Papillomavirus Daonna Chimeric-16 Cáithníní cosúil le Víreas a Thaispeánann P18I10 Agus Peiptídí T20 ó VEID-1 Clúdach a Spreagann HPV16 Agus VEID-1-Díolúine Sonrach Humoral Agus T-Réadaithe i lucha BALB/c

Coimriú:

Sa staidéar seo, cuireadh an peiptíd VEID-1 P18I10 CTL díorthaithe ón lúb V3 de VEID-1 gp120 agus an peiptíd frith-chomhleá VEID-1 gp41 isteach sa phróitéin capsid HPV16 L1. chun VLPanna chimericacha HPV: VEID (L1:P18I10 agus L1:T20) a thógáil trí úsáid a bhaint as an gcóras slonn cille mamaigh. An HPV: Rinneadh VLPanna VEID a íonú trí chrómatagrafaíocht. Léiríomar nach raibh tionchar ag cur isteach peptídí P18I10 nó T20 isteach sa lúb DE de phróitéiní capsid HPV16 L1 ar chobhsaíocht in vitro, ar fhéin-chomhthionól, agus ar mhoirfeolaíocht HPV chimeric: VLPanna VEID. Is é an rud is tábhachtaí ná níor chuir sé isteach ar an imoibríocht antashubstainte VEID a dhírigh ar pheiptídí seicheamhacha agus comhfhoirmiúla P18I10 agus T20 a chuirtear i láthair ar VLPanna chimericacha: VLPanna VEID nó ar ionduchtú antasubstaintí sonracha HPV16 L in vivo. Thugamar faoi deara go bhféadfadh vacsaíní chimeric L1:P18I10/L1:T20 VLPs freagairtí sonracha antashubstainte HPV ach lag VEID a aslú agus go bhfaighidís HPV16- agus VEID-1-T-sonrach freagraí cille i lucha BALB/c. Ina theannta sin, d'fhéadfadh sé a bheith ina teanndáileog féideartha chun freagairtí ceallacha VEID-shonracha a mhéadú san imdhíonadh heitrologach tar éis priming le vacsaín BCG.HIVA. Chuideodh an obair thaighde seo céim i dtreo fhorbairt an chláir nua vacsaíne chimeric HPV: VLP VLP-bhunaithe chun ionfhabhtú HPV16 agus VEID a rialú, a bhfuil géarghá leis i dtíortha i mbéal forbartha agus tionsclaithe.

sochair cistanche do na fir-neartú chóras imdhíonachta

Cliceáil anseo chun táirgí Cistanche Feabhsú Díolúine a fheiceáil

【Iarr tuilleadh】 Ríomhphost:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Eochairfhocail:

VEID-1; HPV16; vacsaín ; cáithníní cosúil le víreas; P18I10; enfuvirtide T20; BCG.HIVA; díolúine humoral; Díolúine T cille-idirghabhála

1. Réamhrá

Thángthas ar an víreas easpa imdhíonachta daonna-1 (VEID-1), is cúis le siondróm easpa imdhíonachta faighte (SEIF), go luath sna 1980í, agus ó shin i leith tá sé ina eipidéim dhomhanda [1]. Cé gur féidir le cóireáil fhrith-aisvíreasach an-ghníomhach (HAART), in éineacht le próifiolacsas réamh-nochta (PrEP) tionchar dáiríre a imirt ar rialú ionfhabhtaithe VEID-1, is cur chuige bunúsach é an vacsaíniú chun leasa an phobail agus chun leas an phobail a chur i gcrích. deireadh leis an eipidéim dhomhanda VEID-1 [2]. In ainneoin breis agus tríocha bliain de thaighde críochnúil ar VEID agus an iliomad trialacha cliniciúla vacsaíne, níl vacsaín ceadúnaithe VEID-1 fós indéanta go dtí seo. Ba é an triail RV144 a rinneadh sa Téalainn an chéad chás a nocht éifeachtúlacht mheasartha de 31.2% i gcoinne éadála ionfhabhtú VEID [3]. Bhí formhór na n-iarrthóirí vacsaíne VEID eile a rinne trialacha cliniciúla bunaithe go príomha ar DNA, veicteoirí víreasacha athchuingeacha, nó samhlacha próitéine fo-aonaid [4,5]. Go hidéalach, tá vacsaín éifeachtach VEID-1 in ann freagairtí imdhíonachta dúchasacha a spreagadh, antasubstaintí a neodrú chun ionfhabhtú víreasach a chosc [6] chomh maith le freagraí citotocsaineacha T-limficítí (CTL) chun cealla ionfhabhtaithe a dhíchur [7]. Mar sin féin, d’fhéadfadh go mbeadh gá le straitéisí vacsaíne éagsúla chun gach freagra a fháil, rud a d’fhágfadh go mbeadh gá le hiarrachtaí forbartha ar leithligh ach comhthreomhar. Beidh tionchar suntasach ag roghnú imdhíon-ghiní agus veicteoirí seachadta ar fheidhm agus ar shainiúlacht na vacsaíní VEID[8,9]. Mar gheall ar theipeanna arís agus arís eile a bhain úsáid as na cineálacha cur chuige caighdeánacha d'fhorbairt vacsaíne VEID-1, aithníodh an tábhacht a bhaineann le roghnú veicteora seachadta, réimis treisithe príomha, agus sainiúlacht imdhíon-ghineachta i bhfreagraí greannacha agus ceallacha araon. Tá níos mó ná 100 cineál papillomavirus daonna (HPV) ar eolas cheana féin agus meastar go bhfuil géinitíopaí HPV 16 agus 18 freagrach as thart ar 70% d'ailsí ceirbheacsacha ar fud an domhain [10]. D’fhéadfadh cáithníní cosúil le víreas HPV L1 (VLPanna), atá aicmithe mar chineál vacsaíní fo-aonaid, freagairtí greannúla sonracha L1- inchomparáide a chothú go príomha ar virion de chineál fiáin agus freisin ar fhreagraí trí mheán T cille [11–13]. Faoi láthair, tá trí vacsaín coisctheacha HPV ceadúnaithe ar an margadh agus tá siad ar fad bunaithe ar VLPanna de phróitéin capsid HPV L1. Táirgeann an córas slonn giosta (Saccharomyces cerevisiae) dhá cheann acu, Gardasil (Merck, Rahway, NJ, SAM) agus Gardasil{-9 (Merck) agus táirgtear an ceann eile, Cervarix (GSK, Brentford, UK), ag an gcóras veicteoir slonn baculovirus/ceall feithidí (BEVS/IC) [14]. Go dtí seo, níl na coinníollacha is fearr maidir le táirgeadh próitéiní HPV16 L1 i gcóras slonn na mamaigh bunaithe go maith. Mar sin, iarracht loighciúil sa chomhrac in aghaidh an dá phataigin mhóra dhomhanda seo is ea vacsaín chomhcheangailte a fhorbairt a chosnódh in aghaidh ionfhabhtuithe VEID agus VEID.

Inár bhfoilseachán páipéir athbhreithnithe roimhe seo maidir le coincheapa dearaidh vacsaíní VEID atá bunaithe ar cháithníní víreas (VLP) atá bunaithe ar víreas, luaigh muid go bhféadfadh ról feidhmiúil a bheith ag VLPanna neamhchlúdach, mar VLPanna papillomavirus, mar veicteoirí seachadta a chur i láthair. VEID-1 CTL nó epitopes antashubstainte a neodrú [15,16]. Deimhníodh an hipitéis seo i roinnt víreas papilloma ciméireach buaibheach (BPV) L1 VLP a léiríonn epitope P18I10 CTL ó lúb V3 de gp120 HIV-1 próitéin imchlúdaigh (Env) agus epitope 2F5 nó réigiún MPER de gp41 VEID-1 Env [17–22]. Tá an ghné struchtúrach de phróitéiní capsid de chineál papillomavirus daonna-16 (HPV16) L1 capsid cosúil le próitéiní BPV agus d'fhéadfadh siad iad féin a chur le chéile i VLPanna L1 aonchiseal [23]. Cruthaíonn cúig cinn de na próitéiní HPV16 L1 pentamer agus cruinníonn 72 de na pentamers iad féin isteach i VLP HPV16 [24]. Mar sin féin, níl aon fhianaise shoiléir ann go fóill go bhféadfadh próitéiní capsid chimeric HPV16:VEID a bheith cobhsaí in vitro agus iad féin a chóimeáil i VLPanna atá lárnach ó thaobh moirfeolaíochta de. Ar an láimh eile, tá sé léirithe go bhfuil VLPanna HPV16 L1 an-imdhíon-ghineach agus go bhfuil siad in ann freagairtí imdhíonachta T agus B-chealla antaigin-shonracha a spreagadh [11-13]. Tá sé le feiceáil fós an bhféadfadh cur i láthair VEID epitopes trí HPV: VLPanna VEID a bheith imdhíon-ghineach. Sa staidéar seo, bhí sé mar aidhm againn vacsaín chimeric VLP-bhunaithe HPV: VEID a fhorbairt trí úsáid a bhaint as cealla daonna 293F, córas seanbhunaithe léirithe cille mamaigh. D'fheidhmigh an próitéin HPV 16 L1 mar an scafall struchtúrach vacsaíne, agus roghnaíodh na peiptídí P18I10 agus T20 mar imdhíon-imdhíonachtaí VEID agus cuireadh isteach iad sa lúb DE den phróitéin HPV 16 L1. Díorthaítear an eipitóp imdhíon-cheannasach P18I10 CTL a chuimsíonn 10 aimínaigéad (iarmhair 311–320: RGP GRAFVTI) ón tríú fearann ​​athróg (V3) den chlúdach VEID-1 glycoprotein gp120. Aithníodh an peiptíd P18I10 mar mhóilín H{-2dd-srianta MHC rang-I chun freagairtí limficítí T citotocsaineacha (CTL) a aslú [25,26]. Is éard atá sa pheptíd T20, ar a dtugtar Enfuvirtide agus atá deartha mar pheptíde comhleá multimeric antiretroviral, seicheamh 36 aimínaigéad (YTSLIHSLIEEESQNQQEKNEQ ELLELDKWASLWNWF) ag déanamh aithrise ar an seicheamh heptad heptad C-críochfort in aice leis an scannán.0 s réigiún proximal seachtrach (MPER) den chlúdach VEID-1 glycoprotein 41 (gp41) [27]. Roghnaíodh an dá eiseapóp cille VEID-1 T (P18I10) agus B (T20) seo mar phointe tosaigh agus mar chruthúnas ar thurgnamh coincheapa don ardán forbartha vacsaíne chimeric VLP-bhunaithe VLP: VEID.

Le deich mbliana anuas, rinneadh tástáil ar go leor formáidí préimh-treisithe éagsúla den vacsaín VLP-bhunaithe[15]. Cé go raibh an chuid is mó de na straitéisí vacsaíne VLP nó BPV chimeric roimhe seo dírithe ar fhreagairtí imdhíonachta a spreagadh trí úsáid a bhaint as an réimeas homalógach príomh-treisithe, mhol dhá iar-staidéar go ndéanfaí imdhíonadh heitrologach. comhdhéanta de athchuingreachMycobacterium bovisBacillus Calmette-Guérin (rBCG) ag cur VEID in iúl-1 Gag prime agus VEID-1 D’fhéadfadh treisiú gobán VLP cur le díolúine T-chealla [29,30]. Inár ngrúpa taighde, tá sé léirithe againn go raibh túsú le rBCG ag léiriú imdhíonaigine VEID agus ag treisiú le veicteoir víreasach athchuingreach MVA.HIVA a bhí sábháilte agus fuair sé freagairtí imdhíonachta T-chealla ar leith i lucha BALB/c [31-33]. Tá an t-imdhíonacht VEID, a dhear an Dr. Tomas Hanke, comhdhéanta den phróitéin lánfhad VEID-1 gobán in éineacht le heipitíopaí iomadúla CTL lena n-áirítear epitopes P18I10 ag an C-terminus [34]. Mar sin, bhí sé mar aidhm againn a mheas an bhféadfadh BCG.HIVA na freagairtí imdhíonachta T-chealla a spreagann VEID: VLPanna HPV (L1:P18I10) i lucha BALB/c a threisiú.

Sa staidéar seo, dearadh agus táirgeadh imdhíon-ghiní chimeric HPV: VEID (L1:P18I10 agus L1:T20) trí úsáid a bhaint as an gcóras slonn 293F. Deimhníodh an slonn próitéin chimeric L1:P18I10 agus L1:T20 trí imdhíonchothaithe. An HPV: VLPanna VEID a íonú ina dhiaidh sin trí 3-modh crómatagrafaíochta céime, lena n-áirítear catation (CEC), eisiamh méide (SEC), agus crómatagrafaíocht cleamhnas heparin (H-AC). Ansin, deimhníodh cobhsaíocht in vitro, féintionól in vitro, agus moirfeolaíocht HPV íonaithe: VLPanna VEID trí SDS-PAGE neamh-laghdaithe, measúnacht mais mhóilíneach, agus micreascópacht leictreoin tarchurtha (TEM), faoi seach. Na peptídí seicheamhach agus comhfhoirmiúil P18I10 agus T20 a chuirtear i láthair ar HPV chimeric: Bhí VLPanna VEID mar shaintréith bhreise ag antasubstaintí monaclónacha frith-VEID -1 gp120 V3 agus 2F5 in vitro trí úsáid a bhaint as blot an Iarthair agus measúnacht indíreach ELISA. Ar deireadh, rinneadh measúnú ar imdhíon-ghineacht HPV: VLPanna VEID i múnla lucha BALB/c. Léiríomar go bhféadfadh vacsaíní chimeric L1:P18I10 agus L1:T20 VLP-bhunaithe freagairtí sonracha antashubstainte HPV agus VEID a aslú agus d’fhéadfadh VLPanna L1:P18I10 chimeric HPV agus VEID a aslú16- {37}}freagraí T-chealla ar leith i lucha BALB/c. Toisc go bhfuil forbairt agus déantúsaíocht vacsaín imdhíon-ghineach HPV: VEID do-ghnóthaithe fós, chuir an staidéar seo straitéis bhonnlíne ar fáil a d’fhéadfadh a bheith fiúntach tacú leis na hiarrachtaí domhanda chun vacsaíní nua chimeric-bhunaithe VLP a fhorbairt chun ionfhabhtuithe HPV agus VEID a rialú.

2. Ábhair agus Modhanna

2.1. Tógáil BCG.HIVA2auxo.int Strain Vacsaín

Tógadh BCG athchuingreach a léiríonn imdhíonacht VEID roimhe seo ag baint úsáide as an veicteoir tointeála comhtháthaithe E.coli-mycobacterial p2auxo.int. Rinneadh cur síos roimhe seo ar thógáil E. coli/veicteora micobacterial ag léiriú antaigin VEID [31-33]. Caolaíodh BCG.HIVA2auxo.int i PBS-Tween20 go 2 × 107 cfu/mL, sonicated chun cur isteach ar clumps baictéarach, agus ionaclaithe isteach sa eochaircheap bia cúil nó BALB / lucha c (50 µL, 106 cfu / luch).

cistanche tubulosa-feabhas a chur ar chóras imdhíonachta

2.2. Cultúir agus Claochlú Baictéarach

Saothraíodh cealla den phéine auxotrófach glicín E. coli, M151GlyA (Invitrogen, Waltham, MA, SAM), a chuir an Dr. Pau Ferrer ar fáil i meán díorthaigh íosta M9-(M{9-D: Na2HPO4, 6.78 g/L; KH2PO4, 3 g/L; NaCl, {{10}}.5 g/L; NH4Cl, 1 g/L, glúcós, 1{{20 }} g/L; MgSO4, 2 mmol/L; CaCl2, 0.1 mmol/L; thiamine, 0.1 g/L; FeCl3, 0.{{56} }}25 g/L; AlCl3·6H2O, 0.13 mg/L; ZnSO4·7H2O, 2.6 mg/L; CoCl2·6H2O, 0.47 mg/L; CuSO4·H2O, 4.6 mg/L; H3BO3, 0.03 mg/L; MnCl2·4H2O, 4.2 mg/L; NiCl2·6H2O, 0.02 mg/L; Na2MoO4·2H2O, 0.06 mg/L) , arna fhorlíonadh le glicín (70 µg/mL). Rinneadh na cealla E. coli M151Gly a chlaochlú leis na plasmids p2auxo.HIVA trí electroporation. Chuige seo, méadaíodh na cultúir E. coli go dlús optúil de 0.9 ag 600 nm agus a chlaochlú ag baint úsáide as leictreoratóir pulser géine Bith-Rad ag 2.5 kV, 25 µF, agus 200 Ω. Saothraíodh na cealla claochlaithe ina dhiaidh sin ar phlátaí agar M{{{9-D) (comhpháirteanna mar a thuairiscítear roimhe seo, le 1.5% bactoagar curtha leis) gan forlíonadh glicín lena roghnú nó le forlíonadh glicín mar rialú. Athraíodh an brú BCG auxotrófach lísín, BCG∆lys, a chuir WR Jacobs Jr., BR Bloom, agus T. Hsu ar fáil go cineálta le p2auxo.HIVAint plasmid DNA trí leictreaphróisiú. Saothraíodh na mycobacteria i meán brat Middlebrook 7H9 nó ar mheán Middlebrook agar 7H10 arna fhorlíonadh le albaimin-dextrose-catalase (ADC; Difco) ina bhfuil 0.05% Tween 80. Díscaoileadh monohidreaclóiríd L-lísín (Sigma, Kawasaki, an tSeapáin) in uisce driogtha agus a úsáidtear mar fhorlíonadh ag tiúchan deiridh de 40 µg/mL. Le haghaidh claochlaithe, saothraíodh BCG go dlús optúil de 1.5 ag 600 nm agus rinneadh é a chlaochlú ag baint úsáide as leictreoir pulser géine Bith-Rad ag 2.5 kV, 25 µF, agus 1000 Ω. Saothraíodh na claochladáin ansin ar mheán Middlebrook agar 7H10 arna fhorlíonadh le ADC ina raibh 0.05% Tween 80 gan forlíonadh lísín.

