Samhail Úrscéalta, Luch Ataxic Ataxia Telangiectasia De bharr Sóchán Neamh-Ábhar Cliniciúil (Cuid 2)

Chun tuilleadh eolais a fháil plz déan teagmháildavid.wan@wecistanche.com

3.0 Plé

Trí strus géineatocsaineach a mhéadú trí bhuille tánaisteach a chur leis an gcosán DDR, ghineamar múnla luiche nua a thaispeánann an tsraith comharthaí AT is cuimsithí d'aon mhúnla go dtí seo. Áirítear leis seo ataxia dian agus forásach a bhaineann le atrophy cerebellar agus suaitheadh ​​​​airíonna PN chomh maith le minicíocht ard ailse agus lochtanna i bhforbairt ceall imdhíonachta. Le chéile, cuimsíonn na comhghalachtaí seo na trí phríomhchúiseanna le bás roimh amAT - gach ranníocaíochtthart ar an tríú cuid de na básanna. Astu seo, is í éifeacht éagumasaithe na haimhéise an ceann is treallaí agus thuairiscigh othair agus cúramóirí gurb í an tionchar is mó ar a gcáilíocht saoil. Ar an gcúis seo, tá tábhacht mhór ag baint le láithreacht ataxia agus atrophy cerebellar sa mhúnla luiche nua seo, toisc go soláthraíonn sé acmhainn den chéad uair ní hamháin chun meicníochtaí mífheidhm néareolaíoch a shoiléiriú, ach freisin samhail in vivo a bhfuil géarghá leis. tástáil a bhfuil géarghá le AT theiripeach, mar na comhdhúile inléite a bhfuil cur síos againn anseo. Fuaireamar roinnt cosúlachtaí idir dul chun cinn iomlán na haimhéise san Atm3535; lucha Aptx agusOthair AT. In AT cliniciúil, tá easnaimh mhótair inbhraite faoi thart ar dhá bhliain d’aois, nuair a bhraitheann tuismitheoirí agus dochtúirí cumas íslithe chun aistriú ó lapadán go geata atá comhordaithe go mín, athfhillteach – ar an drochuair, is beag atá ar eolas faoi lochtanna mótair ag céimeanna níos luaithe de bharr na ngalar. leitheadúlacht íseal agus easpa tástála diagnóiseach luath faoi láthair (Rothblum-Oviatt et al. 2016). Is gnách go bhfoghlaimíonn othair siúl gan chúnamh agus is gnách go bhfanann comharthaí néareolaíocha cobhsaí sa chéad 4 go 5 bliana dá saol (Rothblum-Oviatt et al. 2016). Fuaireamar dul chun cinn luath den chineál céanna maidir le heasnaimh mhótair in Atm735×R3x; lucha Aptx^', ag brath easnaimh mhótair éadroma luatha ag P8 (easnamh athfhillteach ceartaithe) agus tréimhse cobhsaíochta coibhneasta ina dhiaidh sin, sular tháinig forbairt ar ataxia forásach agus dian tar éis p210 lena n-áirítear athruithe ar iompar, athfhillteach scanrúil, crith agus locomotor. ghníomhaíocht. Eascraíonn roinnt ceisteanna tábhachtacha as na torthaí seo, lena n-áirítear an bhfuil ról néarfhorbartha ag ATM agus/nó APTX san

cerebellum. Beidh staidéir sa todhchaí atá dírithe ar chéim luath an neamhord ríthábhachtach chun tuiscint a fháil ar an bhforbraíonn an cerebellum de ghnáth roimh mhífheidhm nó an bhfuil lochtanna forbartha mar chúis tosaigh. Fuair ​​​​muid amach freisin, cosúil le hothair AT, go raibh déine na haimhéise déanach a bhí ag forbairt athraitheach, le roinnt lucha ag luascadh le geata cúil ardchéimeach (Físeán 3) agus cuid eile ag bogadh beagnach go hiomlán trí chreathadh an stoc cúil. Fig.1E agus Físeán 4)(Rothblum-Oviatt et al.2016; Tobhach agus Lang 2018; Boder agus Sedgwick 1958). Tríd is tríd, fuaireamar amach go raibh Atm?35×xR35×; D'fhorbair lucha Aptx caillteanas forásach amhairc domhain agus intomhaiste i gcomhordú mótair cosúil leis an gceann a breathnaíodh in othair AT, a tarrtháil trí chóip amháin ar a laghad den Atm nó Aptx a fháil a nochtadh. Tá caillteanas an chomhordaithe mhótair in AT curtha i leith díghiniúna cerebellar mar gheall ar a néarapaiteolaíocht sách roghnaíoch ar fud na hinchinne agus a ról cúiseach i gcineálacha éagsúla ataxia (Hoche et al.2012). Ag teacht leAT otharstaidéir neuroimaging (Wallis et al.2007; Sahama et al.2015; Sahama et al. 2014; Dineen et al. 2020; Tavani et al. 2003; Quarantelli et al.2013), feicimid an méid cerebellar sin in Atm33 × R. ; Tá lucha Aptx gnáth ar dtús, ach de réir a chéile atrophy i gcomhthráth le hathruithe ar fheidhm néareolaíoch. Cé gur measadh go bhfuil caillteanas fíocháin cheirbreach mar phríomhchúis leis an ataxia i ndaoine, ní léir ó shonraí cliniciúla cé acu an bhfuil déine na haimhéise ina réamhaithriseoir maith ar mhéid na díghiniúna cerebellar a aimsíodh iarbháis (Aguilar et al. 1968b: Crawford et al, 2006 : Dineen et al.2020). Sa Atm?35×R35×; Aptx^ lucha, feicimid atrophy soiléir a bhaineann le tanú an ciseal dendrite néaróin Purkinje a thagann roimh na heasnaimh iompraíochta déanacha, troma. Ár dtuairimí histeolaíocha san Atm?35xR35×; Tugann Aptx’mice le fios gur leor athruithe sa fheidhm cheirbreach féin, seachas caillteanas as cuimse ar chealla cerebellar, chun an feinitíopa aiseach a chur faoi deara, ag teacht le breathnú ar lochtanna iompraíochta roimh chaillteanas suntasach PN i roinnt SCAnna (Shakkottai et al. 2011: Lorenzetti et al. 2000; Clark et al. 1997; Jayabal et al.2016). Níl sé soiléir fós cén fáth a bhfuil easnamh ATM agus APTX ag teastáil chun ataxia a ghiniúint i lucha nuair is leor cailliúint ceachtar acu chun ataxia a chruthú i ndaoine. Féidearthacht amháin is ea go bhféadfadh an inchinn creimire úsáid níos solúbtha a bhaint as conairí cúitimh nó as próitéiní iomarcacha agus iad ag freagairt do na loit DNA 10-20k a mbíonn tionchar acu ar chealla gach lá (Lindahl agus Barnes 2000). Tá roinnt cineálacha deisiúcháin DNA ann chun an dúshlán seo a chomhlíonadh, lena n-áirítear deisiú múchta bonn (BER), deisiú múchta núicléitíde (NER),

