta nephron déanach (Hilliard et al. , 2019). Léiríodh go gceanglaíonn na fachtóirí trascríobh seo seichimh feabhsaithe atá suite i “spotaí teo rialála” sa ghéanóim (O'Brien et al., 2018). Tarlaíonn ionduchtú progenitors nephron mar gheall ar ardú leibhéil -catenin, as a dtagann gníomhachtú coimpléisc Lef1 / Tcf7 ag géinte atá réidh le haghaidh gníomhachtú an chláir nephrogenesis (Park et al., 2012), agus moltar casta le Tcf7l1 agus Tcf7l2 chun lúba chromatin rialála a bhunú agus a chothabháil a éascaíonn gníomhachtú géine (Guo et al., 2021).

Cliceáil chunPúdar cistanche tubulosa chun galar duáin a chóireáil

Tá baint ag staidéir le déanaí le microRNAs (miRNA) maidir le scor nephrogenesis a rialáil. Is móilíní RNA gearra, neamhchódaithe iad miRNA a dhíríonn ar thrascríbhinní teachtaire-RNA (mRNA) le haghaidh aistriúchán laghdaithe nó díghrádú feabhsaithe tríd an gcoimpléasc tosta RNA-spreagtha (RISC) (Bartel, 2009). Is frithbhrúiteoir aitheanta í an phróitéin Lin28b den teaghlach ligin de miRNAs (Heo et al., 2008). Laghdaíonn slonn Lin28b i progenitors nephron de réir mar a théann nephrogenesis ar aghaidh, agus tagann sé seo i gcomhthráth le méadú ar léiriú an teaghlaigh miRNA let-7 (Yermalovich et al., 2019). Ina theannta sin, tá ionduchtú coinníollach slonn Lin28b sa líne Wt1-mar thoradh ar chosc ar lig-7 miRNA, atá leordhóthanach chun nephrogenesis a fhadú (Yermalovich et al., 2019). Ní fios cé acu a rialaíonn miRNAs eile uainiú nephrogenesis. Ina theannta sin, cé go n-aithnítear feabhsaitheoirí a rialaíonn léiriú RNA fada neamhchódaithe le linn nephrogenesis (Nishikawa et al., 2019), níor léiríodh go rialaíonn aon cheann acu léiriú miRNA i sloinnte nephron.

Sa staidéar seo, rinneamar iarracht miRNA núíosach a aithint ag an am céanna a chuidíonn le scor nephrogenesis, mar aon le gnéithe cis-rialála féideartha. Dá bhrí sin, chun athruithe i slonn miRNA agus inrochtaineacht chromatin a bhreathnú idir lá suthach 14.5 (E14.5) agus náid lá iarbhreithe (P0), tháirgeamar tacair sonraí comhoiriúnaithe mRNA-seq agus ATAC-seq ó bhunscoileanna agus gan pasáiste.cealla nephron progenitorag na pointí dhá uair seo. D’aithníomar 114 miRNA a chuirtear in iúl go difreálach icealla nephron progenitoridir na pointí dhá-ama seo, chomh maith le 2,103 réigiún d’inrochtaineacht chromatin athraitheach a dtugtar réigiúin inrochtana difreálach orthu (DARs). I measc na n-anailísí saibhrithe ar na spriocanna géine tuartha maidir le miRNA atá ag athrú go suntasach agus i measc na suíomhanna géanómaíochta de DAR, tá conairí intuigthe a théann i bhfeidhm ar dhifreáil cille epithelial, imirce cille, idirghníomhaíochtaí maitrís seachcheallacha, agus príomhbhealaí comharthaíochta forbartha mar Wnt, Notch, agus comharthaíocht TGF. . Breathnaímid ar athruithe suntasacha in inrochtaineacht i gcrómatin agus cuirimid línte iolracha fianaise i láthair a thugann dhá réigiún géanómacha i bhfeidhm mar fheabhsaitheoirí toimhdeacha do na géinte Eya1 agus Pax8 i gcealla giniúna nephron. Ar deireadh, shainaithnímid inrochtaineacht crómatin chomhsheasmhach agus athruithe slonn miRNA do 33 phéire miRNAs agus DARanna, lena n-áirítear let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a{-181a{-181a{). {11}}p, agus miR-9-3p, agus géinte sprice toimhdeacha i láthair arna shloinneadh i sleachta nephron le haghaidh miRNAs a chuirtear in iúl go difreálach.

Torthaí

Leithlisiú daonraí cille ginearaí néaróin ó E14.5 agus P0duáin

Cealla progenitor Nephronscoite amach trí roghnú dearfach do Itg 8 ag E14.5 nó ag P0, agus roinneadh gach sampla chun mRNA-seq, ATAC-seq, agus rialú cáilíochta a dhéanamh (Figiúr Forlíontach 1 AB). Dheimhnigh PCR cainníochtúil (qRT-PCR) go bhfuil na géinte marcála progenitor nephron Six2 agus Cited1 (Huang et al., 2016) in iúl go mór i samplaí sleachta aonraithe nephron i gcoibhneas leis an iomlán.duán, níos mó ná marcóirí do chineálacha cille eile (lena n-áirítear bachlóg ureteric (Caleb) (Cebrian et al., 2{{10}}14a), cealla endothelial (Pecan) (Kobayashi et al., 2008), stroma duánach (Pdgfr ) (S. Chen et al., 2015) agus vesicle duánach (Lhx1) (Brunskill et al., 2014)(Figiúr forlíontach 1 C) Maidir le gnéas, bhí raon ó bhruscar a úsáideadh do shamplaí E14.5 sa raon ó 27 faoin gcéad go 50 faoin gcéad baineann, agus bhí raon ó 31 faoin gcéad go 75 faoin gcéad baineann i líon na samplaí P0. Ar an meán, bhí samplaí E14.5 38 faoin gcéad baineann, agus samplaí P0 49 faoin gcéad baineann (Figiúr Forlíontach 1 D). -mhaoirsithe nephron daonraí cille progenitor lig dúinn chun anailís a dhéanamhinrochtaineacht chromatinagus léiriú RNA beag sna céimeanna céanna forbartha ag pointí dhá-ama (E14.5 agus P0).

Tá próifílí tras-scríobhacha miRNA ar leith ag ginearaí nephron luath agus déanach

Braitheadh ​​seicheamhú RNA beag 1,104 thras-scríbhinn miRNA aitheanta agus shainaithnítear 114 miRNA a léiríonn athrú suntasach ar shloinneadh idir samplaí E14.5 agus P{{1{0}} (ráta fionnachtana bréagach ( FDR)=0.05; Tábla Forlíontach 1). Léiríonn leath de na miRNAs a chuirtear in iúl go difreálach slonn méadaithe ag P0 i gcomparáid le E14.5, agus léiríonn anailís phríomhpháirte aonchineálacht níos mó i slonn miRNA i measc samplaí E14.5 i gcomparáid le P0 (Fíor 1A). Nochtann cnuasach ordlathach grúpáil soiléir miRNAs isteach iad siúd a bhaineann le léiriú méadaithe agus laghdaithe idir E14.5 agus P0, faoi seach (Fíor 1B). Tá baill den teaghlach ligin de miRNAs i measc na miRNA is airde a aithníodh, agus tugaimid faoi deara go léiríonn gach ball den teaghlach a bhfuil athruithe suntasacha acu slonn méadaithe ag P0 (níl sonraí ar taispeáint). Tá sé seo ag teacht le torthaí a thaispeánann go n-eascraíonn laghdú ar slonn Lin28b go dtiocfaidh méadú leathan ar léiriú teaghlaigh ligean-7 le linn nephrogenesis (Yermalovich et al., 2019). I measc na miRNAs eile a bhfuil slonn i bhfad níos airde ag P0 tá miR-429-3p, ball den teaghlach miR-200 a bhfuil aithne aige go bhfuil tionchar aige ar dhifreáil podocyte (Z. Li et al., 2016), agus miR{{30} araon }}a-5p agus miR-125b-5p. Is eol go ndéanann an dá cheann deiridh díobh seo athscríbhinní Lin28 a athbhrú i dtimpeallachtaí ceallacha éagsúla (Chaudhuri et al., 2012; Potenza et al., 2017). cuimsíonn miRNA a bhfuil slonn i bhfad níos ísle ag P0 an angiogenesis- (S. Wang et al., 2008) agus iomadú chun cinn (Schober et al., 2014) miR-126.

Cuireann uirlis DIANA miRPath ar chumas anailís conaire KEGG ar miRNA bunaithe ar a spriocanna géine faoi seach, mar a thuar ag micrea-T-CDS (Vlachos et al., 2015). Faighimid amach gurb iad miRNA leis na hathruithe is mó sa chaint idir E14.5 agus P0 (suas nó síos) iad siúd a rialaíonn cosáin le príomhróil i nephrogenesis (Fíor 1C, figiúr Forlíontach 2). Mar shampla, tá Tgf- faoi rún ag cealla stromal máguaird chun difreáil giniúna nephron a chur chun cinn (Rowan et al., 2{{50}}18), agus tugaimid faoi deara go bhfuil laghdú ar an slonn i measc miRNA ginearaí nephron a dhíríonn ar éifeachtóirí iartheachtacha na an "cosán comharthaíochta TGF" (conair KEGG mmu04350, p-value 1.45e- 6). Bíonn tionchar ag an "cosán comharthaíochta MAPK" (mmu04010) ar eagrú agus ar thúsú sleachta nephron le haghaidh difreála, agus rialaíonn sé a n-idirghníomhaíochtaí leis an maitrís eischeallach (ECM) trí Itg 8 (Ihermann-Hella et al., 2018). Tugaimid faoi deara líon suntasach miRNAs suas-agus síos-rialaithe a dhíríonn ar ghéinte éagsúla sa chonair chomharthaíochta MAPK seo (p-luachanna 3.5e- 6 agus 3.0e- 4 le haghaidh liostaí suas agus síos, faoi seach) . Mar fhocal scoir, is é an cosán KEGG "Idirghníomhaíocht receptor maitrís seach-cheallacha (ECM)" (mmu04512) an cosán saibhrithe is suntasaí a aithníodh, agus tá a ghéinte comhpháirte dírithe i bhfad níos suntasaí ag miRNA a mhéadaíonn léiriú le himeacht ama (p-luach 7.4e{ {32}} i measc méadú miRNA versus 1.1e-2 i measc laghdú). Dírítear ar ghéinte a bhaineann le ECM ar chuid de na miRNA is mó léirithe agus is suntasaí a bhraithimid, lena n-áirítear miR-196a{-5p, miR-148a-3p, miR) -125a-5p, agus lig{-7f{-5p. Go háirithe, is é miR-196a{-5p) an miRNA is airde léirithe inár samplaí, agus feiceann sé méadú 8-huaire idir E14.5 agus P0. I measc na n-athscríbhinní géine a bhí mar spriocanna tuartha miRNA (ag baint úsáide as TargetScan (Agarwal et al., 2015)) le léiriú méadaithe ag P0 tá Bach2, nasc móilíneach molta idir na bealaí MAPK / AP1 agus Six2 / -catenin le haghaidh féin-athnuachan agus difreálaigh. i progenitors nephron, faoi seach (Hilliard et al., 2019).

