Straitéis Braite Pataigin Dúnaíoch a Bhaineann le Uileláithriú Próitéiní Baictéaracha Dromchla Cuid 1

RÉAMHRÁ

Spreagann ionradh pataigineach ceallraí freagairtí imdhíonachta arna spreagadh ag meicníochtaí faireachais an óstaigh. Cuirtear tús leis seo go ginearálta trí struchtúir mhóilíneacha mhiocróbacha caomhnaithe a aithint ar a dtugtar patrúin móilíneacha a bhaineann le pataigin (PAMPanna). Má dhéantar braiteadh éifeachtach ar na PAMPanna seo ag gabhdóirí aitheanta patrún (PRRanna) spreagann sé go tapa freagairtí imdhíonachta óstaigh éagsúla trí ghníomhachtú conairí casta comharthaíochta a spreagann imréiteach pataigin.

Le blianta beaga anuas, le forbairt na biteicneolaíochta agus feabhas leanúnach na teicneolaíochta taighde, tá tuiscint níos doimhne ag daoine ar an gcaidreamh idir móilíní miocróbach agus díolúine. Is éard atá i móilíní miocróbacha caomhnaithe ná aicme móilíní miocróbacha ar féidir le horgánaigh iad a aithint agus freagairtí imdhíonachta a spreagadh. Áirítear leo go príomha comhpháirteanna móilíneacha de mhiocrorgánaigh amhail baictéir, víris, agus fungais, agus tá siad an-chaomhnaithe agus sainiúil. Tá sé léirithe ag staidéir gur féidir le móilíní miocróbacha caomhnaithe pataiginí éagsúla a sheasamh agus díolúine a fheabhsú trí chóras imdhíonachta an chomhlachta a ghníomhachtú.

Spreagann móilíní miocróbacha caomhnaithe freagraí athlastacha agus imdhíonachta trí mhóilíní tábhachtacha a ghníomhachtú sa chóras imdhíonachta, mar shampla cealla T, cealla B, agus macrophages. Tar éis móilíní miocróbacha caomhnaithe a aithint, scaoilfidh na cealla seo idirghabhálaithe imdhíonachta éagsúla, lena n-áirítear cítocíní agus ceimicíní, rud a mheallfaidh cealla imdhíonachta eile chun páirt a ghlacadh sa fhreagairt imdhíonachta. Ag an am céanna, is féidir le móilíní miocróbacha caomhnaithe feidhmiú mar antaiginí freisin chun freagairtí antashubstainte a ghníomhachtú sa chorp, rud a chruthaíonn cosaint antashubstainte. Is féidir le hidirghníomhaíocht na gceall seo agus na fachtóirí imdhíonachta an comhlacht a chosaint níos fearr ó phataiginí.

Tá sé léirithe ag go leor staidéir gur féidir le móilíní miocróbach caomhnaithe díolúine an chomhlachta a fheabhsú, rud a chosc agus a chóireáil ar ghalair éagsúla, mar shampla galair thógálacha, galair ailléirgeacha, ailse, etc. Mar shampla, déantar an vacsaín heipitíteas B athchuingreach a úsáidtear go coitianta bunaithe ar an. móilín miocróbach caomhnaithe ar antaigin dromchla an víris heipitíteas B. Is féidir freagairt imdhíonachta an chomhlachta a tharlódh trí ionaclú na vacsaíne, chun antashubstaint dhromchla an víris heipitíteas B a ghiniúint, chun an cuspóir a bhaineann le cosc ​​​​a chur ar ionfhabhtú víreas heipitíteas B a bhaint amach.

Mar fhocal scoir, tá nasc láidir idir móilíní miocróbacha caomhnaithe agus díolúine. Trí úsáid iomlán a bhaint as feidhm inmunomodulatory na móilíní miocróbach caomhnaithe, is féidir díolúine an chomhlachta a fheabhsú, agus is féidir galair éagsúla a chosc agus a chóireáil níos fearr. Dá bhrí sin, ba cheart dúinn aird a thabhairt go gníomhach ar thaighde feidhmeach na móilíní miocróbach caomhnaithe agus a gcur i bhfeidhm a chur chun cinn maidir le galair a chosc agus a chóireáil. Ón taobh sin de, ní mór dúinn díolúine a fheabhsú. Is féidir le Cistanche díolúine a fheabhsú go suntasach, toisc go bhfuil éagsúlacht de chomhábhair bhitheolaíocha gníomhacha ag fuinseog feola, mar shampla polaisiúicrídí, dhá bheacáin, agus Huangli, etc. Is féidir leis na comhábhair seo an córas imdhíonachta a spreagadh. Cineálacha éagsúla cealla, méadú ar a ngníomhaíocht imdhíonachta.