Cliceáil anseo chun tuilleadh a fhoghlaim faoi Cistanche

chomh maith le ceangal deiridh homalógach agus neamh-homalógach (HEJ agus NHEJ, faoi seach), a bhfuil baint ag gach ceann díobh le ATM agus APTX (Chou et al.2015; Caglayan et al.2017; Wakasugi et al. 2014; Tumbale et al. 2018; Chatterjee and Walker 2017) Nó, d'fhéadfadh sé a bheith ar an cás nach gcuireann easnamh i ATM nó APTX isteach go leordhóthanach ar shláinte na gceall le linn saolré réasúnta gearr na luiche, agus mar sin is gá an dá phróitéin a dhíchur chun carnadh leordhóthanach damáiste DNA a bhaint amach thar an tréimhse ama seo. Neartaítear an fhéidearthacht seo toisc go bhfuil airíonna bithcheimiceacha sainiúla agus róil fheidhmiúla ar leith ag ATM agus APTX sa fhreagairt damáiste DNA, agus mar sin thuar go mbeadh easnamh sa dá cheann ina chúis le bua níos leithne ar chobhsaíocht an ghéanóim (.i. strus géineatocsaineach méadaithe). Tugann ár dtorthaí go bhfuil gá le dhá phróitéin conair chobhsaíochta genome chun lochtanna néareolaíocha a chothú i lucha le fios go láidir gurb é caillteanas ATM's Oriole i ndeisiú DNA, seachas feidhmeanna féideartha i gcomharthú strus ocsaídiúcháin, mitophagy, nó feidhm mitochondrial is cúis leis na lochtanna cerebellar ( Shiloh 2020). Ní féidir roghanna eile a chur as an áireamh go hiomlán, áfach, mar go bhfuil APTX, cosúil le ATM, tugtha faoi deara laistigh de na mitochondria de chealla inchinn, áit a gceaptar go dtacaíonn sé le próiseáil DNA mitochondrial (Meagher and Lightowlers 2014; Sykora et al. 2011). Soláthraíonn an tsamhail luiche nua seo uirlis nua chun na féidearthachtaí seo a fhiosrú agus a shainiú go meicniúil conas a fhágann caillteanas ATM agus APTX mífheidhmiú cerebellar ar deireadh thiar. Na suaiteanna bithfhisiceacha a breathnaíodh i PNanna a taifeadadh ón AtmR35XR35X; Faightear lucha Aptx mar an gcéanna i roinnt samhlacha luch eile den ataxia. Áirítear leis seo athruithe a thugamar faoi deara ar fhriotaíocht ionchuir PN, toilleas membrane, agus tairseach agus leithead AP, a bhfuil cur síos déanta orthu freisin i múnlaí luch de SCA cosúil le 1, 3, agus 7 (Stoyas et al.2020; Shakkottai et al.2011; Dell ‘Orco et al.2015). Ina theannta sin, tá comhghaol dearfach ag an laghdú forásach ar mhinicíocht lámhaigh fhéideartha gníomhaíochta PN a dtuairiscímid le forbairt ataxia san AtrnR35XR35X; Tuairiscítear Aptx'mice i líon mór samhlacha luiche ataxacha, lena n-áirítear SCAs 1, 2, 3,5, 6, agus 13 chomh maith le cúpla foirm eipeasóideach (féach athbhreithniú (Cook, Fields, and Watt 2021)). Mar gheall ar an bhforluí suntasach i suaitheadh ​​PN a breathnaíodh thar go leor ataxias éagsúla de bharr lochtanna ceallacha ar leith, measadh gur cur chuige teiripeach leathan-bhunaithe é minicíochtaí lámhaigh PN AP a athbhunú. Mar sin féin, níl sé soiléir cé acu an fachtóir is cúis leis an ataxia é lámhaigh laghdaithe PN. Ina theannta sin, tugann fianaise turgnamhach le fios go bhféadfadh athruithe ar ghníomhaíocht PN a bheith ina bhfreagra ginearálaithe chun hoiméastáis a chothabháil le linn lagú leanúnach ar fhiseolaíocht PN a bhaineann le galair (Dell'Orco et al.2015). Mar sin, tá gá le hiarrachtaí leanúnacha ar fud na n-áisíní cerebellar go léir chun na suaitheadh ​​géiniteacha, móilíneacha agus ceallacha de bharr galair a nascadh leis na hathruithe sonracha ar chomharthaíocht néarach cerebellar a ghineann an ataxia ar deireadh thiar. Beidh tábhacht shuntasach san iarracht seo a chinneadh an bhfuil lochtanna cerebellar is cúis le galair ina gcúis go coitianta nó go difreálach ataxia trí chaillteanas feidhm cherebellar (m.sh. caillteanas comharthaí comhordaithe le linn gluaiseachta), nó ó éifeacht cheannasach-diúltach (m.sh., cur isteach ar néarchóras le sruth. ciorcaid le patrúin aschuir néaracha neamhghnácha). I ndeireadh na dála, cé go mbeadh an tionchar is mó ag straitéis chomhchoiteann theiripeach chun aghaidh a thabhairt ar ataxias cerebellar, d’fhéadfadh go mbeadh gá le cur chuige treoraithe a thugann aghaidh ar na cúiseanna géiniteacha agus móilíneacha sainiúla a bhaineann le mífheidhm cheallacha chun teiripe éifeachtach éifeachtach a fhorbairt. An nasc meicniúil idir easnamh DNA. Tá próitéiní cobhsaíochta cosúil le ATM agus APTX agus dysfunction PN i bhfad ó soiléir. Tugann ár dtorthaí le fios go bhfuil éifeacht an chaillteanais ATM agus APTX ar PNanna intreach, toisc nach bhfaighimid athruithe ar airíonna presynaptic na gceall granule nó fianaise ar a gcaillteanas cealla (gan aon athrú ar thiús GCL). Ina theannta sin, cé gur thugamar faoi deara difríochtaí i plaisteacht gearrthéarmach ionchuir olabhacha inferior i PNanna easnamhach ATM agus APTX agus cineál fiáin, is dócha go léiríonn na torthaí seo go gcuirfí isteach ar homeostasis Ca2* a d’fhéadfadh a bheith mar thoradh ar laghduithe ar Inositol 1,4,5- slonn receptor triphosphate 1(ltpr1), cosúil leis na cinn a breathnaíodh i samhlacha SCAs 1,2, agus 3 luch chomh maith le lucha ATM-easnamhach (Kim et al.2020; Chen et al.2008; Demirci et al.2009; Shakkottai et et al. al.2011). Cé go soláthraíonn sé seo bealach geallta le haghaidh scrúdaithe agus comparáide sa todhchaí, níl sé soiléir go fóill, fiú do na GÉSanna, cé acu athruithe ar hoiméastáis Ca²*, an fachtóir cúiseach nó siomptóim eile nó fiú freagra cúitimh ar PNanna a bhfuil galar orthu nó suaite (Dell). ‘Orco et al.2015). Sa chóras imdhíonachta, tá baint ag ATM le deisiú briseadh DNA a tharlaíonn go nádúrtha le linn athshocrú géine géinte receptor antaiginí i réamhtheachtaithe cealla B agus T-chill, feiniméan atá ríthábhachtach d'éagsúlacht na gceall seo maidir le receptor antaiginí (LG agus TCR). a fháil goT-chilllaghdaítear na cionúireachtaí san fhuil go suntasach i gcomhréir le staidéir roimhe seo i ndaoine agus i lucha cnagála AT (Schubert, Reichenbach, agus Zielen 2002; Hathcock et al.2013; Chao, Yang, agus Xu 2000; Barlow et al.1996). Is dócha go bhfuil comhghaol idir an laghdú seo ar T-chealla ar an imeall agus locht ar imdhíonacht cheallacha agus greannacha araon. Rud atá tábhachtach, fuair muid amach gur leor léiriú cóip amháin den ghéine ATM chun CD4 móide easnaimh san fhuil a athbhunú, rud a léiríonn go mbeadh éifeachtúlacht theiripeach ag teiripí atá in ann léiriú páirteach ATM a athbhunú. Cé nach bhfuil measúnú déanta againn ar fhorbairt B-chealla sa pháipéar seo, is dócha go mbainfeadh conclúidí comhchosúla leis an bpróiseas sin i bhfianaise a gcosúlachtaí meicniúla (Marshall et al. 2018). De réir mar a bhíothas ag súil leis, déantar laghdú ar chealla T san fhuil imeallach a chomhghaolú le forbairt thymocyte lochtach. Sa thymus, fuair muid dhá phríomh-locht. Léirítear ceann amháin, a tharlódh go príomha ag easnamh APTX, mar locht san aistriú DN3 go DN4 i gcomhthráth le hathshocrú luath an lócas TCR. Tá comhghaol idir an fabht eile, is cúis go príomha le heasnamh ATM, agus laghdú ar dhul chun cinn CD4*CD8 deimhneach go cealla aon-dearfacha, go príomha tímicítí CD4. Cé gur ábhar iontais é toradh APTX, toisc nach bhfuil baint ag a easnamh (AOA 1) le heasnaimh imdhíonachta, is eol go n-idirghníomhaíonn APTX le próitéiní athshocraithe géine TCR, lena n-áirítear XRCC4 (Clements et al. 2004). Déanfar staidéir amach anseo atá dírithe ar ról APTX i meicníochtaí cónasctha deiridh a shainiú le linn athshocrú géine TCR.