Chun spriocanna toimhdeacha de miRNAs arna léiriú go difreálach i eascairí nephron a aithint, d’úsáideamar anótáil ríomhaireachtúil miRNAs a cuireadh ar fáil i miRDB (Y. Chen & Wang, 2020), agus na hidirghníomhaíochtaí miRNA-mRNA turgnamhacha anótáilte ón mbonn moirtéal (HY Huang et al., 2020), i gcomhar lenár tacar sonraí seicheamhaithe RNA aonchealla E14.5 a gineadh roimhe seo (Bais et al., 2020). Mar sin, ghineamar liosta d’idirghníomhaíochtaí miRNA-mRNA féideartha bunaithe ar léiriú difreálach ar an miR idir E14.5 agus P0 i sleachta nephron le hathrú comhfhreagrach i slonn sprice géine idir féin-athnuachan agus progenitors nephron primed, chomh maith le primed agus progenitors nephron idirdhealú (Fíor 2). Tugann ár n-anailís le fios gur spriocanna ionchasacha iad Meis2 agus Hmga2 don teaghlach ligin de miRNAs i ngineadóirí nephron (Fíor 2), le slonn laghdaithe Meis2 agus Hmga2 bainteach le léiriú méadaithe na mball teaghlaigh ar ligean-7 in idirdhealú nó ag dul in aois progenitors nephron. Cuirtear fachtóir trascríobh Meis2 in iúl go láidir i progenitors nephron agus an stroma duánach le linnduánforbairt (Lam et al., 2014), agus tá sé nasctha le rialú iomadú cille i gcomhthéacsanna eile (Abruzzese et al., 2019). Is próitéin neamhhistone ceangailteach crómatin é Hmga2, tá sé in iúl go mór i gaschealla, agus tá baint aige le héagsúlacht siadaí mesenchymal (Fusco & Fedele, 2007; Lam et al., 2014). Mar an gcéanna, tá slonn Jag1 méadaitheach bainteach le slonn laghdaithe miR-34b-5p, miR-983p, agus miR-200a-3p i idirdhealú nó progenitors nephron ag dul in aois (Fíor 2). Is príomh-ligand é Jag1 i gcomharthaíocht Notch a mhéadaíonn a shloinneadh de réir mar a dhifreálann progenitors nephron (Chung et al., 2016). Tá gach sprioc miRNA tuartha nó anótáilte le haghaidh géinte a bhfuil athruithe slonn orthu idir féin-athnuachan, progenitors nephron agus idirdhealú ar fáil san Fhorlíonadh.

Figiúr 1. Athruithe suntasacha i slonn miRNA idir E14.5 agus P0 nephron progenitors.A) Léiríonn anailís phríomh-chomhpháirt go gcuireann pointe ama forbraíochta go mór le héagsúlacht abairt miRNA. B) Léarscáil teasa a thaispeánann slonn coibhneasta gach miRNA atá ag athrú go suntasach. Tá anót glas éadrom ar cholúin ina bhfuil samplaí E14.5 ar chlé, agus tá anót glas dorcha ar na colúin a bhfuil samplaí P0 orthu ar dheis. C) Saibhriú géinte ó bhealaí sonracha KEGG i measc spriocanna géine réamh-mheasta miRNA suas agus síos-rialaithe (barraí dearga agus gorma, faoi seach). Is é an p-luach íosta atá san áireamh ná 1e-5.

Figiúr 2. idirghníomhaíochtaí miRNA-mRNA le ról féideartha in aosú cille nephron progenitor agus difreáil.Taispeántar miRNA (ciorcail) agus mRNA (cearnóga). taispeántar miRNAs le slonn méadaithe idir E14.5 agus P0 i dearg, taispeántar miRNAs a bhfuil laghdú orthu i gorm. Géin sprice anótáilte (ó mirDB agus mir TarBase) le slonn méadaitheach idir féin-athnuachan, préimh nó difreáilcealla nephron progenitor(Bais et al., 2020)i dearg, mRNA le slonn laghdaitheach i gorm. Fágadh imill ó mirDB agus mirTarDB atá ar neamhréir le hathruithe cainte breathnaithe ar lár ach tá siad san áireamh i dTábla Forlíontach 2.

Tá timpeallachtaí crómatin ar leith ag progenitors nephron luath agus déanach

Cheadaigh sonraí ATAC-seq ó shliocht E14.5 agus P0 nephron dúinn 46,374 réigiún de chromatin inrochtana a shainaithint (le ráta fionnachtana do-laghdaithe (Boleu et al., 2015) de {{ 22}}.1, féach (Figiúr Forlíontach 3 C, Tábla Forlíontach 3), le chéile trasna samplaí agus pointí ama. Tugaimid faoi deara go gcomhlíonann ár sonraí treoirlínte ATAC-seq an tionscadail ENCODE (ENCODE, nd) (Figiúr forlíontach 3 A, B) agus go bhfeicimid rátaí méadaithe caomhantais i measc buaicphointí IDR ná mar a fheictear i rialuithe randamacha (Figiúr Forlíontach 3 D) I measc na RDIanna a dtuairiscímid, tá feabhsaitheoirí atá doiciméadaithe sa VISTA (Visel et al., 2007) i 3,576 agus/nó Tá bunachair shonraí feabhsaithe FANTOM5 (de Rie et al., 2017), agus 13,495 ina bhfuil seichimh DNA le róil rialála tuartha i bhfíochán luiche amháin ar a laghad nó i gcineál cille de réir EnhancerAtlas 2.0 (Gao & Qian, 2020).

Léirigh anailís phríomh-chomhpháirteanna (arna choigeartú le haghaidh difríochtaí gnéis idir samplaí) grúpáil soiléir samplaí de réir phointe ama forbraíochta (Fíor 3A). Chun loci géanómaíochta le hathruithe ar inrochtaineacht chromatin a shainaithint, rinneamar comparáid idir an comhartha ATAC-seq idir samplaí E14.5 agus P0. Thugamar faoi deara 2,103 DAR, ag rialú an FDR ag 10 faoin gcéad . Astu seo léirigh 1,323 (55 faoin gcéad ) inrochtaineacht mhéadaithe ag P0 i gcomparáid le E14.5, agus léirigh cnuasú ordlathach idirdhealú soiléir idir DARanna a osclaíonn agus a dhúnann idir E14.5 agus P0, faoi seach (Fíor 3B).

Sainaithníodh lorga fachtóir trascríobh ag baint úsáide as HINT agus a mheaitseáil le próitéiní ceangailteach DNA ag baint úsáide as móitífeanna ó bhunachar sonraí HOCOMOCO 11 (Kulakovskiy et al., 2018). I measc na 431 móitíf a tástáladh, léiríonn DARanna ina bhfuil lorganna do roinnt próitéiní fachtóirí trascríobh a bhaineann le nephrogenesis méadú ar inrochtaineacht idir E14.5 agus P0. I measc na lorga a bhfuil cónaí orthu i DARanna a mhéadaíonn inrochtaineacht ar an meán, baineann na sé cinn is airde le lorg fachtóir trascríobh meaitseáilte le Pax8 ({{10}}.15), Six2 (0.14), Cebpd (0.13), Sé4 (0.13), Meitheamh (0.12), agus Fos (0.11). I measc na lorga atá anótáilte sna DARanna deiridh tá fachtóirí trascríobh E2F2 agus E2F4, ar eol go mbíonn tionchar acu ar dhul chun cinn timthriall cille (Gaudet et al., 2011) agus a chuireann iomadú cille chun cinn (D. Wang et al., 2000) i gcomhthéacsanna ceallacha eile (Figiúr forlíontach). 4).

Chun an comhthéacs bitheolaíoch a bhaineann le DARanna a oscailt agus a dhúnadh a mheas, d’úsáideamar Uirlis Saibhrithe Anótálacha na Réigiúin Géanómaíochta (GREAT) (McLean et al., 2010) chun tacair géine a aibhsiú le saibhriú na réigiún crómatin athraitheacha gaolmhar. Leis an gcur chuige sin, sainaithnímid próisis bhitheolaíocha Gene Ontology (GO) atá ceangailte go dlúth le forbairt progenitor nephron: go háirithe, is é an próiseas saibhrithe is fearr i measc DARanna oscailte ná "Rialachán difreála cille epithelial" (GO: 0030856, Binomial Q-value {{3) }}.5e-5), agus "Rialachán dearfach ar dhifreáil cille epithelial" (GO: 0030858, tá luach Dénomaíoch Q=5e-3) i measc na 10 gcinn is suntasaí saibhrithe ( Figiúr forlíontach5). Tá an dá cheann ag teacht le méadú ar chlaonadh sleachta nephron dul faoi aistrithe mesenchymal-go-epithelial (MET) de réir mar a dhifreálann siad (S. Chen et al., 2015). I measc na gconairí eile atá saibhrithe go suntasach tá "Rialáil dhearfach ar chonair Chomharthaíochta Notch" (GO: 0045747, X-luach Dénomial=2e-5), atá ag teacht leis an ról atá ag comharthaíocht Notch maidir le difreáil ginearaí nephron a chur chun cinn ( Chung et al., 2016). Níor nocht na 10,083 DAR deiridh a aimsíodh téarmaí suntasacha GO bunaithe ar chritéir réamhshocraithe GREAT maidir le tábhacht (féach Fíor Forlíontach 5).