Cliceáil buntáistí sláinte cistanche

Go dtí seo, aimsíodh agus tréithríodh roinnt aicmí PRRanna, ar nós gabhdóirí cosúil le Dola, géine I (RIG-I) in-inducite aigéid Retinoic, gabhdóirí NODlike, agus gabhdóirí DNA (braiteoirí citosólacha le haghaidh DNA) (1). ). Tá na PRRanna seo ar thús cadhnaíochta maidir le haithint pataigin extracellular agus intracellular agus mothaíonn siad aicmí éagsúla móilíní i miocróib lena n-áirítear próitéiní, lipidí, carbaihiodráití, agus aigéid núicléacha (2). Tá sé seo ríthábhachtach chun stop a chur le dul chun cinn galair agus chun maireachtáil óstaigh a chur chun cinn.

Tá sé ríthábhachtach faireachas a dhéanamh ar an mbileog intracellular chun iomadú pataigin a shrianadh chun steiriúlacht chitosólach a chaomhnú. Soláthraíonn sárú ar mheicníochtaí cosanta den sórt sin tearmann don phataigin ó dhíolúine dúchasach extracellular agus tugann sé deis d'iolrú agus scaipeadh tapa laistigh den óstach (3). Dá bhrí sin, tá meicníochtaí láidre braite pataigin agus córais cosanta uathrialacha cille ríthábhachtach chun pataiginí ionracha a shrianadh. Is straitéis amháin é Ubiquitination a bhfuil ról lárnach aige maidir le haithint agus deireadh a chur le pataigin (4).

Feidhmíonn an cosán díghrádaithe atá leagtha síos ag ubiquitination mar theorainn deiridh i gcoinne na mbaictéar a chónaíonn cítosól a sheachnaíonn go minic an marú ionocytic chlasaiceach trí fholúsóil ina bhfuil pataiginí a réabadh chun ionradh a dhéanamh ar chitosól óstaigh. Aithníodh roinnt ligáis ubiquitin óstach E3 chun lastaí a mhaisiú lena n-áirítear pataiginí intracellular le slabhraí pola-ubiquitin (Ub) (5), agus cé gur braitheadh ​​​​beagán spriocanna baictéaracha cosúil le próitéiní membrane seachtrach (6), tá eolas fairsing fós ann maidir le straitéis aitheantais tsubstráit. teoranta.

Léirigh staidéar le déanaí próitéiní éifeachtóra rúnda a chuimsíonn fearann ​​a bhaineann le ubiquitin (UBA) i eitinn Mycobacterium (Mtb) a earcaíonn ubiquitin go héighníomhach, a sheachadann pataigin ar deireadh thiar do phróitéin a bhaineann le microtubule 1A/1B-slabhra éadrom 3 (LC3) - autophagosomes a bhaineann le. (7). Chomh maith leis sin, tá foshraitheanna neamhghnácha ubiquitin cosúil le lipopolysaccharide (LPS) agus glycan léirithe go galánta i gcúpla pataigin baictéarach, rud a thaispeánann solúbthacht na bhfoshraitheanna uileláithreachta (8, 9).

Go comhlántach, fuarthas amach go ndearna Rickettsia parkeri próitéiní dromchla a mhodhnú go gníomhach, iad a chosaint ó ubiquitination agus marú ina dhiaidh sin (10). Le chéile, cuireann na staidéir neamhspleácha seo béim ar thábhacht logánú dromchla an tsubstráit ubiquitin. Mar sin féin, ní léir go bhfuil céannacht substráit phróitéineach i bpataigin agus conas a d’fhéadfaí iad a aithint go beacht le ligáis óstach E3.
Go leor ligáis ubiquitin óstach, cosúil le athrá saibhir leucine agus -motif steiriúla ina bhfuil 1 (LRSAM1), Parkin, próitéin méaróg fáinne 166 (RNF166), RNF213, Ariadne RING-BetweenRING-RING (RBR) E3- Tuairiscítear go ndéanann ubiquitin protein ligase 1 (ARIH1), E3-shonrach SMAD{3-ubiquitin protein ligase 1 (Smurf1), agus próitéin Skip-Cullin-F-box 2 ina bhfuil coimpléasc (SCFFBXO2) folúis pataigin nó pataigin a mhaisiú. le héagsúlacht topologies slabhra ubiquitin (8, 9, 11-18). Go háirithe, go háirithe, go bhféadfadh LRSAM1 trí uath-ubiquitination comhartha láidir ubiquitin a ghiniúint timpeall na mbaictéar chun an t-innealra uathphagic a earcú (19, 20). Tá baint ag na ligáis ubiquitin atá freagrach as marcáil pataigin freisin le hoiméastáis cheallacha a chothabháil, ag cruthú córas thar a bheith frugal le haghaidh úsáid éifeachtach agus optamach acmhainní.

