Feabhsaíonn Acteoside a Díorthaithe Ó Cistanche Oistéapóróis a Spreagtar le Glucocorticoid Trí Chonair PI3K/AKT/mTOR a ghníomhachtú

Teibí

Cuspóir

Úsáidtear glucocorticoids go forleathan i gcleachtas cliniciúil; áfach, is féidir leo fo-iarsmaí a chur faoi deara, mar shamplaoistéapóróis. Aicteoside(ACT) ó Cistanche baineadh úsáid as chun dul i ngleic le galair éagsúla. Rinneadh an staidéar chun éifeachtúlacht ACT i glucocorticoid-spreagtha a mheasoistéapóróis(GIOP) agus a mheicníocht ionchasach.

Modhanna
Instealladh dexamethasone (Dex) ionmhatánach chun aslúoistéapóróisi múnla francach, agus tugadh ACT ó bhéal. Forlíontar ACT in vivo in Dex-spreagthaosteoblasticCealla MC3T3-E1. Rinneadh RT-qPCR chun leibhéil mRNA defoirmiú cnámh(Runx2, CoL1A1), agus resorption cnámh (OPG agus RANKL). Cuireadh trealamh tráchtála ELISA i bhfeidhm chun leibhéil serum OC agus CTX a mheas. Rinneadh blot an Iarthair chun leibhéil próitéine sa chonair chomharthaíochta PI3K/AKT/mTOR a mheas. Rinneadh measúnacht CCK-8 agus cíteiméadracht sreafa chun inmharthanacht oistéablast agus apoptosis a mheas.

Cliceáil Anseo Chun Cistanche Acteoside a Fháil Chun Osteoblastach spreagtha Dex a chóireáil

Torthaí
Laghdaigh ACT meath microstructure cnámh Dex-spreagtha, leibhéil serum méadaithe OC, agus laghdaigh leibhéil CTX (P< 0.05). In the MC3T3-E1 cells, Dex inhibited cell viability and apoptosis chun cinn; áfach, maolaíodh an éifeacht sin go mór le ACT (P< 0.05). Concurrently, ACT reversed the reduction in Runx2, osterix, CoL1A1, and OPG mRNA levels, ALP activity, and the promotion of RANKL by Dex. Additionally, ACT attenuated Dex-induced inhibition of p-AKT/AKT, p-mTOR/mTOR, and p-PI3K/PI3K protein levels by Dex (P < 0.05), while the PI3K/AKT/mTOR pathway inhibitor LY294002 diminished the potential effect of ACT (P < 0.05).

Conclúid
ACHT óCistancheéifeachtaí osteoprotective a chur i bhfeidhm tríd an cosán comharthaíochta PI3K/AKT/mTOR a ghníomhachtú chun oistéapóróis Dex-spreagtha a mhaolú.

Eochairfhocail:Aicteoside Cistancheglucocorticoids-spreagthaoistéapóróis

Réamhrá
Is galar cnámharlaigh ginearálaithe é oistéapóróis (OP) arb iad is sainairíonna é mais chnámh íseal, scrios microstructure fíocháin cnámh, agus éagothroime i hoiméastáis cnámh [1]. Is cúis le OP níos mó ná 8.9 milliún briste in aghaidh na bliana agus tarlaíonn bristeacha oistéapóróis beagnach gach 3 soicind, agus mar thoradh ar mhíchumas nó bás ar feadh an tsaoil [2]. Déantar glucocorticoids (GCs) a riar go coitianta le haghaidh cóireáil galair athlastacha neamh-ionfhabhtaíocha (cosúil le asma agus galar putóige athlastach) chomh maith le coinníollacha uath-imdhíonachta [3]. Mar sin féin, tá úsáid fadtéarmach GC réamhshuite le níos mó ná 30 faoin gcéad de chásanna OP agus níos mó ná 10 faoin gcéad de chásanna osteonecrosis [4]. Cuireann GCanna bac go díreach ar iomadú agus difreáil osteoblast [5], laghdaítear aibiú agus gníomhaíocht, agus spreagann siad apoptosis osteoblasts, as a dtagann forbairt oistéapóróis glucocorticoid-spreagtha (GIOP) [6]. Thairis sin, tugann fianaise atá ag fás le fios gurb é mífheidhm osteoblast an chúis mhór le caillteanas cnámh. Mar sin, is cosúil gurb é méadú ar líon agus feidhm osteoblasts an phríomhstraitéis chun OP a chosc, go háirithe GIOP.