2.3. Línte Cille agus Cultúr Cille

Saothraíodh na cealla 293F (Tibco), a dhíorthaítear ó chealla duáin suthacha daonna (HEK) 293, i meán slonn FreeStyle 293 (Tibco) arna fhorlíonadh le 5 mL/L de peinicillin-streiptimícin (Tibco) agus gortha i gorlann 37 ◦C ina raibh. atmaisféar tais de 5% CO2 ar ardán croitheora fithiseach a rothlaíonn ag 125 rpm.

2.4. Táirgeadh Próitéiní L1:P18I10 agus L1:T20 ag Úsáid an Chórais Slonn 293F

Sa tógáil pCDNA3.1 bhí seichimh códaithe DNA L1:P18I1{{0 nó L1:T20 a fhreagraíonn do phróitéiní chimeric L1:P18I10 agus L1:T20, faoi seach. Cuireadh an peiptíd VEID-1 P18I10 CTL (RGPGRAFVTI) nó an peiptíd T20 (YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQE LLELD KWASLWNWF) isteach sa lúb RO de phróitéin capsid HPV16 L1. Cuireadh peptide P18I10I10 nó T20 in ionad seicheamh lúb HPV16 L1 DE a ionchódú 130-136 aimínaigéid. Athraíodh na seichimh códaithe DNA L1:P18I10 nó L1:T20 le seicheamh Kozak, optamaithe le codon daonna, taobh leis na suíomhanna einsím srianta HindIII agus XbaI, agus clónáilte isteach i veicteoir pcDNA3.1(+) trí úsáid a bhaint as seirbhísí sintéise géine GeneArt ( Thermo Fisher, Waltham, MA, USA). Rinneadh an DNA plasmid athchuingreach (pDNA) a chlaochlú go cealla inniúla E. coli DH5 (Invitrogen) le haghaidh aimplithe agus a bhaintear trí úsáid a bhaint as feisteáin Maxi plasmid (QIAGEN, Hilden, an Ghearmáin). Saothraíodh na cealla 293F le meán slonn 30mL FreeStyle 293 i bhfleascán 125mL Erlenmeyer (Corning, Nua-Eabhrac, NY, SAM) go dtí dlús 1.0 × 106/mL agus aistríodh iad go sealadach le L1:P18I10 nó L1:T20 ag baint úsáide as na brainse pDNA poileitiléinimín le MW de 25 kDa (PEI{-25K) (Polai-eolaíochtaí) ag cóimheas optamaithe de DNA go PEI 1:3 (w/w) agus DNA le meán saothraithe 1:1 (w/v), de réir de réir threoracha an mhonaróra [35]. Baineadh na cealla 293F ag 96 h tar éis an aistrithe. Is féidir leis na cealla 293F dlús comhlíonta de 3.6 × 106 cill/mL a bhaint amach le hinmharthanacht thart ar 50%.

2.5. Staining Immunofluorescence

Permebilized na cealla ar an sleamhnán gloine le 100% fuar aicéatón. Ina dhiaidh sin, rinneadh iniúchadh ar na cealla seasta leis an antasubstaint frith-HPV16 L1 CAMVIR-1 (Abcam, Cambridge, UK) agus gabhadh iad le frith-luch IgG-FITC (Sigma). Rinneadh monaraithe cille dhaite imdhíonachta a ní go críochnúil le PBS agus clúdaithe le meán gléasta le DAPI (Abcam). Rinneadh iniúchadh ar na híomhánna imdhíonfhluaraiseachta faoi mhicreascóp inbhéartaithe ag formhéadú 40 ×. Socraíodh éifeachtúlacht aistrithe ag an gcóimheas idir cealla FITC (glas) - dearfach agus cealla dhaite DAPI (gorm).

2.6. Íonú VLP: VEID (L1:P18I10 agus L1:T20) VLPanna

Bailíodh 108 gceall 293F a d’aistrigh i bhfleascán 125 ml Erlenmeyer (meán/fleascán cultúir 30 ml) trí lártheifneoiriú ag 1500 rpm ar feadh 5 nóiméad agus nite faoi dhó le PBS. Athchóiríodh millíní cille i maolán lysis a foirmíodh le 1% Triton X-100, coscaire protease (1:100) (Millipore), agus Benzonase (25 U/mL) (Millipore). Soiléiríodh lysates cille le scagaire steallaire PVDF 0.45 µm (Millipore). Rinneadh na samplaí VLP HPV: VEID (L1:P18I10 agus L1:T20) a íonú go sraitheach trí úsáid a bhaint as malartán caitian (Capto SP ImpRes, GE, Boston, MA, SAM), eisiamh méide (Capto Core 700, GE) agus cleamhnas (HiTrap Heparin HP). , GE) crómatagrafaíocht. Rinneadh cur síos ar na prótacail chromatagrafaíochta inár staidéir roimhe seo [36,37] agus lean siad prótacal an mhonaróra [38]. Bhí an comhartha próitéin L1 i ngach céim íonúcháin tréithrithe ag anailís blot an Iarthair agus rinneadh é a thástáil le CAMVIR antasubstainte frith-HPV16 L1-1 [39].

2.7. Neamh-Laghdú SDS-PAGE

Meascadh na VLPanna HPV16 L1, L1:P18I10, agus L1:T20 le maolán samplach 2 × Laemmli (BIO-RAD) in éagmais nó láithreacht 5% (v/v) 2-mercaptoethanol ({{11}) }ME) agus d'imoibrigh sé ag teocht an tseomra (RT) ar feadh 24 h. Scaradh samplaí le glóthacha próitéine saor ó stainse TGX 8-16% (BIO-RAD). Ansin, aistríodh na glóthacha chuig seicní PVDF. Scrúdaíodh na seicní leis an mAb frith-HPV16 L1 CAMVIR-1 ag caolú 1:4000. Ina dhiaidh sin, goradh na seicní le frith-luch IgG Peroxidase Conjugate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAM) ag caolú 1:4000. Forbraíodh agus léiríodh an comhartha trí chemiluminescence ag baint úsáide as trealamh substráit Western Blot ECL (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Fuarthas na híomhánna blot trí úsáid a bhaint as córas íomháithe Odyssey Fc.

2.8. Anailís Aifreann Mhóilíneach

Rinneadh na VLPanna HPV16 L1, L1:P18I10, agus L1:T20 gan chóireáil 2-ME a scagadh amach trí ghléasanna ultrascagtha scoite 1000 kDa de réir meáchain mhóilíneach (MWCO) (SARTORIUS). Cuireadh na VLPanna HPV16 L1, L1:P18I10, agus L1:T20 le 2-Cóireáil ME trí ghaireas ultrascagtha 100 kDa MWCO (Amicon). Rinneadh na retenates a athdhéanamh go dtí an méid bunaidh agus bailíodh iad ó thaiscumar samplach an fheiste scagaire, agus bailíodh na scagáití ag bun an fheadáin lártheifneora. Rinneadh an comhartha L1 a thomhas trí úsáid a bhaint as blot ponc a raibh frith-HPV16 L1 mAb air agus a braitheadh ​​le comhchuingeach IgG-peroxidase frith-luiche (Sigma-Aldrich). Fuarthas íomhánna trí úsáid a bhaint as Córas Íomháithe Odyssey Fc ag cainéal ceimileacain.

Buntáistí cistanche tubulosa- an córas imdhíonachta a neartú

2.9. Micreascópacht Leictreonaigh do Dhonnú agus Tarchur Diúltach

Tar éis na greillí copair brataithe carbóin (Sigma-Aldrich) a mhuirearú faoi sholas ultraivialait ar feadh 5 nóiméad, HPV16 L1 tráchtála (Abcam), íonaithe L1: P18I10 agus L1: T20 VLP cothromaithe le 20 mM Tris-HCl (pH 7.4, 137 mM NaCl ) a shúiteadh ar ghreillí ar feadh 1 nóiméad agus a rinsiú trí huaire le huisce miliQ. An HPV: Bhí VLPanna VEID diúltach-dhaite le aicéatáit úráinil 2% ag pH 4.5 (Sigma-Aldrich) ar feadh 1 nóiméad. Baineadh gníomhairí staining iomarcacha ag páipéar scagaire cáilíochtúil Whatman (Sigma-Aldrich). Cuireadh greillí i seomra dí-humidifier ar a laghad 2 h roimh bhreathnóireacht. Fuarthas íomhánna trí úsáid a bhaint as micreascóp leictreon tarchuir (Tecnai Spirit 120 kV) ag formhéadú SA135K (100 nm) agus SA59000 (200 nm), faoi seach.

2. 10. Leictreafóiréis Glóthach Sóidiam Dodeicile – Leictreafóiréis Glóthach Polacrylamide agus Anailís Blotting an Iarthair

Meascaíodh méideanna comhionann (500 ng) de phróitéin HPV16 L1 (Abcam), L1: P18I10 íonaithe, agus L1: T20 VLP le maolán sampla 2 × Laemmli ina raibh 5% 2-ME agus bruite ag 95 ◦C ar feadh 5 nóiméad . Scaradh na samplaí le glóthacha próitéine saor ó stainse TGX 8-16% agus ansin aistríodh iad chuig membrane PVDF (Millipore, Burlington, MA, SAM) ag baint úsáide as gléas aistrithe Leath-Thriomaigh (Bith-Rad). Cuireadh bac ar an scannán le bainne bearrtha 5% i TBST. Ansin, scrúdaíodh na seicní leis an mAb frith-HPV16 L1 CAMVIR-1 ag caolú 1:4000, frith-VEID-1 gp120 V3 loop mAb (NIBSC, EVA3012) ag caolú 1: 40 agus HIV1 gp41 (2F5) mAb (NIBSC, ARP3063) ag caolú 1:4000, faoi seach. Tar éis sin, goradh na seicní le frith-luch IgG Peroxidase Conjugate (Sigma-Aldrich) ag caolú 1:4000. Baineadh úsáid as trealamh substráit ECL an Iarthair (BIO-RAD) chun comharthaí a fhorbairt. Fuarthas na híomhánna blot trí úsáid a bhaint as an gcóras íomháithe Odyssey Fc ag cainéal chemiluminescence.

2. 11. Imdhíonadh Lucha, Bailiú Séirea, agus Leithlisiú Splenocytes

Is réamhstaidéar cruthúnais coincheap é seo chun imdhíon-ghineacht HPV: VLPanna VEID (L1:P18I10 agus L1:T20 VLPanna) a léiriú. An dáileog, an bealach riaracháin, agus an t-eatramh príomh-treisithe dár n-HPV: Thagair VLPanna VEID do staidéir roimhe seo a rinne imdhíonadh ar lucha le papillomavirus buaibheach (BPV): VLPanna VEID chun freagraí antasubstainte a spreagadh [20,21]. HPV íonaithe: eiblíodh VLPanna VEID le toirt comhionann (225 µg in aghaidh gach dáileog 0.5 mL) sulfáit hiodrocsafhosfáit alúmanaim (Thermo Fisher), chun foirmiú cosúil leis an vacsaín HPV ceadúnaithe Gardasil a chinntiú [40]. Bhí dáileadh comhionann inscne ag gach grúpa luiche (fireann n=4 agus baineann n=4 in aghaidh an ghrúpa). I ngrúpaí A agus B, rinneadh imdhíonadh ar lucha BALB/c go ionmhatánach (im) le 10 µg de L1:P18I10 nó L1:T20 VLPanna, faoi seach, trí réimeas homalógach príomhbhreise a leanúint. I ngrúpa C, rinneadh lucha a ionaclú le 106 cfu de BCG.HIVA2auxo.int intradeirmeach (id, ag an eochaircheap bia) agus treisíodh iad le 10 µg de L1:P18I10 VLP go ionmhatánach. I ngrúpa D, rinneadh lucha rialaithe dearfacha a ionaclú le Gardasil- 9 primer agus treisiú Gardasil{-9 ina dhiaidh sin go hionmhatánach le 10 µg de HPV16 L1 VLPanna. Sa ghrúpa E, rinneadh lucha rialaithe diúltacha a imdhíonadh faoi dhó le maolán PBS. Ba é an t-eatramh príomh-treisithe ná 2 sheachtain. Rinneadh íobairt ar lucha ar lá 28. Bailíodh samplaí fola ó chroí na lucha. Aisghabhadh sera trí lártheifneoiriú agus stóráil ag −20 ◦C le haghaidh measúnacht ELISA. Baineadh spleens Murine agus brú ina n-aonar trí strainer cille (Falcon) le plunger rubair steallaire 5 mL. Tar éis deireadh a chur le cealla fola dearga le maolán lísing ACK (Lonza), nite agus athshuíodh splenocytes i meán lymphocyte R10 (RPMI 1640 arna fhorlíonadh le serum lao féatais 10% (FCS), peinicillin-streiptimícin, 20 mM HEPES agus 15 mM {{ 46}}ME) ag tiúchan 2 × 107 cill/mL.

2.12. Measúnacht Imdhíon-Iomdhíonta Nasctha le heinsím

Chun tástáil a dhéanamh ar antasubstaintí sonracha HPV16 L1- agus VEID-1- atá ceangailteach do HPV chimeric: déanann VEID VLP in vitro, 50 µL de thiúchan comhionann (200 ng/mL) de phróitéin athchuingreach HPV16 L1 (Abcam, ab119880) ), L1:P18I10 agus L1:T20 VLP íonaithe i maolán décharbónáite carbónáit 50mM (pH=9.6) (Sigma) a 2-fillte go sraitheach agus brataithe ar na plátaí Maxisorb (Nunc). Goradh na plátaí ag 4 ◦C thar oíche. Cuireadh bac ar phlátaí leis an maolán blocála (5% bainne bearrtha i TBST) ag 37 ◦C ar feadh 2 h ar a laghad. Tar éis níocháin faoi dhó le TBST, goradh na plátaí atá brataithe le VLP le frith-HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb ag caolú 1:8000, 2F5 mAb (NIBSC, ARP3063) ag caolú 1:8000 agus frith- VEID-1 gp120 V3 loop mAb (NIBSC, EVA3012) ag caolú 1:40 i maolán blocála, faoi seach, ag 37 ◦C ar feadh 2 h. Tar éis níocháin trí huaire le TBST, gor na plátaí le próitéin athchuingreach G peroxidase comhchuingeach (Thermo Scientific, Waltham, MA, SAM) ag caolú 1:4000 i maolán blocála ag 37 ◦C ar feadh 1 h. Baineadh úsáid as TMB chun an comhartha measúnaithe imdhíon-ionsorbent einsím-nasctha (ELISA) a fhorbairt agus stop sé le 50 µL de 2M H2SO4. Rinneadh dlús optúil (OD) gach tobair a thomhas agus a thaifeadadh ag tonnfhad 450 nm trí úsáid a bhaint as léitheoir microplate ionsúcháin EL × 800.