tábhachtach, agus go bhfuil gá le himscrúdú breise ar an bhféidearthacht go bhfuil meicníochtaí eile um nascadh deiridh, cosúil le húsáid na micrhomaleolaíochtaí, ina gcúis le heasnamh imdhíonachta ina éagmais (Bogue et al. 1997). An marthanacht Atm?35×/R35×; Tá Aptx'mice i bhfad níos faide ná múnlaí AT luch roimhe seo. I gcomparáid, an chéadAG KOsamhail luiche thuairiscigh Barlow et al. fuair bás ó thymomas de ghnáth laistigh de 2-4 mí tar éis breithe (Barlow et al. 1996). Is dócha gur géiniteach é an laghdú ar mharthanacht ailse sa mhúnla seo agus go leor samhlacha luiche AT knockout eile, toisc go bhfuil sé léirithe go bhfuil éifeachtaí suntasacha ag an brú cúlra a chothaíonn an sóchán ar leitheadúlacht agus ar mharthanacht ailse, le A/J agus C57BL/6

chúlraí a bhfuil méadú suntasach tagtha ar mharthanacht thar na cineálacha BALBC agus 129S (Genik et al. 2014). Is dócha gur cruthaíodh ár lucha ATM-easnamhach ar chúlra C57BL/6; nach bhforbraíonn lucha Aptx*t ataxia, is é a saolré measartha fada. Ós rud é go bhfuil an Atm35xR35×; ní dócha go gcuireann bás luath i lucha AT KO cosc ​​ar bhreathnú ar fheinitíopa aiseach a fhorbródh sna lucha seo murach é. Mar sin féin, ní fios cé acu an dtugann cúlra C57BL/6 athléimneacht i leith ataxia a fhorbairt, mar a dhéanann sé i gcás ailse. Má shainítear na fachtóirí géiniteacha nó fachtóirí eipigineacha b'fhéidir a mbíonn tionchar acu ar dhéine an ghalair, d'fhéadfaí bealaí a sholáthar d'fhorbairt theiripeach sa todhchaí. Mar gheall ar nádúr domhanda an tsócháin null ATM agus APTX inár múnla luiche, ní féidir linn a chur as an áireamh go hiomlán go bhféadfadh lochtanna seach-cheiribéal cur leis an bhfeinitíopa géar aiseach, agus mar sin scrúdú sa todhchaí lasmuigh den cherebellum sa forebrain, brainstem, chorda an dromlaigh. , agus beidh gá fiú muscle a dhéanamh. Laistigh den cerebellum, cé go bhfuaireamar roinnt difríochtaí anatamaíocha sna hairíonna lámhaigh PN laistigh de réigiúin éagsúla den cherebellum, níor bhraitheamar difríochtaí réigiúnacha i leithead ML nó i ndlús PN. Mar sin féin, tá dúshláin ann maidir le hanatamaíocht réigiúnach a úsáid mar fhachtóir grúpála sa cherebellum, toisc nach gá go mbeadh comhghaol idir fillteacha fisiceacha an fhíocháin agus teorainneacha na bhfearann ​​​​feidhme, léiriú móilíneach, nó maoine fiseolaíocha ar a ndearnadh cur síos (Apps agus Hawkes 2009). ; Tsutsumi et al.2015; Gao, van Beugen, agus De Zeeuw 2012; Zhou et al.2014). Beidh turgnaimh atá dírithe ar scrúdú a dhéanamh ar mhéid na lochtanna cerebellar laistigh de na fearainn seo tábhachtach i staidéir amach anseo agus i gcomparáid leis na tuairiscí starógacha ar dhifríochtaí anatamaíocha in othair AT (Verhagen et al.2012; De Leon, Grover, and Huff 1976; Amromin, Boder, agus Teplitz 1979; Monaco et al. 1988; Terplan agus Krauss 1969; Strich 1966; Solitare 1968; Solitare agus Lopez 1967; Aguilar et al. 1968a; Paula-Barbosa et al. 1983). Cé go mbraithimid dhá chéim fhéideartha maidir le dul chun cinn ataxia san Atm735wR35x; Aptx lucha, forbraíonn an chéim níos déanaí den ataxia dian i ndaoine fásta i lucha, i gcomparáid leis an óige-tosú i ndaoine. D’fhéadfadh sé seo teorainn a chur lena húsáid i roinnt staidéar néarfhorbartha. Chomh maith leis sin, ní mór do léirmhíniú turgnaimh sa todhchaí a chur san áireamh go cúramach go léiríonn an tsamhail nua seo sócháin nialasach in dhá ghéin chobhsaíochta genome ag an am céanna, cás nár aimsíodh in othair dhaonna le AT nó AOA1. Mar fhocal scoir, ba dhúshlán é a thabhairt faoi deara cá háit, cathain agus conas is cúis le heasnamh ATM paiteolaíocht cerebellar agus ataxia, toisc go ginearálta níl na gnéithe sainiúla ag lucha a raibh easpa ATM orthu roimhe seo chun easnaimh cheallacha agus mhóilíneacha a nascadh go cúiseach leis an bhfeinitíopa aiseach. Sainmhíníodh bealaí imscrúdaithe a bhfuil gealladh fúthu, lena n-áirítear iad siúd atá dírithe ar an leibhéal néarónach, áit a bhfuil baint ag ATM le comharthaíocht struis ocsaídiúcháin (Chen et al.2003) agus feidhm shionaptach (Li et al.2009; Vail et al.2016), mar chomh maith le feidhm glial, nuair a thugann fianaise le fios go bhféadfadh paiteolaíocht glial a bheith ina phríomhfhachtóir i bpaiteolaíocht cerebellar (Kaminsky et al. 2016; Campbell et al.2016; Petersen, Rimkus, and Wassarman 2012; Weyemi et al.2015). Soláthraíonn an tsamhail ainmhí nua seo uirlis nua chun hipitéisí meicniúla a thástáil maidir leis an gcaoi a n-eascraíonn easnamh ATM paiteolaíocht cherebellar agus ataxia. Ina theannta sin, d’fhéadfadh go mbeadh an tsamhail seo níos tábhachtaí ná mar uirlis réamhchliniciúil ríthábhachtach chun iarrthóirí teiripeacha a moladh roimhe seo a thástáil (Browne et al.2004; Chen et al.2003) agus ár gcomhdhúile SMRT féin (Du et al. 2013). Ní féidir an iomarca béime a leagan ar na teorainneacha tromchúiseacha a bhaineann le gan múnla réamhchliniciúil oiriúnach le haghaidh tástála teiripeacha, go háirithe le haghaidh neamhoird neamhchoitianta ar nós AT agus AOA1.