Tá leigheasanna luibhe, go háirithe iad siúd atá bunaithe ar chomhdhúile nádúrtha, á gcleachtadh leis na mílte bliain chun galair éagsúla a chóireáil [7]. Is luibh luachmhar é Cistanche a thaifeadtar sa Pharmacopeia Síneach a fhásann i gceantar theas Réigiún Uathrialach Xinjiang Uygur agus tugtar ginseng fásach air [8]. Tá sé cruthaithe go bhfuil éifeachtaí éagsúla ag Cistanche, mar shampla feabhsaithe imdhíonachta, cosaint duánach, frith-aosú, frithocsaídeach, frith-athlastach, agus éifeachtaí neuroprotective [9].Aicteoside(ACT) is glúcoside feinile ethanolic i Cistanche, a bhfuil gníomhaíochtaí bitheolaíocha, mar chosc ar apoptosis neuronal [10], a mhaolú damáiste ae [11], frith-athlasadh [12], frith-ocsaídiúcháin [13] , cosc ​​​​a chur ar diaibéiteas [14], agus otracht [15], chomh maith le díghiniúint an cartilage articular [16]. Ina theannta sin, thuairiscigh roinnt staidéar ar chógaschinéitic ACT agus dheimhnigh siad go bhfuil an éifeacht theiripeach ann fiú mura bhfuil an úsáid béil ach 0.12 faoin gcéad . Meastar gur táirge é ACT le meitibilítí gníomhacha in vivo [17].

Tá Zhang et al. léirigh sé éifeacht chosanta féideartha ACT ar chaillteanas cnámh spreagtha ovariectomy i bhfrancaigh [18]. Modhnaíonn ACT cosán comharthaíochta IGF-1/PI3K/mTOR chun caillteanas cnámh i bhfrancaigh diaibéitis a chosc [19]. Tuairiscíodh go bhfuil róil ríthábhachtacha rialála ag an gcosán PI3K/AKT/mTOR i galair éagsúla, lena n-áirítear GIOP [20]. Maolaíonn Naringin GIOP trí chonair chomharthaíochta PI3K/AKT/mTOR a rialáil [21]. Ina theannta sin, rialaíonn an cosán comharthaíochta seo idirdhealú osteoblast [22], foirmiú cnámh [23], agus leighis briste [24]. Mar sin féin, ní fios an ról a d’fhéadfadh a bheith ag ACT ar GIOP agus an bhfuil sé á rialú ag modhnú chonair chomharthaíochta PI3K/AKT/mTOR.

Bhí sé mar aidhm ag an staidéar seo éifeachtaí cosanta ACT i múnla francach GIOP agus osteoblasts in vitro a thuiscint agus na meicníochtaí móilíneacha bunúsacha a shoiléiriú.

abhair agus modhanna
Ainmhithe turgnamhacha
Fuarthas francach fireann daichead {{0}) seachtain d’aois Sprague-Dawley (SD) dar meáchan 280–340 g ó Shanghai Laboratory Animal Centre (CAS, Shanghai, China). Rinneadh nósanna imeachta cúraim na n-ainmhithe turgnamhacha tar éis an phrótacail a d'fhaomh Coiste Eitice Ainmhithe an Tríú Ospidéal Cleamhnaithe de chuid Ollscoil Leighis Qiqihar. Agus rinneadh an staidéar i gcomhaontú leis na treoirlínte ARRIVE. Coinníodh ainmhithe in ionaid ainmhithe saor ó phataiginí, 24 ± 2 céim , timthriallta 12 h éadrom agus dorcha, taise 50 ± 5 faoin gcéad, agus rochtain saor in aisce ar bhia agus ar uisce.