Fíor 3. Tá difríochtaí in inrochtaineacht chromatin mar thréith ag E14.5 vs. P0cealla nephron progenitor.A) Léiríonn anailís phríomhpháirte ar shamplaí ATAC-seq pointí ama forbartha mar phríomhfhoinse éagsúlachta. B) Léarscáil teasa a thaispeánann réigiúin IDR atá ag athrú go suntasach thar samplaí ATAC-seq. Tá anót glas éadrom ar shamplaí/colúin E14.5, agus déantar anótáil ar shamplaí/colúin P0 le glas dorcha. C) Téarmaí Próiseas Bitheolaíochta GO saibhrithe do réigiúin ghéanómacha a osclaíonn idir E14.5 agus P0 de réir GREAT, rangaithe de réir P-luach déthéarmach, FDR Níos lú ná nó cothrom le 0.001.

Ansin, rinneamar iniúchadhinrochtaineacht chromatini réigiúin den ghéanóm ina bhfuil tionscnóirí agus méadaitheoirí do ghéinte a bhfuil róil foilsithe acu i ndifreáil cille ginearaí nephron. Ina measc seo, tá fachtóir trascríobh Six2 ríthábhachtach chun ilchumhachta a choinneáilcealla nephron progenitor(Self et al., 2006), agus i ngach sampla, thugamar faoi deara crómatin inrochtana timpeall ar a thionscnóir agus feabhsaitheoir Six2 ~50kb in aghaidh an tsrutha ó shuíomh tosaithe trascríobh Six2 (TSS) (O'Brien et al., 2018) (Fíor 4A, B, limistéir gormscáth). Tugaimid faoi deara freisin réigiúin de chromatin inrochtana ar an tionscnóir agus feabhsaitheoir foilsithe don Gdnf próitéine (Fíor 4D, E), atá faoi rún ag progenitors nephron chun brainseach bud ureteric a chur chun cinn (Sanchez et al., 1996; Vega et al., 1996 ). Tá an feabhsaitheoir seo suite ~113kb in aghaidh an tsrutha ón tionscnóir géine agus is eol go bhfreagraíonn sé do chomharthaíocht Wnt i gcomhthéacs sleachta nephron a fhorbairt (Park et al., 2012). Cé nach n-athraíonn tionscnóir Gdnf go suntasach le himeacht ama, méadaíonn an feabhsaitheoir anótáilte go suntasach neamh-inrochtaineacht. Tugaimid faoi deara freisin réigiúin de chromatin inrochtana timpeall ar fheabhsaitheoir foilsithe atá gníomhach i n-easpórtálaithe nephron do Eya1 atá suite ~325kb in aghaidh an tsrutha ó TSS na géine (Park et al., 2012) (Figiúr forlíontach 6). Is fachtóir trascríobh é Eya1 a idirghníomhaíonn le Six2 chun multipotency progenitor nephron a chothabháil (J. Xu et al., 2014).

Breathnaímid ar roinnt DARanna nach bhforluíonn gnéithe rialála aitheanta ach a chuimsíonn réigiúin a bhfuiltear ag tuar go mbeidh gníomhaíocht mhéadaithe acu do ghéinte ar leith i gcineálacha éagsúla cille luiche mar atá anótáilte in EnhancerAtlas 2.0 (Gao & Qian, 2020). I dteannta leis an bhfeabhsaitheoir foilsithe Eya1 (Park et al., 2012)(Fíor Forlíontach 6), cuimsítear le DAR deiridh i gceann d’intron Eya1 (Fíor 5A-B) réigiún a thuartar go mbeidh gníomhaíocht mhéadaithe aige ar an ngéin Eya1 sa luch. Sinsear néarúil agus cealla progenitor granulocyte-monocyte (Gao & Qian, 2020). Ag teacht le laghdú ar ghníomhaíocht feabhsaitheora, thugamar faoi deara roimhe seo go bhfuil laghdú ar léiriú Eya1 i idirdhealú a dhéanamh ar shleachta nephron ag baint úsáide as sonraí E14.5 scRNA-seq (Figiúr Forlíontach 7) (Bais et al., 2020). Tá sé seo comhsheasmhach le sonraí foilsithe ChIP-seq i progenitors nephron bunscoile E16.5 a léiríonn easpa an marc feabhsaithe gníomhach, H3K27ac, agus easpa ceangailteach ó Ctnnb1, Lef1, Six2, agus Tcf7 (Fíor 5) (Guo et al ., 2021). Áiríonn an feabhsaitheoir féideartha seo lorg fachtóir trascríobh do Hoxd10 laistigh dá bhuaic, fachtóir trascríobh atá riachtanach le haghaidh idirdhealú agus comhtháthú sleachta nephron le linn aistrithe mesenchymal-go-epithelial (MET) (Yallowitz et al., 2011).

Déanann DAR a mhéadaíonn neamh-inrochtaineacht ar chrómasóim 24 forluí ar réigiún crómatin le gníomhaíocht feabhsaithe tuartha don fhachtóir trascríobh Pax8 i gcealla saothraithe ó dhuán luiche, epithelia intestinal, agus uterus (Gao & Qian, 2020). Tá cuid de Pax8 iomarcach le Pax2, ach tá gá le ceann amháin ar a laghad den dá fhachtóir trascríobh seo i sleachta nephron le haghaidhduánforbairt (Bouchard et al., 2002; Narlis et al., 2007). Thugamar faoi deara roimhe seo go n-ardaíonn slonn Pax8 ar shleachta néaróin idirdhealaitheacha agus difreáilte (Figiúr Forlíontach 7), agus tugaimid faoi deara méadú suntasach ar inrochtaineacht i DAR a chuimsíonn an ghné rialála seo. Tá baint ag an réigiún seo freisin le marc feabhsaithe gníomhach, H3K27ac, agus ceangailteach Ctnnb1, Lef1, Six2, agus Tcf7 i sonraí foilsithe ChIP-seq ó shleachta nephron bunscoile E16.5 (Fíor 5) (Guo et al., 2021). Breathnaímid ar roinnt lorg fachtóir trascríobh a thagann faoi bhuaic inrochtaineachta an-chaomhnaithe an DAR seo, lena n-áirítear dhá cheann do Sall1, fachtóir núicléach ar eol go bhfuil tionchar aige ar nephrogenesis (Kanda et al., 2014), agus seacht lorg coise dlúthghrúpaithe le haghaidh méar since a bhaineann le MYC. próitéin (Maz), fachtóir trascríobh a bhfuil sé léirithe go bhfuil éifeachtaí dáileog-spleách arduánforbairt i ndaoine agus i lucha (Haller et al., 2018). Tá liosta iomlán i dTábla Forlíontach 3 de na réigiúin inrochtana a aimsímid chomh maith lena staitisticí difreálacha inrochtaineachta faoi seach, nótaí le haghaidh géinte, eiseamláirí, agus tionscnóirí a fhorluíonn siad, agus liostaí de na príomh-lorgairí fachtóir trascríobh nephrogenesis-nasctha a aithníodh.

Fíor 4. Próifílí ATAC-seq ag loci rialála aitheanta agus tuartha.I gcás gach painéal ó bhun go barr, léiríonn gnéithe saibhriú fillteinrochtaineacht chromatini samplaí E14.5 agus P0, le RAI agus DARanna aitheanta mar bhuaicphointí i gorm (IDR nach bhfuil ag athrú) agus glas (ag oscailt DAR). agus dearg (dar ag dúnadh). Léiríonn an ghné seo a leanas nótaí géine, suíomhanna núicléasómacha (liath) agus réigiúin saor ó núicléasóim (dearg) arna dtomhas i samplaí comhthiomsaithe E14.5 agus P0, agus scóir chaomhnaithe PhastCon60 (léiríonn dubh 1{{). 12}}0 faoin gcéad caomhnaithe, bán 0 faoin gcéad caomhnaithe A) Tionscnóir agus comhlacht géine an fachtóir trascríobh Six2. B) Enhancer for Six2foilsithe ag Park et. al. C) Feabhsaitheoir atá inrochtana go difreálach do Gdnf le hinrochtaineacht mhéadaithe ag P0. D) Tionscnóir do Gdnf.

Fíor 5. DARanna ag forluí feabhsaitheoirí núíosacha ionchasacha do ghéinte nasctha le nephrogenesis.A agus C) Léiríonn painéil léarscáil den réigiún 1MB timpeall ar ghéin spéise, le géinte códaithe próitéine i glas agus an t-idirghníomhú feabhsaithe/tionscnóra molta mar lúb dubh. . B agus D) Ó bhun go barr, léiríonn painéil saibhriú fillteinrochtaineacht chromatintomhaiste i samplaí E14.5 agus P0, le IDRanna aibhsithe i glas (oscailt) agus dearg (deiridh), agus ina dhiaidh sin tomhais ChIP-seq sna réigiúin seo tomhaiste ag Guo et. al. i progenitor nephron bunscoilecealla(Guo et al., 2021). Léiríonn an tríú painéal nótaí géine (gorm) agus gnéithe rialála tuartha ó Enhancer Atlas 2.0 (dearg), agus seasann an ceathrú painéal lorg fachtóir trascríobh a aithníodh i sonraí ATAC-seq. Léiríonn an cúigiú painéal nucleosomes (liath) agus NFRs (dearg), agus léiríonn an painéal bun caomhnú. A) Réigiún 1MB ina bhfuil an corp géine do Eya1 agus feabhsaitheoir ionchasach Eya1 thart ar 325kb in aghaidh an tsrutha. B) Réigiún 4.5kb ina bhfuil an feabhsaitheoir ionchasach Eya1. C) Réigiún 1MB ina bhfuil lócas géine Pax8 agus feabhsaitheoir tuartha. D) Réigiún 4.5kb ina bhfuil an feabhsaitheoir tuartha agus a DAR forluiteach.