4.0 Ábhair agus Modhanna

4.1 Ráiteas Eitice

Rinneadh an staidéar seo i gcomhréir dhlúth leis na moltaí sa Treoir um Chúram agus Úsáid Ainmhithe Saotharlainne de chuid na nInstitiúidí Náisiúnta Sláinte. Láimhseáladh na hainmhithe go léir de réir phrótacail cheadaithe an Choiste Institiúideach um Chúram agus Úsáid Ainmhithe (IACUC) ag Institiúid Lundquist (31374-03,31773-02) agus UCLA(ARC-2007-082, ARC{{3}). }). Cheadaigh an Coiste um Eitic Turgnaimh Ainmhithe de chuid Institiúid Lundquist an prótacal (Uimhir Dhearbhaithe: D16-00213). Rinneadh gach iarracht pian agus fulaingt a íoslaghdú trí thacaíocht a sholáthar nuair ba ghá agus trí chríochphointí eiticiúla a roghnú.

4.2Lucha

All mice were group-housed and kept under a 12-h day/night cycle with food and water available ad libitum. Animals were housed within the general mouse house population, and not in specialized pathogen-free rooms. Older animals were made available wetted food or food gel packs on the ground of the cages as ataxia developed. Atm35 and Atm935×mice were created and provided by Dr. Hicks and colleagues at the University of Manitoba. These mice were created to contain the c.103C>T sóchán le fáil i ndaonra mór na hAfraice ThuaidhATothair using recombineering Gateway technology and site-directed mutagenesis. A C>T mutation at this position in the mouse Atm gene creates a TAG G stop codon. The same mutation in the human ATM gene produces a TGA G stop codon. In consideration of the use of these models for therapeutic interventions, we chose to create a mouse model for each of the two PTC codons(Fig.1A). A modified Gateway R3-R4-destination vector was used to pull out the desired region of the mouse Atm gene from a Bacterial Artificial Chromosome (BAC) and subsequently mutated to create either a TAG G stop codon at codon 35(M00001, position 103(C>T))or a TGA G stop codon (M00002, position 103 (CAG>TGA), macasamhlú an duine AT PTC). Ansin rinneadh na hailéilí géanómacha a chlónáil isteach i leagan modhnaithe den veicteoir spriocdhírithe mamaigh NorCOMM ag baint úsáide as Frithghníomh Geatabhealaigh 3-(Bradley et al. 2012). Leictridheadh ​​na veicteoirí spriocdhírithe a d’eascair as seo isteach i gcealla C2 ES (C57BI/6N, díorthaithe i saotharlann A. Nagy, Toronto, Ceanada) agus sainaithníodh clóin spriocdhírithe go rathúil trí roghnú le G418 (Gertsenstein et al.2010). Dheimhnigh blot an Deiscirt comhtháthú an chaiséad spriocdhírithe sócháin isteach sa lócas géine Atm, agus trí tháirgí PCR a sheicheamhú chun láithreacht sóchán Atm PTC a dheimhniú, díriú gan earráid sa lócas Atm, agus comhpháirteanna feidhmiúla saor ó earráid an

veicteoir (sonraí gan a thaispeáint). Baineadh úsáid as clóin ES dearfacha le haghaidh instealladh blastocyst chun na línte trasgenacha a fháil. Bhí tionscnóir béite-actin daonna floxed san ailléil trasgenicTK1-Nua cassette in the intron upstream of the region containing the mutated exon. This floxed cassette was subsequently excised by crossing with a Cre driver mouse(B6.C-Tg(CMV-are)1Cgn/J) to generate Atm3x+ and AtmM1(103CTMFcc, respectively) mouse lines Atm35×+ (MGI nomenclature: AtmTM1(103CAG>TGA)MFGCc;(Fíor 1A). Rinneadh géinitíopáil an dá líne Atm trí úsáid a bhaint as na primers seo a leanas ag céim Tm 62 céim : géine atm ar aghaidh (F) primer:5'-CCTTTGAGGCATAAGTTGCAACTTG-3'; agus cúlú géine Atm(R)primer: 5'-GTACAGTGTATCAGGTTAGGCATGC-3', ag cruthú táirge ailléil de chineál fiáin de 151bp nó táirge ailléil spriocdhírithe de 241bp (Fíoracha 1A, 1B).Bhí Atmn35~ agus Atm035×v ann. ais-thrasnaigh le lucha C57Bl/6J ar feadh 9 nglúin (99.2 faoin gcéad isogenic) roimh an cryachoimeád agus ath-iarghabháil ina dhiaidh sin ag baint úsáide as C57BI/6J máithreacha ionaid. Atm735× agus Atm?35xand Atm 35×/Q35× bhí póraitheoirí a fuarthas ó F1 sibling Atm35 agus Atm835X móide lucha. AtmR35×k35×: fuarthas go raibh an dá cheann torthúil. Cruthaíodh lucha Aptx (Aptx) agus soláthraíodh iad don Dr. Mathews mar shuthanna ón Dr. McKinnon (Ahel et al.2006), agus ina dhiaidh sin athdhearnadh iad trí mháithreacha ionaid C57Bl/6J. Tá lucha Aptx ar chúlra measctha C57Bl/6 agus 129. Atm35k35; Cruthaíodh lucha Aptx de chineálacha éagsúla fiáine, heitrisigeacha, agus comhcheangail homozygous ó Atm35X; Gineadh póraitheoirí Aptxt trí lucha Atm?35×R35 agus Aptx^ a thrasnú. Baineadh úsáid as cohórt amháin de lucha tsóiteáin dúbailte agus lucha rialaithe comhfhreagracha sa staidéar iompraíochta fadaimseartha le haghaidh anailísí gait agus tástáil SHERPA (Figs.2,3). Baineadh úsáid as cohóirt bhreise iolracha de lucha tsóiteáin dúbailte aois-mheaitseála agus rialaithe le haghaidh turgnaimh tástála leictreafiseolaíocha, imdhíon-hiisteolaíocha agus Ingearach Pola (Figs.4, 7). Rinneadh turgnaimh imdhíoneolaíocha agus léirithe próitéine ag baint úsáide as lucha a tógadh ó na lucha bunaidh AtmR35 × agus Atm35 × athdhéaraithe (Figs.5, 6, agus 8). Rinneadh géinitíopáil ó shamplaí fíocháin chluas de lucha P8-11. Baineadh úsáid as modhanna PCR fíor-ama arna seoladh ag Transnetyx Inc. chun géinitíopa gach ainmhí a chinneadh. Rinneadh ainmhithe a shainaithint trí thatúnna ladhar a tugadh ag an am céanna le bithóipse cluaise. Rinneadh na primers uathúla do Atm35× agus Atm35× a chainníochtú agus a úsáid chun lucha fiáine, heitrisigeacha agus homaisigeacha a shainaithint (liostaithe thuas). Baineadh úsáid as primers Aptx' agus Aptx*" chun a gcuid géinitíopaí a mheas.