I measc topologies slabhra ubiquitin éagsúla a foirmíodh ar an bpataigin, is é M1-Maisiúchán Ub a spreagann ionduchtú athlasadh (21) go príomha, agus díríonn topeolaíochtaí slabhra K48- agus K63- go héifeachtach ar mhiocróib i dtreo an phataigin. córas autophagy nó proteasomal, faoi seach (22). Léiríomar le déanaí go bhfuil tionchar antibacterial níos mó ag slabhra K48-Ub i gcomparáid le K63-Ub (23). Go ginearálta, déantar próitéiní ceallacha atá ceaptha do dhíghrádú próitéamaíoch a chlibeáil ag ligáis a bhaineann go sonrach le slabhraí Ub K48-. Is é an comhartha ríthábhachtach d'aithint tsubstráit ag ligáis den sórt sin dírithe go príomha ag móitíf degron (24).

Sa staidéar seo, aithnímid go bhfuil móitífeanna degron ann i bpróitéiní dromchla de bhaictéir atá éagsúil ó thaobh na fíoléiní de de bhunús Gram-dearfach agus Gram-dhiúltach araon. Tríd an spriocdhíriú ar fhoshraitheanna den sórt sin le hinnealra uileláithreach, spreagtar díothú éifeachtach pataigin ón gcill ósta. Agus é seo á úsáid againn, léirímid tiontú próitéin dromchla neamh-ubiquitinable isteach i bhfoshraith ubiquitin trí innealtóireacht degron a chur isteach chun imréiteach baictéarach a chur chun cinn. D’fhéadfadh an prionsabal simplí ach cineálach seo chun foshraitheanna baictéaracha a shainaithint feidhmiú mar mheicníocht chaomhnaithe chun pataiginí citosólacha a aithint, ag gealladh go mbeidh sé éifeachtach agus ilchuspóireach chun ionfhabhtuithe baictéaracha a chosaint.

TORTHAÍ

Cuireann an slabhra K48-Ub braite pataiginí baictéaracha citosólacha chun cinn

Tar éis ionradh citosolic ag pataiginí a bhrath, mharcáil an t-óstach iad le slabhraí pola-Ub chun a n-imréiteach a spreagadh (22). Ós rud é go bhfuil slabhraí polyUb den sórt sin comhdhéanta den chuid is mó de K48- agus K{63-Ub, rinneamar iniúchadh ar an gcéad dul síos ar cheannasacht agus suíomh spásúil na gcineálacha slabhra seo ar dhá phataigin ar leith ó thaobh na fíolaigineach, Streptococcus pneumoniae (SPN) agus Salmonella enterica serovar. Typhimurium (STM), a chuireann faoi deara niúmóine agus gastroenteritis i ndaoine, faoi seach. Maidir leis na pataiginí seo, tá marthain agus iomadú laistigh den chitosól cille óstach doiciméadaithe (13, 25). Ag baint úsáide as antasubstaintí a bhaineann go sonrach le nasc ubiquitin, thugamar faoi deara go raibh céatadán i bhfad níos airde de na baictéir intracellular marcáilte le K48- cineál slabhra Ub (~26 faoin gcéad do SPN agus 37 faoin gcéad do STm) i gcodarsnacht le K63- Ub (Fíor 1A).