Chun na hantasubstaintí VLP-spreagtha i lucha BALB/c a thomhas, brataíodh na plátaí micreatiter le 50 µL de phróitéin HPV16 L1 athchuingreach 2 µg/mL (Abcam, ab119880), VEID-1 P18I10 peptide (NIBSC), ARP734, Peptíde T20 (NIBSC, ARP984), faoi seach, le maolán carbónáit-décharbónáit 50 mM (pH=9.6). Goradh na plátaí ag 4 ◦C thar oíche. Cuireadh bac ar phlátaí leis an maolán blocála (5% bainne bearrtha i TBST) ag 37 ◦C ar feadh 2 h ar a laghad. Ag an am céanna, caolaíodh séiream a bailíodh ó lucha imdhíonta ghrúpa AE le 5% de bhainne bearrtha i TBST ag cóimheas 1:50. Tar éis níocháin faoi dhó le TBST, gor na plátaí leis an séiream caolaithe ag 37 ◦C ar feadh 2 h. Tar éis níocháin trí huaire le TBST, cuireadh na plátaí le próitéin athchuingreach G HRP comhchuingeach ag caolú 1:4000 i maolán blocála agus goraíodh iad ag 37 ◦C ar feadh 1 h. Baineadh úsáid as TMB chun an comhartha ELISA a fhorbairt agus stop sé le 50 µL de 2M H2SO4. Rinneadh OD gach tobair a thomhas ag tonnfhad 450 nm trí úsáid a bhaint as léitheoir microplate absorbance EL × 800 (Biotek).

2.13. IFN- Measúnacht ELISpot

Rinneadh an measúnú ar an spota ionsúite imdhíonachta atá nasctha le heinsím (ELISpot) agus úsáid á baint as trealamh tráchtála murine IFN-ELISpot (Mabtech, Nacka Strand, an tSualainn), de réir threoracha an mhonaróra. Na plátaí ELISpot (MSISP4510, 96-plátaí tobair le seicní difluairíde polaivinileideine, Millipore, Middlesex County, MA, SAM) cóireáilte agus brataithe le EtOH 70% le interferon frith-luch íonaithe- (IFN- ) gabháil antashubstaint mhonaclónach caolaithe i salanda maolánach fosfáite (PBS) go tiúchan deiridh 5 µg/mL ag 4 ◦C thar oíche. Ansin, cuireadh 2.5 × 105 splenocytes úr le gach tobar. Ina dhiaidh sin, spreagadh na cealla ó ghrúpaí A agus B le 2 µg/mL de VLPanna HPV16 L1 agus peiptídí P18I10 VEID, faoi seach. Plátáladh na samplaí agus na rialuithe go léir i dtoibreacha dúblacha. Goradh measúnachtaí ELISpot ar feadh 16 h ag 37 ◦C, 5% CO2. Rinneadh na plátaí a ní ina dhiaidh sin 5 × le PBS, gortha ar feadh 2 h le hantasubstaint frith-IFN-mhonaclónach biotinylated (mAb) caolaithe i PBS 2% Séiream Laonna Féatais (FCS) go tiúchan deiridh de 2 µg/mL, nite 5 huaire. i PBS, agus gortha leis an gcomhchuingeach phosphatase streptavidin-alcaileach i PBS 2% FCS. Ansin, nite plátaí 5 huaire le PBS sular goir iad le 100 µL de 5-bróma-4-clóra-3-fosfáit indolyl (BCIP)/nítri-gorm tetrazolium (NBT) tuaslagán substráit (Sigma-Aldrich). , St. Louis, MO, SAM). Tar éis 5-10 nóiméad, nitear na plátaí le huisce sconna, triomaíodh iad, agus áiríodh na spotaí mar thoradh air ag baint úsáide as léitheoir ELISPOT (AIDS, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasberg, an Ghearmáin). I gcás gach ainmhí, baineadh meán na bhfreagraí cúlra go haonarach ó na toibreacha go léir chun comparáid a dhéanamh idir na cealla foirmithe spot-IFN (SFC)/106 idir grúpaí. Chun freagairtí dearfacha a shainiú, sainmhíníodh tairseach mar ar a laghad cúig spota in aghaidh an tobair, agus freagairtí a sháraigh meánlíon na spotaí i toibreacha rialaithe diúltacha móide trí dhiall chaighdeánacha ó na toibreacha rialaithe diúltacha.

2.14. Anailís staitistiúil

Rinneadh an anailís staitistiúil ar fad ag baint úsáide as bogearraí Prism 6 GraphPad (CA, USA). D’úsáideamar sonraí ó thurgnaimh a rinneadh thar 5 thiúchan éagsúla brataithe pláta ELISA (0, 50, 100, 150, 200 ng/mL) de phróitéin athchuingreach HPV16 L1 (Abcam, ab119880) agus HPV: VLPanna VEID. Bhailíomar sonraí ó 2 ghrúpa (HPV16 L1 agus HPV: VLPanna VEID) agus bhailíomar trí mhacasamhail do gach tiúchan brataithe. Thaispeáin an graf i bPrism na sonraí mar scaipphreas ag taispeáint tiúchan brataithe (ng/mL) ar an X-ais agus OD450 ar an Y-ais. Ós rud é go ndearna muid hipitéis go bhfuil ár sonraí in vitro ELISA gaolmhar i bpatrún líneach, rinneamar an anailís aischéimniúcháin líneach agus rinneamar comparáid idir fánaí an dá líne chun an tacar sonraí agus an tacar sonraí -2 (antashubstaint imoibríocht idir HPV16 L1 agus HPV: tá VLPanna VEID) difriúil ina gcuid gníomhartha. Roghnaíomar eatraimh muiníne 95% taobh leis an líne is fearr a oireann. Déanann Prism líne aischéimniúcháin líneach a fhorleagadh go huathoibríoch ar an dá thacar sonraí againn agus tá líne poncaithe breactha aige arb ionann é agus eatraimh muiníne 95%. Le linn na hanailíse aischéimnithí líneach, níor ríomh na bogearraí ach meánluach Y ár dtacar sonraí a léirigh feabhas na hoiriúnachta. Ina theannta sin, thug Prism tráchtaireacht dúinn, ionas gur féidir linn a thabhairt i gcrích go bhfuil na difríochtaí idir an dá fhána thar a bheith suntasach.

Bhí 5 thacar (ELISA) agus 4 thacar (ELISPOT) againn de shonraí bailithe ó thurgnaimh imdhíonta luiche. Bhí líon comhionann ag na tacair sonraí seo (fireann n=4 agus baineann n=4) i ngach grúpa. D’úsáideamar lucha imdhíonta Gardasil mar ghrúpa rialaithe dearfach agus lucha imdhíonta PBS mar ghrúpa rialaithe diúltach. Ní raibh sonraí ár dturgnaimh deartha ag meaitseáil nó ag péireáil. Thugamar faoi anailís aontreo ar athraitheas (ANOVA) féachaint an raibh na modhanna seo difriúil. Ar dtús rinneamar seiceáil ar ár sonraí oiriúnach do ghnáthdháileadh Gaussach. Fuaireamar amach nár éirigh le roinnt grúpaí sonraí i measúnacht ELISA sa tástáil dáilte normalach Gaussach. Mar sin, rinneamar anailís staitistiúil neamhpharaiméadrach ar na sonraí seo. I gcodarsnacht leis sin, tá gach grúpa sonraí sa mheasúnacht ELISPOT thar an tástáil dáileadh normalach Gaussach. Mar sin, rinneamar anailís staitistiúil pharaiméadrach ar na sonraí seo. Socraíodh an tairseach suntasachta agus an leibhéal muiníne go dtí 0.05 (comhionann le heatramh muiníne 95%). p luach a thaispeánann go ginearálta an dóchúlacht go bhfuil difríochtaí idir grúpaí. Toisc gurb é an príomhábhar imní atá againn don turgnamh seo ná cad iad na difríochtaí idir ár ngrúpaí, thug na comparáidí iolracha i Prism toradh comparáide dúinn i ngach grúpa le gach grúpa eile.

2.15. Ráitis Eitice

Ceannaíodh lucha BALB/c idir sé agus ocht seachtaine d’aois ó Envigo (Cuideachta Inotiv, Chicago, IL, SAM) agus faomhadh iad ag údaráis áitiúla (Generalitat de Catalunya, tionscadal uimhir 11157) agus Coiste Eitice Universitat Autònoma de Barcelona. Chloígh na turgnaimh ainmhithe go docht le reachtaíocht leasa ainmhithe an Generalitat de Catalunya. D'fhormheas an Coiste Eitice Taighde áitiúil na turgnaimh go léir (nós imeachta 43.19, Hospital de la Vall d'Hebron, Universitat Autònoma de Barcelona).

3. Torthaí

3.1. Dearadh Imdhíonaigí L1:P18I10 agus L1:T20 agus Meastóireacht ar HPV: Léiriú Próitéin VEID trí Chóras Slonn 293F a Úsáid

Cuireadh an peptide P18I10 ón lúb tríú fearann ​​athróg HIV-1 Env (V3) agus peptide T20 ó VEID-1 réigiún seachtrach proximal membrane Env (MPER) isteach i próitéin lúb HPV16 L1 DE chun L1 chimeric a ghiniúint :P18I10 agus L1:T20 imdhíon-ghiní. Clónáladh na sraitheanna códaithe DNA chimeric L1:P18I10 agus L1:T20 isteach i veicteoir abairt DNA plasmid pcDNA3.1 (+) le haghaidh aistriú neamhbhuan i gcealla 293F (Fíor 1A). Réamh-mheastar struchtúir mhonaiméirí de phróitéiní capsid HPV16 L1, chimeric L1:P18I10, agus L1:T20 ag baint úsáide as an bhfreastalaí samhail-SWISS (Fíor 1B). Roghnaíodh mórphróitéin capsid HPV16 L1 (7cn2.1.R) mar theimpléad struchtúrach chun samhaltú hoimeolaíochta próitéin capsid HPV16 L1, L1: P18I10, agus L1:T20 a thógáil. I gcomparáid le comhfhoirmiú an pheptíde P18I10 faoi cheangal sa staidéar roimhe seo [41], ritheann treo slabhra príomhfhoirceann N go C an peptide P18I10 ar ár próitéin chimeric L1:P18I10 ar dheis ar chlé (Fíor 1B, painéal lár agus barr), agus d'fhéadfadh na slabhraí taobh P18I10 nochtaithe idirghníomhú le gabhdóirí cealla T (Fíor 1B, painéal lár agus bun). I gcomparáid le struchtúr an peptide inhibitor comhleá VEID-1 sa pháipéar athbhreithnithe roimhe seo [42], cuirtear an peptide T20 a cuireadh isteach ar phróitéin capsid HPV16 L1 i láthair mar fhoirmiú -helix-mhaith (Fíor 1B, painéal ar dheis agus ar bharr). ), agus d'fhéadfadh na gabhdóirí cille B (Fíor 1B, painéal ar dheis agus ar bun) na slabhraí taobh T20 nochta a aithint. Ós rud é go bhféadfadh próitéiní capsid HPV16 L1 teacht le chéile go haonchineálach isteach i gcáithnín icosahedral T=7 le 72 capsóim pentameric [43], d'fhéadfadh taispeáint ard-dlúis peiptídí P18I10 nó T20 go dromchla taobh amuigh HPV chimeric: VLPanna VEID a bheith an-imdhíon-spreagthach. chun freagairtí imdhíonachta a bhaineann go sonrach le epitope a spreagadh.

Fíor 1. L1:P18I10 agus L1:T20 dearadh imdhíonachta agus tógáil HPV chimeric: VLPanna VEID trí úsáid a bhaint as córas slonn 293F. (A) Clónáladh na sraitheanna códaithe DNA chimeric L1:P18I10 agus L1:T20 isteach i pcDNA3.1+ veicteoirí slonn, faoi seach, le haghaidh aistriú neamhbhuan i gcealla 293F. (B) Struchtúir monaiméir de HPV16 L1 agus HPV chimeric a thuar: próitéiní capsid VEID trí úsáid a bhaint as an bhfreastalaí samhail-SWISS. Roghnaíodh HPV16 mórphróitéin capsid L1 (7cn2.1.R) mar an teimpléad struchtúrach chun an HPV16 L1 (painéal ar chlé), L1: P18I10 (painéal lár), agus L1: T20 (painéal ar dheis) samhaltú homalógach próitéin capsid a thógáil. Déantar eilimintí struchtúracha tánaisteacha de phróitéin capsid HPV16 L1 a lipéadú, le litreacha h1–h5 do na 5 -helices. Tá lúba próitéine capsid HPV16 L1 idir na snáitheanna lipéadaithe BC, CD, DE, EF, FG, agus HI. Tá eilimintí struchtúracha tánaisteacha de VEID-1 P18I10 agus peiptídí T20 L1 lipéadaithe ag na saigheada (painéal barr). Tá an chuid den pheptíd P18I10 agus T20 a shruthaíonn os cionn dhromchla an phróitéin capsid HPV16 L1 léirithe ag na saigheada (bunphainéal). (C) staining imdhíonfluaraiseacht de phróitéin L1 i gcealla 293F. Aistríodh na pDNA.L1:P18I10 (ar chlé), pDNA.L1:T20 (lár), agus pDNA.gan chur isteach (ar dheis) i gcealla 293F. Scrúdaíodh na cealla aistrithe le frith-HPV16 L1 mAb agus braitheadh ​​​​le frith-luch IgG-FITC (cainéal glas). Dathaíodh núicléis cille le DAPI (cainéal gorm). Cumascadh íomhánna imdhíonfhluaraiseachta trí úsáid a bhaint as Adobe Photoshop

Ós rud é go ndéanann seicheamh críochfoirt próitéin C HPV16 L1 idirghabháil ar innealra allmhairithe núicléach cheallacha le linn ionfhabhtú [44], sainaithníodh comharthaí logánaithe núicléach (NLS) de phróitéin HPV16 L1 i staidéir roimhe seo [45]. Roghnaíodh antashubstaint mhonaclónach CAMVIR-1 chun eipitóp HPV16 L1 (GFGAMDF, 230–236 aa) [39] a aithint, agus úsáideadh dath fluaraisgein-bhunaithe FITC mar thuairisceoir chun monatóireacht a dhéanamh ar léiriú L1:P18I10 agus L1: próitéiní T20. Léirigh íomhánna imdhíonflua go soiléir go raibh HPV16 L1 (i glas) logánaithe go príomha i núicléis (i gorm) cealla 293F. Níor breathnaíodh aon chomhartha L1 i gcealla rialaithe plasmid-transected 293F (pcDNA3.1 plasmid gan chur isteach) (Fíor 1C). Thug na torthaí le tuiscint go bhféadfaí próitéiní capsideacha L1:P18I10 agus L1:T20 araon a chur in iúl trí úsáid a bhaint as aistriú idirghabhálaithe poileitiléine (PEI) agus aitheanta ag antasubstaint mhonaclónach HPV16 L1 CAMVIR-1.