4.3 Sláinte Ainmhithe

Rinneadh ainmhithe a mheá trí scála digiteach ag P8, 45, 120,210,400. Taifeadadh bás ainmhithe mar an lá a fuarthas marbh, nó ar an lá eotanúcháin nuair a shroich na hainmhithe críochphointe daonnachtúil (an t-ainmhí nach raibh in ann é féin a cheartú laistigh de na 60idí, mataí suntasach gruaige a léirigh easpa féinghrúmaeireachta nó anacair iomarcach mar a thug an tréidlia faoi deara. foireann). Bhí conablaigh ainmhithe reoite láithreach ar bhás, agus rinneadh necropsies iarbháis i mbaisceanna. Rinneadh cúis dhóchúil an bháis a chinneadh chomh fada agus is féidir linn i gcomhar leis an tréidlia foirne (An Dr. Catalina Guerra) trí iniúchadh amhairc ar na horgáin inmheánacha. Rinne foireann vivarium roinnt lucha a channabalú nó a dhiúscairt trí thimpiste agus rinneadh iad

dá bhrí sin lipéadaithe mar "ar iarraidh." Lipéadaíodh lucha nach raibh aon chúis bháis amhairc inaitheanta acu "neamhchinntitheach." Liostaíodh lucha a fuarthas le maiseanna tóracsacha in aice leis an áit a mbeadh an thymus de ghnáth i lucha óga mar "ailse thymic". lipéadaíodh cúiseanna dóchúla an bháis (m.sh., aenna méadaithe, bac fuail) mar "eile."

4.4 Iompar

Sula ndearna siad aon tástáil iompraíochta, bhí lucha i dtaithí ar an seomra iompraíochta ar feadh ~20 nóiméad. Rinneadh tástáil ar lucha ag amanna éagsúla den lá, ag teacht lena dtimthriall laethúil. Rinneadh ceallra de thástálacha iompraíochta ar lucha tsóiteáin naive dúbailte de na géinitíopaí léirithe ag pointí ama éagsúla ag brath ar an iompar ach sa chohórt céanna lucha. Áiríodh ar cheall na dtástálacha an measúnú Catwalk Gait (P45, 120,210, 400) agus fo-thacar de thástálacha Measúnú Feinitíopa SmithKline-Beecham Harwell Imperial-College agus Royal-London-Hospital Assessment feinitíopa (SHERPA) (P30 agus 400). Ba é Croí Iompraíochta UCLA a rinne na tástálacha seo. Scrúdaíodh lucha mutant dúbailte agus lucha rialaithe freisin sa tástáil Pol Ingearach. Scriosadh gach gaireas iompraíochta le eatánól (70 faoin gcéad) idir gach ábhar tástála.

Anailís Gait

D’úsáideamar córas anailíse Noldus Catwalk Gait atá deartha chun siúl na lucha a thomhas agus a anailísiú go leath-uathoibríoch le linn gnáthshealtán. Go hachomair, déantar gluaiseacht na lucha thar chonair bun gloine a fhístaifeadadh ó shuíomh lárnach. Aibhsítear priontaí lapa san fhíseán de bharr soilsiú solais trasna an ardáin siúlóide gloine. Braitear gach céim luiche laistigh de fhís ina dhiaidh sin ag baint úsáide as Catwalk XT (Noldus) ar bhealach leath-uathoibríoch. Is éard atá i rith do gach luch ná 3 thriail de luascadh comhsheasmhach ar fud an ardáin a ndéantar monatóireacht air. Ní ghlactar ach le trialacha comhsheasmhacha, agus féadfaidh lucha suas le 10 n-iarracht a dhéanamh chun 3 thriail chomhlíontacha a chur i gcrích i gceachtar treo trasna na conaire. Sainmhíníodh trialacha comhlíonta mar iad siúd le gluaiseacht trasna an ardáin faoi 5 s-fada agus gan níos mó ná 60 faoin gcéad éagsúlacht luais. Nuair a cuireadh ar an ardán iad, ritheadh ​​lucha anonn is anall de ghnáth gan aon ghá le leideanna ó thurgnaimh.

Pol Ingearach

Cuirtear lucha ag barr bolta 80 cm ar airde agus a srón ar aghaidh síos agus lapaí cúil chomh gar don bharr agus is féidir. Scaoiltear lucha láithreach, agus cuirtear tús leis an am díreach ar an socrúchán.

Stoptar an t-am nuair a théann an chéad forepaw i dteagmháil leis an dromchla faoin cuaille. Is é an réamh-mheastachán nádúrtha atá ag luch ná an cuaille a dhreapadh láithreach, agus tugtar suas le 60í dóibh an cuaille a thrasnú, ar shlí eile, cabhraítear leo as an cuaille. Tugtar am 30s go huathoibríoch do thriail neamhchríochnaithe, toisc go raibh 95 faoin gcéad de lucha nár tháinig síos laistigh de 30 s fós ar an cuaille ag marc na 60í. Rinne Ollscoil California, Croí Iompraíochta SHIRPA tástálacha iompair ag P30

agus P400.Scóráiltear na paraiméadair go léir chun measúnú cainníochtúil a sholáthar. a cheadaíonn comparáid a dhéanamh idir torthaí thar am agus idir saotharlanna éagsúla. Rinneadh gach luch a thástáil go seicheamhach thar gach iompar laistigh de ~20-nóiméad ama sula ndeachaigh sí ar aghaidh go dtí an chéad luch eile. Bhí an turgnamh dall ar ghéinitíopa ainmhithe. Rinneadh an scáileán mar a thuairiscítear roimhe seo (Rogers et al. 1997).

Breathnú Iompraíochta

Soláthraíonn an príomhscáileán próifíl breathnóireachta iompraíochta agus tosaíonn measúnú gach ainmhí trí iompraíocht gan cur isteach a bhreathnú i bpróca féachana (trastomhas 10 cm) ar feadh 5 nóiméad. Chomh maith leis na hiompraíochtaí scórála maidir le suíomh coirp, gníomhaíocht spontáineach, ráta riospráid, agus crith, logálann an breathnóir aon chásanna d'iompraíocht agus trithí aisteacha nó steiréitíopacha, licking éigeantach, biteáil féin-millteach, agus cúlú (ag siúl siar) agus tásca spásúlachta. easaontas.

Iompar Arena

Ina dhiaidh sin, aistrítear an luch chuig an réimse (30 cm x 50 cm) le haghaidh tástála arousal aistrithe agus breathnú ar ghnáth-iompraíocht. Marcáiltear an t-airéine i ngreille de chearnóga 10 x 10 cm² chun gníomhaíocht locomótair a thomhas laistigh de thréimhse 30 s. Cé go bhfuil an luch gníomhach sa réimse, taifeadtar bearta freagartha scanrúil, gait, ingearchló pelvic, agus ingearchló eireaball.

Srian supine

Cuirtear srian ar an ainmhí in áit uachtarach chun iompar uathrialach a thaifeadadh. Le linn an mheasúnaithe seo, rinneadh measúnú ar neart greim, ton coirp, athfhillteach pinna, athfhillteach coirne, pinch ladhar, ainliú sreinge, agus ráta croí.

Iarmhéid agus Treoshuíomh

Ar deireadh, rinneadh roinnt beart d'fheidhm an chórais vestibular. Rinneadh an athfhillteach ceartúcháin, an t-athfhillteán ceartúcháin teagmhála, agus na tástálacha geotaxis diúltacha. Le linn an nós imeachta seo taifeadadh gutha, urination, agus eagla ginearálta, greannaitheacht, nó ionsaí.