Cuidíonn fearainn a bhaineann le topolaíoch le caidreamh feabhsaitheora-miRNA féideartha a aithint

Is éard atá i bhfearainn a bhaineann le topolaíoch (TADanna) ná réigiúin megabase-scála d’eagraíocht chromatin ard-ord a eascraíonn as crómatin a phacáistiú isteach sa núicléas i spás tríthoiseach (Dixon et al., 2012), agus is gnách go mbíonn idirghníomhaíochtaí feabhsaitheoirí-tionscnóra teoranta do gnéithe laistigh den TAD céanna (Symmons et al., 2014). Rinneamar comhfhogasú ar TADanna ó shíolraithe nephron ag baint úsáide as nótaí a ghintear ó ghaschealla suthach luch (ESCanna) (Y. Wang et al., 2018). Chun scagadh a dhéanamh le haghaidh réigiúin cis-rialála féideartha miRNA, rinneamar comhghaolú ar athruithe iinrochtaineacht chromatinle miRNA arna shloinneadh go difreálach laistigh den TAD céanna. Tríd is tríd, tá 42,778 réigiún uathúil inrochtana (thart ar 92 faoin gcéad ) suite taobh istigh de TADanna anótáilte, agus astu seo ní fhorluíonn 30,626 (thart ar 72 faoin gcéad ) le tionscnóir aitheanta. Áirítear leis seo 2,103 DAR, le 1,180 agus 923 ag oscailt agus ag dúnadh le himeacht ama, faoi seach. Roinneann cúig DAR déag tosaigh TAD le miRNA amháin nó níos mó le slonn méadaithe idir E14.5 agus P0, agus roinneann naonúr DAR deiridh TAD le miRNA amháin nó níos mó le slonn laghdaithe. Déanann Fíor 6 achoimre ar an gcur chuige seo agus léiríonn sé na faid idir DARanna agus a miRNA comhoiriúnaithe, a théann ó 27 kb go breis agus 1 mb (meán: 447 kb). Sonraíonn Tábla 1 tacair de ghaolmhaireachtaí DAR – miRNA féideartha, agus tá DAR amháin liostaithe in aghaidh an miRNA comhoiriúnaithe.

I measc na bpéirí miRNA-feabhsaithe atá anótáilte, tugaimid faoi deara trí cinn a bhfuil suim ar leith ag baint leo. Ar dtús, sainaithníodh DAR tosaigh 120 kb le sruth ó ligean-7c-5p agus 73 kb le sruth ó miR-125b-5p, a bhaineann le Six2 láithreán ceangailteach i tacar sonraí E16.5 nephron progenitor ChIP-seq (Fíor 7A) (Guo et al., 2021). Lig-7c-5p tá sé ar cheann de na miRNAs ligean-7 is airde-léirithe a bhraithimid, agus is eol go ndéanann an teaghlach lig-7 athscríbhinní Lin28b a athfhorbhrú (Slack & Ruvkun, 1997; Zhu et al., 2011). Tugaimid faoi deara go n-aithnítear Hmga2 agus Meis2 chomh maith mar spriocanna núíosacha ionchasacha don teaghlach ligin i néar-ghlúin (Fíor 2). Taispeánadh freisin go bhfuil miR-125b-5p faoi chois athscríbhinní Lin28 i gcineálacha hematopoietic luch agus cille giniúna (Chaudhuri et al., 2012). Ar an dara dul síos, is é miR{29}}p an comhlánú cúl le miR-9-5p, miRNA a taispeánadh le déanaí chun cosaint a thabhairt arduánfiobróis trí dhíriú ar bhealaí meitibileach (Fierro-Fernández et al., 2020). Braitheadh ​​​​muid laghdú níos mó ná 10-milleadh i miR-9-3príomh-thscríbhinní idir eolairí nephron E14.5 agus P0, agus tá gné rialála ionchasach thart ar 249kb uaidh (Fíor 7B) aitheanta againn. Breathnaímid ar lorga fachtóir trascríobh do Snai1 agus Snai2 sa DAR gaolmhar, a léiríodh go gcuireann siad aistrithe epithelial-go-mesenchymal (EMT) chun cinn (Sundarajan et al., 2019). Ar deireadh, mheaitseálamar miR-181a{-2-3p le lócas cis-rialála intergenic féideartha 131kb in aghaidh an tsrutha ar chrómasóm 2, áit a dtugaimid faoi deara lorg fachtóir trascríobh don fhachtóir trascríobh Wt1, príomh-rialtóir an tsleachta nephron marthanais (Kreidberg et al., 1993), agus Six2 ceangailteach i dtacar sonraí foilsithe E16.5 nephron eolach ChIP-seq (Fíor 7C) ) (Guo et al., 2021).

Tábla 1. athruithe slonn miRNA, meaitseáilte le DAR amháin nó níos mó sa TAD céanna.

Figiúr 6. Feabhsaitheoir iarrthóra a aimsiú --sprioc-miRNA péirí.A) Sreabhchairt ag cur in iúl an chaoi ar tugadh tosaíocht do réigiúin inrochtaineachta maidir le rialáil fhéideartha ar shloinneadh miRNA. B) Suíomhanna géanómacha gach miRNA scagtha i gcoibhneas lena n-iarrthóir feabhsaithe (stripe ingearach oráiste). Taispeántar scála a n-athraithe fillte log2 ar an y-ais, agus aibhsítear miRNA le slonn méadaitheach nó laghdaithe i glas agus dearg, faoi seach.

Fíor 7. Cuirtear béim ar cheithre phéire miRNA a d'fhéadfadh a bheith ina bhfeabhsóirí féideartha. Tá TADanna aibhsithe i liath, ailínithe ag pointí tosaigh, agus tarraingítear iad ar an scála céanna chun méid coibhneasta a léiriú. Taispeántar géinte aitheanta ó Ensembl i corcra, agus léiríonn réigiúin níos dorcha exons. Taispeántar inrochtaineacht choibhneasta ag E14.5 agus P0 mar cheapacha barra os cionn agus faoin líne dhubh chothrománach, faoi seach, chomh maith le i gceapacha inset a léiríonn carnadh sa DAR sonraithe mar aon le sonraí ChIP-seq arna bhfoilsiú ag Guo et . al. (Guo et al., 2021). Tá lorg fachtóir trascríobh arna sainaithint ag HINT liostaithe i meirgí oráiste. Léiríonn ceapacha barra i bpainéil ar leith ar dheis slonn miRNA (glas) agus imeachtaí ionsáite Tn5 normalaithe i réigiúin feabhsaithe molta (oráiste). A) Tá an ligean-7 ball teaghlaigh a lig-7c-5p an-léirithe icealla nephron progenitoragus tá sé meaitseáilte le "buaic_54636" 119kb amach i réigiún idirghineach. B) miR-9-3p déantar é a mheaitseáil le DAR 249kb uaidh. C) miR-181a 2-3p suite 131kb amach ó "buaic_5887," feabhsaitheoir intergenic féideartha.

Plé

Sa staidéar seo, rinneamar iarracht miRNA núíosach a aithint ag an am céanna a chuidíonn le scor nephrogenesis, mar aon le gnéithe cis-rialála féideartha. D’aithníomar 114 miRNA a chuirtear in iúl go difreálach i gcealla giniúna nephron, chomh maith le 2,103 DAR, in E14.5 i gcomparáid le P0duáin. Breathnaímid ar ghnéithe iomadúla a thuar feabhsaitheoirí toimhdiúla núíosacha do na géinte Eya1 agus Pax8 incealla nephron progenitor. Ar deireadh, d'aithin muid comhsheasmhachinrochtaineacht chromatinagus athruithe slonn miRNA do 33 phéire miRNAs agus DAR, lena n-áirítear let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a-2-3p, agus miR-9-3p, agus géinte sprice toimhdiúla i láthair arna shloinneadh i sleachta nephron le haghaidh miRNAs a chuirtear in iúl go difreálach. Le chéile, léiríonn ár gcuid sonraí go léirítear athruithe intreach do shíolraithe nephron agus atá ag brath ar an gcéim nephrogenesis i dtimpeallacht chromatin na cille progenitor agus ina tras-scríbhinn miRNA.

I measc na n-athruithe a bhreathnaímid ar an tras-scríbhinn miRNA progenitor nephron, tugaimid faoi deara méaduithe leathana ar an slonn ar fud an teaghlaigh lig{{{{{{{2014} mar ghineadóirí aois. Tá sé seo ag teacht le tuairiscí roimhe seo: tá próitéin Lin28b agus an teaghlach ligin de miRNAs freasúil dá chéile agus cruthaíonn siad lasc dioscúrsa a rialaíonn slonn ligean-7 i mamaigh (Zhu et al., 2011), agus i progenitors nephron, cuireann an t-athrú i dtreo slonn méadaithe ligean-7 isteach go díreach ar uainiú scoir nephrogenesis (Yermalovich et al., 2019). Breathnaímid freisin ar léiriú méadaithe miR-125b-5p, arb eol dó freisin léiriú Lin28b a athbhrú i gcomhthéacsanna ceallacha eile (Chaudhuri et al., 2012; Potenza et al., 2017). Tá an teaghlach let-7 agus miR-125b-5p i measc 114 miRNA a chuirtear in iúl go difreálach idir E14.5 agus P0 i sleachta néaróin, rud a thugann le tuiscint ról miRNAs i bhforbairt an tsleachta néaróin níl sé teoranta do ligean-7/Lin28b. Mar shampla, cuimsíonn miRNAs a laghdaíonn slonn dhá bhall den teaghlach miR-200, a tuairiscíodh go bhfuil ról acu i idirdhealú podocyte (Z. Li et al., 2016):miR-200b -3p agus miR-429-3p. Anuas air sin, tugaimid faoi deara laghdú ar an slonn miR-126a 5p, arb eol go gcuireann sé vasculogenesis chun cinn (Schober et al., 2014; S. Wang et al., 2008). D’fhéadfadh sé seo léiriú a thabhairt ar an ngnáth-líneacht mesenchymal de shliocht vasculogenic agus nephron, agus tiomantas fo-thacar de na cealla seo a bheith ina n-easpórtálaithe néaróin.