3.2. Íonú VLPanna L1:P18I10 agus L1:T20 trí Mhodhanna Crómatagrafacha a Úsáid

The chimeric L1:P18I10 and L1:T20 proteins were produced by using the 293F expression system. The capture, intermediate purification, and polishing (CiPP) strategy to develop our chromatographic purification protocol is shown in Figure 2A. Flowthrough (FT) in each purification step was collected and the level of L1 protein expression was detected by Western blot analysis using anti-L1 mAb to trace intermediate HPV: HIV VLPs (Figure 2B, C). A cation exchange (CEC) column was selected as a capturing step to isolate HPV: HIV VLPs from host cell proteins (HCPs). The result of CEC FT revealed that most of the L1:P18I10 and L1T20 VLPs were lost in the FT over the CEC column (Figure 2B, C, lane 2). Traditional CEC matrices we used heavily rely on diffusion-limited mass transfer [46]. Large macromolecular complexes, such as our HPV: HIV VLP samples, might be inefficient for the VLP binding to CEC matrices. In order to reach the maximum binding capacities of the CEC column (~50 mg protein/mL resin), we loaded a double amount of soluble cell lysate containing approximately 2% of HPV: HIV VLPs into the CEC column. In the intermediate purification step, HPV: HIV VLPs were purified using a layered-bead size exclusion chromatography (SEC) resin [38]. Large HPV: HIV particles (>700 kDa) were eluted while most of the small impurities were trapped in the beads (Figure 2B, C, lane 5). Due to heparin having a similar structure as DNA and possibly binding to positively charged peptides of conformational HPV16 L1 VLPs, we selected a heparin affinity chromatography (H-AC) as a polishing step to remove heterogeneous or closely related particles [47]. Analysis of densitometry from Western blot analysis and bovine serum albumin (BCA) assay confirmed that purity of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs after diafiltration step was high, over 76% (Figure 2B, C, lane 10). The purified L1:P18I10 and L1:T20 VLPs were detected as a band in size of approximately 56 kDa and 58 kDa, respectively. We found that the commercial HPV16 L1 protein and our purified chimeric HPV: HIV VLPs (L1:P18I10 and L1:T20) share a similar protein pattern (a target band >50 kDa agus banna íochtair heitreolaíoch<50 kDa). These heterologous lower bands could be detected, especially, when we loaded SDS-PAGE gel with a high amount of chimeric HPV: HIV VLP samples (Figure 2B, C, lane 1 to 10). It is probably caused by proteolytic degradation or heterogeneous formation of L1 proteins. A similar pattern (2 bands) was also found in many previous HPV16 L1 purification studies [23,48–51]. These data demonstrated that the 293F expression system and chromatographic purification methods are feasible approaches to engineer chimeric HPV: HIV VLPs.

Fíor 2. Íonú agus tréithriú VLPanna L1:P18I10 agus L1:T20. (A) Sreabhchairt próiseas scéimreach de L1:P18I10 agus L1:T20 íonú VLP trí chrómatagrafaíocht. (B, C) Anailís blot an Iarthair ar shamplaí L1:P18I10 agus L1:T20 VLP ó gach céim íonúcháin. Bhí an comhartha L1 i ngach céim íonúcháin tréithrithe ag anailís blot an Iarthair arna thástáil le frith-HPV16 L1 mAb. Léiríonn an tsaighead an meáchan móilíneach de ~56 kDa de L1:P18I10 agus ~58 kDa de phróitéiní L1:T20. Lána 1: lysate cille soiléirithe (CCL); Lána 2: sreabhadh tríd (FT) ó luchtú samplach crómatagrafaíocht malartaithe caitian (CEC); Lána 3: CEC eluate; Lána 4: FT ó chéim athghiniúna CEC 2M NaCl; Lána 5: crómatagrafaíocht eisiamh méide (SEC) FT-1; Lána 6: SEC FT-2; Lána 7: FT ó chromatagrafaíocht cleamhnas heparin (H-AC) luchtú sampla; Lána 8: H-AC eluate; Lána 9: FT ó chéim athghiniúna H-AC 2M NaCl; Lána 10: 10-díscagadh huaire.

3.3. Cobhsaíocht In Vitro agus Féin-Chóimeáil L1:P18I10 agus L1:T20 VLPanna

D'fhonn a dhearbhú gur léirigh VLPanna íonaithe VSD: VEID cobhsaíocht in vitro cosúil le VLPanna HPV16 L1, rinneamar SDS-LEATHANACH neamh-laghdaithe chun tras-nascadh díshuilfíde HPV: próitéiní capsid VEID a mheas (Fíor 3A). Tá sé ar eolas go bhfuil comhghaol idir pH, neart ianach, teocht [52], agus timpeallacht redox le bannaí disulfide de phróitéiní capsid HPV16 L1 [53]. Tá claonadh ag VLPanna HPV L1 teacht le chéile ag pH íseal agus neart ianach ard. De ghnáth teastaíonn nochtadh do thiúchan ard d’oibreáin laghdaitheora chun uas-díchóimeáil VLPanna, amhail 5% 2-mercaptoethanol (2-ME) ar feadh tréimhse sách fada [54]. In éagmais oibreáin laghdaithe 2-ME, níor aistríodh ach cuid bheag den phróitéin HPV L1, L1:P18I10, agus L1:T20 go monaiméir a raibh meáchan móilíneach dealraitheach (MW) de 55 kDa orthu. . Bhí nasc déshuilfíd ag thart ar 70% de phróitéiní L1 isteach i dimers nó pentamers níos mó, le MW tuartha de 110 kDa agus 280 kDa (Fíor 3A, lánaí 2, 4, agus 6). I gcodarsnacht leis sin, bhí cuma struchtúir mhonaiméirí i SDS-LEATHANACH neamh-laghdaithe ar bheagnach gach próitéin HPV-16 L1, L1:P18I10 agus L1:T20 sa mhaolán díchóimeála (Fíor 3A, lána 3, 5, agus 7). Léirigh na torthaí seo gur léirigh cobhsaíocht in vitro na VLPanna L1:P18I10 agus L1:T20 íonaithe patrúin tras-nasctha díshuilfíde cosúla le VLPanna HPV16 L1 faoi na coinníollacha pH, neart ianach agus teirmeacha céanna. Is cosúil go ndéantar na VLPanna íonaithe a mhiondealú go dtí leibhéal na bpeantaméirí, na dtriomairí agus na n-imitheoirí tar éis nochtadh fadtéarmach do thiúchan ard oibreán laghdaithe. Tá na sonraí seo ag teacht le staidéir roimhe seo [53,54] Mar sin féin, bhí díchóimeáil HPV: VLPanna VEID fós i bhfad ó bheith críochnaithe (monaiméirí).

Fíor 3. Cobhsaíocht in vitro L1:P18I10 agus L1:T20 VLPanna. (A) Déan tras-nascadh L1:P18I10 agus L1:T20 VLPanna a dhíshuíomh in SDS-PAGE nach laghdaíonn. Meascadh na VLPanna HPV16 L1, L1:P18I10 íonaithe, agus L1:T20 VLP le maolán samplach Laemmli in éagmais nó láithreacht 2-mercaptoethanol (18ME), faoi seach, agus rinneadh anailís orthu trí neamh-laghdú. SDS-LEATHANACH. Tá suíomh an mhonaiméir L1 (55 kDa), L1 dimer (110 kDa), agus L1 pentamer (280 kDa) léirithe ag an tsaighead. Lána 1: marcóir meáchain mhóilíneach próitéin; Lána 2: HPV16 L1 VLP; Lána 3: HPV16 L1 VLP cóireáilte le 2-ME; Lána 4: L1:P18I10 VLP; Lána 5: L1:P18I10 VLP cóireáilte le 2-ME; Lána 6: L1:T20 VLP; Lána 7: L1:T20 VLP cóireáilte le 2-ME. (B) Anailís mhais mhóilíneach ar VLPanna L1:P18I10 agus L1:T20. Rinneadh VLPanna cóimeáilte gan chóireáil le 2-ME (lánaí 2, 4, agus 6) a scagadh amach trí ghléasanna scoite 1000kDa meáchan móilíneach (MWCO) (painéal uachtarach). Scagadh amach VLPanna díchóimeáilte arna gcóireáil le 2-ME (lánaí 3, 5, agus 7) trí ghléasanna scagaire lártheifeacha 100kDa MWCO (painéal íochtair). Bailíodh retenates (R) ó thaiscumair samplacha feiste scagaire, agus bailíodh na scagáití (F) ag bun feadáin lártheifneora. Braitheadh ​​an comhartha próitéin L1 trí úsáid a bhaint as blot poncanna a raibh frith-HPV16 L1 mAb air.

To demonstrate that purified HPV: HIV proteins by chromatography are able to self-assemble to icosahedral particles, we further performed molecular mass analysis under the same reducing condition (5% 2-ME). The commercial HPV16 L1, purified L1:P18I10, and L1T20 proteins without reducing agent treatment were filtered out through 1000 kDa molecular weight cut-off (MWCO) diafiltration devices individually (Figure 3B, top panel). The L1 monomers (55 kDa), oligomers (110~200 kDa), or pentameric capsomers (280 kDa) were expected to pass through an ultrafiltration membrane retaining the integral VLPs (MW~20,000 kDa). The L1 signal of commercial HPV16 L1 proteins was detected in both retentates and filtrates. Most of the purified L1:P18I10 and L1T20 proteins formed large particles (>1000 kDa) agus caomhnaíodh iad i retentes. Bhí an patrún i gcomhthráth leis na sonraí a breathnaíodh i neamh-laghdú SDS-PAGE. Cé gur léiríodh na grúpaí VLP go léir ar déileáladh leo le 2-ME i mbanda monaiméireach (~55 kDa) sa SDS-PAGE neamh-laghdaithe (Fíor 3A, lána 3, 5 agus 7). Mar sin féin, níor rinneadh na VLPanna laghdaithe comhfhreagracha a scagadh amach trí sheicní ultrascagtha 100kDa (Fíor 3B, bunphainéil). Thug na torthaí seo le tuiscint go raibh próitéiní chimeric HPV: VEID in ann iad féin a chóimeáil le cáithníní níos mó, ach d'éiligh dí-chomhthionól uasta VLPanna isteach i monaiméirí ní hamháin laghdú ar bhannaí déshulfíde ach freisin fachtóirí dínádúraithe eile, mar pH nó neart ianach.

3.4. Tréithriú moirfeolaíoch ar VLPanna L1:P18I10 agus L1:T20

Baineadh úsáid as micreascópacht tarchurtha leictreon (TEM) chun scrúdú a dhéanamh ar chomhfhoirmiú moirfeolaíoch HPV16 L1 agus HPV: VLPanna VEID. Cuireadh na peiptídí VEID-1 P18I10 agus T20 isteach i lúba DE de phróitéin HPV16 L1, faoi seach. Is féidir leis na HPV16 L1 tráchtála seo agus an HPV chimeric: próitéiní capsid VEID iad féin a thiomsú go spontáineach in vitro isteach i VLPanna lárnacha ar thrastomhas thart ar 50–60 nm (Fíor 4A–C, painéal ar dheis). I gcomparáid le micreagraif leictreon de VLPanna HPV16 L1 a foilsíodh i staidéir roimhe seo [55,56], ní raibh an struchtúr icosahedral de HPV16 L1, L1: P18I10, agus L1: T20 VLPanna anseo níos lú codarsnachta agus doiléir. D’fhéadfaí é a chur i leith an imoibrí stainne diúltach a d’úsáideamar sa staidéar seo. Inár staidéar le déanaí a foilsíodh i staidéar roimhe seo [37] agus páipéar leanúnach eile faoi athbhreithniú piaraí (sonraí nach bhfuil léirithe), fuaireamar dea-chaighdeán agus réiteach micreagraif leictreon nuair a giosta- agus baculovirus-díorthaithe L1: P18I10 VLPs (an chimeric céanna). Tógáil) cothromaithe i PBS agus diúltach-dhaite le haigéad fosfatungstic (PTA). Toisc gur úsáideamar na córais táirgthe agus íonúcháin VLP éagsúla sa staidéar seo, rinneadh VLPanna L1:P18I10 agus L1:T20 a dhíorthaigh mamaigh a chothromú le Tris-HCl agus a dhaite diúltach le haicéatáit úráinil. Cé go bhféadfaí na micreagraif leictreon a fheabhsú, d’fhéadfaimis patrún soiléir a thabhairt faoi deara go bhféadfadh an chuid is mó den phróitéin capsid HPV16 L1, L1: P18I10, agus L1:T20 iad féin a chur le chéile i VLPanna moirfeolaíocha faoi scáileán TEM (Fíor 4A–C, painéal ar chlé). ). Go bunúsach, tá VLPanna HPV cosanta i gcoinne comhiomlánaithe i gcoinníollacha ard salainn [57]. Roinnt den chomhiomlánú inbhraite de HPV16 L1 agus HPV: D’fhéadfaí VLPanna VEID i maolán Tris-HCl le salann íseal a fheiceáil faoin formhéadú íochtair (Fíor 4A–C, painéal ar chlé). Ó na torthaí seo, tháinig muid ar an gconclúid nach ndearna modhnú ar sheicheamh lúb L1 DE pháirteach trí pheiptídí VEID-1 P18I10 nó T20 a chur isteach go mór ar mhoirfeolaíocht HPV: VLPanna VEID.

Fíor 4. Leictreonmhicreagraif de L1:P18I10 agus L1:T20 VLPanna. (A) Moirfeolaíocht HPV16 VLPanna. (B) Moirfeolaíocht L1:P18I10 VLPanna. (C) Moirfeolaíocht L1:T20 VLPanna. Glacadh VLPanna íonaithe ar ghreillí copair brataithe carbóin arna luchtú ag UV, agus bhí siad dhaite go diúltach le aicéatáit úráinil 2%. Fuarthas íomhánna faoi mhicreascópacht leictreoin tarchurtha. Seasann an barra 200 nm ag formhéadú 59,000 (painéal ar chlé) agus 100 nm ag formhéadú 135K (painéil ar dheis), faoi seach

3.5. Léiriú agus Imoibríocht na nEipitíopaí HPV-16 agus VEID{-1 

Chun a dhearbhú gur cuireadh i láthair epitopes seicheamhach VEID-1 P18I10 nó 2F5 i VLPanna crómatagrafaíocht-íonaithe L1:P18I10 nó L1:T20, rinneadh anailís blot an Iarthair agus ELISA indíreach trí úsáid a bhaint as mABanna a bhain go sonrach le epitope. Roghnaíomar antashubstaint mhonaclónach cáiliúil (mAb), ainmnithe CAMVIR-1, chun aitheantas a thabhairt don epitope ardchaomhnaithe (GFGAMDF, aa 230–236) de phróitéin HPV16 L1 [39,58]. Roghnaíodh mAb a foilsíodh roimhe seo a dhírigh ar VEID-1 gp120 epitope lúb V3 (RIQRGPGRAFVTIGK, aa308-322) chun epitopes seicheamhach P18I10 (RGPGRAFVTI, aa311-320) a bhrath [59]. Ar an láimh eile, roghnaíodh an antashubstaint neodrú leathan (bnAb) a aithníonn VEID-1 gp41 2Epitope F5 (ELDKWA) i gcoinne raon leathan cineálacha VEID saotharlainne-1 le haghaidh tréithriú peiptíde T20 [ 60,61]. Léirigh measúnacht blot an Iarthair a scrúdaíodh le HPV16 L1 mAb bannaí 55, 56, agus 58 kDa a fhreagraíonn do HPV16 L1, L1:P18I10, agus L1:T20 próitéin, faoi seach (Fíor 5A, B, ar chlé). Bhí an meáchan móilíneach (MW) de phróitéin L1:P18I10 cosúil le próitéin HPV16 L1 (Fíor 5A, ar chlé). Breathnaíodh an banna a fhreagraíonn do phróitéin L1:T20 beagán níos airde ná próitéin HPV16 L1, mar atá tuartha ón seicheamh aimínaigéad breise (Fíor 5B, ar chlé). Braitheadh ​​na bandaí de thart ar 56 agus 58 kDa, a chomhfhreagraíonn do L1:P18I10 agus L1:T20 próitéin, i measúnacht blot an Iarthair arna thástáil le frith-VEID-1 gp120 V3 agus 2F5 mAb, faoi seach (Fíor 5A, B, ar dheis ). Shíleamar go raibh an meáchan móilíneach (MW) de phróitéin frith-dhaite L1:T20 ceart agus gur fheistiú sé an 58 kDa a rabhthas ag súil leis (Fíor 5B, ar dheis). Mar sin féin, tá an MW de phróitéin dhaite L1:P18I10 frith-VEID-1 gp120 V{3-daite L1:P18I10 beagán níos ísle (Fíor 5A, ar dheis). D’fhéadfaí é seo a chur i leith struchtúr ilchineálach próitéiní chimeric L1:P18I10. Ós rud é go bhféadfaí an comhfhoirmiú epitope seicheamhach a chailleadh faoin gcoinníoll dínádúraithe in SDS-PAGE. Mar sin, rinneamar ELISA indíreach a thuilleadh chun an peptide comhfhoirmiúil P18I10 a léiriú i gceart ar ár VLPanna chimeric L1: P18I10 (Fíor 5E). Ar an láimh eile, d'aithin an lúb frith-VEID-1 gp120 V3 antashubstainte a d'úsáideamar an lúb iomlán V3 VEID seachas an epitope P18I10. Dá bhrí sin, bhí an comhartha frith-V3 iomlán níos ísle (Fíor 5A, B, painéil ar dheis). Mar sin féin, léirigh na torthaí seo go gcuirtear na peiptídí seicheamhach VEID{-1 P18I10 agus T20 i láthair sna VLPanna HPV: VEID.