Trealamh a Úsáideadh

Réimse Plexiglas 1.Clear (toisí inmheánacha thart ar 55x33 x18 cm). Ar urlár an réimse tá bileog Plexiglas marcáilte le 15 cearnóga (11 cm). Daingnítear sreang docht cothrománach (trastomhas 3 mm) trasna an chúinne ar chúl ar dheis ionas nach féidir leis na hainmhithe teagmháil a dhéanamh leis na taobhanna le linn ainliú na sreinge. Daingnítear greille (40x 2{{40} cm) le mogall 12 mm (neas) trasna leithead an bhosca chun crochadh eireabaill agus iompar neart greim a thomhas. 2. Baineadh úsáid as sorcóir Plexiglas soiléir (15 x ll cm) mar phróca féachana. 3. Urlár greille amháin (40x 2{{20 cm) le mogaill 12mm ar a seasann prócaí amharc.4. Ceithre thaca sorcóireacha dosmálta (fad 3 cm x 2.5 cm trastomhas) chun greillí a ardú den bhinse. 5. Pláta cruach dhosmálta cearnach amháin (13 cm) chun ainmhithe a aistriú chuig an láthair. 6. Fad gearrtha de 3/0 Mersilk coinnithe sna fórsaí do thástálacha athfhillteacha coirne agus pinna 7. Géaraíodh slat shaille plaisteach go pointe peann luaidhe chun salivation agus biting a thástáil.8. Péire fórsa díroinnte trealaimh, cuartha le pointí míne (fórsa 125 mm, Philip Harris Scientific, Cat. Uimh. D46-174), le haghaidh pinch na ladhar. 9.A stopwatch.10. Úsáidtear bosca Cliceáil IHR chun na freagraí scanrúla a thástáil. Gineann an Bosca Cliceáil ton gairid 20 kHz ag 90dB SPL nuair a choinnítear é 30cm os cionn na luiche. Déan teagmháil leis an Ollamh KP Steel, Institiúid Taighde Éisteachta an MRC, Páirc na hOllscoile, Nottingham NG{7 2RD. 11.A rialóir.12.A feadán Plexiglas soiléir 30 cm le trastomhas inmheánach de 2.5 cm don cheartú teagmhála Reflex.4.5 Leictrifiseolaíocht Ullmhaíodh slices géara cerebellar slices parasagittal gleoite de thiús 300 μm as an cerebellum de lucha littermate turgnamhach agus rialaithe trí mhodhanna foilsithe a leanúint (Hansen et al., 2013). Go hachomair, baineadh cerebella go tapa agus tumtha i dtuaslagán eischeallach oighir le comhdhéanamh (mM): 119 NaCl, 26 NaHCOg, 11 glúcóis, 2.5 KCl, 2.5 CaCla, 1.3 MgCla, agus 1 NaHzPOa,pH7.4 nuair gasaithe le 5 faoin gcéad CO-/95 faoin gcéad O2. Gearradh Cerebella go parasaigití trí úsáid a bhaint as vibratome (Leica VT-100, Leica Biosystems, Nussloch, an Ghearmáin) agus ar dtús goradh ag 35 céim ar feadh{-30 nóiméid, agus ansin é a chothromú agus a stóráil ag teocht an tseomra go dtí go n-úsáidfí é. Leictrifiseolaíocht Eischeallach Fuarthas taifeadtaí eischeallacha agus incheallacha ó néaróin Purkinje (PNanna) i slisní a bhíodh perfused i gcónaí le tuaslagán eischeallach carbogen-bubbled agus a chothabháil ag ceachtar 37 céim C (seachcheallacha) nó 32 céim (intracellular) ± 1 céim (féach thuas). Rinneadh na cealla a léirshamhlú le optaic DIC agus cuspóir tumoideachais 40 × (NA 0.75) ag baint úsáide as micreascóp Scrúdaitheoir Zeiss. Líonadh pípéid ghloine de fhriotaíocht ~3 MQ (Samhail P-1000, Sutter Instruments, Novato, CA) le tuaslagán eischeallach agus cuireadh iad in aice le cnoic axon PN chun gluaiseachtaí srutha toilleasa poitéinsiúla a thomhas i mód voltais-clamp. agus an poitéinseal pípéad coinnithe ag 0 mV. Le haghaidh taifeadtaí paiste-clampán iomlána, líonadh pípéid le tuaslagán infhéitheach (mM): 140 mí (CH3KO3S), 10 NaCl, 2 MgCl2,0.2 CaClz, 10 HEPES, 14 Fosphocreatine (tris salt), 1 EGTA,4 Mg -ATP,0.4 Na-GTP.100 μM Cuireadh Picrotoxin (Sigma) leis chun ionchuir shionaipeacha GABAegeric coisctheacha a bhlocáil. Fuarthas sonraí ag baint úsáide as

aimplitheoir MultiClamp 700B ag 20 nó 100 kHz i mód voltais nó sruth-clamp, Digidata 1440 le pClamp10 (Feistí Móilíneacha, Sunnyvale, CA) agus scagtha ag 2 go 4 kHz. Bhí friotaíocht na sraithe de ghnáth idir 10 agus 15 MQ. Cúitíodh friotaíocht sraithe ag 80 faoin gcéad le haghaidh turgnaimh plasticity gearrthéarmacha amháin. Maidir le taifeadtaí eischeallacha, rinneadh idir 20 agus 45 PN a thaifeadadh ó gach ainmhí thar gach géinitíopa, inscne agus aoisghrúpa. Scaipeadh taifeadtaí thar ais medial-cliathánach agus rostrocaudal an gránaigh. Níor scrúdaíodh ach cealla le cuma “sláintiúil” (codarsnacht íseal de theorainneacha ceallacha) agus ráta lámhaigh rialta gan bhriseadh. Le linn na hanailíse, fuarthas go raibh bearnaí sa lámhaigh níos mó ná 2 soicind i roinnt cealla, agus cuireadh deireadh leis na cealla seo ón anailís, toisc go bhfuil baint ag an gcineál lámhaigh seo le bheith "míshláintiúil." Ní raibh difríocht cháilíochtúil ag fíocháin mutant dúbailte i cuma faoi mhicreascópacht DIC roimh thaifeadtaí, agus ní raibh líon na gceall "míshláintiúil" níos airde ná líon na ngéinitíopaí eile (7 faoin gcéad vs 4 go 11 faoin gcéad de na cealla go léir trasna géinitíopaí rialaithe ag P400). Fuarthas comparáid spásúil de ghníomhaíocht néarúil trí thaifead a dhéanamh ó chodanna sraitheacha sna slisní flocculus, cliathánach (2"d nó 3'), idirmheánach (6" nó 7th), agus medial (11" nó 12t). na haoisghrúpaí níos óige (P45 agus 110) chun suíomh coibhneasta na dtaifeadtaí thar aoisghrúpaí a mheaitseáil go garbh. 0-3 rinneadh taifeadtaí ó gach lobule laistigh de gach slice ag brath ar cháilíocht fíocháin agus sláinte. Mhair gach taifeadadh ar feadh {{29} Úsáideadh 3 go 5 lucha do gach aoisghrúpa, agus dalladh an turgnamh don ghéinitíopa, don aois agus don ghnéas.

Fuarthas taifeadtaí intracellular ó PNanna i lobule IIl nó VIl den gránach medial (ie, vermis); níor breathnaíodh aon difríochtaí staitistiúla maidir le hairíonna idir lobules.