Léiríonn anailísí cosáin ar spriocanna géine tuartha maidir le miRNAs a athrú ag baint úsáide as DIANA miRPath (Vlachos et al., 2015) saibhriú MAPK agus comharthaíocht TGF, an dá phríomh-rialtóir sleachta nephron (Hilliard et al., 2019; Ihermann-Hella et al., 2018 ). Tá róionadaíocht á déanamh ar roinnt bealaí KEGG eile freisin i measc na spriocanna géine réamh-mheasta de miRNAs uas-rialaithe, lena n-áirítear cosáin a bhaineann leis an maitrís eischeallach, cíteascóp actin, agus greamaitheacht fócasach: gach gné ríthábhachtach den imirce cheallacha, difreáil, brainseach, ceangaltán, polarú, agus iomadú. (Rozario & Desimone, 2010). Dírítear ar ghéinte a bhaineann le ECM ar chuid de na miRNAs is mó léirithe agus is suntasaí a bhraithimid, lena n-áirítear an tras-scríbhinn is airde sainráite a bhraithimid: miR-196a-5p. Is eol go ndíríonn miR-196a{-p) Col1a1, Col1a2, agus Col3a1—géinte atá uas-rialaithe i Pax2-sleachta nephron easnamhacha a ndéantar trasdhifreáil isteach sa stroma duánach (Naiman et al., 2017). Mar sin, d’fhéadfadh go mbeadh ról ag miR méadaithe agus ag brúchtadh chun teorainneacha línse a neartú de réir mar a théann an ginear in aois. Ina theannta sin, sainaithnímid sprioc-idirghníomhaíochtaí miRNA-mRNA ionchasacha nua a d'fhéadfadh cur le scor an nephrogenesis, lena n-áirítear uas-rialáil an teaghlaigh let-7 a d'fhéadfadh díriú ar Hmga2 agus Meis2 (a bhaineann le iomadú cille) (Abruzzese et al). ., 2019; Fusco & Fedele, 2007; Lam et al., 2014; Mugford et al., 2009) mar nephron progenitors aois. Níl aon ról aitheanta ag Hmga2 iduánForbairt. Mar sin féin, meastar go bhfuil forluí feidhme ag Meis2 leis an bhfachtóir trascríobh gaolmhar Meis1, arb eol go bhfuil gá leis d’fhorbairt na nduán (Hisa et al., 2004). Breathnaímid freisin ar íos-rialáil miRs (miR-34b-5p, miR-983p, agus miR-200a-3p)) ar féidir díriú orthu Jag1, arb eol go bhfuil sé uasrialaithe agus tábhachtach maidir le difreáil nephron (Chung et al., 2016).

In éineacht leis an tras-scríbhinn miRNA athraitheach, rinneamar athruithe ar thimpeallacht chromatin na cille ginearaí nephron idir E14.5 agus P0 a thomhas ag an am céanna. Déanaimid cur síos ar dhá fheabhsaitheoir núíosacha tuartha do Eya1 agus Pax8, bunaithe ar (i) a ngaireacht do na tionscnóirí géine seo, (ii) a n-athruithe faoi seach iinrochtaineacht chromatinle linn na forbartha a bheith ag teacht le hathruithe ar léiriú géine pseudotime le linn difreála, (iii) lorg coise deduánfachtóirí trascríobh forbartha, (iv) caomhnú seichimh, (v) fianaise ar fheidhm mhéadaithe i bhfíocháin eile / cineálacha cille ó Enhancer Atlas2.0 (Gao & Qian, 2020), agus (vi) sonraí ChIP-seq in E16 .5 progenitors nephron le haghaidh marc méadaitheoirí gníomhacha (H3K27ac) agus fachtóir trascríobh ceangailteach de Ctnnb1, Lef1, Six2, agus Tcf7. Breathnaímid ar laghdú ar inrochtaineacht chromatin don fheabhsaitheoir Eya1, atá ag teacht le ról Eya1 chun ilchumhachta giniúna nephron a chur chun cinn agus le tuairiscí go n-eascraíonn caillteanas Eya1 go luath eipidelialú an daonra progenitor (J. Xu et al., 2014; PX Xu et al., 1999). Cuireann Pax8 agus a homalog Pax2 le sonraíocht lineage na n-easpórtálaithe nephron (Bouchard et al., 2002), agus ní dhéanfar MET ar shleachta néaróin nach bhfuil ceann amháin de na géinte sin acu ar a laghad (Narlis et al., 2007). Tá an inrochtaineacht mhéadaithe chromatin a bhraithimid don fheabhsaitheoir toimhdiúil Pax8 comhsheasmhach le slonn méadaithe Pax8 san epithelia duánach de réir mar a dhifreálann nephrons.

Nocht anailís saibhrithe (McLean et al., 2010) ar DARanna "Rialachán na Difreála Epithelial" mar an téarma is suntasaí i measc réigiúin oscailt chromatin, rud a thugann le fios go bhféadfadh gnéithe rialála a bheith sna DARanna a bhraithimid ag tiomáint nó ag freagairt do chomharthaí le haghaidh difreála agus forbairt nacealla nephron progenitori gcineálacha cille epithelial. Tá comharthaíocht notch i measc na dtéarmaí GO saibhrithe is suntasaí a aithníodh i measc na DARanna oscailte, agus i n-easpórtálaithe nephron, is eol go ndéanann an cosán seo slonn Six2 a chosc agus difreáil cille ginearaí nephron a chur chun cinn (Chung et al., 2016). I measc ghéinte intuigthe an chosáin seo tá Jag1, ligand lárnach i gcomharthaíocht Notch a bhfuil sé tuairiscithe go bhfuil comhghaolú contrártha ag a léiriú le slonn Six2 agus Hes1 (Chung et al., 2016). Tugaimid faoi deara gur sprioc anótáilte é Jag1 do thrí miRNA le slonn méadaitheach (miR34b-5p, miR98-3p, agus miR200a-3p, Fíor 2). Ar deireadh, tugaimid faoi deara saibhriú do ghéinte a bhaineann le hathmhúnlú soithigh fola agus morphogenesis in oscailt DARanna, cé gur dealraitheach gur iarmhairt é seo ar ghéinte a roinntear idir na cosáin forbartha seo agus idirdhealú cille epithelial, lena n-áirítear Jag1, Eya1, Hes1, Foxc1, agus Hey2.

Athruithe iinrochtaineacht chromatini measccealla nephron progenitora thomhas i staidéir roimhe seo (Guo et al., 2021; Hilliard et al., 2019).

Ar an iomlán, tá ár dtorthaí comhsheasmhach leis na staidéir roimhe seo, ag cur béime ar ghéinte a bhaineann le Notchsignaling agus Pax. Go háirithe, áfach, tá roinnt difríochtaí turgnamhacha sna staidéir roimhe seo i gcomparáid leis an tuarascáil seo. D’fhéadfadh sé go gcuirfeadh an cinneadh go bhfuil laghdú tuairiscithe thart ar 45 faoin gcéad ar líon na nephron san ailléil seo ag baint úsáide as cill fhluaraiseachta-ghníomhachtaithe ón luch tuairisceora tras-ghéine Six2-TGC (Hilliard et al. , 2019; Volovelsky et al., 2018). Ina theannta sin, léiríodh go bhfuil tras-scríbhinní ar leith ag eiseamláirí nephron saothraithe (fásta le dáileog íseal nó dáileog ard CHIR) ó shíolraithe néaróin phríomhúla, rud a thugann le tuiscint go mbeadh a n-inrochtaineacht chromatin difriúil freisin (Guo et al., 2021; Hilliard et al., 2019). Ós rud é gurb é sprioc ár staidéar ná tuiscint a fháil ar an gcaoi a mbíonn tionchar ag athruithe ar an tírdhreach crómatin ar léiriú miRNA go luath i gcoinne sleachta nephron déanach, bhí gá le hanailís ar ghineadóirí néaróin bunscoile.

Tá Cistanche níos fearr do na duáin

Trí na hathruithe breathnaithe seo sa timpeallacht chromatin a chomhcheangal le hathruithe comhoiriúnaithe i slonn miRNA, déanaimid ceangal ar roinnt péirí núíosacha feabhsaithe miRNA toimhdeacha maidir le scor nephrogenesis le haghaidh tuilleadh staidéir. Feiceann na miRNAs miR-125a-5p agus lig-7c-5p, mar shampla, méadú suntasach ar slonn idir E14.5 agus P0 , agus tá sé seo á léiriú arís ag an dorochtaineacht mhéadaitheach atá ar DAR (chr16:77,719,058 77,720,407) sa TAD céanna. Tá baint ag an DAR seo freisin le suíomh ceangailteach Six2 (Guo et al., 2021), agus d’fhéadfadh sé go n-ainmneodh sé feabhsaitheoir a chuireann isteach ar slonn miR-125a-5p agus/nó lig{{18}). }c-5p, rud a d'fhéadfadh difreáil a chur chun cinn trí Lin28b a chur faoi chois. Mar an gcéanna, tugaimid faoi deara feabhsaitheoir féideartha le haghaidh miR 181a, arb eol dó léiriú renin a mhodhnú i ndaoine (Marques et al., 2015) agus a measadh mar sprioc theiripeach chun nephrotocsaineacht a laghdú mar gheall ar a chumas BIRC6 agus apoptosis a athbhrú (Liu et al. al., 2018). Ar deireadh, tugaimid faoi deara DAR deiridh a bhaineann le miR-9-3p a bhfuil lorg fachtóir trascríobh ann do na próitéiní Wnt a fhreagraíonn do chomharthaíocht Snai1 agus Snai2.miR{-9-3p, miR-9-5p, is eol a chosaint óduánfiobróis (Fierro-Fernández et al., 2020), Snai1 agus Snai2 léiríodh go gcuireann siad meatastasis carcinoma chun cinn i gcealla ailse craiceann luiche (Olmeda et al., 2008) agus chun aistrithe epithelial-go-mesenchymal (EMT) a chur chun cinn in othair ailse. (Sundararajan et al., 2019), agus is eol go gcuireann miR-9 angiogenesis chun cinn agus imirce cealla endothelial meall (Zhuang et al., 2012). D’fhéadfadh meicníocht a bheith ann ina n-eascróidh méadú ar chomharthaíocht Wnt le slonn laghdaithe Snai1 agus Snai2, rud a laghdaíonn slonn miR-9-3p chun tacú le difreáil ginearaí nephron.