Fíor 5. Léiriú eispitóip HPV-16 agus VEID{-1. (A, B) Brath epitope seicheamhach ar VLPanna L1:P18I10 agus L1:T20 chimeric. Rinneadh anailís ar na VLPanna íonaithe L1:P18I10 agus L1:T20 de réir blot an Iarthair, ag baint úsáide as frith-HPV16 L1, frith-VEID-1 gp120 V3 agus 2F5 mAb. Baineadh úsáid as na VLPanna HPV16 L1 mar rialú. Tá meáchan móilíneach na bpróitéiní L1 (55 kDa), L1:P18I10 (56 kDa), agus L1:T20 (58 kDa) léirithe leis an tsaighead. Lána 1: marcóir meáchain mhóilíneach próitéin; Lána 2: próitéin HPV16 L1; Lána 3: próitéin L1:P18I10; Lána 4: próitéin L1:T20. (C, D) HPV16 L1 mAb a cheangal le L1:P18I10 agus L1:T20 VLPanna chimeric. (E) Ceangal frith-VEID-1 gp120 V3 mAb le L1:P18I10 VLPanna chimeric. (F) VEID-1 2F5 mAb a cheangal le VLPanna L1:T20 cimeric. Rinneadh an líneghraf de ELISAnna indíreacha chun eiseapóipí comhfhoirmiúla na VLPanna athchuingreach HPV16 L1, L1:P18I10, agus L1:T20 atá ceangailte le frith-L1, frith-VEID-1 gp120 V3 nó 2F5 mAbs a bhrath, faoi seach. Tá na sonraí ionadaíoch ar thrí thurgnamh neamhspleácha. Rinneadh tástáil aischéimnithe líneach shimplí chun comparáid a dhéanamh idir difríocht líne na VLPanna íonaithe L1:P18I10 agus L1:T20 le cuar caighdeánach VLPanna L1 tráchtála; ns: ní suntasach; ** p < 0.01.

Ina theannta sin, chun a chinneadh an bhféadfadh na hantasubstaintí neodraithe in vitro gp120 V3 agus 2F5 a bheith aitheanta ar VEID VEID, rinneamar measúnacht indíreach ELISA le seiceáil. an tsainiúlacht agus an imoibríocht atá ceangailteach leis an epitope. Mar a léirítear i bhFíor 5C, D, HPV16 L1, L1:P18I10, agus L1:T20 VLPs aitheanta ag frith-L1 mAb. Rinneamar anailís líneach aischéimnithe chun fána gach líne caolaithe a chur i gcomparáid. Léirigh na torthaí nach raibh sainiúlacht L1 ceangailteach eiteipóp de cheachtar VLPanna L1:P18I10 nó L1:T20 difriúil ó VLPanna HPV16 L1. Ina theannta sin, bhí gp120 V3 mAb frith-VEID in ann L1:P18I10 VLPanna a cheangal, ach ní raibh VLPanna HPV16 L1 (Fíor 5E). Ina theannta sin, d'fhéadfadh an 2F5 mAb L1:T20 VLPanna a aithint, ach ní HPV16 L1 VLPs (Fíor 5F). Tar éis anailís aischéimniúcháin líneach, bhí an difríocht i sainiúlacht gp120 V3 ceangailteach epitope idir L1:P18I10 agus HPV16 L1 thar a bheith suntasach (p < 0.01%). Bhí sainiúlacht 2F5 epitope-cheangailteach de VLPanna L1:T20 difriúil go suntasach ó VLPanna HPV16 L1 (p < 0.01%). Léirigh an patrún seo nach raibh lipidí ceallacha hidreafóbacha riachtanach chun antasubstaintí 2F a neodrú le HPV: VLPanna VEID in vitro a cheangal. Cé go bhfuil imoibríocht antasubstaintí frith-VEID-1 gp120 V3 agus 2F5 a neodaíonn antasubstaintí do HPV: VLPanna VEID measartha éadrom, ceanglaíodh go suntasach ceangaltas frith-VEID-1 gp120 V3 agus 2F5 mAb le HPV: VLPanna VEID. epitop-shonrach.

3.6. Imdhíonacht L1:P18I10 agus L1:T20 VLPanna tar éis Imdhíonadh lucha BALB/c

Rinneamar measúnú ar na freagairtí imdhíonachta sonracha HPV16- agus VEID{-1-i ndiaidh imdhíonta lucha BALB/c le L1:P18I10 agus L1:T20 VLPanna. Taispeántar an sceideal imdhíonta i bhFíor 6A. Toisc go raibh imdhíon-ghineacht VLP-spreagtha tar éis riarachán mucosal níos laige go ginearálta ná tar éis riarachán sistéamach, rinneadh imdhíonadh ionmhatánach ar lucha le séú cuid den dáileog Gardasil-9 HPV16 L1 [22,62]. An aidiúvach hiodrocsa-fosfáit alúmanaim sulfáit le haghaidh dáileog (10 µg/100 µL) de HPV chimeric: Coigeartaíodh VLPanna VEID go dtí an tiúchan céanna (1 mg/1 mL) le Gardasil-9. Chun measúnú a dhéanamh ar an difríocht inscne i dtorthaí an vacsaínithe, rinneadh comparáid idir freagraí antasubstainte idir lucha fireanna (n=4) agus baineann (n=4). Sa ghrúpa L1:P18I10 VLP, L1:T20 VLP agus Gardasil-9, bhí freagraí antashubstainte frith-HPV16 L1 ó lucha baineanna níos airde ar an meán ná na lucha fireanna sin (Fíor 6B). Fuair ​​2 as 4 (50%) baineannaigh imdhíonta L1:P18I10 VLP, 3 as 4 (75%) baineannaigh imdhíonta L1:T20 agus gach (100%) lucha baineanna imdhíonta Gardasil leibhéal níos airde d’antasubstaintí frith-L1 ná lucha fireann. Bhí na freagraí frith-L1 a chothaigh lucha baineanna sa ghrúpa Gardasil i bhfad níos airde ná na lucha fireanna (p=0.0041) (Fíor 6B). Braitheadh ​​leibhéal an-íseal freagraí antashubstainte frith-L1 sa ghrúpa de bharrú BCG.HIVA agus treisiú L1:P18I10 VLP. Comhfhreagraíonn an patrún seo le torthaí roimhe seo a chuireann síos ar gurb é BCG freagraí T-chealla den chuid is mó seachas táirgeadh IgG [63].

Fíor 6. Ionduchtú freagairtí imdhíonachta greannacha ag L1:P18I10 agus L1:T20 VLPanna i lucha BALB/c. Léirítear an sceideal imdhíonta in (A) Bhí dáileadh comhionann inscne ag gach grúpa luiche (fireann n=4 agus baineann n=4). Grúpaí A agus B: imdhíonadh homalógach príomh-treisithe le 10 µg L1:P18I10 nó L1:T20 VLP go ionmhatánach (im); Grúpa C: priming le 106 cfu rBCG.HIVA intradermally (id) agus treisiú le 10 µg L1:P18I10 VLPs im; Grúpa D: vacsaíniú homalógach príomh-treisithe le Gardasil-9 ina bhfuil 10 µg de HPV16 L1 VLPs im; Grúpa E: imdhíonadh faoi dhó le maolán PBS. Ba é an t-eatramh príomh-treisithe ná 2 sheachtain. Ba é críochphointe na trialach seo an lá 28. Bailíodh agus caolaíodh sera ag titer 1:50 le haghaidh measúnachta ELISA. (B) HPV L1-IgG sonrach i lucha fireanna agus baineanna. (C–E) IgG a bhaineann go sonrach le heipitíopa arna tharlú ag VLPanna L1:P18I10 agus L1:T20. Rinneadh ELISA chun anailís a dhéanamh ar fhrith-L1, frith-P18I10, agus frith-T20 IgG arna tharlú ag lucha BALB/c tar éis teaglaim éagsúla príomhbhreise mar a thuairiscítear thuas. Taispeántar sonraí mar mheán ± SD Rinneadh tástáil aontreo ANOVA (neamhparaiméadrach) chun difríochtaí idir grúpaí a chur i gcomparáid. OD: optúladlús. N nach bhfuil suntasach; ** p < 0.01

Rinneamar measúnú an bhféadfadh lucha a imdhíonadh le L1: P18110 agus L1: T20 VLPanna antashubstaintí sainiúla HPV agus VEID {6}} i lucha BALB/c a aslú. Rinneadh antasubstaintí IgG spreagtha VLP i sera murine a thomhas ag ELISA atá brataithe le próitéin athchuingreach HPV16 L1, P18I10, nó peiptídí T20, faoi seach. Braitheadh ​​difríocht staitistiúil in IgG sonrach L{1-ag serum titer de 1:50 sa ghrúpa Gardasil{-9 i gcomparáid leis an ngrúpa rialaithe PBS (p=0.0039). Bhí na freagraí frith-L1 i measc Gardasil-9, L1:P18I10, agus L1:T20 VLP-imdhíonta mar a chéile agus ní raibh mórán difríochta eatarthu (Fíor 6C). Fuair ​​lucha treisithe BCG.HIVA2auxo.int prime agus L1:P18I10 VLP leibhéal an-íseal IgG frith-L1. Thug na torthaí seo le tuiscint go raibh an leibhéal céanna IgG frith-L1 ag lucha imdhíonta VLP: VEID agus lucha imdhíonta Gardasil (Fíor 6C). Cé gur dealraitheach go huimhriúil go bhfuil treocht ag an ngrúpa L1:P18I10 VLP i dtreo leibhéal níos airde de IgG epitope-shonrach P18I10 ná grúpaí imdhíonta eile, ní raibh na difríochtaí seo suntasach go staitistiúil (Fíor 6D). I gcuid de lucha L1:P18I10-imdhíonta VLP (4 as 8, 50%), breathnaíodh antashubstaintí ceangailteacha frith-P18I10 níos airde i gcomparáid le lucha imdhíonta Gardasil. Nó, léirigh anailís T-tástáil go raibh an difríocht idir an grúpa L1:P18I10 VLP agus Gardasil{{-9 grúpa suntasach (p=0.005) (sonraí gan taispeánta). Sa ghrúpa L1:T20 VLP, braitheadh ​​freagairt antashubstainte i bhfad níos airde in aghaidh na peiptíde T20 i gcomparáid leis an ngrúpa Gardasil (p=0.0083). De réir mar a bhíothas ag súil leis, ní raibh na titers frith-T20 inbhraite i Gardasil-9, PBS, L1:P18I10 VLP, agus BCG.HIVA prime in éineacht le grúpaí treisithe L1:P18I10 VLP (Fíor 6E). Bhí titer an antashubstainte peptide-shonrach T20 sách íseal. Is dócha go bhfuil sé seo mar gheall ar: (1) Is peptide subdominant é T20; (2) teastaíonn comhchuingeacha peptide-lipid (Fíor 6E) chun antasubstaintí neodraithe MPER nó 2F5 a dhíshealbhú. Ar an iomlán, léirigh ár dtorthaí go bhféadfadh VLPanna L1:P18I10 agus L1:T20 freagairtí sainiúla antashubstainte i lucha a bheith mar thoradh ar VEID ach lag VEID.

cistanche tubulosa-feabhas a chur ar chóras imdhíonachta

Chun meastóireacht a dhéanamh ar fhreagairtí imdhíonachta T-chealla VSD agus VEID-shonracha i lucha, leanamar an sceideal imdhíonta a thaispeántar i bhFíor 7A. Ina theannta sin, rinneadh comparáid idir priming heitrologous BCG.HIVA2auxo.int agus treisiú L1:P18I10 VLP le príomh-imdhíonadh homalógach L1:P18I10 VLP agus treisiú chun minicíocht freagairtí imdhíonachta T-chealla sonrach-HPV16 agus VEID -1 a mheas. Ní raibh aon difríochtaí idir grúpaí Gardasil-9 agus PBS maidir le secretion IFN tar éis spreagadh splenocyte le VLPanna HPV16 L1. Ní raibh difríochtaí suntasacha freisin idir grúpaí L1:P18I10 VLP agus Gardasil. Bhaineamar amach go bhféadfaí an secretion lag IFN- sonrach L{1-a chur i leith an tiúchan íseal (2 µg/mL) de VLPanna HPV16 L1 a úsáidtear mar spreagthaigh. Chonacthas an grúpa BCG.HIVA2auxo.int prime agus L1:P18I10 treisiú VLP minicíocht níos airde splenocytes secreting IFN agus difríochtaí suntasacha i secretion IFN i gcomparáid le lucha vacsaínithe le Gardasil{-9 ghrúpa (p=0 }}.0103). Fuair ​​3 lucha as 8 (~38%) na freagraí sonracha L{1- is airde IFN- (Fíor 7B). D’fhéadfaí é seo a chur i leith aidiúvacht neamhshonrach BCG de réir ár staidéir roimhe seo [64-66]. Tá an éifeacht phríomha fhollasach, fiú amháin de réir chineál fiáin BCG, ag teacht le cumas díorthaigh rBCG gníomhú mar aidiúvaigh láidre chun vacsaíní a threisiú ina dhiaidh sin [64,65]. Maidir leis na freagairtí sonracha T-chealla VEID, breathnaíodh an méid iomlán is airde de chealla spotfhoirmithe IFN (SFC)/106 splenocytes i lucha preim BCG.HIVA2auxo.int i gcomparáid le lucha a fhaigheann Gardasil{{54} } vacsaíní nó L1:P18I10 VLPanna. Phrím lucha le BCG.HIVA agus neartaíodh iad le L1:P18I10 VLPanna d’éirigh go mór le secretion IFN- níos airde i gcomparáid le lucha a vacsaíníodh le príomh-bhreisiú homalógach L1:P18I10 VLP (p=0.0268). Ina theannta sin, chonacthas secretion IFN i bhfad níos airde i lucha a vacsaíníodh le L1:P18I10 VLPanna i gcomparáid le lucha a fhaigheann vacsaíní Gardasil-9 (p=0.0157) (Fíor 7C). Mar a bheifí ag súil leis, ní raibh an rún IFN inbhraite i ngrúpaí Gardasil agus PBS. Léirigh na torthaí seo gur tharraing (1) L1:P18I10 VLPanna freagairtí imdhíonachta T-chealla ar leith do VEID; (2) L1:P18I10 D’aimsigh VLPanna freagairtí imdhíonachta T-chealla a bhain go sonrach le HPV agus (3) D’fhéadfadh BCG.HIVA2auxo.int na freagairtí imdhíonachta T-chealla sonracha VEID a spreag L1:P18I10 VLP.

Fíor 7. Ionduchtú ar fhreagraí sonracha cille T HPV16 agus VEID-1 trí VLPanna L1:P8I1{{{0 chimericeacha agus BCG.HIVA i lucha BALB/c. Léirítear an sceideal imdhíonta in (A). Bhí dáileadh comhionann inscne ag gach grúpa luiche (fireann n=4 agus baineann n=4). Grúpa A: imdhíonadh homalógach príomh-treisithe le 10 µg L1:P18I10 VLP go ionmhatánach (im); Grúpa B: priming le 106 cfu rBCG.HIVA intradermally (id) agus treisiú le 10 µg L1:P18I10 VLPs im; Grúpa C: vacsaíniú homalógach príomh-treisithe le Gardasil-9 ina bhfuil 10 µg de HPV16 L1 VLPs im; Grúpa D: imdhíonadh faoi dhó le maolán PBS. Ba é an t-eatramh príomh-treisithe ná 2 sheachtain. Ba é críochphointe na trialach seo an lá 28. Rinneadh splenocytes a leithlisiú le haghaidh measúnacht phota IFN-ELIS. Rinne IFN-ELISpot measúnú ex vivo ar fhreagraí imdhíonachta T-chealla ar HPV16 agus VEID-1 tar éis spreagadh splenocyte le peiptíd HPV16 L1 VLP agus P18I10. (B, C) Freagraí sonracha T-chealla L1:P8I10 agus BCG.HIVA prime mar aon le treisiú L1:P18I10 VLP (B, C) HPV16 L1- agus VEID-1 P8I{39}}P8I. Taispeántar sonraí mar airmheán ± SD Rinneadh tástáil ANOVA aontreo chun difríochtaí idir grúpaí a chur i gcomparáid. N nach bhfuil suntasach; * p < 0.05.