Léirigh anailís ar shuíomh spásúlachta trí mhicreascópacht soilsithe struchtúrtha (SIM) go mbaineann baictéir chitosólacha (saor ó iarsmaí bhfolúsacha) nó baictéir chitosóil-nochta (laistigh den endosome millte) go príomha le K48-Ub, agus K63-Ub Bhí an comhartha suite ar endosomes damáiste, marcáilte le Galectin-8 (Gal8; marcóir braite damáiste endosome) (Fíor 1, B go E) (26). Bhí thart ar 99 agus ~76 faoin gcéad de K48-SPN uibítínte agus STm, faoi seach, gan Gal8 (Fíor 1F). Rinneadh an láithreacht baictéarach sa chitosól a bhailíochtú tuilleadh trí mhicreascópacht leictreoin tarchurtha (TEM) agus imdhíon-chothú le marcóir membrane FM4-64 (fig. S1, A go F). Fuaireamar 78.4 agus 80.4 faoin gcéad K48-Ub-dearfach SPN agus STm, faoi seach, gan aon chomhcheangal membrane, agus bhí 77.7 agus 74.4 faoin gcéad K63-Ub-dearfach SPN agus STm, faoi seach, teoranta laistigh de an folúntas (Fig. 1G). I dteannta a chéile, thug na torthaí seo le tuiscint gur mór-mheicníocht braite pataiginí é an dromchla baictéarach a bhratú le slabhraí K{48-B a úsáideann an t-óstach chun miocróib atá ina gcónaí i gcíteasal a aithint.

Is cód cineálach é Degron le haghaidh uileláithreacht baictéarach

An chéad uair eile rinneamar iarracht an tsubstráit le haghaidh uileláithreacht K48 ar an dromchla baictéarach a aithint. Go ríthábhachtach, tá ligáis óstach E3 ubiquitin, a thuairiscítear go bhfuil baint acu le huibítíniúchán baictéarach, bainteach freisin le feidhmeanna ríthábhachtacha ceallacha (12, 14) áit a ngníomhaíonn slabhraí Ub K mar phríomhchomhartha do phróitostasis cheallacha. Rinneamar hipitéis go bhféadfadh an t-óstach prionsabail chomhchosúla a ghlacadh chun an tsubstráit K48-Ub ar an dromchla baictéarach a shainaithint. Maidir le próitéiní óstacha, tuairiscítear gur réamhriachtanas le haghaidh ubiquitination K48 (24).

Scrúdaíodh muid próitéiní dromchla SPN le haghaidh láithreacht gnéithe den chineál céanna (Fíor 1 H), a aithint BgaA agus PspA mar spriocanna tuartha le haghaidh ubiquitination ( Fíor. 1 H agus Fíor. S2 , A , agus B ). Is -galactosidase é BgaA a thuairiscítear chun feidhmiú mar adhesin do SPN, agus is próitéin choilín-cheangailteach é PspA a cheanglaíonn lactoferrin agus atá ag teastáil le haghaidh imghabháil comhlántach (27, 28). Thugamar faoi deara laghdú ~50 go 53 faoin gcéad i gcomhlachas de chineál slabhra K48-Ub do mutants ΔbgaA agus ΔpspA araon, gan aon athrú ar leibhéil K63-Ub (Fíor 1I). Bhí an laghdú seo pronounced (~ 75 faoin gcéad ) i brú dúbailte-knockout (ΔbgaAΔpspA), le tuiscint ar an nádúr nonredundant de na foshraitheanna ubiquitin ( Fíor. 1 I ).

Ina theannta sin, mar thoradh ar léiriú BgaA-T (leagan teasctha den phróitéin, ina bhfuil aimínaigéid 1 go 1049) agus PspA i gcealla óstach, déantar a n-ubiquitination le K48-Ub topology (Fíor 1J). Deimhníodh bailíocht na spriocanna tuartha trí chomhlánú, agus neartaíodh an tsamhail trí úsáid a bhaint as ΔhysA (próitéin dromchla SPN nach gcomhlíonann critéir trípháirteacha degron) mutant mar rialú chun leibhéil comhlachais K48-Ub a scóráil (Fíor 1I). ).

An chéad uair eile rinneamar iniúchadh ar an éifeacht atá ag maisiú K48-Ub ar imréiteach baictéarach.

Chuir easpa foshraitheanna K{0}}B bac ar imréiteach baictéarach, rud a d'fhág go raibh marthanacht intracellular feabhsaithe go mór do thréanna SPN mutant (~1.8-huaire do ΔbgaA agus ~2-fold for ΔpspA) ( Fíor 1K). Deimhníodh uilíocht ár gcur chuige um thuar tsubstráit trí roinnt próitéiní dromchla-nochta a shainaithint i bpataiginí éagsúla eile mar fhoshraitheanna tuartha le haghaidh uileláithreachta (tábla S1). Deimhníodh iarrthóir tuarthach amháin den sórt sin, próitéin membrane seachtrach RlpA ar STm mar sprioc don innealra uileghabhálach ósta, mar a thaispeáin an tsóiteán ΔrlpA ~1.5- comhlachas laghdaithe fillte le K48-Ub i gcomparáid le fiáin -type (WT) STm (Fíor 1L). Bhunaigh an toradh seo infheidhmeacht leathan ár straitéis roghnúcháin foshraitheanna. Chomh fada agus is eol dúinn, is iad seo na chéad phróitéiní dromchla baictéaracha a thuairiscítear a bheith aitheanta ag innealra uileláithreachta óstaigh chun pataigin a bhrath agus a imréiteach.