Anailísí

Braitheadh ​​agus anailísíodh eatraimh idirspreagtha féideartha gníomhaíochta spontáineach ag baint úsáide as gnáthaimh chaighdeánacha agus saincheaptha i ClampFit (Gléas Móilíneach), GoPro (Wavemetrics), agus Excel (Microsoft). Go sonrach, aimsíodh féidearthachtaí gníomhaíochta tairsí, agus rinneadh staidreamh spiking (.i. minicíocht agus fad eatraimh) a chinneadh ag baint úsáide asadaptedlgorProroutines(TaroTools; https://sites.google.com/site/tarotoolsregister/). Ríomhadh comhéifeacht éagsúlachta an mheán-eatramh idirspíce (CV) agus an t-eatramh idirspíce airmheánach (CV2=2 ISIn móide 1-ISInl/(ISIn plus 1 plus IIn)) in Excel ag baint úsáide as Excel. macraí saincheaptha. Rinneadh anailís ar airíonna caighdeánacha membrane ag baint úsáide as lgorPro. Socraíodh RM trí fhreagraí rian 3 voltas a mheánú ar chuisle céime mV ó -80 phoitéinseal coinneála mV agus an sraonadh srutha mar thoradh air a thomhas idir 900 agus 1000 ms tar éis tosú. Tomhaiseadh tairiseach ama an scannáin trí aon easpónantúil amháin a fheistiú ar an gcéim lobhadh tosaigh ó 90 faoin gcéad go 10 faoin gcéad den bhuaicphointe. Rinneadh CM a ríomh tríd an tairiseach ama membrane a roinnt ar na RM.sEPSC. Spreagadh axons snáithíní comhthreomhara agus dreapadóireachta ag baint úsáide as leictreoidí gloine theta (WPI) agus aonraitheoir spreagtha TTL-rialaithe (ISO-Flex, AMPI). Rinneadh anailís ar aimplitiúid spreagtha EPSC agus tairisigh ama meatha (1 chaiteachais le haghaidh comhthreomhar agus 2 chaiteachas do shnáithíní dreapadóireachta) ag baint úsáide as gnáthaimh shaincheaptha in lgorPro. Scrúdaíodh poitéinseal gnímh mar chuid de thacar d’instealltaí reatha 1 s idir -500 agus 2250 pA (250 pA céimeanna) agus coigeartaíodh sruth sealúchais chun acmhainneacht ~70 mV a choinneáil. Tomhaiseadh tonnfhoirmeacha féideartha gníomhaíochta trí úsáid a bhaint as saincheaptha

Gnáthaimh i lgorPro. Sainmhíníodh tairseach poitéinseal gníomhaíochta mar an chéad voltas membrane inar sháraigh an chéad díorthach 30 mV/ms (Zhu et al.2006).

4.6 Scrúdú ar Thréafacht Cheiribileach

Méid cerebellar Díreach tar éis an inchinn a bhaint as an cloigeann, fuarthas íomhá droma iomlán. Próiseáladh íomhánna ansin ag baint úsáide as Fidsí (NIH). Rinneadh measúnú ar na méideanna forebrain agus cerebellar trína 2-spás toisí a imlíniú agus ansin an t-achar a ríomh. Normalaithe againn le haghaidh difríochtaí féideartha i méid foriomlán na hinchinne trí thorthaí an gránaigh a roinnt ar mhéid an forebrain chun cóimheas gránach-go-forebrain coibhneasta a tháirgeadh. Bhí na turgnaimh dall ar ghéinitíopa an ainmhí. Imdhíon-cheimic Ag críochphointí an staidéir faoi seach (P45, 120,210,4{{7{{1{108}}4}}}}0), lucha fireanna agus baineanna de gach géinitíopa Rinneadh ionadaíocht sa staidéar seo a ainéistéisiú le isaflurane agus rinneadh perfusion trascairdiach le saline maolánach fosfáite ina dhiaidh sin 4 faoin gcéad (w/v) paraformaildéad maolánach (PFA) agus ansin dídháileadh é chun an inchinn a bhaint. Tógadh íomhánna den inchinn ar fad díreach tar éis an inchinn a bhaint den cloigeann agus ansin cuireadh na hinchinne faoi uisce i 4 faoin gcéad PFA ar feadh 24 uair an chloig, agus ansin crióchosanta i saline maolánach Tris (TBS) le 0.05 faoin gcéad azide agus 30 faoin gcéad de shiúcrós le haghaidh 72. uair an chloig agus a stóráil ag 4 céim go dtí go n-úsáidfear a thuilleadh. Scaradh an cerebellum ón forebrain agus altaíodh parasagittal ag baint úsáide as micreatóim sleamhnáin （Microm HM 430, Thermo Scientific） socraithe go rannóg ag tiús 40 μm. Bailíodh ailt cerebellum i sraith de shé agus stóráiltear iad i TBS-AF (TBS le 30 faoin gcéad de shiúcrós, 0.05 faoin gcéad azide sóidiam, agus 30 faoin gcéad glycol eitiléine) ag 4 céim nó -20 céim go dtí go n-úsáidfear a thuilleadh iad. Le haghaidh léirshamhlú imdhíonfhluaraiseacha de néaróin Purkinje, codanna cerebellum den dá Atm*; Aptx*t agus Atm?35×R35×; Niteadh Aptx^(n=5 in aghaidh an ghéinitíopa) ar feadh 5 nóiméad i TBS trí huaire agus ansin blocáladh é i séiream gabhar gnáth 15 faoin gcéad ag teocht an tseomra ar feadh 30 nóiméad agus ina dhiaidh sin gor saorshnámh i gcoinne chailbinidín coinín nó luch D. -28k (1:1000)ar feadh 1 uair ag teocht an tseomra ar chuar-chroiteoir. Ansin nite codanna ar feadh 5 nóiméad le TBS trí huaire, agus ina dhiaidh sin gor saor-snámh in aghaidh coinín gabhar nó i luch Alexa Fluor 488 (1:1000) ar feadh 1 uair sa dorchadas ag teocht an tseomra ar chuar-chroiteoir. Tar éis gor antashubstaint thánaisteach, nite na codanna ar feadh 5 nóiméad i TBS trí huaire, ansin gléasadh iad agus clúdaíodh iad le Fluoromount-G le DAPI. I gcás codanna áirithe, rinneadh antashubstaintí frith-scríofa Caspase-3(1:200) agus frith-CD68(1:400) a iniúchadh i gcomhthráth le Calbindin ag baint úsáide as antasubstaint thánaisteach Alexa Fluor 647 (1:500). Scanadh na sleamhnáin ag baint úsáide as Stereo Investigator (MBF Bioscience, ver.2020) ar mhicreascóp Zeiss atá feistithe le ApoTome 2 (Carl Zeiss Microscopy, Axio Imager.M2) ag baint úsáide as cuspóir 2.5, 10,20,40, nó 63x, agus íomhánna a gabhadh le ceamara Hamamatsu CMOS (Hamamatsu Photonics, ORCA Flash 4.0 LT móide). Chun líon na gceall imoibríoch calbindin i ngach lobule sna híomhánna a tháinig as a chainníochtú, d'úsáideamar Stereo Investigator chun 2 líne a tharraingt go randamach idir 300 agus 500 μm ar fad i gach lobule agus de láimh líon iomlán na PNanna feadh an fad laistigh den tiús 40 um den slice fíocháin faoi 40x formhéadú. meán le haghaidh tuilleadh comparáide idir lobules agus ainmhithe. Rinneadh leithead dendrite PN deimhneach Calbindin a thomhas ag suíomh réamhshainithe i lobule VI ó gach ainmhí i 25 nó 40 um rannóga tiubh fíocháin faoi formhéadú 20x. Rinneadh leithead dendritic na mbrainsí bunscoile agus tánaisteacha a thomhas ag an lárlíne idir na cealla PN agus imeall na ciseal móilíneach. Tomhaiseadh idir 7 agus 13 dendrite in aghaidh na coda, cuid amháin in aghaidh an ainmhí. Le haghaidh tomhais somatic PN, baineadh úsáid as Stereo Investigator chun PNanna a roghnú go randamach a dáileadh ar fud na rannóige meánach ar fad faoi mhéadú 20x. Socraíodh an meánleithead PN in aghaidh an ainmhí trí mheán na dtorthaí thar 3 chuid sraitheach (16 go 37 PN in aghaidh na coda). Tomhaiseadh leithid an PN ingearach leis an gciseal PN nó leis an dendrite a bhí ann amach anseo má bhí sé níos airde ná cúpla céim. Rinneadh measúnú ar leithead an chiseal mhóilíneach agus an chiseal granule (léirithe le stains Calbindin agus DAPI, faoi seach) in Stereo Investigator trí dhá thomhas leithead a mheán ag láithreacha réamhshainithe do gach lobule, thart ar leath bealaigh chomh maith le fad fad gach lobule faoi mhéadú 2.5x.CD68 Rinneadh dearfacht sna hailt cerebellar a chainníochtú trí achar iomlán CD68 a thomhas chomh maith le staining dearfach ar fud na coda cerebellar medial ar fad. Rinneadh íomhánna fuaite 10x a thairseach don rialú diúltach agus rinneadh iad a chainníochtú ag baint úsáide as ImageJ, cuid amháin in aghaidh an ainmhí. Chun an céatadán de PNanna deimhneacha Calbindin a bhí dearfach do Caspase scoilte-3 a chainníochtú, rinneamar PNanna a chomhaireamh ar fud an ghránaigh ar fad ag baint úsáide as Stereo Investigator. Scrúdaíodh trí íomhá méadaithe 20x fuaite in aghaidh an ainmhí agus meánaíodh na torthaí. Bunaíodh an tairseach le haghaidh dearfacht Caspase ó chodanna rialaithe a dhaite leis na hantasubstaintí tánaisteacha amháin. Maidir le hanailís histeolaíoch neamhfhluaraiseach, 25-um-tiubh, saor-snámh, codanna fíocháin ar shleamhnáin luchtaithe deimhneacha agus aerthriomaítear thar oíche. Níodh an fíochán i saline maolánach Fosfáite (PBS) faoi dhó ar feadh 5 nóiméad, ansin dhaite go seicheamhach le 0.1 faoin gcéad Hematoxylin in eatánól 95 faoin gcéad ar feadh ~ 25s agus 0.5 faoin gcéad Eosin in eatánól 95 faoin gcéad ar feadh ~ 3s agus nite in uisce driogtha dúbailte ina dhiaidh sin. gach stain. Díhiodráitíodh an fíochán ina dhiaidh sin ar feadh 1 nóiméad i 95 faoin gcéad eatánól, 100 faoin gcéad eatánól, agus 100 faoin gcéad níocháin Xiléin, ansin clúdaíonn sé le Permount. Rinneadh íomhánna de na sleamhnáin agus úsáid á baint as ceamara daite (Q Imaging, MBF Biosciences) ar an micreascóp Zeiss céanna agus bogearraí fála MBF. Bhí na turgnaimh dall ar ghéinitíopa na luiche inar scrúdaíodh ailt, agus bhí ord an scrúdaithe idirdhuilleogach do gach tomhas histeolaíochta.