4. Discúisín

Is galair ghnéas-tarchurtha iad HPV16 agus HIV-1 agus is iomaí staidéar vacsaíne a ndírítear orthu faoi láthair. Cé go bhfuil tráchtálú déanta ar vacsaíní próifiolacsacha HPV agus go bhfuil tarchur VEID rialaithe go mór ag cóireáil fhrith-aisvíreasach (ART) agus PrEP, tá géarghá le vacsaín chimeric éifeachtach, sábháilte agus inacmhainne HPV: VEID in aghaidh an dá víreas. Sa staidéar seo, (1) léirigh muid go bhféadfadh an córas slonn 293F agus an modh íonú crómatagrafaíochta a bheith indéanta chun L1: P18I10 agus L1: T20 VLPanna chimeric a tháirgeadh agus a íonú; (2) dheimhnigh muid nach ndearna cur isteach peptídí P18I10 nó T20 isteach sa lúb DE de phróitéiní capsid HPV16 L1 difear do chobhsaíocht in vitro, féin-thionól agus moirfeolaíocht HPV chimeric: VLPanna VEID; (3) Na peiptídí P18I10 nó T20 seicheamhach agus comhfhoirmiúil a nochtar do lúba DE de HPV chimeric: D'fhéadfaí VLPanna VEID a bhrath trí antasubstaintí neodraithe frith-VEID -1 gp120 V3 agus 2F5 in vitro; (4) D'fhéadfadh na VLPanna chimeric L1:P18I10 agus L1:T20 antashubstaintí ceangailteacha sonracha VEID a fháil ach VEID lag i lucha BALB/c. Ina theannta sin, níor chuir ionsá peiptídí VEID{{-1 P18I10 nó T20 isteach i bpróitéin HPV16 L1 isteach ar ionduchtú sainiúil antashubstainte in vivo HPV16 L; (5) L1:P18I10 D'fhéadfadh VLPanna freagairtí sonracha T-chealla HPV16 agus VEID a chothú; (6) Fuair ​​treisiú BCG.HIVA prime agus L1:P18I10 VLP an méid is airde de splenocytes a tháirgeann IFN i gcomparáid le L1:P18I10 VLPanna treisiú homalógach príomha i lucha BALB/c. Thacaigh na torthaí seo le tuilleadh forbartha a dhéanamh ar vacsaíní VEID bunaithe ar rBCG agus HPV chimeric: VLPanna VEID. Tríd is tríd, cuireann an staidéar seo straitéis bhonnlíne ar fáil a d’fhéadfadh a bheith fiúntach chun tacú leis na hiarrachtaí domhanda chun vacsaíní nua chimeric-bhunaithe VLP a fhorbairt chun ionfhabhtuithe HPV agus VEID a rialú.

Sa staidéar seo, d'fhéadfadh L1:P18I10 agus L1:T20 VLPanna an leibhéal céanna antasubstaintí ceangailteach frith-HPV16 L1 a aslú agus a d'fhéadfadh a bheith ag an vacsaín HPV Gardasil-9. Mar sin féin, ní fhaigheann VLPanna L1:P18I10 agus L1:T20 ach leibhéil ísle de P18I10 agus T20 freagraí antashubstainte a bhaineann go sonrach le VEID a bhaineann go sonrach le heipitíopa. Rinneamar hipitéisí a d'fhéadfadh a bheith mar gheall ar phlátaí measúnachta ELISA a bheith brataithe le próitéin athchuingreach HPV16 L1, peiptíd VEID{-1 P18I10, agus peiptíd VEID{-1 T20, faoi seach. D'fhéadfadh na hantasubstaintí frith-L1 murine a tharlódh lenár VLPanna L1:P18I10 agus L1:T20 díriú ar eiseapóipí ceangailteacha iolracha de phróitéin L1. I gcodarsnacht leis sin, ní dhíríonn antasubstaintí frith-VEID-1 murine a fhaigheann ár VLPanna L1:P18I10 agus L1:T20 ach ar pheiptíd VEID amháin (P18I10 nó T20) ar VLPanna VEID: VEID. Mar thoradh air sin, bhí uasluachanna foriomlána OD450 d’antasubstaintí ceangailteacha frith-VEID i bhfad níos ísle ná antasubstaintí frith-HPV16 L1.

Is é an fáth gur roghnaigh muid lúb DE HPV16 L1 próitéin capsid mar an réigiún ionsáite réamhimdhíonachta VEID-1 tagairt do staidéar roimhe seo a rinne imdhíonadh ar lucha le papillomavirus buaibheach (BPV): VLPanna VEID chun freagraí antasubstainte a spreagadh [20]. Tá sé ar eolas go gcuireann na epitopes atá suite laistigh de lúba dromchla-nochta DE agus FG de phróitéiní móra capsid HPV L1 go príomha leis na antasubstaintí tras-neodraithe de bharr vacsaín [67]. Ina theannta sin, tá sé léirithe ag staidéir roimhe seo go bhféadfadh ionsá VEID-1 MPER isteach sa lúb BPV L1 DE antasubstaintí a neodrú go páirteach a aithníonn go sonrach comhfhoirmiú dúchasach MPER i VEID-1 Env [20]. Mar sin féin, níor léirigh aon sonraí cibé an gcuireann an BPV L1:MPER VLP athchuingreach isteach ar an imdhíon-ghineacht agus ar an neodrú i gcoinne BPV tar éis VEID-1 MPER a chur isteach i bpróitéin BPV L1. Inár staidéar ag baint úsáide as VLPanna HPV16 L1 mar veicteoir seachadta antaiginí VEID, thugamar faoi deara nach bhfuil struchtúr HPV L1 modhnaithe ag ionsá peptide VEID, agus go bhfuil an cumas ag próitéiní HPV: VEID chimeric VLPanna a fhoirmiú. Ina theannta sin, rinneamar an coincheap maidir le hindhroicheadú chun freagairtí imdhíonachta inchomparáide a léiriú idir iarrthóir VLP: VEID VLP (ár n-iarrthóir) agus vacsaín VLP-bhunaithe VLP ceadaithe (Gardasil ceadúnaithe-9). Thug ár sonraí le fios go bhféadfadh iontráil peptide VEID{{-1 P18I10 nó T20 i HPV chimeric: VLPanna VEID titer comhchosúil d’antasubstaintí ceangailteacha sonracha HPV16 L a fháil, i gcomparáid leis an Gardasil HPV-9 vacsaín. Bhí na hantasubstaintí ceangailteacha frith-HPV16 L1 cineál-shonracha a breathnaíodh le vacsaín VLP ceadúnaithe HPV Gardasil i gcomparáid le leaganacha chimericeacha den vacsaín HPV Gardasil-9 ag teacht lenár sonraí.

Fad agus suíomh antaigin choigríche optamach VEID-1 atá ionchorpraithe sna VLPanna HPV16 L1 agus cobhsaíocht in vitro an HPV chimeric mar thoradh air: Ba cheart VLPanna VEID a fhíorú roimh imdhíonadh lucha. Tá sé léirithe ag ár staidéar reatha nach raibh tionchar ag cur isteach peptídí P18I10 nó T20 i próitéin HPV16 L1 ar chobhsaíocht in vitro, ar fhéin-chomhthionól, agus ar mhoirfeolaíocht HPV chimeric: VLPanna VEID. Bhí na torthaí seo ag teacht le staidéir roimhe seo a thug le fios nach raibh tionchar ag ionsá fearann ​​​​VEID-1 MPER isteach i seicheamh lúb BPV L1 DE ar chumas féin-chóimeáil próitéin capsid BPV L1 le VLPanna [20]. Go bunúsach, cuireann epitopes atá suite laistigh de lúba dromchla-nochta DE agus FG de na próitéiní capsid HPV L1 go príomha le hionduchtú L1-antasubstaintí tras-neodracha ar leith [67]. Anseo, thaispeánamar nach raibh tionchar ag ionduchtúchán sonrach antashubstainte ar L{1- ag HPV chimeric: VLPanna VEID tar éis imdhíonta do lucha nuair a cuireadh peptides VEID-1 P18I10 nó T20 isteach sa lúb HPV16 L1 DE. Ina theannta sin, tá na epitopes VEID-1 P18I10 nó T20 ar lúba HPV16 DE de HPV chimeric: VEID VLPanna braitheadh ​​​​in vitro agus bhí siad imdhíonta in vivo. HPV16 L1 Is éard atá i VLPanna ná scafall féideartha chun mórthionscnamh spéise VEID a thaispeáint ar an dromchla. Sa staidéar seo, rinneamar ELISA indíreach chun an peptide comhfhoirmiúil P18I10 agus T20 a chuirtear i láthair ar dhromchla ár HPV chimeric: VLPanna VEID a léiriú. Sa todhchaí, d'fhéadfadh micreascópacht imdhíon-leictreon a bheith ina chur chuige breise freisin chun logánú struchtúrach antaiginí P18I10 nó T20 a léiriú agus eagrú laistigh de HPV: VLPanna VEID.

Is innéacs ionadaíoch é féintionól de chobhsaíocht in vitro VLPanna HPV16 L1. Tá sé ar eolas go bhfuil comhghaol idir pH, neart ianach, teocht [52], agus timpeallacht redox le bannaí disulfide de phróitéiní capsid HPV16 L1 [53]. Mhol na hoibreacha níos luaithe ar VLPanna papillomavirus an tábhacht a bhaineann le bannaí disulfide le mórfhéinthionól capsid L1 [68,69]. Léirigh foirmiú disulfide cistéin níos airde de phróitéin capsid L1 i gcéimseata cuí [53]. Nascann na tras-naisc disulfide seo le hiarmhair 175 agus 428 (do HPV16) a chobhsaíonn virions HPV agus VLPanna [70]. Sa staidéar seo, rinneamar anailís ar phatrúin tras-nasctha díshuilfíde idirmhóilíneacha mar fhianaise indíreach chun a chruthú go mbíonn claonadh ag ár bpróitéiní capsid L1:P18I10 agus L1:T20 teacht le chéile in vitro iad féin. I bhFíor 3A, léirigh muid gur léirigh VLPanna íonaithe L1:P18I10 agus L1:T20 patrúin tras-nasctha déshilfíde idirmhóilíneacha cosúla le VLPanna HPV16 L1 faoi na coinníollacha pH, neart ianach agus teirmeacha céanna. I bhFíor 3B, léirigh muid freisin go raibh próitéiní íonaithe L1:P18I10 agus L1:T20 in ann iad féin a chur le chéile le cáithníní níos mó (níos mó ná L1 pentamer MW 280 kDa) in vitro. Mar sin, in éineacht leis an bpatrún VLP féin-tionóil moirfeolaíoch (cé nach raibh an struchtúr icosahedral sách maith) a breathnaíodh i bhFíor 4, thugamar chun críche ár HPV chimeric íonaithe: tá VLPanna VEID cobhsaí in vitro. Chomh maith le cobhsaíocht VLP, ba cheart go leor fachtóirí criticiúla eile a d'fhéadfadh tionchar a bheith acu ar imdhíon-ghineacht HPV chimeric: VLPanna VEID a mheas, mar shuíomh ionsáite imdhíon-ghineachta i measc lúba éagsúla VLPanna [71], dáileog, eatraimh phríomh-threisiú, agus bealach riaracháin [22] , etc.

Cuirtear na peptídí P18I10 a dhíorthaítear ón lúb VEID -1 gp120 V3 i láthair i gcealla atá ionfhabhtaithe le VEID ag móilíní aicme I casta histocompatibility móra (MHC-I) [26]. D'fhéadfadh CD8+, limficítí T cíteatocsaineacha (CTL), antaiginí P18I10 teoranta MHC-I a aithint agus éagsúlacht cítocíní a chur faoi deara, mar shampla IFN- chun cealla ionfhabhtaithe le VEID a dhíchur [72-75]. Is feithiclí maithe vacsaíne iad DNA víreasach nó plasmid athchuingreach chun peiptídí P18I10 a chur in iúl i gcealla óstaigh agus chun freagairtí ceallacha sonracha P18I a spreagadh tríd an gcosán MHC-I [76-79]. Mar shampla, ba leor réimeas comhcheangailte de threisiú DNA príomh-víreas vaccinia Ankara (MVA) chun freagairtí IFN- agus CTL a ionduchtú i gcoinne an epitope P18I10 [79]. Os a choinne sin, ní chuirtear peiptídí P18I10 exogenous i láthair go héifeachtach do T-chealla CD8+ tríd an gcosán MHC-I [80,81] agus éilíonn siad rannpháirtíocht aidiúvach cuí [82-85] nó iompróirí antaiginí, mar shampla VLPanna. Mar shampla, bhí imdhíon-ghineacht peiptídí sintéiseacha P18I10 arna bhforlíonadh le aidiúvaigh imeallach mar gheall ar easpa deitéarmanaint T-chúntóir [82-85]. Tuairiscíodh roimhe seo go bhfuil VLPanna VEID{-1 Gobán [{86], VLPanna antaiginí dromchla heipitíteas B (HBsAg) [87], VLPanna parvaivíris VP2 [88], agus VLPanna papillomavirus L1 [17–19] d’fhéadfadh siad gníomhú mar veicteoirí seachadta le haghaidh cur i láthair epitope CTL teoranta MHC-I in vivo. Cé nach bhfuil an mheicníocht maidir le freagraí T-chealla srianta MHC-I-spreagtha VLP soiléir fós, d'fhéadfadh struchtúr cáithníneach VLPanna leas a bhaint as glacadh endocytic macrophages nó cealla dendritic, agus mar sin rochtain a fháil ar an gcíteasól agus ag dul isteach ina dhiaidh sin cosán tipiciúil MHC-I [89, 90]. Ina theannta sin, breathnaíodh go spreagtar an cinntitheach MHC-I-srianta P18I10 chun freagairtí T-chealla cúntóir CD4+ a spreagadh trí chonair MHC-II [91,92]. Is féidir VLPanna hibrideacha BPV1 L1 a úsáid mar iompróirí epitóp antaigineacha chun freagraí teiripeacha víreas-shonracha CTL a fháil trí chosáin MHC-I agus MHC-II [17,19], ag soláthar straitéis geallta do dhearadh na vacsaíne chun ionfhabhtú víreasach a rialú. Léirigh roinnt staidéir luatha freisin go raibh VLPanna BPV L1 ag léiriú epitope HPV16 E7 nó epitope P18I10 de VEID-1 gp120 V3 dromchlaí mucosal lúb-spreagtha agus freisin díolúine sistéamach VLP epitop-sonrach humoral agus cealla T [18]. Ag teacht le staidéir roimhe seo, tá réamhléiriú déanta againn go bhféadfadh ár VLPanna chimeric HPV: VEID (L1:P18I10) freagairtí imdhíonachta T-chealla a bhaineann go sonrach le VEID i lucha BALB/c tar éis spreagadh splenocyte le peiptíd P18I10. Ina theannta sin, chuir tús le BCG.HIVA feabhas ar na freagairtí imdhíonachta T-chealla ar leith do VEID i lucha. Mar sin féin, bheadh ​​gá le tuilleadh staidéir imdhíoneolaíochta ar na freagairtí imdhíonacha T-chealla ilfheidhmeacha a tharlódh L1:P18I10 VLPanna.