Tógáil samhail GIOP
Tar éis 7 lá de bheathú oiriúnaitheach, roinneadh francaigh go randamach i ngrúpaí rialaithe agus múnla ag baint úsáide as an modh tábla uimhreacha randamacha, Dexamethasone (Dex, Sigma-Aldrich St. Louis, MO, SAM) 5 mg/kg dhá uair sa tseachtain ar feadh 6 seachtaine. ionmhatánach chun OP a aslú i bhfrancaigh sa mhúnlaghrúpa [25]. Instealladh an méid céanna salainn i bhfrancaigh sa ghrúpa rialaithe (n = 10). Níor breathnaíodh aon athruithe suntasacha ar mheáchan coirp i bhfrancaigh sa dá ghrúpa ag 6 seachtaine. Ina dhiaidh sin, foroinneadh na francaigh sa ghrúpa múnla sa ghrúpa múnla, grúpa dáileog íseal ACT (Samhail móide ACT-L), agus grúpa ard-dáileog ACT (Múnla móide ACT-H). Fuarthas ACT (HPLC 98 faoin gcéad) ó Baoji Herbest Bio-tech., Ltd. (Baoji, an tSín), agus cóiríodh é le fionraí tuaslagóir uiscí. Tugadh dáileog de 50 mg/kg/d agus 100 mg/kg/d ACT ó bhéal do francaigh sna grúpaí dáileoga íseal agus ard (8 bhfrancach in aghaidh an ghrúpa), faoi seach, agus ar aghaidh ar feadh 8 seachtaine. Ina measc, ríomhadh méid an tsampla bunaithe ar staidéar roimhe seo [26]. Ag cur san áireamh leibhéal suntasachta dhá thaobh de 0.05 [eatramh muiníne 95 faoin gcéad (= 0.05)], cumhacht 80 faoin gcéad, agus méid éifeacht 0.5, mheas anailís cumhachta méid sampla riachtanach de 6 ainmhí in aghaidh an ghrúpa ag glacadh leis go leibhéal éifeachta ábhartha oistéapóróis 30 faoin gcéad. Thairis sin, le ráta fágála de 20 faoin gcéad , measadh go raibh 8 n-ainmhí in aghaidh an ghrúpa (32 francach san iomlán) oiriúnach.

Samplaí de serum francach
Tar éis 8 seachtaine, rinneadh ainéistéitic ar fhrancaigh le hiodráit chlórach 10 faoin gcéad (400 mg / kg, intraperitoneally, Solarbio, Beijing China), bailíodh fuil ón aorta bhoilg, clotáilte ag teocht an tseomra, agus lártheifneoirithe ag 3500 rpm / min ar feadh 10 nóiméad. Stóráladh an serum i bhfeadáin lártheifneora 1.5 ml go dtí go n-úsáidfí a thuilleadh é.

Measúnú ar dhlús mianraí cnámh
Bhí dlús mianraí cnámh (BMD) á úsáid ag densitometer cnámh ainmhithe beaga DAX (Ranzhe Instrument Equipment Co., Shanghai, An tSín). Go hachomair, cuireadh na francaigh sa suíomh uachtarach agus cuireadh na géaga deiridh amach. Scanadh femur ceart na francaigh de réir threoracha an mhonaróra, agus taifeadadh na luachanna BMD [27].

Anailís mhoirfeolaíocht cnámh
Ag deireadh an turgnaimh, rinneadh na francaigh a eothánú trí instealladh intraperitoneal de bhreis-hiodráit chlórach, agus socraíodh na femurs in eatánól 70 faoin gcéad. Ina dhiaidh sin, rinneadh scanadh ar chóras VivaCT 40μCT mar a thuairiscítear i staidéar roimhe seo agus ar an toirt cnámh / toirt iomlán (BV / TV), uimhir trabecular cnámh (Tb.N), tiús trabecular cnámh (Tb.Tn), agus scaradh trabecular cnámh (Tb.Sp) [28]. Maidir le eotanáis, rinneadh ainéistéisiú ar fhrancaigh SD tar éis anailís mhoirfeolaíochta cnámh trí instealladh intraperitoneal de hiodráit chloral 10 faoin gcéad (350 mg/kg).