Aithníodh go cuimsitheach inár staidéar athruithe sa tírdhreach chromatin agus tras-scríbhinn miRNA de shliocht nephron le linn forbairt suthach, agus tá réigiúin cis-rialála agus miRNA is iarrthóirí aitheanta againn a bhféadfadh ról a bheith acu i scor nephrogenesis. Soláthraíonn anailísí saibhrithe do shonraí mRNA-seq agus ATAC-seq araon leideanna mealltacha maidir leis na meicníochtaí a d'fhéadfadh a bheith i gceist, mar bhealaí a rialaíonn difreáil giniúna nephron, lena n-áirítear mar Notch agus TGF- . Tuairiscímid freisin dhá ghné rialála toimhdiúla nua do Eya1 agus Pax8, géinte ar eol go bhfuil tábhacht leoduánforbairt, agus seichimh rialála ionchasacha le haghaidh eochair-miRNA atá bainteach le scor nephrogenesis.

Modhanna

Amhrán luch

Fuarthas CD Wildtype-1 baineannaigh atá ag iompar clainne le hamphlé ó Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, SAM, RRID: MGI:5659424) agusduáina bailíodh ó bhruscair ag lá suthach E14.5 nó P0. Cuireadh na hainmhithe ar fad sa vivarium ag Ionad Taighde Rangos ag Ospidéal na Leanaí UPMC in Pittsburgh (Pittsburgh, PA, SAM) agus rinneadh gach turgnamh ar ainmhithe de réir bheartais an Choiste Institiúideach um Chúram agus Úsáid Ainmhithe ag Ollscoil na hÉireann. Pittsburgh. Sainaithníodh an gnéas do gach suth nó laonna trí PCR a dhéanamh ar DNA géanómaíochta scoite amach ó ghearrthóga eireabaill ag baint úsáide as na primers seo a leanas don ghéin Y-crómasóim Sry: SryF 5ʹ-GATGATTTGAGTGGAAATGTGAGGTA-3ʹ agus SryR 5ʹ-CTTATGTTTATAGGGCATGTAGTA{6} foilsithe roimhe seo (McFarlane et al., 2013).

Seicheamhú agus anailís RNA beag

RNA iomlán scoite ó nacealla nephron progenitora bhí fágtha tar éis an codán cille ATAC-seq a bhaint a cuireadh faoi bhráid Chroílár Seicheamhaithe na nEolaíochtaí Sláinte ag Ospidéal na Leanaí UPMC in Pittsburgh le haghaidh ullmhú leabharlainne ag baint úsáide as trealamh ullmhúcháin leabharlainne QIAseq miRNA (Qiagen 3315{{1{0}}2). Rinneadh seicheamhú aon-deireadh de leabharlanna mRNA-seq ar Illumina NextSeq500, agus cuireadh leabharlanna in ord doimhneacht de thart ar 50 milliún léamh singil in aghaidh na leabharlainne. Rinneadh léamha seicheamhaithe a ailíniú ansin le genome mm10 na luiche ag baint úsáide as an bpacáiste Rsubread (Liao et al., 2019) (leagan 2.0.1), agus anótáilte le miRNA aitheanta atá liostaithe i miRBase (leagan 22) (Kozomara & Griffiths-Jones, 2014) le feidhm featureCounts an phacáiste Rsubread. Tomhaiseadh léiriú difreálach ar miRNA aitheanta ag baint úsáide as an bpacáiste DESeq2 R (leagan 1.26.0) (Love et al., 2014). Áiríodh an codán de léann ailínithe atá anótáilte do miRNA aitheanta chomh maith leis an codán de shuthanna baineanna in aghaidh an tsampla mar chomhfhachtóirí sa tsamhail tástála a cuireadh faoi bhráid DESeq2. Aithníodh miRNA a léiríodh go difreálach ansin agus an ráta fionnachtana bréagach á rialú ag 5 faoin gcéad , agus socraíodh treo an athraithe (méadú vs. ag laghdú) bunaithe ar a luach athraithe fillte ("méadú" a léiríonn léiriú níos airde ag P0 i gcomparáid le E14.5). . Ríomhadh saibhriú conairí rialála i measc spriocanna géine réamh-mheasta miRNA le slonn méadaithe agus laghdaithe go suntasach ag baint úsáide as uirlisí DIANA miRPath leagan 3.0 (Vlachos et al., 2015). Aisghabhadh tras-scríbhinní sprice tuartha do miRNA ó stórtha TargetScan (Agarwal et al., 2015) agus miRDB (Y. Chen & Wang, 2020).

Leithlisiú progenitor Nephron

Duáindeighilte ó bhruscair de {{0}} suthanna E14.5 nó laonna P0, agus measadh gur sampla amháin iad gach bruscar. Baineadh úsáid as duán amháin in aghaidh an tsampla le haghaidh leithlisiú iomlán RNA le húsáid mar "rialú duáin iomlán" in anailísí ina dhiaidh sin (féach thíos). Bailíodh trí shampla san iomlán ag gach pointe ama. Ansin leithlisíodh cealla cortical ó gach sampla ag baint úsáide as sórtáil cille maighnéadach-ghníomhach (MACS) mar a foilsíodh roimhe seo (Brown et al., 2011). Go hachomair, rinneadh díleá páirteach ar na duáin le collagenase 2mM A (Roche 11088793001) agus pancreatin 3.5mM (Sigma P1625) i saline maolánach fosfáit (PBS) ar feadh 15 nóiméad ag 37 céim. Cuireadh stop leis an imoibriú díleá trí úsáid a bhaint as séiream bó féatais fuar 100 faoin gcéad (FBS), agus bailíodh an fionraí cille agus athchuireadh é i saline maolánach fosfáite (DPBS) fuar Dulbecco le inhibitor 1mM phenylmethylsulfonyl fluairíd (PMSF) protease (Sigma-Aldrich 108370910). Rinneadh na cealla a ní agus a chur ar fionraí i maolán leithlisithe fuar-oighear comhdhéanta de 2 faoin gcéad FBS i PBS, ansin gortha le coirníní maighnéadacha (trealamh Flexi FlowComp Dynabeads, ThermoFisher 11061D) biotinylated chuig antasubstaintí le haghaidh Integrin alpha 8 (Itg 8, R&0 Systems) ag baint úsáide as Fearas Lipéadaithe Próitéin DSB-X Biotin (ThermoFisher D-20655). Aonraíodh ginteoirí Nephron a bhí ceangailte leis na coirníní seo mar a foilsíodh roimhe seo (Hemker et al., 2020) agus comhthiomsaíodh iad trasna na nduán do gach sampla. Próiseáladh slánchuid de 50,000 cealla ginearaí nephron láithreach tríd aninrochtaineacht chromatinprótacal ullmhúcháin leabharlainne (féach thíos), agus baineadh RNA iomlán as an bhfionraí cille a bhí fágtha ag baint úsáide as an Qiagen miRNeasy Mini Kit (Qiagen 217004).

Chun saibhriú a dhearbhúcealla nephron progenitori gcomparáid le cineálacha cealla eile, scoiteadh RNA iomlán ó shíolraithe nephron agus ón iomlánduáin(rialú duáin iomlán, féach thuas), agus rinneadh PCR droim ar ais cainníochtúil (qRT-PCR) do na marcóirí seo a leanas: marcóirí progenitor nephron Six2 agus Cited1 (L. Huang et al., 2016), agus le haghaidh Lhx1, Pdgfr, Pecan, agus Caleb a mharcálann vesicle duánach (Brunskill et al., 2014), stroma duánach (S. Chen et al., 2015), endothelial (Kobayashi et al., 2008), agus bachlóg ureteric (Cebrian et al., 2014aa (c) cealla, faoi seach; féach freisin figiúr Forlíontach 1. Baineadh úsáid as Gapdh (Barber et al., 2005) mar ghéin choimeádta agus ríomhadh cainníochtú coibhneasta tríd an modh 2-ΔΔCt (Livak & Schmittgen, 2001). Áirítear i dTábla 2 na bunuimhreacha do na tras-scríbhinní seo.

Tábla 2. primers RT-PCR.

Inrochtaineacht chromatinullmhú leabharlainne

Timpeall 50,000cealla nephron progenitorBaineadh úsáid as chun gach leabharlann seicheamhaithe a ghiniúint do ATAC-seq ag baint úsáide as Kit Prep Leabharlann Nextera DNA Flex (Illumina FC-121-1030) le modhnuithe de réir modha a foilsíodh roimhe seo (Buenrostro et al., 2013). Go hachomair, cuireadh cealla ar fionraí i maolán lysis neamh-ianach fuar oighir comhdhéanta de 10mM Tris, 10mM NaCl, 3mM MgCl2, inhibitor protease 1mM PMSF, agus 0.05 faoin gcéad Triton X-100 de réir toirte ar feadh 10 nóiméad chun an chill lyse seicní agus iad ag fágáil seicní núicléacha slán. Athchóiríodh núicléis progenitor nephron slán i maolán trasuímh ina raibh an einsím trasposáis agus goraíodh iad ag 37 céim ar feadh 30 nóiméad. Glanadh DNA géanóm saor in aisce a scaoiltear tríd an bpróiseas trasuímh trí úsáid a bhaint as trealamh íonúcháin MinElute PCR (Qiagen 28004) agus ansin é a innéacsú ag baint úsáide as primers innéacs ar aghaidh (i7) agus droim ar ais (i5) ón Nextera Index Kit (Illumina FC-121-1011). Baineadh amach ligation innéacs agus aimpliú blúirí trí úsáid a bhaint as clár rothaíochta teirmeach aimplithe PCR an mhodha.