Tá freagairtí T-chealla níos leithne ar CD8+ i gcoinne eipitéipí CTL iomadúla caomhnaithe chun leasa na héagsúlachta géiniteacha VEID agus éalú [7,93-100]. Ba cheart go mbeadh an cumas ag dearadh réasúnach na n-imdhíon-ghiní T-chealla VEID, mar VEID, freagairt d'il-eipitíopaí CTL [34]. Tá an t-imdhíonacht VEID VEID, a dhear an Dr. Tomas Hanke, comhdhéanta den phróitéin gobán iomlán VEID in éineacht le heipitíopaí iolracha CTL lena n-áirítear epitopes P18I10 ag an C-terminus [34]. Roghnaíodh an DNA, MVA, agus rBCG mar fheithiclí seachadta imdhíonta VEID agus spreag siad méid ard agus fairsinge na bhfreagraí ceallacha a bhaineann go sonrach le heipitíopa CTL trí úsáid a bhaint as réimis heitrologacha príomh-ardaithe i múnlaí lucha agus príomhaigh neamhdhaonna (NHP) [34,101]. Tá sé léirithe ag ár réamhstaidéir gur spreag BCG.HIVA prime i gcomhar le treisiú MVA.HIVA VEID-1-T-chealla sainiúla IFN a tháirgeann CD{8+ i lucha BALB/c [31–33,102]. Suimiúil go leor, d’fhéadfadh VLPanna a bheith ina teanndáileog féideartha chun freagairtí ceallacha VEID-shonracha a mhéadú san imdhíonadh heterologach le rBCG [29,30] nó vacsaíní DNA [103,104]. Mar shampla, rBCG ag léiriú VEID-1 D’fhéadfadh próitéin gobán an córas imdhíonachta T-chealla a threorú go héifeachtach le haghaidh treisithe le VLPanna Gag i múnlaí NHP [29,30]. Sa staidéar reatha, tá sé léirithe againn go bhféadfadh túsú BCG.HIVA na freagairtí imdhíonachta T-chealla a spreagann VLPanna VEID: VEID (L1:P18I10) a threisiú. Déanfaimid imscrúdú breise ar mhéid na bhfreagraí ilfheidhmeacha CD4+, CD8+, agus T-chealla cuimhne a ghineann an príomh-réimeas treisithe rBCG agus VLP seo.

cistanche tubulosa-feabhas a chur ar chóras imdhíonachta

Faoi láthair, tá ár ngrúpa taighde ag díriú ar fhorbairt rBCG tuar dóchais inti: vacsaíní VEID a léiríonn imdhíonaigine T-chealla núíosacha VEID, mar imdhíonaigine T-chealla tHIVconsvX agus VEIDACAT (HTI), chun VEID a fheabhsú-1 meaitseáil athraitheach agus leithead freagartha T-chealla. Dearadh imdhíon-ghiní HIVconsvX den dara glúin trí ath-shainmhíniú a dhéanamh ar na réigiúin chaomhnaithe grúpa M agus úsáid a bhaint as dearadh mósáic défhiúsach chun an mheaitseáil is fearr a bhaint as 9-eipitíopaí féideartha T-chealla sa vacsaín le leaganacha domhanda [64]. Ceapadh an t-imdhíonacht HTI chun spriocanna T-chealla a chumhdach a dtugtar freagraí T-chealla orthu go príomha i ndaoine aonair ionfhabhtaithe le VEID -1 ualaí víreasacha [65,66]. Toisc gur cruthaíodh gur iomad-iompróirí CTL epitope iad VLPanna papilloma [17], bhí sé mar aidhm againn VLPanna chimericacha HPV16 L1 a thógáil a iompraíonn il-eipitíopaí CTL VEID caomhnaithe i gcomhar le rBCG ag léiriú imdhíon-ghiní T-chealla ThivconsvX nó HTI chun níos mó a aslú. Freagraí imdhíonachta CTL i gcoinne VEID-1. D’fhéadfadh na hard-dlúis agus na cóipeanna iolracha den epitope CTL VEID {-1 a cuireadh i láthair ar HPV chimeric: VLPanna VEID feabhas a chur ar sheachadadh antaigin don chóras imdhíonachta agus minicíocht níos airde freagraí CTL a spreagadh. I gcodarsnacht leis sin, is dóichí go nginfidh BCG athchuingreach minicíocht níos ísle freagraí CTL mar gheall ar mhacasamhlú mall in vivo. Toisc go bhfuil tionchar ar leith ag BCG ar dhifreáil na gcealla T, rud a chiallaíonn gur féidir le BCG cuimhne cealla T CD8+ a aslú trí rannpháirtíocht cealla T-chúntóra CD4+ [105], tá an airí imdhíon-ghineach seo d'fhéadfadh sé go mbeadh BCG oiriúnach mar oibreán priming i réimis ilchineálacha treisithe. Mar sin, bhíomar ag súil go bhféadfadh an chuma a bheith ar ár HPV: VLPanna VEID mar teanndáileog geallta chun méid agus fairsinge na bhfreagairtí CTL VEID a mhéadú agus BCG athchuingreach ag léiriú imdhíon-ghin T-chealla nua in iúl do VEID. .

Tá epitope líneach 2F5 (ELDKWA) an-chaomhnaithe sa pheptíd T20. Tuairiscíodh go raibh éifeachtúlacht neodraithe den chuid is mó ag an antashubstaint 2F5 a bailíodh ó othair fadtéarmacha ionfhabhtaithe [106,107]. Meastar go bhfuil an MPER de gp41 droch-imdhíon-ghineach, b'fhéidir a bhaineann lena shuíomh gar don déchiseal fosfailipidí ceallach agus víreasach [108]. Tá sé tairbheach úsáid a bhaint as veicteoirí DNA a chuireann MPER i láthair i dtimpeallacht lipid chun gp41-NAbs ar leith a aslú [109–111]. Mar shampla, léiríodh go n-eascródh na vacsaíní ionchódaithe DNA VEID, a dhear an Dr. Britta Wahren, freagairtí neodrú antashubstainte tras-chlade [109]. I gcodarsnacht leis sin, theip ar go leor iarrachtaí luatha chun NAbs a spreagadh chun díriú ar gp41 trí úsáid a bhaint as straitéisí vacsaíne peptide nó fo-aonaid [112-116]. Le déanaí, thug roinnt staidéir le fios go raibh neodrú traschlúideach mar thoradh ar neodrú tras-chláta ag VLPanna BPV L1 a léirigh 2F5 epitope nó MPER de VEID-1 gp41 spreagtha 2F5-antasubstaintí sonracha i lucha [20,21]. Fuarthas patrún imdhíon-ghineachta comhchosúil nuair a comhleádh antaigin dromchla heipitíteas B (HBsAg) le VEID-1 2epitope F5 nó MPER [59,117–119]. Anseo, léirigh muid go bhféadfadh cur i láthair na peptide VEID{{2 T20 agus P18I10 inár VLP chimeric HPV16 L1 freagairtí antashubstaintí i gcoinne VEID-1 agus HPV16. D'fhéadfadh epitopes neodraithe cobhsaithe ar scafall comhfhoirmiúil, mar shampla spikes feidhmiúla VEID nó VLPanna, a bheith mar phríomhshrutha dearadh imdhíonaigine B-chealla chun antasubstaintí neodraithe leathana (bnAbs) a bhaint amach [93]. Mar sin féin, is réigiúin neamhleanúnacha agus comhdhéanta iad an chuid is mó d’eipitíopaí bnAb núíosacha (thart ar 90%) tugtha le chéile i 3-chumraíochtaí tríthoiseacha [120]. Cé go bhféadfaí cur i láthair epitopes neamhleanúnach ar scafall próitéine a thuar trí shamhaltú ríomhaireachtúil [121], d'fhéadfaí dúshlán a thabhairt do na epitopes bnAb seo a bheith leabaithe i scafall próitéin HPV16 L1 neamh-chlúdach. I gcodarsnacht leis sin, tá eipitéipí neodrúcháin líneacha i mionlach d’imdhíon-ghiní B-chealla VEID, mar shampla MPER (2F5) de VEID-1 gp41 nó lúb V3 (P18IIB) de gp120, agus d’fhéadfadh go mbeadh siad oiriúnach don HPV: cnámh droma próitéin VEID. Dá bhrí sin, roghnaigh muid an epitope neodraithe líneach 2F5 atá san áireamh i peptide T20 leathnaithe de VEID -1 MPER i dtéarmaí struchtúr fabhrach le haghaidh foirmiú -helix [122]. D'fhéadfaí peptídí T20 a chomhleádh agus a chobhsú ar scafaill capsid L1 chun freagraí neodraithe antashubstainte a fháil dá bhféadfaí cumraíocht dhúchasach an epitope 2F5 a chur i láthair. Sa staidéar seo, fuaireamar amach go raibh 2F5 nAbs ceangailte le VLPanna chimericacha: VEID (L1:T20) in vitro. Ina theannta sin, is féidir leis na VLPanna L1:T20 antasubstaintí ceangailteacha sonracha T a aslú i lucha BALB/c. Bhí fianaise ag dul i méid go bhfuil airíonna comhchosúla ag antasubstaintí coisctheacha comhleá comhleá (T20) VEID agus peptide comhleá Enfuvirtide frith-VEID -1 chun an t-iarmhar hidreafóbach tras-scileánach T20 atá suite i MPER de gp41 a cheangal le linn. VEID-1 agus cuireann sé le rialú víreasach [109,123,124]. De réir ár n-athbhreithnithe roimhe seo, bheadh ​​gá i gcónaí smaoineamh ar dhearadh réasúnach vacsaíní chimeric-bhunaithe VLP chun freagairtí antashubstaintí neodrú-shonracha HPV agus VEID agus CTL a aslú i dtéarmaí roghnú imdhíonaigine, veicteoirí seachadta antaiginí, agus réimis threisithe príomha. Mar fhocal scoir, léirigh an staidéar seo ardán slonn malartach ceall-bhunaithe mamaigh agus modh íonú crómatagrafach inscálaithe chun HPV chimeric a innealtóireacht: VLPanna VEID. Measaimid go gcabhróidh ár modhanna íonúcháin nua le haisghabháil HPV antaigineach: VLPanna VEID ó chealla mamacha leis an sprioc am, costas agus saothair a laghdú agus an cumas táirgthe tionsclaíoch a mhéadú, chomh maith leis sin, léirigh muid gur féidir le VLPanna HPV16 L1 oibriú mar a ardán seachadta chun antaigin peptide VEID a iompar toisc nach raibh tionchar ag ionsá peptides P18I10 nó T20 isteach sa lúb DE de phróitéiní capsid HPV16 L1 ar chobhsaíocht in vitro, ar fhéin-chóimeáil, agus ar mhoirfeolaíocht HPV chimeric: VLPanna VEID agus rinne sé gan cur isteach ar ionduchtú sainiúil antashubstainte HPV16 L in vivo. Ar an láimh eile, HPV chimeric: D'fhéadfadh VLPanna VEID freagairtí imdhíonachta HPV16 agus VEID-shonracha B agus T-chealla a fháil i gcoinne an dá víreas. Scrúdaigh an tuarascáil seo an fhéidearthacht vacsaíní VEID a fhorbairt bunaithe ar imdhíonáin athchuingeacha BCG a chuireann in iúl do VEID agus HPV: VLPanna VEID, ar féidir iad a úsáid le haghaidh imdhíonta ó VEID i measc leanaí. Ós rud é gur dúshlán fós é vacsaín chimeric éifeachtach a fhorbairt i gcoinne HPV16 agus VEID{-1, cuidíonn an obair seo céim i dtreo fhorbairt an chláir vacsaínithe nua-chiméireacha HPV: VEID VLP-bhunaithe chun HPV16 agus VEID a rialú{{118 }} ionfhabhtú, a bhfuil géarghá leis i dtíortha i mbéal forbartha agus tionsclaithe.

Tagairtí

1. Staitisticí Domhanda UNAIDS VEID & SEIF-2018 Bileog Faisnéise. 2019. Ar fáil ar líne: http://www.unaids.org/en/resources/factsheet (ar rochtain an 15 Meitheamh 2020).

2. Baeten, JM PrEP do VEID: Grád A le haghaidh fianaise ach ar feitheamh tionchair. Nat. Urol. 2019, 16, 570–571. [CrossRef]

3. Rerks-Ngarm, S.; Pitisutithum, P.; Nitayaphan, S.; Kaewkungwal, J.; Chiu, J.; Páras, R. ; Premsri, N. ; Namwat, C. ; De Souza, M.; Adams, E.; et al. Vacsaíniú le ALVAC agus AIDSVAX chun ionfhabhtú VEID a chosc sa Téalainn. N. Béarla. J. Med. 2009, 361, 2209–2220. [CrossRef]

4. Ng'uni, T.; Chasara, C. ; Ndhlovu, ZM Baic mhóra eolaíocha i bhforbairt vacsaíne VEID: Peirspictíocht stairiúil agus treoracha don todhchaí. Tosaigh. Imdhíonól. 2020, 11, 590780. [CrossRef]

5. Vacsaíní Robinson, HL VEID/SEIF: 2018. Clin. Cógaslann. Ther. 2018, 104, 1062–1073. [CrossRef]

6. Wang, Q. ; Zhang, L. Antasubstaintí agus dearadh vacsaíne a neodrú go ginearálta in aghaidh ionfhabhtú VEID. Tosaigh. Med. 2020, 14, 30–42. [CrossRef]

7. Collins, DR; Gaiha, GD; Walker, BD CD8+ T cealla i rialú, leigheas agus cosc ​​VEID. Nat. Ath. Immunol. 2020, 20, 471–482. [CrossRef] [PubMed]

8. Pollard, AJ; Bijker, EM Treoir ar an vacsaíniú: Ó bhunphrionsabail go forbairtí nua. Nat. Ath. Immunol. 2021, 21, 83–100. [CrossRef]

9. Shapiro, SZ Ceachtanna le haghaidh taighde vacsaíne ginearálta ó iarrachtaí chun vacsaín VEID a fhorbairt. Vacsaín 2019, 37, 3400–3408. [CrossRef]

10. Ahmed, HG; Bensumaidea, SH; Alshammari, FD; Alenazi, FSH; ALmutlaq, BA; Alturkstani, MZ; Aladani, IA Leitheadúlacht subtypes víreas papilloma daonna 16 agus 18 i measc othair Yemeni a bhfuil ailse cheirbheacsach orthu. Asian Pacific J. Ailse Roimhe Seo 2017, 18, 1543–1548. [CrossRef]

11. Olcáis, VA; Chen, Y.; Schlegel, R.; Yuan, H. Tréithriú réimsí lúb HPV16 L1 i bhfoirmiú epitope comhfhoirmiúil cineál-shonrach. Micribhithil BMC. 2004, 4, 29. [CrossRef]

12. Dupuy, C. ; Buzoni-Gate, D.; Touze, A.; Le Cann, P.; Bout, D.; Coursaget, P. Díolúine cille-idirghabhála arna spreagadh i lucha ag cáithníní víreas HPV 16 L1. Miocrób. Paitóg. 1997, 22, 219–225. [CrossRef] [PubMed]

13. Schiller, J. ; Lowy, D. Mínithe ar an ard- potency na vacsaíní HPV phróifiolacsach. Vacsaín 2018, 36, 4768–4773. [CrossRef] [PubMed]

14. Markowitz, LE; Schiller, JT Vacsaíní Papillomavirus Daonna. J. Infect. Dis. 2021, 224, S367–S378. [CrossRef] [PubMed]

15. Chen, CW; Saubi, N.; Joseph-Munné, J. Dear choincheapa na vacsaíní VEID atá bunaithe ar cháithníní atá cosúil le víreas. Tosaigh. Imdhíonól. 2020, 11, 573157. [CrossRef] [PubMed]

16. Eto, Y. ; Saubi, N.; Fearr, P. ; Joseph, J. Ag dearadh vacsaíní ciméireacha cosúil le víreas atá bunaithe ar cháithníní le haghaidh an víreas papilloma daonna agus VEID: Ceachtanna foghlamtha. SEIF, Ath. 2019, 21, 218–232. [CrossRef]

17. Liu, WJ; Liu, XS; Zhao, KN; Leggatt, GR; Cáithníní cosúil le víreas Papillomavirus Frazer, IH chun il-eipitíopaí cille T cíteatocsaineacha a sheachadadh. Víreolaíocht 2000, 273, 374–382. [CrossRef]

18. Liu, XS; Abdul-Jabbar, I.; Qi, YM; Frazer, IH; Zhou, J. Faigheann imdhíonadh mucosal le cáithníní cosúil le víreas papillomaivír díolúine sistéamach agus mucosal i lucha. Víreolaíocht 1998, 252, 39–45. [CrossRef]

19. Peng, S.; Frazer, IH; Fernando, GJ; Is féidir le cáithníní cosúil le víreas Zhou, J. Papillomavirus epitopes sainithe CTL a sheachadadh chuig cosán aicme I MHC. Víreolaíocht 1998, 240, 147–157. [CrossRef]

20. Zhai, Y. ; Zhong, Z.; Zariffard, M.; Spear, GT; Qiao, L. Cáithníní cosúil le papillomavíreas bó-ainmhithe a chuireann eipitipí caomhnaithe i láthair ón réigiún seachtrach membrane-cóngarach de VEID-1 gp41 spreagtha mucosal agus antasubstaintí sistéamach. Vacsaín 2013, 31, 5422–5429. [CrossRef]