Measúnacht imdhíonta-nasctha le heinsím (ELISA)
Baineadh úsáid as feisteáin tráchtála ELISA chun leibhéil osteocalcin (OC, E-EL-R0243c, Elabscience) agus telopeptide C-críochfort (CTX, E-EL-R1405c, Elabscience) a bhrath i serum na bhfrancach. Go hachomair, baineadh na himoibrithe ag 18-25 céim chun an tuaslagán a chothromú agus a ullmhú le haghaidh níocháin agus oibriú caighdeánach. Plátaí einsím Socraíodh plátaí le toibreacha caighdeánacha, bána agus samplacha. Cuireadh thart ar 100 μL tuaslagán caolaithe samplach leis na toibreacha, gortha ar feadh 90 nóiméad ag 37 céim, agus cuireadh antashubstaint biotinylated ina ionad ar feadh 60 nóiméad ag 37 céim. Tar éis níocháin, cuireadh an tuaslagán oibre ceangailteach einsím leis agus gor é ar feadh 30 nóiméad. Cuireadh an tuaslagán tsubstráit (90 μL), agus gor é ar feadh 15 nóiméad le cosaint ón solas. Nuair a bhí an grádán gorm le feiceáil sna toibreacha caighdeánacha, cuireadh 50 μL den réiteach foirceanta leis agus rinneadh anailís ar an athrú ar OD450.

PCR fíor-ama trascríobh droim ar ais-cainníochtúil (RT-qPCR)
Cuireadh imoibrí TRlzol LS leis an séiream francach agus cealla MC3T3-E1 arna chóireáil le ACT, agus asbhaineadh RNA iomlán trí ghor ag teocht an tseomra agus ansin clóraform a chur leis. Deimhníodh tiúchan agus íonacht RNA trí ionsúchán A260/280 a thomhas i speictreafótaiméadar Nanodrop ND-1000. Baineadh úsáid as trealamh Reverse Transcriptase SuperScript II chun RNA a thrascríobh ar ais go cDNA. Ina dhiaidh sin, cuireadh cDNA i bhfeidhm mar theimpléad, cuireadh primer leis, agus rinneadh trealamh máistir-mheascáin SYBR-Green PCR a mheascadh agus a fhorlíonadh le ddH2O go 20 μL, agus rinneadh an t-imoibriú aimplithe PCR ag baint úsáide as na bithchórais Fheidhmeach AMI7500 Fast Real-time PCR córas (ABI, CA, SAM). Baineadh úsáid as GAPDH mar thagairt inmheánach le haghaidh normalú, agus ríomhadh na leibhéil slonn coibhneasta ag baint úsáide as modh 2 - ΔΔCt agus rinneadh iad i dtríúplaí. Cuirtear an t-ord primer le haghaidh fachtóir trascríobh a bhaineann le Runt 2 (Runx2), cineál collagen I 1 (CoL1A1), activator receptor fachtóir núicléach-κB ligand (RANKL), osterix, agus osteoprotegerin (OPG) i láthair i dTábla 1.

Anailís blot an Iarthair
Cuireadh lysate RIPA ina bhfuil inhibitor protease 1 faoin gcéad leis na cealla, agus bailíodh próitéin iomlán ó gach grúpa tar éis lysis na gcealla trí chroitheadh ​​​​ar feadh 5 nóiméad ag 4 céim . Baineadh úsáid as trealamh measúnaithe BCA chun tiúchan na bpróitéiní i ngach grúpa a chainníochtú. Ina dhiaidh sin, rinneadh na samplaí próitéine a mheascadh le maolán 10 faoin gcéad dodeicile sulfáit sóidiam (SDS) i méid comhionann agus bruite i ndabhach uisce ag 95 céim ar feadh 5 nóiméad le haghaidh dínádúraithe próitéine. Ullmhaíodh glóthach ingearach SDS-polyacrylamide 12 faoin gcéad, agus tar éis an fhoirmiú solidified, sampláladh 30 ug próitéine don scaradh leictreafóiréis glóthach 120 mA 90 min. Aistríodh an phróitéin ansin chuig an scannán PVDF ag 90 V ar feadh 120 nóiméad. Tar éis é a bheith ina saothraítear rónta le albaimin serum bó-5 faoin gcéad, gearradh an membrane PVDF bunaithe ar mheáchan móilíneach an marcóra agus an sprioc-bhanna próitéine agus goraíodh é leis an antashubstaint phríomhúil comhfhreagrach thar oíche ag 4 céim. Caolaíodh antasubstaintí polyclonal coinín i gcoinne p-AKT, p-mTOR, agus p-PI3K go cóimheas 1:1000 (Proteintech, Wuhan, an tSín). Níodh TBST ar feadh 30 nóiméad agus gor é leis an antashubstaint thánaisteach chomhfhreagrach le lipéadú sárocsaídáise horseradish ag teocht an tseomra ar feadh 1 h. Rinneadh an blot a léirshamhlú agus úsáid á baint as imoibrithe cemiluminescence feabhsaithe. Rinneadh dlús na mbandaí próitéine a chainníochtú ag baint úsáide as Íomhá J. Fostaíodh GAPDH mar rialú chun leibhéil choibhneasta próitéine a ríomh.