4.7 Sreabh-Chítiméadracht Tomhais

Rinneadh anailís cíteaiméadrachta sreafa ar chealla fola agus thymus trí staining le antasubstaintí frith-luiche ar leith - CD4, CD8, CD3, CD44, agus CD25. Go hachomair, rinneadh samplaí fola uile (50 μ) a dhathú ag baint úsáide as antasubstaintí fluaraiseacha-lipéadaithe, ansin lísíodh cealla fola dearga ag baint úsáide as tuaslagán líseála BD agus bhí dhaite cealla fola bána beo ag baint úsáide as stain inmharthanachta. Bhí Thymi dícheangailte go meicniúil. Bhí 1 go 2 mhilliún cealla thymus daite mar an gcéanna ag baint úsáide as antasubstaintí sonracha do CD4, CD8, CD44, agus CD25. Rinneadh anailís ar chealla fola bána imdhíon-dhaite nó samplaí thymus ag baint úsáide as FACS ARIA l agus rinneadh anailís ar shonraí ag baint úsáide as bogearraí FlowJo mar a tuairiscíodh roimhe seo (Sanghez et al. 2017).

4.8 BIOtaí an Iarthair

Rinneadh eastóscáin phróitéin (cealla/fíocháin) a aonchineálú i maolán lysis measúnacht rad-imdhíonachta (RIPA) (150 mM NaCl, 1 faoin gcéad Nonidet P-40 [NP-40],0 .5 faoin gcéad deoxycholate, 0.1 faoin gcéad SDS, 50 mM Tris, pH 8.0) le coscairí protease (10 ug/ml AEBSF, 10 ug/ml leupeptin, 5 ug/ml pepstatin, 5 ug/ml chymotrypsin, 10ug/ml aprotinin). Rinneadh na sleachta próitéin a sonicated agus ansin millíní trí lártheifneoiriú ag 13,000 rpm for15 min ag 4C. Baineadh úsáid as measúnacht próitéin BCA chun tiúchain próitéine a chainníochtú. Scaradh samplaí ina raibh méideanna comhionann próitéine 50 go 100 ug in aghaidh an lána ag baint úsáide as glóthacha réamhtheilgthe TGX grádán 4 go 12 faoin gcéad BioRad aistríodh ansin ag córas TransBlot Semi-Dry BioRad ag baint úsáide as pacáiste aistrithe Nitrocellulose. Rinne Ponceau S stain blotaí aistrithe a dhathú le haghaidh lódála próitéine comhionann agus ansin nite agus bac le bainne tirim neamhshaille 5 faoin gcéad i TBST ar feadh 60 nóiméad ag teocht an tseomra. Goradh antasubstaintí príomhúla le croitheadh ​​thar oíche ag 4 chéim. Scrúdaíodh blotaí le haghaidh na n-antasubstaintí seo a leanas: Comharthaíocht ATM (D2E2) Coinín mAb Cell, ag caolú 1:1000, -Actin (D6A8) Comharthaíocht cille coinín mAb, GAPDH (D16H11) Comharthaíocht cille coinín mAb agus an horseradish cuí peroxidase-conjugated ina dhiaidh sin HRP) frith-choine tánaisteach, Frith-luch ar feadh 2 uair ag teocht an tseomra. Tar éis nite iomadúla le TBST, braitheadh ​​​​sliocht próitéine ag substráit chemiluminescence Radiance Plus ag baint úsáide as an Azure c400 agus na córais íomháithe BioRad ChemiDoc. Rinneadh anailís densitometric ar an ATM ag baint úsáide as ImageJ. Rinneadh turgnaimh le 2 mhacasamhlú theicniúla agus 2-3 mhacasamhlú bitheolaíochta mar a léiríodh.

4.9 Measúnú Staidrimh

Bhí líon na n-ainmhithe a roghnaíodh do gach grúpa bunaithe ar anailís chumhachta priori ag baint úsáide as GPower v3.1 bunaithe ar mhéid 0.5, cumhacht 0.8, agus méideanna éifeacht measta ó na réamhshonraí nó staidéir roimhe seo. D’úsáideamar an dá mhodh paraiméadracha (1-agus 2-way ANOVA)) le haghaidh modhanna staitistiúla dáilte de ghnáth agus neamhpharaiméadrach (Kruskal Wallace) le haghaidh sonraí eatraimh chun difríochtaí idir grúpaí a thástáil agus tástálacha comparáide iolracha péirewise ina dhiaidh sin mar a léirítear i an téacs. Asluiteacha le haghaidh sonraí imdhíonachta i bhFíor. Eisíodh 6 agus 7 tríd an modh ROUT (Q=2 faoin gcéad ). Tá na hanailísí sonracha a úsáideadh do gach tacar sonraí nóta i ngach eochairfhigiúr. I gcás na bhfigiúirí go léir: n nach bhfuil suntasach,*p Níos lú ná nó cothrom le 0.05,** p<0.01,***><0.001,****><0.0001. data="" are="" reported="" as="" mean="" ±="" sem="" and="" box="" and="" whisker="" plots="" indicate="" the="" minimum,="" first="" quartile,="" median,="" third="" quartile,="" and="" maximum="" data="" values.="" all="" figures="" and="" statistical="" analyses="" were="" completed="" using="" excel="" (microsoft="" 360)="" or="" prism="" v8="" and="" 9="">