21. Zhang, H. ; Huang, Y. ; Fayad, R.; Spear, GT; Qiao, L. Ionduchtú antasubstaintí mucosal agus neodraithe sistéamach i gcoinne víreas easpa imdhíonachta daonna cineál 1 (VEID-1) trí imdhíonadh ó bhéal le papillomavirus-VEID buaibheach-1 gp41 cáithníní chimeric víreas-mhaith. J. Víreas. 2004, 78, 8342–8348. [CrossRef]

22. Xiao, SL; Wen, JL; Cong, NZ; Ach, HL; Leggatt, G. ; Frazer, IH Cinneann bealach riartha BPV1 VLP chimeric carachtar na bhfreagraí imdhíonachta spreagtha. Imdhíonól. Cill Biol. 2002, 80, 21–29. [CrossRef]

23. Kirnbauer, R.; Taub, JANET; An Chloch Ghlas, HEATHER; Roden, RICHARD; Dürst, M.; Gissmann, L.; Lowy, DR; Schiller, JT Féin-Chóimeáil Éifeachtúil de Chineál Papillomavirus Daonna 16 LI agus L1-L2 isteach i gCáithníní atá cosúil le Víreas. J. Víreas. 1993, 67, 6929–6936. [CrossRef] [PubMed]

24. Zhao, Q. ; Potter, CS; Carragher, B. ; Lander, G. ; Sworen, J. ; Towne, V. ; Abraham, D.; Donnchadh, P. ; Wasabaugh, MW; Sitrin, RD Tréithriú cáithníní cosúil le víreas i GARDASIL® trí mhicreascópacht leictreoin tarchurtha cryo. Hum. Vacsaíní Imdhíonachta. 2014, 10, 734–739. [CrossRef] [PubMed]

25. Achour, A. ; Lemhammedi, S.; Picard, O.; M'bika, JP; Zagury, JF; Moukrim, Z.; Willer, A. ; beix, F. ; Burny, A. ; Zagury, D. Limpicítí T cíteatocsaineacha atá Sonrach do VEID-1 gp160 Antaigin agus Peiptíd Sintéiseach P18IIIB i HLA-A11-Duine aonair Imdhíonta. SEIF Res. Hum. Aisvíris 1994, 10, 19–25. [CrossRef]

26. Nakagawa, Y. ; Kikuchi, H.; Takahashi, H. Anailís mhóilíneach ar TCR agus idirghníomhaíocht peptide/MHC ag baint úsáide as P{1}}I10-díorthaigh peiptídí le hionadú D-aimínaigéad amháin. Bithfhis. J. 2007, 92, 2570–2582. [CrossRef]

27. Qiu, Z.; Chong, H. ; Yao, X.; Su, Y. ; Cui, S.; He, Y. Aithint agus tréithriú fophóca ar an N-trimer VEID-1 Gp41: Impleacht maidir le hiontráil víreasach agus sprioc drugaí. Áiseanna 2015, 29, 1015–1024. [CrossRef]

28. Peadar, BS; Cheingsong-Popov, R.; Caladh, D. ; Foxall, R. ; Patou, G. ; Hodgkin, K.; Weber, JN Staidéar píolótach chéim II ar shábháilteacht agus imdhíon-ghineacht VEID p17/p24:VLP (p24-VLP) in ábhair shíordheimhneacha VEID asymptomatic. J. Infect. 1997, 35, 231–235. [CrossRef]

29. Chege, GK; Burgers, WA; Stutz, H.; Meyers, AE; Chapman, R.; Kiravu, A.; Bunjun, R. ; Aoire, EG; Jacobs, WR; Rybicki, PE; et al. Díolúine Láidir i leith Mycobacterium Auxotrófach Mycobacterium bovis BCG-VLP Iarrthóir Vacsaín Príomh-Threisiú VEID i Múnla Príomháite Neamhdhaonna. J. Víreas. 2013, 87, 5151–5160. [CrossRef]

30. Chege, GK; Tomás, R.; Aoire, EG; Meyers, A.; Boun, W. ; Williamson, C.; Maclean, J. ; Liath, CM; Rybicki, PE; Williamson, AL Tugann réimeas imdhíonta den scoth ag baint úsáide as vacsaíní athchuingreach BCG agus Pr55gag de cháithníní atá cosúil le víreas atá bunaithe ar fhochineál C VEID de chineál 1 freagraí a bhaineann go sonrach le Gag amach i mbabúin. Vacsaín 2009, 27, 4857–4866. [CrossRef]

31. Ióseph, J. ; Saubi, N.; Táim, EJ; Fernández-Lloris, R.; Gil, O.; Cardona, PJ; Gatell, JM; Hanke, T. Feabhsaíonn vacsaíniú lucha nuabheirthe le BCG.HIVA222 + MVA.HIVA-1-freagraí imdhíonachta sonracha VEID: Tionchar aoise agus bealaí imdhíonta. Clin. Dev. Imdhíonól. 2011, 2011, 516219. [CrossRef]

32. Saubi, N. ; Gea-Mallorquí, E.; Fearr, P. ; Hurtado, C. ; Sánchez-Úbeda, S.; fós, Y. ; Gatell, JM; Hanke, T. ; Joseph, J. Innealtóireacht dearadh vacsaíne miocabaictéarach nua don vacsaín phéidiatraiceach VEID-TB veicteoirithe ag auxotróf lísín de BCG. Mol. Ther. Modhanna Clin. Dev. 2014, 1, 14017. [CrossRef]

33. Mahant, A. ; Saubi, N.; fós, Y. ; Giotár, N.; Gatell, JM; Hanke, T. ; Joseph, J. Forbairt réamhchliniciúil BCG.HIVA2auxo.int, ag cothú veicteoir cainte comhtháite, le haghaidh vacsaín péidiatraiceach VEID-TB. Feabhas a chur ar chobhsaíocht agus ar dhíolúine T-chealla sonrach VEID. Hum. Vacsaíní Imdhíonachta. 2017, 13, 1798–1810. [CrossRef] [PubMed]

34. Hanke, T. ; McMichael, AJ Dear agus tóg vacsaín thurgnamhach VEID-1 ar feadh bliana-2000 triail chliniciúil sa Chéinia. Nat. Med. 2000, 6, 951–955. [CrossRef] [PubMed]

35. Durocher, Y. ; Perret, S.; Kamen, A. Táirgeadh próitéin athchuingreach ardleibhéil agus ard-thréchuir trí aistriú neamhbhuan de chealla EBNA1 daonna 293-fhás fionraíochta. Aigéid Núicléacha Res. 2002, 30, E9. [CrossRef] [PubMed]

36. Kim, HJ; Kim, SY; Lim, SJ; Kim, JY; Laoi, SJ; Kim, HJ Íonú crómatagrafaíochta aon-chéim ar phróitéin papillomavirus daonna 16 L1 ó Saccharomyces cerevisiae. Próitéin Expr. Purif. 2010, 70, 68–74. [CrossRef] [PubMed]

37. Eto, Y. ; Saubi, N.; Fearr, P. ; Joseph-Munné, J. Léiriú próitéin chimeric HPV-VEID L1P18 i pichia pastoris; íonú agus tréithriú na gcáithníní cosúil le víreas. Cógaisíocht 2021, 13, 1967. [CrossRef]

38. GÉ. Úsáid CaptoTM Core 700 agus Capto Q ImpRes chun cáithníní atá cosúil le víreas papilloma daonna a íonú. J. Pharm na hÁise. Bithchógais. Ind. 2014, 1–4.

39. McLean, CS; Eaglaiseoir, MJ; Meinke, J. ; Smith, GL; Higgins, G. ; Stanley, M.; Minson, AC Antashubstaint mhonaclónach a tháirgeadh agus a thréithriú go dtí an víreas papilloma daonna cineál 16 ag baint úsáide as víreas athchuingreach vaccinia. J. Clin. Paitól. 1990, 43, 488–492. [CrossRef]

40. Merck Canada Inc. Monagraf Táirge Gardasil®. Táirg. Monagra. Monapril Táirge. Monagra. 2015, 1–71.

41. Achour, A. ; Pearsa, K.; Harris, RA; Sundbäck, J.; Fear Seolta, CL; Lindqvist, Y.; Schneides, G. ; Kärre, K. Struchtúr criostail H-2D(d) MHC aicme I casta leis an VEID-1- peptide díorthaithe P18-110 ag taifeach 2.4 Å: Impleachtaí do chill T agus cill NK aitheantas. Díolúine 1998, 9, 199–208. [CrossRef]

42. Pang, W. ; Tom, SC; Zheng, YT Coscairí comhleá peptide reatha den chineál VEID-1. Antivir. Ceimic. Ceimicí. 2009, 20. [CrossRef]

43. Chen, XS; Garcea, RL; Goldberg, I.; Casino, G.; Harrison, SC Struchtúr na gCáithníní Beaga atá cosúil le Víreas arna Chéile as Próitéin L1 Papillomavirus Daonna 16. Mol. Cill 2000, 5, 557–567. [CrossRef] [PubMed]

44. Lá, PM; Weisberg, AS; Thompson, CD; Hughes, MM; Pang, BB; Lowy, DR; Schiller, JT Papillomavirus Daonna 16 Capsids Iontráil Núicléach Idirmheánach le linn Ionfhabhtaithe. J. Víreas. 2019, 93, r00454-19. [CrossRef]

45. Zhou, J. ; Barra an dorais, J. ; Grian, XY; Crawford, LV; McLean, CS; Frazer, IH An comhartha logánaithe núicléach de phróitéin cineál 16 L1 papillomavirus daonna a shainaithint. Víreolaíocht 1991, 185, 625–632. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Vlps, A. ; Middelberg, APJ; Lua, LHL Bithphróiseáil cáithníní cosúil le víreas: Dúshláin agus deiseanna. Pharm. Bithphróiseas. 2013, 1, 407–409.

47. Bousarghin, L. ; Touzé, A.; Combita-Rojas, AL; Coursaget, P. Is leor seichimh de phróitéiní capsid cineál 16 víreas papilloma daonna a luchtaítear go dearfach chun aistriú géine isteach i spriocchealla a idirghabháil tríd an ngabhdóir heparan sulfáit. J. Gen. Viol. 2003, 84, 157–164. [CrossRef]

48. Sasagawa, T. ; Pushko, P.; Steers, G. ; Gschmeissner, SE; Nasser Hajibagheri, MA; Finch, J. ; Crawford, L.; Tommasino, M. Sintéis agus cóimeáil cáithníní cosúil le víreas de víris papilloma daonna cineál 6 agus Cineál 16 i giosta eamhnaithe Schizosaccharomyces pombe. Víreolaíocht 1995, 206, 126–135. [CrossRef]

49. Biemelt, S. ; Sonnewald, U.; Galmbacher, P. ; Willmitzer, L.; Müller, M. Táirgeadh Cáithníní cosúil le Víreas de Chineál 16 Daonna i bPlandaí Trasghéineacha. J. Víreas. 2003, 77, 9211–9220. [CrossRef]

50. Zahin, M.; Eoin, J.; Khanal, S.; Husk, A. ; Mason, H. ; Warzecha, H.; Ghim, SJ; Miller, DM; Matoba, N.; Jenson, AB Táirgeadh inscálaithe de phróitéin HPV16 L1 agus VLPanna ó dhuilleoga tobac. PLoS ONE 2016, 11, e0160995. [CrossRef]

51. Aires, KA; Cianciarullo, AM; Carneiro, SM; Villa, LL; Boccardo, E.; Pérez-Martinez, C.; Perez-Arellano, I.; Oliveira, MLS; Ho, PL Cáithníní cosúil le víreas de chineál 16 L1 de chineál papilloma daonna a tháirgeadh ag cealla athchuingreach Lactobacillus casei. Appl. Timpeallacht. Micribhith. 2006, 72, 745–752. [CrossRef]

52. Shank-Retzlaff, ML; Zhao, Q.; Anderson, C.; Hamm, M.; Ard, K. ; Nguyen, M.; Wang, F.; Wang, N.; Wang, B. ; Wang, Y.; et al. Meastóireacht ar chobhsaíocht theirmeach Gardasil®. Hum. Vacsaín. 2006, 2, 147–154. [CrossRef] [PubMed]

53. Mukherjee, S.; Thorsteinsson, MV; Johnston, LB; DePhillips, PA; Zlotnick, A. Cur Síos Cainníochtúil ar Thionól In Vitro de Phapalómaivíreas Daonna 16 Cháithníní cosúil le Víreas. J. Mol. Biol. 2008, 381, 229–237. [CrossRef] [PubMed]

54. McCarthy, MP; Bán, WI; Palmer-Hill, F.; Koenig, S.; Suzich, JA Díchóimeáil Cainníochtúil agus Athchóimeáil Papillomavirus Daonna Cáithníní de Chineál 11 Víreasach In Vitro. J. Víreas. 1998, 72, 32–41. [CrossRef] [PubMed]

55. Kirnbauer, R. ; Booy, F.; Cheng, N.; Lowy, DR; Schiller, JT Papillomavirus L1 mórphróitéin capsid féin-chéile isteach i gcáithníní cosúil le víreas atá an-imdhíon-ghineach. Proc. Natl. Acad. Sci. Stáit Aontaithe Mheiriceá 1992, 88, 12180–12184. [CrossRef]

56. Patel, MC; Patkar, KK; Bású, A. ; Mohandas, KM; Mukhopadhyaya, R. Táirgeadh papillomavirus daonna imdhíon-ghineach-16 mórcháithníní próitéine capsid díorthaithe atá cosúil le víreas. Indiach J. Med. Res. 2009, 130, 213–218.

57. Shi, L. ; Sanal, G. ; Ní, A.; Luo, Z.; Doshna, S.; Wang, B. ; Graham, TL; Wang, N.; Volkin, DB Cáithníní cosúil le víreas papillomaivíris daonna a chobhsú ag dromchlaghníomhaithe neamh-ianacha. J. Pharm. Sci. 2005, 94, 1538–1551. [CrossRef]

58. Carter, JJ; Wipf, GC; Benki, SF; Christensen, ND; Galloway, DA Aithint de Chineál Papillomavirus Daonna 16-Eipitíopa Sonrach ar Ghéag C-Teirminéal an Mhórphróitéin Capsid L1. J. Víreas. 2003, 77, 11625–11632. [CrossRef]

59. Von Brunn, A. ; Branda, M. ; Reichhuber, C.; Morys-Wortmann, C.; Deinhardt, F. ; Schdelt, F. Tá príomhfhearann ​​neodraithe VEID-I an-imdhíon-ghineach nuair a chuirtear in iúl é ar dhromchla na gcáithníní lárnacha heipitíteas B. Vacsaín 1993, 11, 817–824. [CrossRef]

60. Dennison, SM; Anasti, K.; Scearc, RM; Sutherland, L.; Páirceanna, R.; Xia, S.-M.; Liao, H.-X.; Gorny, MK; Zolla-Pazner, S.; Haynes, BF; et al. Neamh-neutralizing VEID-1 gp41 Clúdach Cnuasach II Antasubstaintí Monacónacha Daonna Taispeáin Il-imoibríocht chun Ceangailteacha Fosfailipidí agus Uathantigíní Próitéin. J. Víreas. 2011, 85, 1340–1347. [CrossRef]

61. Trkola, A. ; Kuster, H.; Rusert, P. ; Joos, B. ; Fischer, M. ; Leemann, C. ; Manrique, A.; Huber, M.; Rehr, M.; Oxenius, A. ; et al. Moill ar VEID-1 ar ais tar éis scor den teiripe antiretroviral trí aistriú éighníomhach antasubstaintí neodraithe daonna. Nat. Med. 2005, 11, 615–622. [CrossRef]

62. Shank-Retzlaff, M.; Wang, F.; Morley, T. ; Anderson, C.; Hamm, M.; Donn, M. ; Rowland, K.; Pancari, G. ; Zorman, J.; Lowe, R. ; et al. Comhghaol idir cumas luiche agus cumas coibhneasta in vitro do cháithníní cosúil le víreas papillomaivíris daonna de Chineál 16 agus samplaí vacsaíne Gardasil. Hum. Vacsaín. 2005, 1, 191–197. [CrossRef] [PubMed]

63. Kilpeläinen, A. ; Maya-Hoyos, M.; Saubí, N.; Soto, CY; Joseph Munne, J. Dul chun cinn agus dúshláin i bhforbairt vacsaíne athchuingreach VEID bunaithe ar BCG Mycobacterium bovis BCG: Ceachtanna foghlamtha. Vacsaíní Saineolaithe Ath. 2018, 17, 1005–1020. [CrossRef] [PubMed]