Chun an líon is fearr de thimthriallta aimpliúcháin a theastaíonn don leabharlann ATAC-seq a chinneadh, rinneadh taobh-imoibriú qPCR ag baint úsáide as SsoAdvanced SYBR Supermix (BioRad 1725274) agus 96-Timthriall Teirmeach tobar C100 (Bith-Rad) chun an normalaithe a ríomh luach tuairisceora (Rn) do gach timthriall. Aithníodh an uimhir thimthriallta ag ar shroich an t-imoibriú aon trian dá uasfhluaraiseacht mar an líon optamach de thimthriallta aimpliúcháin a bhí fágtha, agus cuireadh an méid eile den imoibriú trasuímh innéacsaithe ATAC-seq faoi réir an líon sin timthriallta breise san aimpliú deiridh. clár. Rinneadh leabharlanna deiridh a íonú trí úsáid a bhaint as coirníní maighnéadacha Ampure XP (Beckman Coulter A63881).

Inrochtaineacht chromatinseicheamh

Rinne Croílár Seicheamhú na nEolaíochtaí Sláinte in Ospidéal na Leanaí UPMC in Pittsburgh seicheamhú péireáilte ar leabharlann ATAC-seq ar Illumina NextSeq500 ag an gCroílár Seicheamhú Eolaíochtaí Sláinte ag Ospidéal na Leanaí UPMC in Pittsburgh, ilphléacsáilte le comhchruinnithe leabharlainne a mheastar a thabharfaidh 90 milliún léamh péireáilte in aghaidh an tsampla. . Rinneadh bearradh cáilíochta le léamh trí úsáid a bhaint as TrimGalore (BabrahamLab, 2014) (leagan 0.4.3) sa mhód "--péireáilte" agus le socruithe réamhshocraithe eile. Rinneadh léamha a ailíniú leis an ngéanóm mm10 (Church et al., 2011) ag baint úsáide as Bowtie2 (Langmead et al., 2009) (leagan 2.3.1) leis na socruithe "--local -q -X 2000 -- m". Marcáladh léamha mar thoradh ar dhúblaigh PCR den blúire DNA céanna trí úsáid a bhaint as feidhm MarkDuplicates Picard Tools (Broad Institute, 2016) (leagan 2.10.9) le socruithe réamhshocraithe. Sannadh léamha a rinne mapáil débhríoch ar níos mó ná suíomh amháin sa genome go randamach do cheann de na suíomhanna seo dá mbeadh níos lú ná ceithre fhéidearthacht ann, agus cuireadh deireadh leo ar shlí eile (ENCODE, nd) (ag baint úsáide as script Python atá ar fáil ag https://github. com/kundajelab/atac_dnase_píblínte, (Lee, 2017) leis na socruithe "--paired-end -k"). Baineadh úsáid as Samtools (H. Li et al., 2009) (leagan 1.3.1) chun léamha dúblacha, neamhphóipeála, dílleachta agus miteachondrial a scagadh, chomh maith le comhaid BAM a shórtáil agus a innéacsú. Lean rialú cáilíochta ar shonraí ATAC-seq le treoirlínte ATAC-seq an tionscadail ENCODE (ENCODE, ú), agus rinneadh sampláil randamach ar leabharlanna samplacha go dtí go raibh 31 milliún léamh péireáilte i ngach ceann acu d’fhonn normalú do dhifríochtaí i méideanna leabharlainne.

Is féidir le Cistanche ionfhabhtú duáin a chosc

Réigiúin chromatin inrochtana a aithint

Tiontaíodh comhaid BAM ina raibh léite ATAC-seq scagtha go formáid BED ceann péireáilte ag úsáid Bedtools' (Quinlan & Hall, 201{{20}}) (leagan 2.26.0) 'buama ' feidhm le socruithe "- leaba pe -mate1". Sainaithníodh réigiúin de chromatin inrochtana ag baint úsáide as an uirlis Anailíse Bunaithe ar Mhúnla ar an uirlis ChIP-seq (MACS2, leagan 2.1.1.20160309) algartam leathan buaicghlao (Zhang et al., 2008), le socruithe "--formáid BEDPE {{ 18}}g mm -p 0.01 --leathan --shift 37 --méid an téacs 75 --coimeád ar fad --samhla". Chun réigiúin ard-mhuiníne inrochtana a shainaithint, rinneadh comparáidí péire-ciallmhar (de gach teaglaim macasamhla ó phointe ama ar leith) agus ríomhadh an ráta fionnachtana neamh-in-atáirgthe (IDR) (Q. Li et al., 2011) ag baint úsáide as ráta atá ar fáil go poiblí. Cur i bhfeidhm Python (GitHub https://github.com/nboley/idr) (Boleu et al., 2015) le socruithe “--input-file-type broad peak --rank p.value {{ 35}}bog-IDR-tairseach 0.1 --leaba de chineál comhaid aschuir". Go sonrach, le haghaidh gach pointe ama cuireadh comhad LAE comh-chomhtháite de gach réigiún inrochtana isteach tríd an argóint "--buaicliosta" do gach comparáid (mar shampla, nuair a dhéantar comparáid idir dhá shampla E14.5, buaic leathana E14.5 ar fad úsáidtear idir na trí mhacasamhail). Rinneadh réigiúin inrochtaineachta a bhí comhsheasmhach le IDR in ar a laghad dhá chomparáid mhacasamhail péire (le forluí 20 faoin gcéad ar a laghad) a chomhcheangal i sraith aontaithe de réigiúin inrochtana ardmhuiníne ("réigiúin IDR").

Athruithe i réigiúin chromatin inrochtana

Rinneadh inrochtaineacht gach réigiún IDR laistigh de shampla ar leith a chainníochtú trí líon na dteagmhas trasuímh a tharlaíonn agus normalú á dhéanamh do sheicheamh GC-ábhar trasna samplaí a chomhaireamh. Baineadh é seo amach trí úsáid a bhaint as script shaincheaptha (ar fáil ag an stór bogearraí a théann leis, féach na sonraí forlíontacha). Socraíodh athruithe ar an inrochtaineacht seo ansin trí na luachanna seo a chur i gcomparáid thar phointí ama trí úsáid a bhaint as pacáiste bogearraí Limma-voom (leagan 3.42.2) (Ritchie et al., 2006). Chun gnéas suth a chur san áireamh, áiríodh an codán de shuthanna baineanna i ngach sampla mar chomhfhachtóir i múnlaí líneacha a úsáideadh le haghaidh anailíse inrochtaineachta difreálach, agus baineadh é mar éifeacht bhaisc in léirshamhlú ag baint úsáide as feidhm éifeacht baisce bhaint phacáiste Limma. Measadh go raibh réigiúin inrochtaine difreálach de chromatin (DARs) ag oscailt go suntasach (inrochtaineacht mhéadaithe idir E14.5 agus P0) nó ag dúnadh (laghdú inrochtaineachta idir E14.5 agus P0) agus an ráta fionnachtana bréagach á rialú ag 10 faoin gcéad. . Socraíodh anailísí saibhrithe feidhme ar réigiúin ghéanómacha oscailte agus dhúnta trí chomhordanáidí faoi seach a chur isteach chuig Uirlis Saibhrithe Anótálacha na Réigiún Géanómacha (GREAT, ar fáil ag http://great.stanford.edu/public/html/) (McLean et al., 2010 ). Aisghabhadh nótaí ar fheabhsaitheoirí aitheanta agus tuartha ó stórtha FANTOM5 (Andersson et al., 2014), VISTA (Visel et al., 2007), agus EnhancerAtlas 2.0 (Gao & Qian, 2020).

lorg fachtóir trascríobh

Aithníodh lorga fachtóir trascríobh trí na comhaid BAM go léir a chomhthiomsú ón bpointe ama céanna, agus ansin rith na bogearraí Aitheantais TF Footprints (HINT) atá bunaithe ar Hmm (leagan 0.12.3) an Bosca Uirlisí Géanóm Rialála (leagan 0.12.3), go sonrach an tsamhail lorg coise do ATAC -seq data (ar fáil ag www.regulatory-genomics.org ) ( Z. Li et al., 2018). Ritheadh ​​an bogearra seo le socruithe "lorg an leid dheis --orgánach=mm10 --ag-seq --deireadh péireáilte". Ansin rinneadh na lorganna a anótáil le móitífeanna a aithníodh ina gceangal luiche ó bhunachar sonraí HOCOMOCO 11 (Kulakovskiy et al., 2018) ag baint úsáide as feidhm meaitseála móitíf HINT leis na socruithe "ceart-mhóitíf anailís a mheaitseálann --orgánach=mm10". Níor cuireadh lorga le scóir HINT faoi bhun 10 as an áireamh. Ar deireadh, tomhaiseadh pátrúin ghníomhaíochta difreálacha i measc lorga móitífeanna ag baint úsáide as feidhm dhifreálach an chláir RGT-HINT, le socruithe "difreálach leid dheis --orgánach=mm10 --bc {{27} }NC 12 --phróifíl aschuir". Aithníodh leibhéil ghníomhaíochta atá ag athrú go suntasach bunaithe ar scoite p-luach 0.05 (modh Friedman-Nemeny).

Is féidir le Cistanche feabhas a chur ar fheidhm na duáin

Cumraíocht núicléach

Comhthiomsaíodh léamha ailínithe ón bpointe ama céanna i gcomhad BAM amháin, agus úsáideadh an pacáiste NucleoATAC (leagan 0.3.4) chun patrúin i faid léitheoireachta a aithint a thugann le tuiscint do ruaimeanna núicléasómacha faoi cheangal agus de réigiúin saor ó núicléasóim ( NFRanna) (Schep et al., 2015). Feidhmíodh an bogearra seo trí úsáid a bhaint as socruithe réamhshocraithe. Rinneadh nótaí ar núicléasóim mar go raibh an réigiún 146bp dírithe timpeall ar gach lí núicléasóim ar a dtugtar.