Is réamhriachtanas é móitíf thrípháirteach le haghaidh clibeáil bheacht ubiquitin ar phróitéiní dromchla baictéarach

Tar éis an tsubstráit a aithint, bhí sé mar aidhm againn gnéithe ríthábhachtacha an mhóitíf thrípháirtigh a bhí mar chnámh droma ár scáileáin a thástáil (Fíor 2A agus Fíor. S2A). Mar thoradh ar scriosadh seicheamh degron (102VTPKEE107) i BgaA-T tháinig laghdú ~50 faoin gcéad ar chomhcheangal K48-Cineál slabhra Ub, i gcomparáid le WT SPN beag beann ar chinéitic fáis den chineál céanna agus ar chumas cloí cille (Fíor 2C). agus Fíor S3, A, agus B). Bhí an laghdú seo inchomparáide leis an brú cnag ΔbgaA, rud a dhearbhaigh an feinitíopa a bhaineann go sonrach le degron. Seachas an t-ord degron, tá iarmhar lísín i ngarchomharsanacht ríthábhachtach chun an ubiquitin moiety a cheangal leis an tsubstráit. I BgaA, tá an seicheamh degron in éineacht le dhá ubiquitination proximal laghdaithe go mór K48 i gcomparáid le BgaA-T (Fíor 2 D). Go háirithe, cuireadh ar ceal an fhéidearthacht go ndéanfaí athrú mór comhfhoirmithe i bpróitéin BgaA-TΔDegron chun difear a dhéanamh do ubiquitination trí thuar in silico agus speictreascópacht dichroism ciorclach (CD) de phróitéin íonaithe BgaA-TΔDegron, a léirigh sínithe struchtúracha cosúil le BgaA-T (fig. S3,). C agus D). Cosúil le BgaA, ba é an toradh a bhí ar scriosadh seicheamh degron (327PETPAPE333) agus sóchán lísín (K315R) i PspA freisin go raibh laghdú suntasach tagtha ar chomhcheangal K48-Ub, mar aon le cumas fada marthanach (fig. S4, A go D).

An chéad cheann eile rinneamar innealtóireacht ar an próitéin dromchla SPN HysA, ar dtús easpa seicheamh degron bunscoile, trí chur leis seicheamh degron laistigh de réigiún struchtúrach neamhord den próitéin ina bhfuil iarmhar lísín (Fíor 2, F agus G, agus fig. S2, C). a E). Thug an modhnú seo aitheantas agus uileláithreacht K48 don phróitéin HysA nach raibh in-áititheach roimhe seo. K48-B’ionann leibhéil chomhcheangail Ub de thraenacha SPN a iompraíonn an phróitéin HysA a innealtóireacht (ΔbgaA:pHysADegron-BgaA agus ΔpspA:pHysADegron-PspA) 2.2- agus 3.2-huaire níos airde i gcomparáid le ceachtar ΔbgaA agus ΔbgaA: pHysA nó ΔpspA amhrán, faoi seach (Fíor 2H).

Déanann maisiú feabhsaithe ΔbgaA:pHysADegron-BgaA agus ΔpspA:pHysADegron-PspA tréithchineálacha le K48-Ub robáil SPN den ghnóthachan marthanachta a sholáthraíonn easpa degron in ΔbgaA agus ΔbgaA: pHysA nó ΔpspA (Fig. 2I). Tháirg na tréithchineálacha SPN go léir a ndearnadh innealtóireacht orthu leibhéil chomhchosúla den niúmóilín tocsain póir-fhoirmithe (Ply) (Fíor 2, B agus G), atá ina réamhriachtanas le haghaidh damáiste endomembrane agus uileláithreacht ina dhiaidh sin (25). Cuireann sé seo ar ceal an méid a d'fhéadfadh damáiste membrane íseal nó fairsing a dhéanamh chun athrú suntasach ar leibhéil uileláithreachta i dtréithchineálacha SPN mutant a chur chun cinn. I dteannta a chéile, tugann siad seo le tuiscint go gcuireann breisiú saorga ar an seicheamh degron chun cinn braite agus díothú pataiginí trí mheán ubiquitin. Go háirithe, bhí an seicheamh degron i BgaA caomhnaithe go mór thar séiritíopaí niúmacocúla éagsúla (fig. S5A).