Cultúr cille agus grúpáil
Ceannaíodh réamh-osteoblasts luiche MC3T3-E1 ó Bhailiúcháin Chultúr Fíocháin na Síne (CTCC, an tSín) agus saothraíodh iad in -MEM ina bhfuil 10 faoin gcéad de shéiream bó féatais agus peinicillin 100 U/mL, agus streiptimícin 100 mg/mL in a. gorlann humidified ag 37 céim agus 5 faoin gcéad CO2. Maidir le cultúr difreála cnámh, rinneadh meán ionduchtaithe oistéigineach trí 10 mM- -glycerophosphate agus 50 mg/ml d’aigéad ascorbic (Sigma-Aldrich) a mheascadh le -MEM agus cuireadh leis na cealla MC3T3-E1 chun aslú a n-idirdhealú. Athraíodh an meán tar éis 3 lá. Baineadh úsáid as cultúir ar feadh 14 lá le haghaidh inmharthanacht phosphatase Alcaileach (ALP). Ina theannta sin, rinneadh réamhchóireáil ar chealla leis an inhibitor PI3K LY294002 (10 μM) ar feadh 30 nóiméad, agus ina dhiaidh sin cóireáil le Dex agus ACT.

Measúnú inmharthanachta cille
Rinneadh an measúnú maidir le hOistéablasts a chóireáiltear le ACT-8 (CCK-8) chun inmharthanacht na n-oistéablastaí a chóireáiltear le ACT a mheas. Ionaclaithe na cealla MC3T3-E1 i 96 pláta tobair ag 5 × 103 cill/tobar. Measadh go raibh cainníocht 1 μM de Dex bunaithe ar staidéir roimhe seo [29] agus comh-ghlais le comhchruinnithe grádán de ACT (10 - 8, 10 - 7, 10 - 6, agus 10 - 5 M). Athsholáthraíodh an meán cultúir sna 96-plátaí tobair tar éis meán meascaithe agus imoibrí CCK-8 a chur leis i gcóimheas 10:1. Tar éis gor leanúnach ar feadh 1 h ag 37 céim , rinneadh measúnú ar an athrú ar OD450.

Brath uimhreacha apoptosis Osteoblast
Díleádh na cealla MC3T3-E1 a cuireadh faoi chóireálacha éagsúla le trypsin saor ó EDTA agus bailíodh iad trí lártheifneoiriú. Tar éis níocháin le maolán ceangailteach 1 ×, cuireadh 5 μL Annexin V-FITC leis agus gor é ag teocht an tseomra ar feadh 5 nóiméad, forlíonta le 5 μL PI agus a rith trí líon níolón mogalra 200-. Rinneadh anailís ar na samplaí agus úsáid á baint as córas cítoiméadrachta sreafa FACScan.

Measúnú gníomhaíochta ALP
Rinneadh na cealla MC3T3-E1 a ionaclú i 24-phlátaí tobair, agus cuireadh ACT agus Dex leis tar éis plástrála. Cuireadh meán difreála oistéigineach don chultúr in ionad an mheán saothraithe cille. Tar éis lysis cealla a úsáid trí thuaslagán lysis cille (P0012J, Beyotime Biteicneolaíocht), bailíodh an supernatant trí lártheifneoiriú, agus breacadh an cuar caighdeánach. Baineadh úsáid as trealamh ALP (P0132S, Beyotime Biotechnology) chun gníomhaíocht ALP a mheas agus ríomhadh an OD450.

Anailís staitistiúil
Tar éis trí thurgnaimh neamhspleácha a dhéanamh i dtríúlacha, rinneadh anailís ar na sonraí trí úsáid a bhaint as bogearraí GraphPad Prism 6.0 agus cuireadh in iúl iad mar mheán ± diall caighdeánach. Fostaíodh ANOVA chun difríochtaí staitistiúla idir grúpaí iolracha a chur i gcomparáid. Measadh go raibh luach P < 0.05 difriúil go staitistiúil.