Slonn RNA aonchealla

Próiseáladh sonraí slonn géine aonchealla le haghaidh lámhscríbhinne roimhe seo (BioRxiv https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.09.16.300293v1) (Bais et al., 2020), agus fuarthas é ón Gene Expression Omnibus (GEOID GSE158166). I measc na sonraí próiseáilte a ionchorpraítear i bhFíor Forlíontach 7 tá cineálacha cille, leibhéil slonn géine, leabaithe ísealtoiseacha (tSNE), agus nótaí pseudotime i gcoibhneas leis an trajectory a bunaíodh idir braislí de shleachta néaróin iomadaithe agus idirdhealaitheacha. Rinneadh rochtain ar shonraí agus eagraíodh iad trí úsáid a bhaint as an bpacáiste SingleCellExperiment R (Lun & Risso, 2019).

idirghníomhaíochtaí miRNA-mRNA in aosú agus difreáil cille progenitor nephron

Géinte le slonn athraitheach idir féin-athnuachan, primed, agus idirdhealúcealla nephron progenitorFuarthas ó tháblaí Forlíontacha 3 agus 4 arna bhfoilsiú ag Bais et al.. (FDR< 0.1="" for="" all="" genes,="" 99="" genes="" total).="" mirtarbase="" v8.0="" for="" the="" mouse="" was="" downloaded="" (https://mirtarbase.cuhk.edu.cn/~mirtarbase/mirtarbase_2022/cache/download/8.0/mmu_mt="" i.xls)="" while="" mirdb="" version="" 6.0="" predictions="" were="" obtained="" from="" the="" mid="" b="" website="" (y.="" chen="" &="" wang,="" 2020);="" high-quality="" mirna-to-target-gene="" predicted="" interactions="" with="" a="" minimum="" score="" of="" 90="" were="" considered.="" annotated="" mir="" target="" genes="" and="" differentially="" expressed="" genes="" were="" then="" intersected="" using="" the="" r="" programming="" environment="" to="" generate="" figure="" 2="" and="" supplemental="" table="">

Seicheamh imdhíon-réamhshamhlú chromatin i sleachta nephron bunscoile

Aisghabhadh sonraí seicheamhú imdhíon-réamhshamhlú chromatin (ChIP-seq) le haghaidh -catenin, Lef1, Six2, agus Tcf7 ceangailteach i sleachta príomhúla nephron ó chomhaid BedGraph laistigh de stór GEO (GSE131119) le haghaidh Guo et al., 2021. Ba iad meánluachanna comhartha saibhrithe fillte ná meánluachanna comhartha saibhrithe fillte trasna samplaí macasamhlaithe.

Scagadh le haghaidh eilimintí rialála a dhéanann difear do léiriú miRNA

Chun scagadh a dhéanamh le haghaidh feabhsaitheoirí miRNA a d’fhéadfadh a bheith ann, rinneamar anótáil ar miRNA agus DARanna leis na fearainn a bhaineann le topologically (TADs) ina bhfuil siad suite bunaithe ar nótaí mm10 ó ghaschealla suthacha luiche, arna n-íoslódáil ón mBrabhsálaí Géanóim 3D (ar fáil ag http://3dgenome .fsm.northwestern.edu/) (Y. Wang et al., 2018). Réigiúin deinrochtaineacht chromatinagus measadh go raibh miRNA mar iarrthóirí feabhsaithe-miRNA péirí má bhí áitiú siad an TAD céanna agus léirigh athruithe comhsheasmhacha in inrochtaineacht agus slonn (inrochtaineacht a mhéadú le slonn miRNA méadaithe agus vice versa). Níor breithníodh DARanna mar “gnéithe rialála” féideartha ach amháin mura raibh forluí acu ar thionscnóir aitheanta nó ar chríoch exon. Tugadh tús áite do phéirí féideartha miRNA agus eilimintí rialála tuartha má thit siad 1) laistigh den TAD céanna agus 2) athruithe suntasacha idir E14.5 agus P0 (méadú ar léiriú miRNA agus inrochtaineacht réigiún IDR a mhéadú, agus vice versa) .

Buíochas

Chuir Shelby Hemker agus Abha Bais le dearadh turgnamhach. Rinne Croílár Seicheamhaithe na nEolaíochtaí Sláinte ag Ospidéal Leanaí UPMC in Pittsburgh seicheamhú do ATAC-seq agus mRNA-seq.

Leasanna iomaíocha

Níor dearbhaíodh aon leasanna iomaíocha

Maoiniú

Thacaigh AC le deontais ón Institiúid Náisiúnta um Diaibéiteas agus Díleácha agusDuánGalair faoin Institiúid Náisiúnta Sláinte (T32DK061296-17). Fuair ​​DK tacaíocht ó dheontais ón Institiúid Náisiúnta um Eolaíochtaí Míochaine Ginearálta faoin Institiúid Náisiúnta Sláinte (R01GM115836). Thacaigh JH le deontais ón Institiúid Náisiúnta um Dhiaibéiteas agus um Ghalair Dhíleácha agus Dhuánáin faoin Institiúid Náisiúnta Sláinte (R01DK103776 agus 125015). Thacaigh DMC le Dámhachtain Forbartha Gairme Líonra Staidéir Nephrotic Siondróm (NEPTUNE) agus Comhaltacht Iardhochtúireachta Chomhairle Chomhairleach Taighde Ospidéal na Leanaí Pittsburgh. Thacaigh YP le deontais ó Ospidéal Leanaí UPMC in Pittsburgh agus ó Chuibhreannas Galar Mitochondrial Mheiriceá Thuaidh.

Infhaighteacht sonraí

Aisghabhadh feabhsaitheoirí luiche tuartha ó FANTOM5 (DOI: 10.1038/nature12787; comhad ar fáil anseo), Vista (DOI: 10.1093/var/gkl822; comhad ar fáil anseo), agus EnhancerAtlas (DOI: 10.1093/var/gkz980 comhaid ar fáil anseo); bunachair shonraí. Íoslódáladh an genome mm10 luiche agus a nótaí trí thionscadal genomes Illumina (ar fáil anseo). Aisghabhadh an comhad róshlabhra chun comhordanáidí mm9 a ardú go mm10 ó bhrabhsálaí genome UCSC (DOI: 10.1101/gr.229102; comhad ar fáil anseo). Aisghabhadh nótaí TAD ó ghaschealla suthacha luiche ón mBrabhsálaí Géanóim 3D (DOI: 10.1186/s13059-018-1519-9; comhad ar fáil anseo). Aisghabhadh spriocanna tras-scríbhinne miRNA tuartha ó TargetScan (DOI: 10.7554/eLife.05005, comhad ar fáil anseo), agus ó miRDB leagan 6 (DOI: 10.1093/var/gkz757, comhad ar fáil anseo). Tá sonraí ATAC-seq lena n-áirítear láithreacha IDR/DAR, nótaí, agus torthaí saibhrithe difreálach ar fáil ar GEO (GSE168339), mar atá sonraí mRNA-seq lena n-áirítear nótaí agus torthaí slonn difreálach (GSE168342). Tá cód ríomhaire a úsáidtear chun sonraí a phróiseáil agus a anailísiú, agus chun figiúirí a ghiniúint ar fáil ag https://bitbucket.org/clugstonA/mirna_enhancers

Leabharliosta

Abruzzese, MP, Bilotta, MT, Fionda, C., Zingoni, A., Soriani, A., Petrucci, MT, Ricciardi, MR, Molfetta, R., Paolini, R., Santoni, A., & Cippitelli, M. .(2019). Is é an fachtóir trascríobh homeobox MEIS2 ná rialtóir ar mharthanas cille ailse agus ar ghníomhaíocht IMiDs i Il-Myeloma: modhnú ag coscairí próitéin Bromodomain agus Seach-theirminéil (BET). Bás Ceall agus Galar, 10(4). https://doi.org/10.1038/s41419-019-1562-9

Agarwal, V., Bell, GW, Nam, JW, & Bartel, DP (2015). Suímh sprice éifeachtacha microRNA a thuar i mRNAnna mamaigh. ELife. https://doi.org/10.7554/eLife.05005

Andersson, R., Gebhard, C., Miguel-Escalada, I., Hoof, I., Bornholdt, J., Boyd, M., Chen, Y., Zhao, X., Schmidl, C., Suzuki, T. ., Ntini, E., Arner, E., Valen, E., Li, K., Schwarzfischer, L., Glatz, D., Raithel, J., Lilje, B., Rapin, N., … Sandelin, A. (2014). Atlas d'fheabhsaitheoirí gníomhacha ar fud cineálacha cille daonna agus fíocháin. Dúlra, 507(7493), 455–461. https://doi.org/10.1038/nature12787

Lab Babraham. (2014). Baile Átha Troim go leor. Sa Bhithfhaisnéisíocht. http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_go leor

Bais, AS, Cerqueira, DM, Clugston, AS, Ho, J., & Kostka, D. (2020). Léiríonn seicheamhú RNA aonchealla gníomhaíocht timthriall cille difreálach i bpríomhdhaonraí cille le linn nephrogenesis. BioRxiv. https://doi.org/ https://doi.org/10.1101/2020.09.16.300293

Bearbóir, RD, Harmer, DW, Coleman, RA, & Clark, BJ (2005). GAPDH mar ghéin coimeádta: Anailís ar léiriú GAPDH mRNA i bpainéal 72 fíochán daonna. Géanómaíocht Fhiseolaíochta. https://doi.org/10.1152/physiolgenomics.00025.2005

Bartel, DP (2009). MicroRNA Aithint Sprioc agus Feidhmeanna Rialála. Cill, 136(2), 215–233. https://doi.org/10.1016/j.cell.2009.01.002.MicroRNA

Bertram, JF, Douglas-Denton, RN, Diouf, B., Hughson, MD, & Hoy, WE (2011). Uimhir nephron daonna: Impleachtaí do shláinte agus do ghalair. Neifreolaíocht Phéidiatraiceach, 26(9), 1529–1533. https://doi.org/10.1007/s00467-011-1843-8

Boleu, N., Kundaje, A., Bickel, PJ, & Li, Q. (2015). Ráta Neamh-in-atáirgthe Fionnachtana (2.0.3). https://github.com/nboley/idr

Bouchard, M., Souabni, A., Mandler, M., Neubüser, A., & Busslinger, M. (2002). Sonraíocht lineage Nephric ag Pax2 agus Pax8. Géinte agus Forbairt. https://doi.org/10.1101/gad.240102

..............

Ó: Dialann Réamh-cruthúnas

2021 Arna fhoilsiú ag Elsevier Inc.