Mar sin féin, i séiritíopa 19F a bhaineann go minic le riosca méadaithe báis ó niúmóine baictéarach agus sepsis (29-31), fuarthas amach go raibh an príomh-dhíogrón sóchán (P104Q). Thugamar faoi deara go ndearna aithris ar an sóchán seo i BgaA (fig. S5B) uileláithreacht lag agus cumas marthanais feabhsaithe do ΔbgaA:pBgaA-TP104Q i gcomparáid le ΔbgaA:pBgaA-T (fig. S5, C agus D). Leagann sé seo béim ar aitheantas degron mar straitéis a úsáideann an t-óstach chun é féin a chosaint ar ionfhabhtuithe baictéaracha tromchúiseacha.

Is ligáis ubiquitin E3 frithmhiocróbach é SCFFBW7

Táthar ag tuar go n-aithneofar an seicheamh degron canonical atá i láthair sna foshraitheanna ubiquitin roghnaithe ag coimpléasc ligáis ubiquitin SCFFBW7 E3 (24), a bhfuil baint aige le rialáil timthriall cille agus fás (32). Tá sé comhdhéanta de dhá phróitéin chaomhnaithe, S-phase kinase-associated protein 1 (SKP1) agus ball de theaghlach próitéin Cullin, chomh maith le próitéin athróg F-bosca a sholáthraíonn sainiúlacht tsubstráit (33). Chun rannpháirtíocht SCFFBW7 in SPN uileláithreach a fhíorú, rinneamar measúnú ar dtús ar chomhcheangal FBXW7 le SPN. Fuaireamar ~ 31 faoin gcéad de SPN intracellular a bhaineann le FBXW7 ar anailís imdhíonfluaraiseacht ( Fíor. 3 A agus Fíor. S6 A ). Bhíothas ag súil leis, bhí FBXW7-SPN dearfach ag comhlonnú le K48 ubiquitin (fig. S6B). Chun rannpháirtíocht SCFFBW7 a chruthú, scrúdaíodh lipéadú na mbaictéar le slabhraí K{48-Ub trí imdhíonfhluaraiseacht, tar éis íosrialáil slonn Cullin1, SKP1, agus géinte FBXW7 ag baint úsáide as RNAanna trasnaíochta beaga spriocdhírithe (siRNAs; fig. S7, A go C).

Go háirithe, rinneadh tosta FBXW7 a bhailíochtú ag leibhéal carntha cyclin E1 i gcealla cóireáilte siFBXW (fig. S7F). Thugamar faoi deara ~45 go 60 faoin gcéad de laghdú i gcomhar SPN le K48-Ub i gcealla leagain Cullin1, SKP1, agus FBXW7 (Fíor 3B), rud a d’fhág, ar a seal, ~1.6- go dtí 1.75-méadú faoi dhó ar mharthanacht SPN laistigh de chealla óstaigh (Fíor 3E). Cruthaíodh an spriocdhíriú sonrach ar mhóitíf degron ag SCFFBW7 trí dhifríochtaí gan athrú i K48-Ub colocalization agus cumas marthanais ΔpspAΔbgaA agus ΔbgaA:pBgaA-TΔDegron tréithchineálacha i siFBXW7-cealla cóireáilte (fig. S8, A go D). Bhí bunús leis na torthaí seo ag laghduithe suntasacha i K48 ubiquitination BgaA-T i gcealla óstach tar éis knockdown FBXW7 (Fíor 3 C).

Thairis sin, in vitro, léiríonn ubiquitination le BgaA-T íonaithe (fig. S9, A go D) agus na comhpháirteanna casta SCF gan athbhrí SCFFBW7 mar an bona fide E3 ligáis atá freagrach as uileláithreacht BgaA. Bhí SCFFBW7 athchuingreach in ann BgaA-T íonaithe uileláithreach a dhéanamh ach níor éirigh leis an malairt BgaA-TΔDegron nó an t-athraitheach ionadach lísín-go-arginine BgaA-TK97R (Fíor 3D) a fholúsú. Thairis sin, léirigh cealla óstach a léiríonn leagan FBXW7R505C, a thaispeánann cumas aitheantais lagaithe do cyclin E1 (foshraith de FBXW7) (fig. S7E), laghdaithe (~50 faoin gcéad) K48 uileláithreacht SPN, chomh maith le ~2-huaire marthanacht níos airde de SPN i gcomparáid le cealla WT (Fíor 3, F agus G). Cruthaíonn na turgnaimh seo an príomhról atá ag ligáis SCFFBW7 E3 maidir le pataiginí a bhfuil cónaí orthu i gcítosól a bhrath agus iad a dhíriú i dtreo cosáin maraithe.

Cuireann GSK3 -fosfarylation de mhóitíf dígron idirghabhála le gníomhaíocht fhrithmhiocróbach SCFFBW7

Go ginearálta, aithníonn próitéiní bosca-F foshraitheanna fosphorylated chun a n-ubiquitination a chur chun cinn (34). Mar sin, rinneamar imscrúdú ar dhóchúlacht agus ar thionchar fosfarylation foshraitheanna baictéaracha ar bhratú K48-Ub na pataigin. Nocht anailís bhithfhaisnéisíochta láithreacht iarmhair thoimhdí fosfair-thréinín (102VT*PKEE107) laistigh den seicheamh degron i BgaA. Thugamar faoi deara gur léirigh an brú SPN ag cothú sóchán BgaA-TT103A (ΔbgaA:pBgaA-TT103A) (Fíor 4A) 71 faoin gcéad colocalization laghdaithe le K48-Ub i gcomparáid le WT (Fíor 4B), ag nochtadh ábharthacht na fosfarylation in aithint tsubstráit ag an choimpléasc SCF.

Go ríthábhachtach, d'aisghair claonadh laghdaithe fosfarylation BgaA in ΔbgaA:pBgaA-TT103A cumas an óstaigh deireadh a chur le hualaí baictéaracha intracellular (~1.8-huaire) (Fíor 4C). Ag an am céanna le BgaA, léirigh athraitheach PspA degron (ΔpspA: pPspAT329A) titim 51 faoin gcéad i K48-chomhlonnú Ub a bhain le marthanacht intracellular fada (fig. S10, A go C). Go ginearálta, tá threonine / serine (T / S *) ag foshraitheanna sprice SCFFBW7 in aice le hiarmhar proline, atá fosfarlaithe ag kinase próitéin proline-dhírithe, GSK3 (35-37). Rinneamar, mar sin, iarracht rannpháirtíocht GSK3 a réiteach maidir le haitheantas foshraitheanna a mhéadú.

Léirigh muid ar dtús go bhfuil GSK3 dlúth-chleamhnaithe le SPN uileláithreach, marcáilte le FBXW7 (Fíor 4, D, agus E). Ina dhiaidh sin, trí mheasúnacht in vitro kinase a dhéanamh, thugamar faoi deara go bhféadfadh GSK3 an BgaA-T athchuingreach a phosphorylate. Ag an am céanna, d'fhan an leagan BgaA-TT103A nonphosphorylated (Fíor 4F). Dheimhnigh sé seo céannacht an iarmhair threonine laistigh den seicheamh degron de BgaA-T mar sprioc le haghaidh fosfarylation trí mheán GSK. Mar thoradh ar leagadh spriocdhírithe GSK3 le siRNA (fig. S7D) tháinig laghdú ~58 faoin gcéad ar K48 uileláithreacht SPN (Fig. 4G). Mar thoradh ar an uileláithreacht laghdaithe seo, tar éis ís-rialáil slonn GSK3, tháinig laghdú ar chumas an óstaigh pataiginí ionradh cille (~1.5-huaire) (Fíor 4H) a ghlanadh ach níor léirigh sé aon éifeacht ar ΔbgaA : pBgaA-TT103A (fig. S8, E, agus F). Le chéile, cuireann sé seo an chéad fhianaise ar kinase óstach, go sonrach GSK3 , a rialaíonn ubiquitination próitéiní dromchla baictéarach le haghaidh imréiteach éifeachtach pataiginí ( Fíor. 4 I ).

Tugann uileláithreacht pataiginí citosólacha cinniúint ar leith dá ndíothú. Go háirithe, cuireann ubiquitination K48 díriú ar fhoshraitheanna i dtreo próitéasóim (22). Mar an gcéanna, tugann ár dtorthaí le fios go bhfuil baint ag SPN uileláithreach le fo-aonad proteasomal, 7 (fig. S11, A, agus C). Ina theannta sin, feabhsaíonn cosc ​​​​próitéamónach trí chóireáil MG132 marthanacht WT SPN ach ní athraíonn sé cumas marthanais ΔpspAΔbgaA. Breathnaíodh feinitíopaí comhchosúla i gcás mutant STm agus ΔrlpA (fig. S11, B, agus D).

Cosnaíonn faireachas pataigin faoi threoir degron an t-óstach ó sepsis

D’fhéachamar ansin le tionchar aitheantais SPN tríd an innealra uibítíneachta cille ar thorthaí ionfhabhtaithe a chinneadh. Ag baint úsáide as múnla seanbhunaithe de SPN sepsis (38), rinneamar comparáid idir virulence an tsóiteáin ΔbgaA le ceann an WT SPN chomh maith le tréithchineálacha arna gcomhlánú le BgaA-T (ΔbgaA: pBgaA-T) nó leagan nach bhfuil an seicheamh degron ann ( ΔbgaA:pBgaA-TΔDegron). Ag teacht le tuairiscí roimhe seo (39), léirigh brú scriosta bgaA géine lagaithe, agus d'fhulaing lucha ionfhabhtaithe le WT, ΔbgaA:pBgaA-T, nó ΔbgaA: BgaA-TΔDegron ionfhabhtú (Fíor 5A agus fig. S12, A go D). . Mar sin féin, léirigh an grúpa lucha a bhí ionfhabhtaithe le brú SPN a raibh easpa seicheamh degron acu cion níos airde de bhásanna ach le mortlaíocht moillithe i gcomparáid le ΔbgaA:pBgaA-T-grúpa ionfhabhtaithe (P=0.0492, tástáil log-ranga) (Fíor 5A). Dheimhnigh comparáid idir na hualaí baictéaracha san fhuil (Fíor 5B) agus an spleen (Fíor 5C) agus cúrsa ama comharthaí galair infheicthe i lucha ionfhabhtaithe (Fíor 5D) an treocht i dtreo níos mó géine sa phéine ΔbgaA:pBgaATΔDegron.

Tá sé léirithe ag staidéir roimhe seo go bhfuil SPN sepsis bunaithe ó thaiscumar baictéir sa spleen (38). Cé go bhfuil an chéad tonn de bhaictéir ionracha sa gcúrsaíocht glanta go tapa ag meicníochtaí imdhíonachta dúchasacha an óstaigh, maireann cuid de SPN agus iomadaíonn siad laistigh de mhacrophages splenic, sula ndéantar iad a athshíolú isteach san fhuil. Rinneamar hipitéisiú go bhféadfadh gur tharla moill fhada ar ghalair thromchúiseacha i lucha atá ionfhabhtaithe le ΔbgaA:pBgaA-TΔDegron mar thoradh ar mharthanas fada SPN laistigh de mhacrophages splenic, mar gheall ar aitheantas intracellular laghdaithe na mbaictéar ag an innealra uileghabhálach óstach. Mar thaca leis seo, thugamar faoi deara go raibh moill ar theacht an dara tonn den bhaictéaremia i lucha a bhí ionfhabhtaithe le brú ΔbgaA:pBgaA TΔDegron i gcomparáid le ΔbgaA:pBgaA-T (24 uair in aghaidh 12 uair an chloig), tar éis na céime imréitigh luath (Fíor 5E).

Mar sin féin, sa chéim eclipse, ar lena linn a baictéir a ghlanadh as an fhuil, bhí líon baictéarach splenic níos airde go seasta i ΔbgaA: pBgaA-TΔDegron-ionfhabhtaithe lucha (Fíor 5 F). Tugann na torthaí seo le tuiscint go leathnaítear céim iomadaithe SPN laistigh de mhacrophages splenic in éagmais aitheantais intracellular d'ionfhabhtú tríd an innealra uileghabhálach. Mar thoradh air sin, is féidir le dlús baictéarach méadaithe carnadh sa spleen (Fíor 5 F), ina dhiaidh sin síolú isteach san fhuil i líon níos airde, a d'fhéadfadh cuntas a thabhairt ar an moill ach méadú ar bhásmhaireacht ΔbgaA:pBgaA-TΔDegron-ionfhabhtaithe lucha. Le chéile, léiríonn na sonraí seo go gcuireann aithint agus uileláithreacht SPN intracellular le rialú óstaigh ar phataiginí le linn sepsis.

For more information:1950477648nn@gmail.com